專利名稱：：生產(chǎn)核苷－5’－磷酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)方法。本發(fā)明也涉及新的酸性磷酸酶、編碼該酸性磷酸酶的基因、含有該基因的重組DNA，涉及包含該重組DNA、可用來生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的微生物。核苷-5’-磷酸酯可用作調(diào)味品、藥物和生產(chǎn)這類物質(zhì)的原料。通過使用以下磷酸基團供體，用生化方法將核苷磷酸化，生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法是已知，包括使用對硝基苯磷酸的方法(日本專利公告39-29858)、使用無機磷酸的方法(日本專利公告42-1186)、使用多磷酸的方法(日本專利公開53-56390)、使用乙酰磷酸的方法(日本專利公開56-82098)和使用三磷酸腺苷(ATP)的方法(日本專利公開63-230094)。然而，因為這些方法使用的底物昂貴或在反應(yīng)中產(chǎn)生副產(chǎn)物，所以在高效并便宜地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯方面不能令人滿意。因此，本發(fā)明人研制出一種方法，通過讓特定的微生物細胞在酸性條件下作用于核苷和磷酸基團供體(選自多磷酸或其鹽、苯磷酸或其鹽和氨甲酰磷酸或其鹽)，高效地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯，而不產(chǎn)生2’-、3’-核苷異構(gòu)體副產(chǎn)物(日本專利公開7-231793)。然而，甚至該方法也有以下缺點。即例如，在反應(yīng)期間由于在所用微生物細胞中不幸地微量存在降解核苷的活性，一部分底物被降解。而且，如果繼續(xù)反應(yīng)，那么產(chǎn)生并積累的核苷-5’-磷酸酯被降解。因此，在反應(yīng)溶液中產(chǎn)生副產(chǎn)物，已不可能獲得足夠的產(chǎn)量。此外，因為每個微生物細胞的轉(zhuǎn)磷酸活性低，如果加入高濃度的底物，那么反應(yīng)不能進行。本發(fā)明的目的是提供便宜并有效地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，本發(fā)明的另一目的是提供一種酶、一個編碼該酶的基因、含有該基因的重組DNA以及含有該重組DNA、可用于生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的微生物。本發(fā)明人進行了各種研究，以便研制出比常規(guī)方法更有效地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過讓從微生物無細胞提取物中純化的酸性磷酸酶在pH3.0-5.5的條件下，作用于核苷和磷酸基團供體(選自多磷酸或其鹽、苯磷酸或其鹽和氨甲酰磷酸或其鹽)，可以有效高產(chǎn)地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯。另外，本發(fā)明人已成功地從不同的細菌中獲得編碼酸性磷酸酶的野生型基因，并通過在得自埃希氏桿菌細菌的腹性磷酸酶上導(dǎo)入一個突變，成功地獲得在野生型酸性磷酸酶具有更多核苷菌親和力的酸性磷酸酶的編碼基因。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過按照遺傳工程技術(shù)大量表達該基因，大大提高了核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)率。本發(fā)明人還嘗試制備溫度穩(wěn)定性提高的突變型酸性磷酸酶，目的是用酸性磷酸酶在較高溫度下進行磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，使得核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)效率更高，因為反應(yīng)速度提高，并且在反應(yīng)溶液中的磷酸酯受體濃度更高。然后，本發(fā)明人成功地制備了比實施例19中描述的突變型酸性磷酸酶溫度穩(wěn)定性更高的突變型酸性磷酸酶，并可以在高溫下用于反應(yīng)中，因此完成了本發(fā)明。即本發(fā)明提供生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，包括以下步驟讓對核苷具有較高親和性和/或溫度穩(wěn)定性提高的酸性磷酸酶，在pH3.0-5.5的條件下作用于核苷和磷酸基團供體(最好選自多磷酸或其鹽、苯磷酸或其鹽、乙酰磷酸或其鹽和氨甲酰磷酸或其鹽)，生產(chǎn)并收集核苷-5’-磷酸酯。另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，包括以下步驟讓微生物在pH3.0-5.5的條件下，作用于核苷和磷酸基團供體，生產(chǎn)并收集核苷-5’-磷酸酯；其中微生物用包含對核苷-5’-磷酸酯具有較高親和性和/或溫度穩(wěn)定性提高的酸性磷酸酶的編碼基因的重組DNA轉(zhuǎn)化。另一方面，本發(fā)明提供對核苷具有較高親和性和/或溫度穩(wěn)定性提高的突變型酸性磷酸酶、編碼這些酸性磷酸酶的基因、含有這些基因的重組DNA和包含重組DNA的微生物。&lt;1&gt;酸性磷酸酶的制備用于本發(fā)明的酸性磷酸酶不特別限制，只要它在pH3.0-5.5的條件下，通過將磷酸基團從磷酸基團供體(例如選自多磷酸或其鹽、苯磷酸或其鹽、乙酰磷酸或其鹽和氨甲酰磷酸或其鹽)轉(zhuǎn)移到核苷催化產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯的反應(yīng)即可。這種酸性磷酸酶最好包括得自微生物的那些酸性磷酸酶。在特別推薦的實施方案中，本發(fā)明使用得自屬于摩根氏菌屬、埃希氏桿菌屬、普羅威登斯菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏桿菌屬或沙雷氏菌屬細菌的一種酶。這種細菌的代表實例包括以下細菌菌株。摩氏摩根氏菌NCIMB10466摩氏摩根氏菌IFO3168摩氏摩根氏菌IFO3848EsherichiablattaeJCM1650EsherichiablattaeATCC33429EsherichiablattaeATCC33430斯托氏普羅威登斯菌ATCC29851斯托氏普羅威登斯菌ATCC33672產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010產(chǎn)氣腸桿菌IFO13534KlebsiellaplanticolaIFO14939KlebsiellaplanticolaIAM1133SerratiaficariaIAM13540粘質(zhì)沙雷氏菌IAM12143我們注意到，酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)最初為在酸性條件下催化水解磷酸酯反應(yīng)的酶，它具有降解通過轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)生成的核苷-5’-磷酸酯的核苷酸酶活性(在下文，核苷酸酶活性稱為“磷酸單酯酶活性”)。甚至這樣一種酸性磷酸酶也可以用于本發(fā)明生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法中。然而，為了高產(chǎn)地獲得核苷-5’-磷酸酯，需要使用突變型酸性磷酸酶，與用上述細菌生產(chǎn)的野生型酸性磷酸酶相比，它在將向核苷的轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)中對核苷的親和性提高(必要時，下文簡稱為“突變型酸性磷酸酶”)。最好使用Km值低于100mM的突變型酸性磷酸酶。通過表達直接突變編碼下述酸性磷酸酶的基因獲得的突變型基因獲得突變型酸性磷酸酶?；蛘撸米贤夤廨椛浠蛲ǔＳ糜谌斯ふT變的突變劑(諸如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)等)，處理產(chǎn)生對核苷具有較高親和性酸性磷酸酶的微生物，然后培養(yǎng)突變的微生物，產(chǎn)生對核苷具有較高親和性的突變型酸性磷酸酶，也可以獲得突變型酸性磷酸酶。具有酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)可以從上述微生物中獲得，即通過在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)具有該活性的微生物菌株，收獲增殖的微生物細胞，破碎這些微生物細胞以制備無細胞提取物，然后適當?shù)貜闹屑兓摰鞍踪|(zhì)。培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基不受特別限制，為此可以獲得含有一般碳源、氮源、無機離子和可選的有機營養(yǎng)物源的普通培養(yǎng)基。適當使用的碳源包括例如諸如葡萄糖和蔗糖等的糖類、諸如甘油等的醇類化合物和有機酸。所用的氮源包括例如氨氣、氨水和銨鹽。必要時適當使用的無機離子包括例如鎂離子、磷離子、鉀離子、鐵離子和錳離子。適當使用的有機營養(yǎng)物源包括例如維生素和氨基酸以及含有它們的那些營養(yǎng)物源，諸如酵母膏、胨、肉膏、玉米漿、水解酪蛋白和大豆水解物等。培養(yǎng)條件也不特別限制。微生物例如可以在需氧條件下培養(yǎng)大約12-48小時，同時將pH和溫度適當?shù)乜刂圃趐H5-8和25-40℃的范圍內(nèi)。可以例如通過離心，從培養(yǎng)液中收獲增殖的微生物細胞。用常規(guī)方法，從收獲的微生物細胞中制備無細胞提取物。即用諸如超聲處理、Dyno-mill和FrenchPress等方法破碎微生物細胞，然后通過離心除去細胞碎片，獲得無細胞提取物。用通常用于酶純化的適當技術(shù)組合(諸如硫酸銨分級分離、離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾層析和等電純化等)，從無細胞提取物中純化酸性磷酸酶。關(guān)于沉淀，不需要必需完全純化酸性磷酸酶。做到除去諸如參加降解核苷底物的酶等污染物就足夠了。&lt;2&gt;酸性磷酸酶基因的制備含有編碼具有酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的DNA片斷，可以從例如具有該酶活性的微生物細胞中開始克隆。克隆方法包括例如用止該酶活性作為指標篩選染色體基因表達文庫的方法、制備該蛋白質(zhì)的抗體以篩選染色體基因表達文庫的方法、以及分析氨基酸序列(諸如該純化蛋白質(zhì)的N-末端序列等)，并在此基礎(chǔ)上制備探針以篩選基因文庫的方法。具體地說，上述摩氏摩根氏菌、Esherichiablattae、斯托氏普羅威登斯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、Klebsiellaplanticola、Klebsiellaplanticola、Serratiaficaria或粘質(zhì)沙雷氏菌的酸性磷酸酶的編碼基因的克隆，可以通過制備每種微生物的染色體基因表達文庫，并用磷酸酶活性作為指標篩選該文庫來進行。即可以如下制備染色體基因表達文庫首先制備摩氏摩根氏菌或Esherichiablattae的染色體DNA，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶部分降解該DNA，隨后將其與能在大腸桿菌中自主復(fù)制的載體連接，用獲得的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌?？梢允褂枚喾N限制性內(nèi)切酶降解染色體DNA，通過調(diào)整降解反應(yīng)的時間調(diào)整降解程度?？梢允褂萌魏屋d體克隆該基因，只要它能在大腸桿菌中自主復(fù)制即可?？梢允褂美鏿UC19、pUC118、pHSG298、pBR322和pBluescriptII。載體可以與含有酸性磷酸酶編碼基因的DNA片斷連接以制備重組DNA，即預(yù)先用與降解染色體DNA使用的相同的限制性內(nèi)切酶或用產(chǎn)生的剪切末端與染色體DNA片斷剪切末端互補的限制性內(nèi)切酶降解載體，然后用諸如T4DNA連接酶等連接酶，將其與DNA片斷連接。