專利名稱：一種葡萄糖異構(gòu)酶的247位單突變體酶和138位,247位雙突變體酶及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變方法改良葡萄糖異構(gòu)酶的技術(shù)領(lǐng)域。
中國專利申請?zhí)?5112782.9“SM33 GI的突變酶GI G138P及一種提高GI熱穩(wěn)定性的突變方案”給出了有關(guān)7號淀粉酶鏈霉菌M1033葡萄糖異構(gòu)酶(SM33 GI)的來源、特性及蛋白質(zhì)工程對該酶改造的一般情況。但現(xiàn)有技術(shù)未能提高該酶的活力。
本發(fā)明的目的是提出一種使SM33 GI酶活力提高的突變體酶SM33 GI G247D，熱穩(wěn)定性和酶活力同時得以提高的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)，及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D，其特征在于所述SM33 GI的Gly247或某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33 GI的Gly247位的甘氨酸(Gly)變成了天門冬氨酸(Asp)。
本發(fā)明SM33 GI G247D的制備方法，其特征在于根據(jù)SM33 GI的基因序列，設(shè)計并合成引入Asp247密碼子的定點(diǎn)突變引物，對SM33 G1基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA序列，鑒別出Gly247密碼子變成Asp247密碼子的突變體，并進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明SM33 GI的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)，其特征在于將帶有Asp247密碼子的SM33 GI基因片段，或某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33 GI的G247D，替代了SM33 GI G138P上的相應(yīng)的DNA片段或相應(yīng)位點(diǎn)。
本發(fā)明5M33 GI雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)的制備方法，先按中國專利申請?zhí)?5112782.9技術(shù)獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G138P，其特征在于根據(jù)SM33 GI的基因序列，設(shè)計并合成引入Asp247密碼子的定點(diǎn)突變引物，對SM33 GI基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA序列，鑒別出Gly247密碼子變成Asp247密碼子的突變體，并進(jìn)行表達(dá)，獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D；再將SM33 GI G138P及SM33 GI G247D分別用XhoI酶解，將帶有G138P的SM33 GI基因5’端DNA片段與帶有G247D的SM33 GI基因3’端DNA片段經(jīng)T4連接酶連接而成為帶有G138P、G247D雙突變位點(diǎn)的SM33 GI基因，并進(jìn)行表達(dá)。
比較由上述突變體進(jìn)行表達(dá)獲得的突變體粗酶的性質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)單突變體酶SM33 GIG247D與野生型粗酶GI相比，酶比活有較明顯的提高，但熱穩(wěn)定性下降；而雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)在熱穩(wěn)定性和酶比活上均優(yōu)于野生型GI、單突變體酶GI G138P及GI G247D；進(jìn)一步比較雙突變體酶GI(G138P,G247D)及單突變體酶GI G138P的純酶，前者比活及其熱穩(wěn)定性均優(yōu)于后者。
由此可知，本發(fā)明SM33 GI的單突變體酶SM33 GI G247D具有提高酶活的優(yōu)點(diǎn)；而將帶有此Asp247位的片段替換了SM33 GI G138P相應(yīng)片段所構(gòu)成的SM33 GI雙突變體酶GI(G138P,G247D)，比這兩種單突變體酶中任一種具有更高的酶活及熱穩(wěn)定性。
依據(jù)分子的空間結(jié)構(gòu)，當(dāng)247位引入Asp后，局部構(gòu)象發(fā)生細(xì)微調(diào)整，但不會產(chǎn)生大的空間障礙。因為247位接近不對稱單位二體的結(jié)合面，且此結(jié)合面主要由G260、A261、G262的主鏈構(gòu)成，而Gly殘基主鏈構(gòu)象允許有較大的變化，允許247D的引入。盡管如此，247D位的引入對分子中的二體形成仍有一定的影響，可影響分子的熱穩(wěn)定性。
247位引入Asp產(chǎn)生的效應(yīng)是在分子中引入電荷，從而改變分子的靜電場分布。根據(jù)枯草桿菌蛋白酶的相應(yīng)研究結(jié)果，這種遠(yuǎn)離活性中心的電荷引入會影響酶的催化活力。
專利申請?zhí)?5112782.9已分析表明，138位引入Pro會增加酶的熱穩(wěn)定性，原因可能是引入Pro會限制酶的柔性，使其對溫度變得不十分敏感。
空間結(jié)構(gòu)表明，138位和247位相距甚遠(yuǎn)，彼此構(gòu)象改變不會相互影響，故而上述138位和247位分別引入Pro和Asp，其對酶的影響效應(yīng)同時存在。
因此，采用本發(fā)明構(gòu)建方法，可使SM33 GI的酶活提高，以及酶活和熱穩(wěn)定性同時獲得提高；尤其是雙突變體可構(gòu)建工程菌株，具有廣泛的應(yīng)用前景。
實(shí)施例1．SM33 GI G247D的制備1)、合成寡核苷酸點(diǎn)突變引物根據(jù)SM33 GI的基因序列，設(shè)計將Gly247(GGC)的密碼子改成Asp247(GAC)的密碼子的寡核苷酸突變引物，例如5′-ACC TCA ACG ACC AGT CCG-3′；采用DNA合成法進(jìn)行合成。