任何微生物菌株都可以用作制備的重組DNA的受體，只要它適于載體的復(fù)制即可?？梢允褂美缰T如HB101、JM109和DH5等大腸桿菌的微生物菌株。由此獲得的轉(zhuǎn)化體在瓊脂培養(yǎng)基上生長，形成菌落。此后，將含有對硝基苯磷酸的反應(yīng)溶液倒到培養(yǎng)基表面上，進行反應(yīng)，然后表達磷酸酶活性的菌株釋放對硝基酚，并表現(xiàn)出黃色。包含含目的酸性磷酸酶編碼基因的DNA片斷的轉(zhuǎn)化體可以如下篩選通過在酸性條件下進行上述反應(yīng)，用顏色變化作為指標篩選轉(zhuǎn)化體。此后，從篩選的轉(zhuǎn)化體回收重組DNA，分析含與載體連接的酸性磷酸酶編碼基因的DNA片斷的結(jié)構(gòu)。關(guān)于酸性磷酸酶編碼基因的核苷酸順序，得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466的基因示于順序表的SEQIDNO2中，得自EsherichiablattaeJCM1650的基因示于順序表的SEQIDNO6中，得自斯托氏普羅威登斯菌ATCC29851的基因示于順序表的SEQIDNO21中，得自產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010的基因示于順序表的SEQIDNO23中，得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的基因示于順序表的SEQIDNO25中，得自SerrtiaficariaIAM13540的基因示于順序表的SEQIDNO27中。得出的由上述基因編碼的酸生磷酸酶的氨基酸序列在SEQIDNO4、8、22、24、26和28中進行了描述。本發(fā)明最好使用由上述基因編碼的酸性磷酸酶。另外，本發(fā)明也最好使用包含的氨基酸順序與上述基因編碼的酸性磷酸酶中任一種的氨基酸順序基本相同的酸性磷酸酶。“基本相同”是指酸性磷酸酶的氨基酸序列可以替代、缺失、插入或轉(zhuǎn)換一個或多個氨基酸殘基，而不損失產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯的活性(下文稱為“轉(zhuǎn)磷酸活性”)&lt;3&gt;突變型酸性磷酸酶編碼基因的制備按上述方法獲得的野生型酸性磷酸酶具有磷酸單酯酶活性。因此，磷酸單酯酶活性可能作為核苷-5’-磷酸酯生產(chǎn)中，隨著時間的推移造成產(chǎn)物的伴隨性降解的因素致使反應(yīng)產(chǎn)率降低。為了克服這一情況，最好在酸性磷酸酶的編碼基因上產(chǎn)生人工突變，使得對核苷的親和性增加。另外，用酸性磷酸酶在較高溫度下進行磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，使得核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)有效得多，因為反應(yīng)速度提高，并且在反應(yīng)溶液中的磷酸酯受體的濃度可以更高。為此，最好在酸性磷酸酶的編碼基因上產(chǎn)生人工突變，使得溫度穩(wěn)定性提高。在DNA的目的位點上產(chǎn)生目的突變的定位點誘變的方法包括例如使用PCR的方法(Higuchi，R.，61，inPCRtechnology，Erlich，H.A.Eds.，Stocktonpress(1989)；Carter，P.，Meth.inEnzymol.，154，382(1987))，和使用噬菌體的方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.inEnzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.等人，Meth.inEnzymol.，154，367(1987))。對核苷親和性較高的突變型酸性磷酸酶的實例為包含的氨基酸順序與選自順序表的SEQIDNO4、8、22、24、26和28中描述順序的其中一種氨基酸順序基本相同、并具有增加野生型酸性磷酸酶對核苷親和性的突變的酸性磷酸酶。具體地說，得自EsherichiablattaeJCM1650的突變型酸性磷酸酶的實例為，順序表中SEQIDNO8中描述的氨基酸順序的第74位甘氨酸殘基和/或第153位異亮氨酸殘基被另一個氨基酸殘基替代。在以下描述的實施例中，突變型酸性磷酸酶的編碼基因作為一個實施例進行描述，其中第74位甘氨酸殘基用天冬氨酸殘基替代，而第153位的異亮氨酸殘基用蘇氨酸殘基替代。選自順序表中SEQIDNO8中的包括第63位亮氨酸殘基、第65位丙氨酸殘基、第66位谷氨酸殘基、第69位天冬氨酸殘基、第71位絲氨酸殘基、第72位絲氨酸殘基、第85位絲氨酸殘基、第92位丙氨酸殘基、第94位丙氨酸殘基、第116位天冬氨酸殘基、第130位絲氨酸殘基、第135位蘇氨酸殘基和/或第136位谷氨酸殘基用另一氨基酸替代的其它突變，進一步提高了酸性磷酸酶對核苷的親和性。溫度穩(wěn)定性提高的突變型酸性磷酸酶的實例為，包含的氨基酸順序與選自順序表的SEQIDNO4、8、22、24、26和28中描述順序的其中一種氨基酸順序基本相同、并且具有增加野生型酸性磷酸酶溫度穩(wěn)定性的突變的酸性磷酸酶。具體地說，得自EsherichiablattaeJCM1650的突變型酸性磷酸酶的實例是，順序表中SEQIDNO8中描述的氨基酸順序中的第104位谷氨酸殘基和/或第151位蘇氨酸殘基被另一個氨基酸殘基替代。在以下描述的實施例中，編碼突變型酸性磷酸酶的基因作為一個實施例進行描述，其中第104位谷氨酸殘基用甘氨酸殘基替代，而第151位蘇氨酸殘基用丙氨酸殘基替代。因此，可以按照上述定位點誘變方法，在野生型基因的特定位點替代核苷酸，以編碼這些突變型酸性磷酸酶。增加對核苷親和性的突變是合乎需要的突變，即通過這種突變，生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的活性與野生型酸性磷酸酶相比，基本上不降低。然而，甚至在產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯的活性降低的情況下，如果磷酸單酯酶活性降低的程度大于產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯的活性降低程度，結(jié)果與野生型酸性磷酸酶相比，磷酸單酯酶的活性與產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯的活性之比降低，那么也是足夠的。關(guān)于對核苷親和性的增加程度，在轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)中對核苷的Km值最好低于100mM。增加溫度穩(wěn)定性的突變是指，在溫度處理后這種突變殘留的活性高于野生型酸性磷酸酶的殘留活性。溫度穩(wěn)定性增加的程度最好是在pH7.0、50℃處理30分鐘后不發(fā)生活性降低。正如下面實施方案中描述的，EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶的氨基酸順序與摩氏摩根氏菌NCIMB10466的氨基酸順序高度同源，在SEQIDNO4描述的氨基酸順序中的第72位甘氨酸殘基、第102位的谷氨酸殘基、第149位蘇氨酸殘基和第151位異亮氨酸殘基分別相當于SEQIDNO8描述的氨基酸順序中的第74位甘氨酸殘基、第104位谷氨酸殘基、第151位蘇氨酸殘基和第153位的異亮氨酸殘基。另外，除EsherichiablattaeJCM1650之外，得自諸如斯托氏普羅威登斯菌ATCC29851、產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010、KlebsiellaplanticolaIFO14939和SerrtiaficariaIAM13540等微生物的酸性磷酸酶的氨基酸順序與摩氏摩根氏菌NCIMB10466的氨基酸順序高度同源，這些酸性磷酸酶的氨基酸順序包括每個分別相當于在SEQIDNO4描述的氨基酸順序中的第72位甘氨酸殘基、第102位的谷氨酸殘基、第149位蘇氨酸殘基和第151位異亮氨酸殘基的氨基酸殘基。因此，得自這些微生物的突變型酸性磷酸酶的編碼基因可以按上述方法獲得。在SEQIDNO22、24或26中描述的得自斯托氏普羅威登斯菌ATCC29851、產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010或KlebsiellaplanticolaIFO14939的酸性磷酸酶的氨基酸順序中的第92位甘氨酸殘基、第122位谷氨酸殘基、第169位蘇氨酸殘基和第171位異亮氨酸殘基以及在SEQIDNO28中描述的得自SerrtiaficariaIAM13450的酸性磷酸酶的基硫順序中的第88位甘氨酸殘基、第118位谷氨酸殘基、第165位蘇氨酸殘基和第167位異亮氨酸殘基分別相當于在SEQIDNO4描述的氨基酸順序中的第72位甘氨酸殘基、第102位谷氨酸殘基、第149位蘇氨酸殘基和第151位異亮氨酸殘基。圖12描述了比較上述酸性磷酸酶的氨基酸順序的結(jié)果。在圖12基礎(chǔ)上，決定酸性磷酸酶的哪個氨基酸殘基相當于另一酸性磷酸酶的另一氨基酸殘基。&lt;4&gt;將酸性磷酸酶基因?qū)胨拗髦懈咚奖磉_酸性磷酸酶活性的重組微生物可以通過以下步驟獲得將含有按上述方法獲得的具有酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)編碼基因的DNA片斷與適當?shù)妮d體重組后，將該DNA片斷導(dǎo)入宿主中。在這一步驟中，用野生型酸性磷酸酶的編碼基因表達野生型酸性磷酸酶，而用突變型酸性磷酸酶的編碼基因表達突變型酸性磷酸酶。宿主包括諸如上述HB101、JM109和DH5等的大腸桿菌微生物菌株。除這些菌株外，還可以將所有細菌用作宿主，只要構(gòu)建的重組DNA的復(fù)制起點和酸性磷酸酶基因起作用、重組DNA可復(fù)制、而酸性磷酸酶基因可以表達即可。其中一個最優(yōu)選的宿主是大腸桿菌JM109。導(dǎo)入酸性磷酸酶編碼基因的載體不特別限制，只要它可在宿主中復(fù)制即可。使用大腸桿菌作為宿主時，載體的實例是在該細菌中可自主復(fù)制的質(zhì)粒。例如可以使用ColE1型質(zhì)粒、pl5A型質(zhì)粒、R因子型質(zhì)粒和噬菌體型質(zhì)粒。這類質(zhì)粒具體包括例如pBR322(Gene，2，95(1977)、pUC19(Gene，33，103(1985)、pUC119(MehtodsinEmzymology，153，3(1987))、pACYC184(J.Bacteriol.，134，1141(1978)和pSC101(Proc.Natl.AcadSci.U.S.A.，70，3240(1973))。當含有酸性磷酸酶編碼基因的DNA片斷含有在宿主中起作用的啟動子時，可以將DNA片斷照原樣與載體連接。當該DNA片斷不含這一啟動子時，可以將在宿主微生物中起作用的另一啟動子(諸如lac、trp和PL等)連接到該基因上游位置。甚至當該DNA片斷含有該啟動子時，該啟動子也可以用另一啟動子替代，以便有效地表達酸性磷酸酶編碼基因。將通過載體與含有酸性磷酸酶編碼基因的DNA片斷連接構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入宿主中的方法沒有特殊的限制?？梢杂贸Ｒ?guī)方法將重組DNA導(dǎo)入宿主中。使用大腸桿菌作為宿主時，可以使用例如氯化鈣法(J.Mol.Biol.，53，159(1970))、Hanahan法(J.Mol.Biol.，166，557(1983))、SEM法(Gene，96，23(1990))、Chung等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，2172(1989))和電擊法(NucleicAcidsRes.，16，6127(1988))。酸性磷酸酶基因可以插入自主復(fù)制的載體DNA上，可以將其導(dǎo)入宿主中，使得它作為上述染色體外DNA包含于宿主中?；蛘?，可以按照使用轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子(Biotechnol.，1,417(1983))、Mu噬菌體(日本專利公開2-109985)或同源重組(ExperimentsinMolecularGenetics，ColdSpringHarbourLab.(1972))的方法，將酸性磷酸酶基因引入宿主微生物的染色體中。&lt;5&gt;用重組微生物表達酸性磷酸酶基因按上述方法獲得的已導(dǎo)入重組DNA(含有酸性磷酸酶編碼基因)的轉(zhuǎn)化體，通過將其培養(yǎng)在適當?shù)呐囵B(yǎng)基(含有碳源、氮源、無機離子和可選的有機營養(yǎng)物源)中，能夠在其細胞中高水平地表達酸性磷酸酶活性。適當使用的碳源包括例如諸如葡萄糖等的糖類、諸如甘油等的醇類化合物和有機酸。所用的氮源包括例如氨氣、氨水和銨鹽。必要時適當使用的無機離子包括例如鎂離子、磷離子、鉀離子、鐵離子和錳離子。適當使用的有機營養(yǎng)物源包括例如維生素和氨基酸以及含有它們的那些營養(yǎng)物源，諸如酵母膏、胨、肉膏、玉米漿、水解酪蛋白和大豆水解物。根據(jù)啟動子，將諸如IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)等表達誘導(dǎo)劑加入培養(yǎng)基中，可以增加酸性磷酸酶活性的表達量。培養(yǎng)條件也不特別限制。例如可以在需氧條件下培養(yǎng)大約12-48小時，同時將pH和溫度適當?shù)乜刂圃趐H5-8和25-40℃的范圍內(nèi)。此后，從培養(yǎng)物中收獲微生物細胞，通過破碎制備無細胞提取物，可以從其中純化酸性磷酸酶。使用通常用于酶純化的的適當技術(shù)組合(諸如上述第&lt;1&gt;條中描述的那些技術(shù)等)進行純化。關(guān)于純化，不必完全純化酸性磷酸酶。做到除去諸如參加核苷底物降解的酶等污染物就足夠了。&lt;6&gt;核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯可以在反應(yīng)混合物中生產(chǎn)，即讓按第&lt;1&gt;條描述方法獲得的酸性磷酸酶、或野生型酸性磷酸酶、或通過按照第&lt;5&gt;條描述的遺傳工程技術(shù)大量表達基因得到的突變型酸性磷酸酶，與核苷及磷酸基團供體(選自多磷酸或其鹽、苯磷酸或其鹽、乙酰磷酸或其鹽和氨甲酰磷酸或其鹽)接觸并引起反應(yīng)。為了在該反應(yīng)中達到高生產(chǎn)率，重要的是將反應(yīng)溶液的pH調(diào)至3.0-5.5的弱酸性范圍內(nèi)。當用遺傳工程技術(shù)大量表達酸性磷酸酶的編碼基因時，特別是當大量表達對核苷的親和性較高的突變型酸性磷酸酶編碼基因時，也可以使用含轉(zhuǎn)化體微生物細胞的培養(yǎng)物，便宜并有效地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯，從培養(yǎng)物中分離并收獲微生物細胞，或按照例如固定化處理、丙酮處理或冷凍干燥處理代替純化的酸性磷酸酶，從微生物細胞中獲得產(chǎn)物。使用的核苷包括例如嘌呤核苷，諸如肌苷、鳥苷、腺苷、黃苷、嘌呤核糖核苷、6-甲氧基嘌呤核糖核苷、2，6-二氨基嘌呤核糖核苷、6-氟嘌呤核糖核苷、6-硫代嘌呤核糖核苷、2-氨基-6-硫代嘌呤核糖核苷和巰基鳥苷等；和嘧啶核苷，諸如尿苷、胞苷、5-氨基尿苷、5-羥基尿苷、5-溴尿苷和6-氮雜尿苷等。反應(yīng)結(jié)果是，這些天然型核苷和非天然型核苷在它們的5’-位置上專一性地磷酸化，分別生產(chǎn)出相應(yīng)的核苷-5’-磷酸酯。需要加入反應(yīng)溶液中的核苷濃度為1-20g/dl。使用微溶于水的核苷時，可以通過加入硼酸或諸如二甲基亞砜等表面活性劑，提高反應(yīng)產(chǎn)量。通過發(fā)酵生產(chǎn)核苷時，發(fā)酵后的發(fā)酵培養(yǎng)基可以照原樣加入磷酸化反應(yīng)液中。當培養(yǎng)基中包含分解核苷-5’-磷酸酯的成分時，最好使用純化步驟，使得除去所述成分。關(guān)于所用的磷酸基團供體，可作為多磷酸或其鹽使用的那些磷酸基團供體包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、它們的混合物、其鈉鹽、鉀鹽和它們的鹽的混合物。那些可作為苯磷酸或其鹽使用的磷酸基團供體包括例如苯磷酸二鈉、苯磷酸二鉀、鄰，鄰-二苯磷酸酐和它們的混合物。那些可作為氨甲酰磷酸或其鹽使用的磷酸基團供體包括例如氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨、氨甲酰磷酸二鋰和它們的混合物。那些可作為乙酰磷酸或其鹽使用的磷酸基團供體包括例如乙酰磷酸鋰鉀。磷酸基團供體使用的濃度由作為磷酸基團受體的核苷濃度決定。磷酸基團供體的用量通常為核苷用量的1-5倍。在溫度通常為20-60℃、最好為30-40℃，pH為3.5-6.5、最好為4.0-5.0的弱酸性范圍內(nèi)的反應(yīng)中，獲得最佳結(jié)果。使用溫度穩(wěn)定性增加的突變型酸性磷酸酶時，反應(yīng)溫度為20-70℃，最好為30-60℃?？梢圆捎渺o止方法和攪拌方法中的任一種方法進行反應(yīng)。反應(yīng)時間根據(jù)諸如所用酶的活性和底物濃度等條件而延遲，然而，一般為1-100小時。在完成反應(yīng)后，可以采用使用合成樹脂吸附的方法、使用沉淀劑的方法和其它常規(guī)收集和分離方法，從混合物中收集和分離由此生產(chǎn)的核苷-5’磷酸酯。下面參考實施例具體解釋本發(fā)明，然而，本發(fā)明不限于這些實施例。用肌苷作為底物，在以下條件下測定轉(zhuǎn)磷酸活性。反應(yīng)在pH5.0、30℃下進行10分鐘，在反應(yīng)溶液(1ml)中含有40μmol/ml肌苷、100μmol/ml焦磷酸鈉、100μmol/ml乙酸鈉緩沖液(pH5.0)和酶。加入200μl2N鹽酸中止反應(yīng)。此后，通過離心除去沉淀。然后，定量測定通過轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)產(chǎn)生的5’-肌苷酸。在該標準反應(yīng)條件下每1分鐘產(chǎn)生1μmol5’-肌苷酸的酶量定為1個單位。使用5’-肌苷酸作為底物，在以下條件下測定磷酸單酯酶活性。反應(yīng)在30℃下進行10分鐘，在反應(yīng)溶液(1ml)中含有10μmol/ml5’-肌苷酸、100μmol/mlMES/NaOH緩沖液(pH6.0)和酶。加入200μl2N鹽酸中止反應(yīng)。此后，通過離心除去沉淀。然后，定量測定通過水解反應(yīng)產(chǎn)生的肌苷。在該標準反應(yīng)條件下每1分鐘產(chǎn)生1μmol肌苷的酶量定為1個單位。在以下條件下用高效液相層析(HPLC)分析肌苷和5’-肌苷酸。柱子Cosmosil5C18-AR(4.6×150mm)[由nacalaitesque生產(chǎn)]；流動相5mM磷酸鉀緩沖液(pH2.8)/甲醇＝95/5；流速1.0ml/min；溫度室溫；檢測UV245nm。順便說說，在用除肌苷外的核苷作為原料生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的反應(yīng)中，按照上述方法用HPLC分析作為原料的核苷和產(chǎn)生的核苷-5’-磷酸酯。實施例1得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的純化和表征將含有1g/dl胨、0.5g/dl酵母膏和1g/dl氯化鈉的營養(yǎng)培養(yǎng)基(pH7.0，50ml)注入坂口(Sakaguchi)燒瓶(500ml)中，在120℃下滅菌20分鐘。每個燒瓶用白金接種環(huán)接種一次摩氏摩根氏菌NCIMB10466斜面培養(yǎng)物，在30℃震蕩培養(yǎng)16小時。將通過離心從培養(yǎng)物收獲的微生物細胞(大約3,000g)懸浮在100mM磷酸鉀緩沖液(1L，pH7.0)中。在4℃下進行超聲處理20分鐘，以破碎微生物細胞。對處理后的懸浮液進行離心，以除去不溶部分。由此制備得到無細胞提取物。將硫酸銨加入無細胞提取物中，使得達到30％的飽和度。通過離心除去出現(xiàn)的沉淀，然后再將硫酸銨加入上清液中，使得達到60％的飽和度。通過離心收集出現(xiàn)的沉淀，將其溶于100mM磷酸鉀緩沖液中。該粗酶溶液對5L100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析4次，然后將其加到用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopeal650M柱(φ4.1×22cm)上，然后用800ml20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗滌。在通過柱子的一個部分中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)磷酸活性，從而回收該部分。將硫酸銨加入該部分中，使得達到35％的飽和度，將其吸附到用含有35％飽和度硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopeal柱(φ3.1×26cm)上。用磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中飽和度為35-20％的線性濃度梯度進行洗脫。收集活性部分，并對1L50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，然后加到用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的羥基磷灰石柱(φ5×6.5cm)上。用50-300mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性濃度梯度進行洗脫。收集活性部分，并進行超濾濃縮。將該酶溶液加到HiLoadTM16/60Superdex200柱上(由Pharmacia生產(chǎn))。用含有100mM氯化鈉的50mM磷酸鉀緩沖液，以1.0ml/min的流速進行洗脫。按照上述步驟，結(jié)果從無細胞提取物中純化出表現(xiàn)轉(zhuǎn)磷酸活性的酶，純化倍數(shù)為大約550倍，回收率大約為10％。該純化方法的比活和回收率示于表1中。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上，該酶樣是均一的。表1回收步驟總活性總蛋白比活回收率(單位)(mg)(單位/mg)(％)1.無細胞提取物597127,2000.0051002.硫酸銨分級分離568122,2100.00595(30-60％)3.DEAE-Toyopearl51736,4980.014874.Butyl-Toyopearl3941,1210.351665.羥基磷灰石112502.244196.Superdex20063242.63010純化的酶具有以下性質(zhì)。(1)作用將磷酸基團從諸如多磷酸等磷酸基團供體轉(zhuǎn)移到核苷上，產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯。相反地，該酶也表現(xiàn)出水解磷酸酯的活性。(2)底物專一性在轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)中用作磷酸基團供體的那些底物包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、苯磷酸二鈉、苯磷酸二鉀、鄰，鄰-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨和氨甲酰磷酸二鋰。作為磷酸基團受體的那些底物包括例如嘌呤核糖核苷、肌苷、鳥苷、腺苷、黃苷、尿苷和胞苷。另一方面，在磷酸酯水解反應(yīng)中受到作用的那些底物包括例如無機磷酸，諸如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等；磷酸酯，諸如苯磷酸二鈉、苯磷酸二鉀、鄰，鄰-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨和氨甲酰磷酸二鋰；以及5’-核苷酸，諸如5’-嘌呤核糖核苷酸、5’-肌苷酸、5’-鳥苷酸、5’-腺苷酸、5’-黃苷酸、5’-尿苷酸和5’-胞苷酸等。(3)最適pH5.2(轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng))，6.5(磷酸酯水解反應(yīng))。