2)、構(gòu)建重組M13DNA將重組表達(dá)質(zhì)粒pTKD-GI和M13mp19RF用EcoRⅠ+SphⅠ雙酶解，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分別從膠中抽提0.9kb和7.2kb片段，以T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-blue。
3)、定點(diǎn)誘變采用雙引物法，步驟簡述如下a、制備重組M13DNA的參U單鏈模板，于大腸桿菌CJ236中完成；b、磷酸化寡核苷酸點(diǎn)突變引物；c、將磷酸化點(diǎn)突變引物、通用引物與參U單鏈模板退火，進(jìn)行體外延伸與連接；d、轉(zhuǎn)染突變反應(yīng)液于XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞。
具體過程可參見中國《(生物化學(xué)與生物物理學(xué)報》1995年27(5)470頁。
然后挑取噬菌斑，小規(guī)模抽提單鏈，測定DNA序列，鑒定出Gly247的密碼子變成Asp247的密碼子的突變體。
4)、表達(dá)突變體基因?qū)⑼蛔凅w基因克隆回原重組表達(dá)質(zhì)粒pTKD-GI，轉(zhuǎn)化大腸桿菌K38/pGP1-2?？刹捎弥袊?高技術(shù)通訊)》1993年3(7)10頁所述的方法，培養(yǎng)表達(dá)出SM33 GI G247D。
實(shí)施例2.SM33 GI(G138P,G247D)的構(gòu)建及雙突變體酶的制備1)、pTKD-GI(G138P,G247D)的構(gòu)建附

圖1是pTKD-GI(G138P,G247D)的構(gòu)建圖，圖中A-Ⅰ是pTKD-GI G138P，其DNA大小為4.3Kb；A-Ⅱ是A-Ⅰ經(jīng)XhoⅠ酶解后，經(jīng)電泳分離獲得的大片段，其DNA大小為3.6Kb，它由pTKD載體大片段以及帶有G138P突變位點(diǎn)的GI基因5’端DNA片段構(gòu)成。圖中B-Ⅰ是pTKD-GI G247D，其DNA大小為4.3Kb,B-Ⅱ是B-Ⅰ經(jīng)XhoⅠ酶解后，經(jīng)電泳分離得到的小片段，其DNA大小為700bp，它是由pTKD載體小片段以及帶有G247D突變位點(diǎn)的GI基因3’端DNA片段構(gòu)成。
AB是指pTKD-GI(G138P,G247D)，是將A-ⅡDNA片段和B-ⅡDNA片段經(jīng)T4連接酶(T4Ligase)連接而構(gòu)成的帶有G138P、G247D雙突變位點(diǎn)的完整SM33 GI基因的pTKD表達(dá)質(zhì)粒，其DNA大小為4.3Kb。
2)、表達(dá)SM33 GI(G138P,G247D)雙突變體酶按實(shí)施例1所述方法將pTKD-GI(G138P,G247D)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K38/pGP1-2，培養(yǎng)表達(dá)可得到SM33 GI(G138P,G247D)雙突變體酶。
實(shí)施例3.SM33 GI,SM33 GI G138P,SM33 GI G247D及SM33 GI(G138P,G247D)粗酶性質(zhì)比較1)、比活測定采用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖為底物。具體按《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報》1992年22(2),232-235頁所述方法測定，結(jié)果列于表1表1
<p>2)、熱穩(wěn)定性的測定70℃，加熱2小時，采用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖為底物，測定其加熱前后的相對活力，結(jié)果列于表2表2
由上述對粗酶性質(zhì)的測定結(jié)果可以得出雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)的酶活及熱穩(wěn)定性為最佳。
由中國專利申請?zhí)?5112782.9提出的“SM33 GI的突變酶GI G138P及一種提高GI熱穩(wěn)定性的突變方法”，突變體酶GI G138P的熱穩(wěn)定性較野生型有明顯提高，酶活無明顯下降；而雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)實(shí)質(zhì)上也就是在SM33 GI G138P突變體酶的247位GIy又引入Asp的突變；故有必要進(jìn)一步純化及比較雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)與單突變體酶SM33 GI G138P的性質(zhì)變化。
實(shí)施例4．雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)與單突變體酶SM33 GI G138P的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)比較1)、純化ⅰ)、加熱變性除去雜蛋白70℃加熱15’后酶蛋白及酶活的變化分別將SM33 GI(G138P,G247D)和SM33 GI G138P兩種粗酶液于70℃加熱15′后取出，立即冷卻至4℃,10000rmp離心20分鐘，去沉淀，由上清測得單突變體酶SM33 GI G138P和雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)加熱前后的總蛋白和總活力(以加熱前為100％)，結(jié)果列于表3表3
可見采用加熱變性的方法除去了大部分雜蛋白。
ⅱ)、純化按“生物化學(xué)與生物物理學(xué)報”1995年27(5)470頁所述方法，將上清經(jīng)DEAE-sepharose FF一次柱層析，即獲得SDS-PAGE電泳純酶。