(4)pH穩(wěn)定性pH3.0-12.0(在30℃處理60分鐘)。(5)最適溫度大約35℃。(6)溫度穩(wěn)定性可穩(wěn)定至30℃(在pH7.0下處理30分鐘)。(7)加入金屬離子和抑制劑的效果加入任何金屬離子，該酶都不表現(xiàn)出與其活性有關(guān)的激活現(xiàn)象。該活性受Ag2+、Pb2+、Hg2+和Cu2+的抑制。該活性也受碘乙酸的抑制。(8)分子量按照高效液相層析(TSKgelG-3000SW，由ToyoSoda生產(chǎn))計算的分子量為大約190,000。(9)亞基分子量按照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳計算的亞基分子量為大約25,000。該酶不僅表現(xiàn)出將磷酸基團轉(zhuǎn)移到核苷的活性，而且表現(xiàn)出相反的水解磷酸酯的活性。此外，該酶表現(xiàn)出的磷酸酯水解活性(磷酸單酯酶活性)比轉(zhuǎn)磷酸活性高出的倍數(shù)不低于20倍。其它性質(zhì)與用屬于摩根氏菌屬細菌產(chǎn)生的已知酸性磷酸酶的那些性質(zhì)(Microbiology，140，1341-1350(1994))很好地吻合。因此，已經(jīng)闡明該酶為酸性磷酸酶。將焦磷酸鈉(10g/dl)和肌苷(2g/dl)溶于pH為5.5、5.0、4.5、4.0和3.5的乙酸鈉緩沖液中，加入上述酶樣，使達到50單位/dl的濃度。該反應(yīng)混合物在30℃下保溫6小時，同時保持每個pH；隨著時間的推移，測定產(chǎn)生的5-’肌苷酸的量。產(chǎn)生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本沒有觀察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副產(chǎn)物的產(chǎn)生。結(jié)果示于圖1中。5’-肌苷酸的生產(chǎn)速度在pH5.0下最大。然而，5’-肌苷酸最大積累量在較低pH下更高。在pH4.0下的反應(yīng)條件對5’-肌苷酸的生產(chǎn)最有效，其中通過進行3小時的反應(yīng)，5’-肌苷酸產(chǎn)生并積累的量為2.60g/dl。實施例2用得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶樣品進行的各種核苷的磷酸化反應(yīng)將焦磷酸鈉(10g/dl)和作為磷酸基團受體的肌苷、鳥苷、尿苷或胞苷(2g/dl)溶于乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入實施例1中制備的酶樣，使達到50單位/dl的濃度。該反應(yīng)混合物在30℃下保溫3小時，同時將pH保持在4.0。通過反應(yīng)產(chǎn)生的核苷-5’-酯的量示于表2中。產(chǎn)生的核苷酸只含有核苷-5’-酯。根本沒有觀察到核苷-2’-酯和核苷-3’-酯副產(chǎn)物的產(chǎn)生。表2核苷產(chǎn)物產(chǎn)量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸2.60鳥苷5’-鳥苷酸1.90尿苷5’-尿苷酸1.30胞苷5’-胞苷酸0.98實施例3用得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶樣品從作為磷酸基團供體的各種磷酸化合物生產(chǎn)5’-肌苷酸將肌苷(2g/dl)和作為磷酸基團供體的三聚磷酸鈉、多磷酸鈉(商品名PolygonP，由ChiyodaChemical生產(chǎn))、苯磷酸二鈉或氨甲酰磷酸二鈉(10g/dl)溶于乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入實施例1中制備的酶樣，使得其濃度為50單位/dl。該反應(yīng)混合物在30℃下保溫3小時，同時將pH保持在4.0。通過反應(yīng)產(chǎn)生的5’-肌苷酸的量示于表3中。使用任何磷酸基團供體，都有效地產(chǎn)生并積累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸鈉作為磷酸基團供體時，5’-肌苷酸的積累量最高。表3磷酸基團供體產(chǎn)生的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸鈉2.10多磷酸鈉2.72苯磷酸二鈉2.33氨甲酰磷酸二鈉2.54實施例4得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶的純化和表征將含有1g/dl胨、0.5g/dl酵母膏和1g/dl氯化鈉的營養(yǎng)培養(yǎng)基(pH7.0，50ml)注入坂口燒瓶(500ml)中，在120℃下滅菌20分鐘。每個燒瓶用白金接種環(huán)接種一次EsherichiablattaeJCM1650斜面培養(yǎng)物，在30℃震蕩培養(yǎng)16小時。通過離心從培養(yǎng)物收獲微生物細胞。將微生物細胞(大約3,300g)懸浮在100mM磷酸鉀緩沖液(1L，pH7.0)中。在4℃下進行超聲處理20分鐘，以破碎微生物細胞。對處理后的懸浮液進行離心，以除去其不溶部分。由此制備得到無細胞提取物。將硫酸銨加入無細胞提取物中，使得達到30％的飽和度。通過離心除去出現(xiàn)的沉淀，然后再將硫酸銨加入上清液中，使得達到60％的飽和度。通過離心收集出現(xiàn)的沉淀，將其溶于100mM磷酸鉀緩沖液中。該粗酶溶液對5L100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析4次，然后將其加到用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的DEAE-Toyopeal650M柱(φ6.2×35cm)上，然后用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗滌。在通過柱子的一個部分中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)磷酸活性，從而收集該部分。將硫酸銨加入該活性部分中，使得達到35％的飽和度，將其加到到用含有35％飽和度硫酸銨的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的Butyl-Toyopeal柱(φ5.0×22.5cm)上。用磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中飽和度為35-20％的線性濃度梯度進行洗脫。收集活性部分，并對1L100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)透析，然后加到用100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的羥基磷灰石柱(φ3.0×7.0cm)上。用50-100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的線性濃度梯度進行洗脫，并收集活性部分。該酶溶液對1L100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)透析，然后加到用10mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)平衡的CM-Toyopearl柱(φ2.0×14.0cm)上。用磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中含有0-300mM氯化鉀的線性濃度梯度進行洗脫。收集從柱子洗脫的活性部分。按照上述步驟，結(jié)果從無細胞提取物中純化出表現(xiàn)轉(zhuǎn)磷酸活性的酶，純化倍數(shù)為大約600倍，回收率大約為16％。該純化方法的比活和回收率示于表4中。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上，該酶樣品是均一的。表4步驟總活性總蛋白比活回收率(單位)(mg)(單位/mg)(％)1.無細胞提取物365160,6500.0021002.硫酸銨分級分離340138,8950.00293(30-60％)3.DEAE-Topopearl31830,4400.010874.Butyl-Topopearl2326610.347635.羥基磷灰石96961.000266.CM-Toyopearl59431.36516純化的酶具有以下性質(zhì)。(1)作用將磷酸基團從諸如多磷酸等磷酸基團供體轉(zhuǎn)移到核苷上，產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯。相反地，該酶也表現(xiàn)出水解磷酸酯的活性。(2)底物專一性在轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng)中作為磷酸基團供體的那些底物包括例如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸、苯磷酸二鈉、苯磷酸二鉀、鄰，鄰-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨和氨甲酰磷酸二鋰。作為磷酸基團受體的那些底物包括例如嘌呤核糖核苷、肌苷、鳥苷、腺苷、黃苷、尿苷和胞苷。另一方面，在磷酸酯水解反應(yīng)中受到作用的那些底物包括例如無機磷酸，諸如焦磷酸、三聚磷酸、三偏磷酸、四偏磷酸、六偏磷酸等；磷酸酯，諸如苯磷酸二鈉、苯磷酸二鉀、鄰，鄰-二苯磷酸酐、氨甲酰磷酸二鈉、氨甲酰磷酸二鉀、氨甲酰磷酸二銨和氨甲酰磷酸二鋰等；以及5’-核苷酸，諸如5’-嘌呤核糖核苷酸、5’-肌苷酸、5’-鳥苷酸、5’-腺苷酸、5’-黃苷酸、5’-尿苷酸和5’-胞苷酸。(3)最適pH5.2(轉(zhuǎn)磷酸反應(yīng))，6.5(磷酸酯水解反應(yīng))。(4)pH穩(wěn)定性pH3.5-12.0(在30℃處理60分鐘)。(5)最適溫度大約35℃。(6)溫度穩(wěn)定性可穩(wěn)定至40℃(在pH7.0下處理30分鐘)。(7)加入金屬離子和抑制劑的效果加入任何金屬離子，該酶都不表現(xiàn)出與其活性有關(guān)的激活現(xiàn)象。該活性受Fe2+、Ag2+、Pb2+、Hg2+和Cu2+的抑制。該活性也受碘乙酸的抑制。(8)分子量按照高效液相層析(TSKgelG-3000SW，由ToyoSoda生產(chǎn))計算的分子量為大約188,000。(9)亞基分子量按照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳計算的亞基分子量為大約24,500。該酶不僅表現(xiàn)出將磷酸基團轉(zhuǎn)移到核苷的活性，而且也表現(xiàn)出相反的水解磷酸酯的活性，其方式與從摩氏摩根氏菌NCIMB10466的無細胞提取物中純化的酶相似。此外，該酶表現(xiàn)出的磷酸酯水解活性(磷酸單酯酶活性)比轉(zhuǎn)磷酸活性高出的倍數(shù)不低于30倍。因此，已經(jīng)闡明該酶為酸性磷酸酶。將焦磷酸鈉(15g/dl)和肌苷(3g/dl)溶于pH為5.5、5.0、4.5、4.0和3.5的乙酸鈉緩沖液中，加入上述酶樣，使達到50單位/dl的濃度。該反應(yīng)混合物在30℃下保溫6小時，同時保持每個pH；隨著時間的推移，測定產(chǎn)生的5-’肌苷酸的量。產(chǎn)生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本沒有觀察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副產(chǎn)物的產(chǎn)生。結(jié)果示于圖2中。5’-肌苷酸的生產(chǎn)速度在pH5.0下最大。然而，5’-肌苷酸最大積累量在較低pH下更高。在pH4.0下的反應(yīng)條件對5’-肌苷酸的生產(chǎn)最有效。通過在30℃、pH4.0下進行3小時的反應(yīng)，5’-肌苷酸產(chǎn)生并積累的量為1.56g/dl。實施例5用得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶樣品進行的各種核苷的磷酸化反應(yīng)將焦磷酸鈉(15g/dl)和肌苷、鳥苷、尿苷或胞苷(3g/dl)溶于乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入實施例4中制備的酶樣，使得其濃度為50單位/dl。該反應(yīng)混合物在35℃下保溫3小時，同時將pH保持在4.0。產(chǎn)生的核苷-5’-酯的量示于表5中。產(chǎn)生的核苷酸只含有核苷-5’-酯。根本沒有觀察到核苷-2’-酯和核苷-3’-酯副產(chǎn)物的產(chǎn)生。表5核苷產(chǎn)物產(chǎn)量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸1.56鳥苷5’-鳥苷酸1.05尿苷5’-尿苷酸1.87胞苷5’-胞苷酸1.22實施例6用得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶樣品從作為磷酸基團供體的各種磷酸化合物生產(chǎn)5’-肌苷酸將肌苷(2g/dl)和作為磷酸基團供體的三聚磷酸鈉、多磷酸鈉(商品名PolygonP，由ChiyodaChemical生產(chǎn))、苯磷酸二鈉或氨甲酰磷酸二鈉(10g/dl)溶于乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入實施例4中制備的酶樣，使得其濃度為50單位/dl。該反應(yīng)混合物在35℃下保溫3小時，同時將pH保持在4.0。產(chǎn)生的5’-肌苷酸的量示于表6中。使用任何磷酸基團供體，都有效地產(chǎn)生并積累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸鈉作為磷酸基團供體時，5’-肌苷酸的積累量最高。表6磷酸基團供體產(chǎn)生的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸鈉1.20多磷酸鈉1.79苯磷酸二鈉1.50氨甲酰磷酸二鈉1.53實施例7摩氏摩根氏菌染色體的酸性磷酸酶編碼基因的分離(1)N-末端氨基酸順序的測定將按照實施例1描述的方法從摩氏摩根氏菌NCIMB10466無細胞提取物中純化的酸性磷酸酶，吸附到DITC膜(由Milligen/Biosearoh生產(chǎn))上，用Prosequencer6625(由Milligen/Biosearch生產(chǎn))測定其N-末端氨基酸順序。確定了順序表SEQIDNO1中所示一個包含20個殘基的N-末端氨基酸順序。(2)含有酸性磷酸酶編碼基因的DNA片斷的分離按照Murray和Thomson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，從培養(yǎng)的摩氏摩根氏菌NCIMB10466微生物細胞中提取染色體DNA。用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分降解染色體DNA。此后，借助于蔗糖密度梯度離心分離3-6kbp的DNA片斷。質(zhì)粒載體pUC118(由TakaraShuzo生產(chǎn))用限制性內(nèi)切酶BamHI降解，將其與部分降解的染色體DNA片斷連接。用DNA連接藥盒(由TakaraShuzo生產(chǎn))按照指定的方法進行DNA連接。此后，按照常規(guī)方法，用獲得的DNA混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由TakaraShuzo生產(chǎn))。轉(zhuǎn)化體在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上鋪平板，讓其生長以制備基因文庫。將含有4mM對硝基苯磷酸和100mMMES/NaOH緩沖液(pH6.5)的反應(yīng)溶液倒在轉(zhuǎn)化體生長的瓊脂培養(yǎng)基上，將溫度保持在30℃15分鐘。表達磷酸酶活性的菌株釋放對硝基酚并表現(xiàn)出黃色。因此，用該現(xiàn)象作為指標篩選轉(zhuǎn)化體。篩選了一個包含大約20,000個轉(zhuǎn)化體菌株的基因表達文庫，結(jié)果獲得30個表達磷酸酶活性的轉(zhuǎn)化體菌株。表達磷酸酶活性的轉(zhuǎn)化體(30個菌株)經(jīng)過單克隆分離。將單克隆培養(yǎng)在含有100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基(2.5ml)上，讓其在37℃培養(yǎng)16小時。將含有肌苷(2g/dl)和焦磷酸鈉(10g/dl)的乙酸鈉緩沖液(100mM，pH5.0，50μl)加入從培養(yǎng)物中收獲的微生物細胞中，反應(yīng)混合物在30℃保溫16小時。通過HPLC分析檢測5’-肌苷酸的生產(chǎn)，以篩選具有轉(zhuǎn)磷酸活性的微生物菌株。結(jié)果，我們成功地獲得5個轉(zhuǎn)化體，它們表現(xiàn)出轉(zhuǎn)磷酸活性，并假定包含含有目的酸性磷酸酶基因的DNA片斷。實施例8得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因核苷酸順序的測定按照堿裂解法(MolecularCloning2ndedition(J.Sambrook，E.F.FritschandT.Maniatis，ColdSpringHarbourLaboratoryPress，pl.25(1989))，從實施例7獲得的、假定包含含有酸性磷酸酶基因(得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466)的DNA片斷的一個轉(zhuǎn)化體菌株制備質(zhì)粒，分析插入的DNA片斷。該質(zhì)粒命名為pMPI501。圖3顯示了測定的插入DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖譜。通過亞克隆進一步具體測定酸性磷酸酶基因區(qū)。結(jié)果顯示，該酸性磷酸酶基因包含在用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI剪切的大小為1.2kbp的片斷上。因此為了測定該核苷酸順序，構(gòu)建一個質(zhì)粒DNA，將1.2kbp片斷與用HindIII和EcoRI降解的pUC118連接。按照常規(guī)方法，用命名為pMPI505的該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由TakaraShuzo生產(chǎn))，將其在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基鋪平板，以獲得轉(zhuǎn)化體。按照堿裂解法，從包含pMPI505的大腸桿菌JM109(由TakaraShuzo生產(chǎn))的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，測定核苷酸順序。按照Sanger的方法(J.Mol.Biol.，143，161(1980))，用TaqDyeDeoxy末端循環(huán)測序藥盒(由AppliedBiochemical生產(chǎn))測定核苷酸順序。一個測定的開放閱讀框架的核苷酸順序示于順序表的SEQIDNO2中。從該核苷酸順序得出的蛋白質(zhì)氨基酸順序示于順序表的SEQIDNO3中。在該氨基酸順序中發(fā)現(xiàn)一個與純化酶N-末端氨基酸順序完全吻合的部分順序。純化酶的N-末端從SEQIDNO3中所示順序的第21位丙氨酸殘基開始。因此，我們假定SEQIDNO3中所示的氨基酸順序為前體蛋白的氨基酸順序，并且包含從第1位甲硫氨酸殘基至第20位丙氨酸殘基區(qū)域的多肽在翻譯后被去除。由此得出的成熟蛋白的氨基酸順序示于順序表的SEQIDNO4中。從該氨基酸順序估計的成熟蛋白的分子量計算為24.9千道爾頓，它與純化酶的SDS-PAGE結(jié)果很好地吻合。按照上述結(jié)果，由于包含含該片斷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出轉(zhuǎn)磷酸活性，鑒定該開放閱讀框架為目的酸性磷酸酶的編碼區(qū)。分別比較核苷酸順序和氨基酸順序與已知順序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的數(shù)據(jù)庫。結(jié)果揭示出，順序表的SEOIDNO2中所示的核苷酸順序與得自摩氏摩根氏菌的已知酸性磷酸酶基因的核苷酸順序(Thaller，M.C.等人，Microbiology，140，1341(1994))吻合，只是在后者中，第54位G為A，第72位G為A，第276位T為G，第378位T為C，第420位G為T，第525位C為G，第529位C為T和第531位G為A，并且順序表的SEQIDNO4中所示的氨基酸順序與得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的氨基酸順序相同。即包含順序表SEQIDNO4中所示氨基酸順序的蛋白質(zhì)的編碼基因為摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因。前體蛋白包含249個氨基酸，從其順序得出的蛋白質(zhì)的分子量為27.0千道爾頓。用質(zhì)粒pMPI505轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株命名為AJ13143，已經(jīng)于1996年2月23日在布達佩斯條約下，在工業(yè)科學技術(shù)局的國家生命科學和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)進行了國際儲藏，給予的儲藏號為FERMBP-5422。實施例9通過表達得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466的酸性磷酸酶基因放大活性將實施例8中構(gòu)建的大腸桿菌JM109/pMPI505接種在含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的L培養(yǎng)基(50ml)中，在37℃下培養(yǎng)16小時。通過離心從其培養(yǎng)物中收獲微生物細胞，用生理鹽水洗滌1次。將微生物細胞懸浮于100mM磷酸鉀緩沖液(5ml，pH7.2)中，通過在4℃下進行20分鐘的超聲處理破碎細胞。將處理后的溶液離心，以除去不溶部分，由此制備得到無細胞提取物。測定獲得的無細胞提取物的轉(zhuǎn)磷酸活性，而使用的對照為從摩氏摩根氏菌野生型菌株和用質(zhì)粒pUC118按照上述相同方法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109制備的無細胞提取物。結(jié)果示于表7中。在大腸桿菌JM109/pUC118中沒有檢測到轉(zhuǎn)磷酸活性。在摩氏摩根氏菌野生型菌株中轉(zhuǎn)磷酸活性也很低。另一方面，大腸桿菌JM109/pMPI505表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)磷酸活性，其比活為摩氏摩根氏菌野生型菌株的150倍。按照該結(jié)果，證明導(dǎo)入的DNA片斷使大腸桿菌高水平地表達酸性磷酸酶。表7微生物菌株轉(zhuǎn)磷酸活性(單位/mg)摩氏摩根氏菌NCIMB104660.008大腸桿菌JM109/pUC118未檢測到大腸桿菌JM109/pMPI5051.250實施例11Esherichiablattae染色體的酸性磷酸酶編碼基因的分離(1)N-末端氨基酸順序的測定將從EsherichiablattaeJCM1650無細胞提取物中純化的酸性磷酸酶，吸附到DITC膜(由Milligen/Biosearch生產(chǎn))上，用Prosequencer6625(由Milligen/Biosearch生產(chǎn))測定其N-末端氨基酸順序。確定了順序表SEQIDNO8中所示的一個包含15個殘基的N-末端氨基酸順序。(2)含有酸性磷酸酶編碼基因的DNA片斷的分離按照Murray和Thmoson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，從培養(yǎng)的EsherichiablattaeJCM1650細胞中提取染色體DNA。用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分降解染色體DNA。