2)、雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)與單突變體酶SM33 GIG138P的性質(zhì)比較ⅰ)、熱穩(wěn)定性的測定選用10mM MgCl2/50mM Tris-HCl(PH7.0)緩沖液作為熱穩(wěn)定性實(shí)驗的緩沖液。酶液在80℃水浴中保溫，每20分鐘取樣100ul，分別以木糖和葡萄糖為底物，將酶液與底物分別混合后，在35℃水浴中反應(yīng)15分鐘，用半胱氨酸-咔唑法測活，數(shù)據(jù)分別列于表4和表5表4是以木糖為底物時不同保溫時間后酶的相對活力；表5是以葡萄糖為底物時不同保溫時間后酶的相對活力。表4
表5
取橫坐標(biāo)為時間(單位分鐘)，縱坐標(biāo)為相對活力，以保溫時間-相對活力的對數(shù)作圖。圖2為SM33 GI G138P和SM33 GI(G138P,G247D)在80℃，以木糖為底物時的熱穩(wěn)定性曲線；圖3為SM33 GI G138P和SM33 GI(G138P,G247D)在80℃，以葡萄糖為底物時的熱穩(wěn)定性曲線。圖中黑圓點(diǎn)是SM33 GI(G138P,G247D)的活力數(shù)據(jù)，黑方塊是SM33 GI G138P的活力數(shù)據(jù)；實(shí)線表示SM33 GI(G138P,G247D)的時間-相對活力曲線，虛線表示SM33 GI G138P的時間-相對活力曲線。
根據(jù)附圖2和3，從縱坐標(biāo)上1g50所對應(yīng)的橫坐標(biāo)，即可求得突變體葡萄糖異構(gòu)酶的半衰期列于表6
表6
可以看出，雙突變體酶8M33 GI(G138P,G247D)的熱穩(wěn)定性優(yōu)于單突變體酶SM33 GIG138P，其熱失活半衰期在以葡萄糖為底物時提高到1.24倍；在以木糖為底物時提高到4.06倍。
ⅱ)、比活測定經(jīng)上述先加熱變性，再經(jīng)DEAE-sepharose FF柱層析獲得的雙突變體酶，采用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖為底物，測得SM33 GI G138P的比活為113.3U/mg，而SM33 GI(G138P,G247D)為179.2 U/mg，即SM33 GI(G138P,G247D)的比活是SM33 GI G138P的1.58倍。
由上述結(jié)果可知，本發(fā)明制備的SM33 GI(G138P,G247D)是較單突變體酶SM33 GI G138P的熱穩(wěn)定性及酶活力同時得以提高的有意義的雙突變體酶，其酶活較GI G138P提高到1.58倍，其熱失活半衰期在以葡萄糖為底物時提高到1.24倍，在以木糖為底物時提高到4.06倍。
權(quán)利要求
1.一種SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D，其特征在于所述SM33 GI的Gly247或某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33 GI的Gly247位的甘氨酸(Gly)變成了天門冬氨酸(Asp)。
2.一種SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D的制備方法，其特征在于根據(jù)SM33 GI的基因序列，設(shè)計并合成引入Asp247密碼子的定點(diǎn)突變引物，對SM33 GI基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA序列，鑒別出Gly247密碼子變成Asp24 7密碼子的突變體，并進(jìn)行表達(dá)。
3.一種SM33 GI的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)，其特征在于將帶有Asp247密碼子的SM33 GI基因片段，或某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33 GI的G2 47D，替代了SM33 GI G1 38P上的相應(yīng)片段或位點(diǎn)。
4.一種SM33 GI的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)的制備方法，先按中國專利申請?zhí)?5112782.9技術(shù)獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G138P，其特征在于根據(jù)SM33 GI的基因序列，設(shè)計并合成引入Asp247密碼子的定點(diǎn)突變引物，對SM33GI基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測定DNA序列，鑒別出Gly247密碼子變成Asp247密碼子的突變體，并進(jìn)行表達(dá)，獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D；再將SM33 GIG138P及SM33 GI G247D分別用XhoI酶解，將帶有G138P的SM33GI基因5’端DNA片段與帶有G247D的SM33 GI基因3’端DNA片段經(jīng)T4連接酶連接而成為帶有G138P、G247D雙突變位點(diǎn)的SM33 GI基因，并進(jìn)行表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變方案及其SM33 GI的突變體酶和雙突變體酶,其特征在于將SM33 GI的247位或在同源性比較相當(dāng)于247位的Gly替換為Asp,獲得的突變體酶SM33 GI G247D,其酶活較野生型粗酶GI有明顯的提高;再將帶有Asp247的SM 33 GI基因片段替代SM33 GI GI38P基因的相應(yīng)片段,可獲得雙突變體酶SM33GI(GI38P,G247D),其酶活和熱穩(wěn)定性同時獲得提高。
文檔編號C12N9/92GK1213003SQ9711971
公開日1999年4月7日 申請日期1997年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月30日
發(fā)明者王玉珍, 徐沖, 牛立文, 王淳, 伍傳金, 滕脈坤, 崔濤, 陶莉梅, 朱國萍, 杭俊, 朱學(xué)勇, 羅昭鋒, 廖軍 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)