此后，用蔗糖密度梯度離心分離3-6kbp的DNA片斷。質(zhì)粒載體pUC118(由TakaraShuzo生產(chǎn))用限制性內(nèi)切酶BamHI降解，將其與部分降解的染色體DNA片斷連接。用DNA連接藥盒(由TakaraShuzo生產(chǎn))按照指定方法進行DNA連接。此后，按照常規(guī)方法，用獲得的DNA混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由TakaraShuzo生產(chǎn))。轉(zhuǎn)化體在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基鋪平板，讓其生長以制備基因文庫。將含有4mM對硝基苯磷酸和100mMMES/NaOH緩沖液(pH6.5)的反應(yīng)溶液倒在轉(zhuǎn)化體生長的瓊脂培養(yǎng)基表面上，將溫度保持在30℃15分鐘。表達磷酸酶活性的菌株釋放對硝基酚并表現(xiàn)出黃色。因此，用該現(xiàn)象作為指標篩選轉(zhuǎn)化體。篩選了一個包含大約8,000個轉(zhuǎn)化體菌株的染色體基因表達文庫，結(jié)果獲得14個表達磷酸酶活性的轉(zhuǎn)化體菌株。表達磷酸酶活性的轉(zhuǎn)化體(14個菌株)經(jīng)過單克隆分離。將單克隆培養(yǎng)在含有100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基(2.5ml)上，讓其在37℃培養(yǎng)16小時。將含有肌苷(2g/dl)和焦磷酸鈉(10g/dl)的乙酸鈉緩沖液(100mM，pH5.0，50μl)加入從培養(yǎng)液中收獲的微生物細胞中，在30℃進行16小時的反應(yīng)。通過HPLC分析檢測5’-肌苷酸的生產(chǎn)，以篩選具有轉(zhuǎn)磷酸活性的菌株。結(jié)果，我們成功地獲得3個轉(zhuǎn)化體，它們表現(xiàn)出轉(zhuǎn)磷酸活性，并假定包含含目的酸性磷酸酶基因的DNA片斷。實施例12得自EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因核苷酸順序的測定按照堿裂解法，從實施例11獲得的、假定包含含酸性磷酸酶基因(得自EsherichiablattaeJCM1650)的DNA片斷的一個轉(zhuǎn)化體菌株中提取質(zhì)粒，分析插入的DNA片斷。該質(zhì)粒命名為pEPI301。圖5顯示了測定的插入DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖譜。通過亞克隆進一步具體測定酸性磷酸酶基因區(qū)。結(jié)果顯示，該酸性磷酸酶基因包含在用限制性內(nèi)切酶ClaI和BamHI剪切的、大小為2.4kbp的片斷上。因此為了測定該核苷酸順序，構(gòu)建質(zhì)粒DNA，其中將該片斷與用ClaI和BamHI降解的pBluescriptKS(+)(由Stratagene生產(chǎn))連接。按照常規(guī)方法，用命名為pEPI305的該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由TakaraShuzo生產(chǎn))，將其在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基鋪平板，以獲得轉(zhuǎn)化體。按照堿裂解法，從包含pEPI305的大腸桿菌JM109(由TakaraShuzo生產(chǎn))轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，測定核苷酸順序。一個測定的開放閱讀框架的核苷酸順序示于順序表的SEQIDNO6中。從該核苷酸順序得出的蛋白質(zhì)的氨基酸順序示于順序表的SEQIDNO7中。在該氨基酸順序中發(fā)現(xiàn)一個與純化酶N-末端氨基酸順序完全吻合的部分順序。純化酶的N-末端從SEQIDNO7中所示順序的第19位亮氨酸殘基開始。因此，我們假定SEQIDNO7中所示的氨基酸順序為前體蛋白質(zhì)的氨基酸順序，并且包含從第1位甲硫氨酸殘基至第18位丙氨酸殘基區(qū)域的多肽在翻譯后被去除。由此推測的成熟蛋白的氨基酸順序示于順序表的SEQIDNO8中。因此，估計的成熟蛋白的分子量計算為25.1千道爾頓，它與純化酶的SDS-PAGE結(jié)果很好地吻合。按照上述結(jié)果，由于包含含該片斷的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出轉(zhuǎn)磷酸活性，因此鑒定該開放閱讀框架為目的酸性磷酸酶的編碼區(qū)。即包含順序表ESQIDNO8中所示氨基酸順序的蛋白質(zhì)編碼基因為EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因。分別比較核苷酸順序和氨基酸順序與已知順序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的數(shù)據(jù)庫。結(jié)果，揭示出順序表的SEQIDNO8中所示的蛋白質(zhì)與編碼它的DNA是新的。該基因編碼的前體蛋白包含249個氨基酸，由其順序得出的蛋白質(zhì)的分子量為27.0千道爾頓。分別比較氨基酸順序與已知順序的同源性。結(jié)果，該蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與斯托氏普羅威登斯菌的酸性磷酸酶、實施例8中的摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶和鼠傷寒沙門氏菌的酸性磷酸酶的高度同源性，同源性分別為77.1％、77.1％和44.3％。用質(zhì)粒pEPI305轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109菌株命名為AJ13144，已經(jīng)于1996年2月23日在布達佩斯條約下，在工業(yè)科學技術(shù)局的國家生命科學和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)進行了國際儲藏，給予的儲藏號為FERMBP-5423。實施例13通過表達得自EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因放大活性將實施例12中構(gòu)建的大腸桿菌JM109/pEPI305接種在含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的L培養(yǎng)基(50ml)中，在37℃下培養(yǎng)16小時。通過離心從其培養(yǎng)物中收獲微生物細胞，用生理鹽水洗滌1次。將微生物細胞懸浮于100mM磷酸鉀緩沖液(5ml，pH7.2)中，通過在4℃下進行20分鐘的超聲處理破碎細胞。將處理后的溶液離心，以除去不溶部分，由此制備得到無細胞提取物。測定獲得的無細胞提取物的轉(zhuǎn)磷酸活性，而使用的對照為從Esherichiablattae野生型菌株和用質(zhì)粒pBluescriptKS(+)按照上述相同方法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109中制備的無細胞提取物。結(jié)果示于表8中。在大腸桿菌JM109/pBluescriptKS(+)中沒有檢測到轉(zhuǎn)磷酸活性。在Esherichiablattae野生型菌株中轉(zhuǎn)磷酸活性也很低。另一方面，大腸桿菌JM109/pEPI305表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)磷酸活性，其比活為Esherichiablattae野生型菌株的120倍。按照該結(jié)果，證明導(dǎo)入的DNA片斷使大腸桿菌高水平地表達酸性磷酸酶。表8微生物菌株轉(zhuǎn)磷酸活性(單位/mg)EsherichiablattaeJCM16500.002大腸桿菌JM109/pBluescriptKS(+)未檢測到大腸桿菌JM109/pEPI3050.264實施例14用包含得自EsherichiablattaeJCM1650的酸性磷酸酶基因的菌株從肌苷生產(chǎn)5’-肌苷酸將焦磷酸鈉(12g/dl)和肌苷(6g/dl)溶于100mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入上述大腸桿菌JM109/pEPI305的微生物細胞，使轉(zhuǎn)化為微生物細胞干重時的細胞濃度為200mg/dl。反應(yīng)混合物在35℃下保溫10小時，同時將pH保持在4.0；隨著時間的推移，測定產(chǎn)生的5’-肌苷酸的量。產(chǎn)生的肌苷酸只含有5’-肌苷酸。根本沒有觀察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副產(chǎn)物的生產(chǎn)。結(jié)果示于圖6中。在短時間內(nèi)，用該微生物在從焦磷酸鹽和肌苷產(chǎn)生5’-肌苷酸的反應(yīng)中，非常高效地生產(chǎn)和積累5’-肌苷酸。實施例15磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶編碼基因的制備正如實施例13和實施例14所描述的，包含得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶基因的菌株表達相當大量的酸性磷酸酶，并且在短時間內(nèi)，在用該微生物從焦磷酸鹽和肌苷生產(chǎn)5’-肌苷酸的反應(yīng)中，非常高效地生產(chǎn)和積累5’-肌苷酸。然而，它揭示出5’-肌苷酸的積累量不超過一定程度，因為該酸性磷酸酶本身具有的磷酸單酯酶活性，使生產(chǎn)的5’-肌苷酸降解。因此，試圖按照用PCR定位點誘變的方法，將突變導(dǎo)入實施例11克隆的得自Esherichiablattae的該酸性磷酸酶基因中，改進該酶。使用DNA合成儀(由AppliedBiosystems生產(chǎn)的394型)，按照磷酰胺化物法，分別合成順序表的SEQIDNO9、10和11中所示的寡核苷酸MUT300、MUT310和MUT320。將在實施例12中制備的、作為模板的質(zhì)粒pEPI305、作為引物的M13引物RV(由TakaraShuzo生產(chǎn))和MUT310寡核苷酸(每種2.5μmol)以及TaqDNA聚合酶(2.5單位，由TakaraShuzo生產(chǎn))加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每種200μM)、氯化鉀(50mM)和氯化鎂(1.5mM)的100mMTris-HCl緩沖液(pH8.3，100μl)中，進行PCR反應(yīng)，其中一個循環(huán)包括在94℃下30秒、在55℃下2分鐘和在72℃下3分鐘，重復(fù)該循環(huán)25次。使用PJ2000型熱循環(huán)儀(由TakaraShuzo生產(chǎn))進行PCR反應(yīng)。此外，以上述相同方式，用質(zhì)粒pEPI305(1ng)作為模板、M13引物M3(由TakaraShuzo生產(chǎn))和MUT300寡核苷酸(每種2.5μmol)作為引物進行PCR反應(yīng)。每種反應(yīng)溶液通過用Microspin柱S-400(由Pharmacia生產(chǎn))進行凝膠過濾純化，以除去引物。將每種PCR反應(yīng)產(chǎn)物(1μl)加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每種200μM)、氯化鉀(50mM)和氯化鎂(1.5mM)的100mMTris-HCl緩沖液(pH8.3，95μl)中，將其在94℃加熱10分鐘，然后在60分鐘內(nèi)冷卻至37℃。此后，將溫度保持在37℃15分鐘，形成異源雙鏈。加入TaqDNA聚合酶(2.5單位)，在72℃下反應(yīng)3分鐘，使得完成異源雙鏈。此后，將M13引物RV和M13引物M3(每種2.5μmol)加入該反應(yīng)溶液中，進行PCR反應(yīng)，其中一個周期包括在94℃下30秒、在55℃下2分鐘和在72℃下3分鐘，重復(fù)10次周期。將第二個PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用ClaI和BamHI降解，然后用苯酚/氯仿抽提，然后進行乙醇沉淀。將該DNA片斷與用ClaI和BamHI降解的pBluescriptKS(+)連接。按照常規(guī)方法，用獲得的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由TakaraShuzo生產(chǎn))，將其在含有100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上鋪平板，以獲得轉(zhuǎn)化體。按照堿裂解法，從轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，以測定其核苷酸順序，證實目的核苷酸被替代。由此制備編碼突變型磷酸酶的突變型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸殘基(GGG)用天冬氨酸殘基(G*A*T)替代。含有該突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI310。按照上述相同的方式，用pEPI305作為模板，MUT300和MUT320寡核苷酸作為引物，制備編碼突變型磷酸酶的突變型基因，其中成熟蛋白的第153位異亮氨酸殘基(ATC)用蘇氨酸殘基(A*CC)替代。含有該突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI320。此外，按照上述相同的方式，用pEPI310作為模板，MUT300和MUT320寡核苷酸作為引物，制備編碼突變型磷酸酶的突變型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸殘基(GGG)用天冬氨酸殘基(G*A*T)替代，而第153位異亮氨酸殘基(ATC)用蘇氨酸殘基(A*CC)替代。含有該突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI330。將已導(dǎo)入含有相應(yīng)突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI310、大腸桿菌JM109/pEP1320和大腸桿菌JM109/pEPI330，以及已導(dǎo)入含野生型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI305接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的L培養(yǎng)基(50ml)中，在37℃培養(yǎng)16小時。從它們的培養(yǎng)物中收獲微生物細胞，用生理鹽水洗滌1次。將微生物細胞懸浮于100mM磷酸鉀緩沖液(5ml，pH7.0)中，通過在4℃下超聲處理20分鐘破碎細胞。離心處理后的溶液，以除去不溶部分，由此制備得到無細胞提取物。在pH4.0下測定獲得的無細胞提取物的磷酸單酯酶活性和轉(zhuǎn)磷酸活性，將它們與野生型菌株的活性進行比較。表9表明野生型酸性磷酸酶和磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶的磷酸單酯酶活性和轉(zhuǎn)磷酸活性的測定結(jié)果。它表明，與野生型酸性磷酸酶相比，磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶的磷酸單酯酶活性和轉(zhuǎn)磷酸活性都降低，并且磷酸單酯酶活性的降低程度大于轉(zhuǎn)磷酸活性的降低程度，結(jié)果，與野生型酸性磷酸酶相比，突變型酸性磷酸酶的磷酸單酯酶活性與轉(zhuǎn)磷酸活性之比降低。表9質(zhì)粒磷酸單酯酶活性轉(zhuǎn)磷酸活性比值1)(單位/mg)(單位/mg)(相對值)pEPI3052.380.13218.03(100)pEPI3100.260.01913.68(76)pEPI3200.880.1237.15(39)pEPI3300.420.0706.00(33)1)磷酸單酯酶活性與產(chǎn)生核苷-5’-磷酸酯活性之比實施例16用包含磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶編碼基因的菌株從肌苷生產(chǎn)5’-肌苷酸將已導(dǎo)入含有磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶編碼基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI310、大腸桿菌JM109/pEPI320和大腸桿菌JM109/pEPI330，以及已導(dǎo)入含野生型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI305接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的L培養(yǎng)基(50ml)中，在37℃培養(yǎng)16小時。將焦磷酸鈉(12g/dl)和肌苷(6g/dl)溶于乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入通過上述培養(yǎng)獲得的每種大腸桿菌菌株的微生物細胞，使轉(zhuǎn)化為微生物細胞干重時的細胞濃度為200mg/dl。反應(yīng)混合物在35℃下保溫32小時，同時將pH保持在4.0；隨著時間的推移，測定產(chǎn)生的5’-肌苷酸的量。結(jié)果示于圖7中。在圖7中，縱坐標軸表示5’-肌苷酸的濃度(mg/dl)，而橫坐標軸表示反應(yīng)時間(h)。對于用相應(yīng)的菌株細胞測定的反應(yīng)進程，大腸桿菌JM109/pEPI305用實心圓表示，大腸桿菌JM109/pEPI310用實心三角表示，大腸桿菌JM109/pEPI320用空心圓表示，而大腸桿菌JM109/pEPI330用空心方塊表示。在用包含磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶的菌株從肌苷生產(chǎn)5’-肌苷酸的反應(yīng)中，生產(chǎn)的5’-肌苷酸的降解速度降低。結(jié)果，5’-肌苷酸的產(chǎn)量和積累量都增加了。大腸桿菌JM109/pEPI330表現(xiàn)出最高積累量的5’-肌苷酸，該菌株包含磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶的編碼基因，其中第74位甘氨酸殘基和第153位異亮氨酸殘基分別用天冬氨酸殘基和蘇氨酸殘基替代。實施例17用包含磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶編碼基因的菌株生產(chǎn)各種核苷-5’-磷酸酯將已導(dǎo)入含有磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶編碼基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI330接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的L培養(yǎng)基(50ml)中，在37℃培養(yǎng)16小時。將焦磷酸鈉(12g/dl)和作為磷酸基團受體的肌苷、鳥苷、尿苷或胞苷(6g/dl)溶于100mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入上述微生物細胞中，使轉(zhuǎn)化為細胞干重時的細胞濃度為200mg/dl。反應(yīng)混合物在35℃下保溫32小時，同時將pH保持在4.0。生產(chǎn)的核苷-5’-磷酸酯的量示于表10中。產(chǎn)生的核苷酸只含有核苷-5’-磷酸酯。根本沒有觀察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副產(chǎn)物的生產(chǎn)。表10核苷產(chǎn)物產(chǎn)量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸7.45鳥苷5’-鳥苷酸4.77尿苷5’-尿苷酸8.93胞苷5’-胞苷酸6.60實施例18用包含磷酸單酯酶活性較低的酸性磷酸酶編碼基因的菌株從作為磷酸基團供體的各種磷酸化合物生產(chǎn)5’-肌苷酸將已導(dǎo)入含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI330接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的L培養(yǎng)基(50ml)中，在37℃培養(yǎng)16小時。將肌苷(6g/dl)和作為磷酸基團供體的三聚磷酸鈉、多磷酸鈉(商品名PolygonP，由ChiyodaChemical生產(chǎn))、苯磷酸二鈉或氨甲酰磷酸二鈉(12g/dl)溶于100mM乙酸鈉緩沖液(pH4.0)中，加入上述微生物細胞中，使轉(zhuǎn)化為細胞干重時的細胞濃度為200mg/dl。反應(yīng)混合物在35℃下保溫32小時，同時將pH保持在4.0。生產(chǎn)的5’-肌苷酸的量示于表11中。使用任何磷酸基團供體，都有效地產(chǎn)生并積累5’-肌苷酸。然而，使用多磷酸作為磷酸基團供體時，5’-肌苷酸的積累量最高。表11磷酸基團供體生產(chǎn)的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸鈉5.96多磷酸鈉8.84苯磷酸二鈉7.60氨甲酰磷酸二鈉7.73實施例19對得自EsherichiablattaeJCM1650的新突變型酸性磷酸酶基因的產(chǎn)生和該突變型酸性磷酸酶基因的酶學性質(zhì)的研究在實施例19-22中，在以下條件下，測定對核苷的轉(zhuǎn)磷酸活性。用含40μmol/ml肌苷、100μmol/ml焦磷酸鈉、100μmol/ml乙酸鈉緩沖液(pH4.0)和酶的1ml反應(yīng)溶液，在30℃、pH4.0下進行10分鐘的反應(yīng)。加入200μl2N鹽酸中止該反應(yīng)。然后，通過離心除去沉淀，在上述條件下，測定通過轉(zhuǎn)磷酸生成的5’-肌苷酸的量。在這些標準反應(yīng)條件下，生產(chǎn)1μmol肌苷酸的酶量定義為1單位。此外，將肌苷濃度從10μmol/ml變?yōu)?00μmol/ml，在上述組成的反應(yīng)條件下測定轉(zhuǎn)磷酸活性，使用Hanes-Woolf作圖法[Biochem.J.，26,1406(1932)]測定轉(zhuǎn)磷酸活性中肌苷的速度常數(shù)。按照以下所述，對實施例15中所述的用來提高核苷-5’-磷酸酯的產(chǎn)量的突變型酶進行詳細分析。隨后發(fā)現(xiàn)，突變型酶對核苷的親和性野生型酶的對核苷親和性，提高了2倍。因此，本發(fā)明人認為，通過增加上述酶對核苷的親和性，可以提高核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)率，通過遺傳工程技術(shù)，進一步修飾該酶。使用實施例15所述的含有得自Esherichiablattae的野生型酸性磷酸酶編碼基因的質(zhì)粒pEPI305，通過遺傳工程技術(shù)將位點專一性突變導(dǎo)入該質(zhì)粒DNA中，產(chǎn)生編碼突變型酸性磷酸酶的基因。pEPI305為通過將用限制性內(nèi)切酶ClaI和BamHI剪切并含有得自blattae埃希氏桿菌JCM6150野生型酸性磷酸酶編碼基因的2.4KbpDNA片斷連接到用ClaI和BamHI剪切的pBluescriptKS(+)(由Stratagene供應(yīng))上形成的質(zhì)粒DNA。該酸性磷酸酶編碼基因的堿基順序由順序表的SEQIDNO6表示。此外，由該堿基順序得出的前體蛋白的氨基酸順序由順序表的SEQIDNO7表示。從純化酶(實施例4中描述的)分析結(jié)果，推測出成熟蛋白的氨基酸順序，用順序表的SEQIDNO8表示。使用DNA合成儀(由AppliedBiosystem供應(yīng)的394型)，用磷酰胺化物法合成具有順序表中所示順序的寡核苷酸MUT300(順序表的SEQIDNO9)、MUT310(順序表的SEQIDNO10)、MUT320(順序表的SEQIDNO11)、MUT330(順序表的SEQIDNO12)、MUT340(順序表的SEQIDNO13)、MUT350(順序表的SEQIDNO14)、MUT360(順序表的SEQIDNO15)、MUT370(順序表的SEQIDNO16)、MUT380(順序表的SEQIDNO17)和MUT390(順序表的SEQIDNO18)。將作為模板的1ngpEPI305、2.5μmolM13引物RV(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供應(yīng))、2.5μmol寡核苷酸MUT310和2.5單位TaqDNA聚合酶(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供應(yīng))加入含有200μMdATP、200μMdCTP、200μMdGTP、200μMdTTP、50mM氯化鉀和1.5mM氯化鎂的100μlTris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中。進行PCR，其中三步步驟-即在94℃下30秒、在55℃下2分鐘和在72℃下3分鐘，重復(fù)25次。在該反應(yīng)中，使用PJ2000型熱循環(huán)器(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供應(yīng))。另外，用1ngpEPI305作為模板、2.5μmolM13引物M3(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供應(yīng))作為引物和2.5μmol寡核苷酸MUT300同樣進行PCR。通過用Microspin柱S-400(由Pharmacia供應(yīng))進行凝膠過濾純化每種反應(yīng)溶液，以除去引物。將1μl每種PCR溶液加入含有200μMdATP、200μMdCTP、200μMdGTP、200μMdTTP、50mM氯化鉀和1.5mM氯化鎂的95μl100mMTris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中。將混合物在94℃加熱10分鐘，然后在60分鐘內(nèi)冷卻至37℃，在37℃保溫15分鐘，以形成異源雙鏈。加入2.5單位TaqDNA聚合酶，在72℃下反應(yīng)3分鐘，以完成異源雙鏈。隨后，將2.5μmolM13引物RV和2.5μmolM13引物M3加入該反應(yīng)溶液中，進行PCR反應(yīng)，其中三步步驟-即在94℃下30秒、在55℃下2分鐘和在72℃下3分鐘，重復(fù)10次。將第二個PCR產(chǎn)物用ClaI和BamHI剪切，然后用苯酚和氯仿的混合物抽提，用乙醇沉淀。將該DNA片斷連接到用ClaI和BamHI剪切的pBluescriptKS(+)上。用常規(guī)方法，用所得的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(由TakaraShuzoCo.，Ltd.供應(yīng))。將其在含有100μg/ml的氨芐青霉素的L瓊脂培養(yǎng)基上鋪平板，以獲得轉(zhuǎn)化體。用堿細菌裂解法從轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，測定堿基順序，鑒定出目的堿基已被替代。用Sanger等人的方法[J.Mol.Biol.，143，161(1980)]，用TaqDyeDeoxyTerminatorCycle測序藥盒(由AppliedBiochemical供應(yīng))進行堿基順序的測定。這樣，產(chǎn)生編碼突變型磷酸酶的突變型基因，其中成熟蛋白的第74位甘氨酸殘基(GGG)用天冬氨酸殘基(G*A*T)替代。該含突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI310(實施例15)。用已導(dǎo)入突變的質(zhì)粒作為模板重復(fù)上述步驟，以累積性地導(dǎo)入位點專一性突變。用堿細菌裂解法從轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒，測定堿基順序，鑒定出目的堿基已被替代。所得的編碼突變型磷酸酶的突變型基因和突變位點示于表12中。突變位點中的氨基酸殘基表示用SEQIDNO8表示的成熟蛋白的氨基酸順序中的一個氨基酸殘基。表12<p>導(dǎo)入含突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI330、大腸桿菌JM109/pEPI340、大腸桿菌JM109/pEPI350、大腸桿菌JM109/pEPI360、大腸桿菌JM109/pEPI370、大腸桿菌JM109/pEPI380、大腸桿菌JM109/pEPI390和大腸桿菌JM109/pEPI400以及已導(dǎo)入含有野生型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI305中的每一種接種到含有100μg/ml的氨芐青霉素和1mMIPTG的50mlL培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。通過離心，從每個菌株的2L培養(yǎng)液中收集細胞，用生理鹽水溶液洗滌1次。將細胞懸浮于50ml100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，在4℃下超聲處理20分鐘以破碎細胞。離心如此處理的溶液，以除去不溶部分，制備無細胞提取物。用實施例4描述的方法，從每種無細胞提取物中純化每種酸性磷酸酶。每種酶產(chǎn)物在SDS-聚丙烯酰胺電泳中都是均一的。測定純化的突變型酸性磷酸酶和野生型酸性磷酸酶轉(zhuǎn)磷酸中的肌苷速度常數(shù)，結(jié)果示于表13中。我們發(fā)現(xiàn)，在實施例15中描述的、在大腸桿菌JM109/pEPI330中表達的提高核苷-5’-磷酸酯生產(chǎn)率的突變型酶，其Vmax降低，但它對肌苷的Km值大大降低，這意味著與在大腸桿菌JM109/pEPI305中表達的野生型酶相比，它對肌苷的親和性增加2倍或2倍以上。這暗示著，該突變型酶的核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)率大大提高，其原因不僅是因為其核苷酸酶活性降低，而且因為它對核苷的親和性提高-這是一個重要因素。因此，我們預(yù)期，對核苷的親和性提高導(dǎo)致生產(chǎn)率的提高。在已導(dǎo)入本實施例中產(chǎn)生的新突變型酶基因的大腸桿菌JM109中表達的新突變型酶表現(xiàn)出對核苷的親和性比在實施例15中描述的大腸桿菌JM109/pEPI330中表達酶的親和性更高。因此，我們預(yù)計核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)率提高。此外，在大腸桿菌JM109/pEPI380中表達的突變型酶與野生型酶相比，不僅提高了對核苷的親和性，而且也提高了Vmax值。另外，我們預(yù)計核苷-5’-磷酸酯的生產(chǎn)率提高。表13具有酶的菌株Km(mM)Vmax(單位/mg)大腸桿菌JM109/pEPI3052021.83大腸桿菌JM109/pEPI3301091.39大腸桿菌JM109/pEPI340851.03大腸桿菌JM109/pEPI350850.93大腸桿菌JM109/pEPI360551.33大腸桿菌JM109/pEPI370421.15大腸桿菌JM109/pEPI380422.60大腸桿菌JM109/pEPI390422.58大腸桿菌JM109/pEPI400432.11實施例20用含新的突變型酸性磷酸酶基因的菌株生產(chǎn)5’-肌苷酸將已導(dǎo)入含有突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI330、大腸桿菌JM109/pEPI340、大腸桿菌JM109/pEPI360、大腸桿菌JM109/pEPI370和大腸桿菌JM109/pEPI380中的每一種接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的50mlL培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。將焦磷酸(15g/dl)和8g/dl肌苷溶于乙酸鹽緩沖液(pH4.0)中。在該溶液中加入已導(dǎo)入含有上述突變型酸性磷酸酶基因和野生型酸性磷酸酶基因的大腸桿菌JM109菌株，使得按照細胞干重計的細胞濃度達到200mg/dl。反應(yīng)在35℃下進行32小時，同時將pH保持在4.0，在整個過程中測定形成的5’-肌苷酸的量。形成的肌苷酸只是5’-肌苷酸，根本沒有觀察到2’-肌苷酸和3’-肌苷酸副產(chǎn)物的生成。結(jié)果示于圖8中。實施例15中描述的大腸桿菌JM109/pEPI330顯示大量積累5’-肌苷酸。盡管仍有底物，但當5’肌苷酸的積累量達到7.5g/dl時5’-肌苷酸的產(chǎn)生停止，5’-肌苷酸的量不再增加。相反，含有新的突變型酸性磷酸酶基因的菌株提供大量積累的5’-肌苷酸。尤其是，在使用大腸桿菌JM109/pEPI370和大腸桿菌JM109/pEPI380的反應(yīng)中，提供更大量積累的5’-肌苷酸。此外，該反應(yīng)速率高，表明5’-肌苷酸的生產(chǎn)率進一步大大提高。尤其是在大腸桿菌JM109/pEPI380中，反應(yīng)速率高，表明相當高的反應(yīng)性。實施例21用含新的突變型酸性磷酸酶基因的菌株生產(chǎn)各種核苷-5’-磷酸酯將已導(dǎo)入含有新的突變型酸性磷酸酶基因質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI380接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的50mlL培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。將焦磷酸(15g/dl)和8g/dl作為磷酸基團受體的肌苷、鳥苷、尿苷或胞苷溶于100mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中。加入上述菌株，使得按照細胞干重計的細胞濃度達到100mg/dl。反應(yīng)在35℃下進行12小時，同時將pH保持在4.0。生成的核苷-5’-磷酸酯的量示于表14中。用任何核苷都能很好地進行轉(zhuǎn)磷酸，生成并積累相應(yīng)的核苷-5’-磷酸酯。生成的核苷酸只是核苷-5’-磷酸酯，根本沒有觀察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副產(chǎn)物的生成。表14核苷產(chǎn)物產(chǎn)量(g/dl)肌苷5’-肌苷酸12.05鳥苷5’-鳥苷酸5.78尿苷5’-尿苷酸13.28胞苷5’-胞苷酸10.65實施例22用含新的突變型酸性磷酸酶基因的菌株和作為磷酸基團供體的各種磷酸化合物生產(chǎn)5’-肌苷酸將已導(dǎo)入含有新的突變型酸性磷酸酶基因的質(zhì)粒的大腸桿菌JM109/pEPI380接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的50mlL培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。將肌苷(6g/dl)和15g/dl三聚磷酸鹽、多磷酸鹽(“PolygonP”，ChiyodaKagakuK.K.產(chǎn)品的商品名)、苯乙酸二鈉或氨甲酰磷酸二鈉溶于100mM乙酸鹽緩沖液(pH4.0)中。加入上述菌株，使得按照細胞干重計的細胞濃度達到100mg/dl。反應(yīng)在35℃下進行12小時，同時將pH保持在4.0。生成的5’-肌苷酸的量示于表15中。用任何磷酸基團供體，都非常有效地生成并積累5’-肌苷酸。尤其使用多磷酸鹽作為磷酸基團供體時，積累最大量的5’-肌苷酸。表15磷酸基團供體生成的5’-肌苷酸(g/dl)三聚磷酸鈉10.84多磷酸鈉13.35苯乙酸二鈉12.84氨甲酰磷酸二鈉12.42乙酰磷酸鉀鋰10.65實施例23得自斯托氏普羅威登斯菌染色體的酸性磷酸酶基因的分離和該基因核苷酸順序的測定分別合成具有順序表的SEQIDNO19和20中描述的核苷酸順序的寡核苷酸PRPl和PRP2。在斯托氏普羅威登斯菌酸性磷酸酶編碼基因的已知核苷酸順序(EMBL數(shù)據(jù)庫登記號X64820)基礎(chǔ)上，設(shè)計這些寡核苷酸來擴增斯托氏普羅威登斯菌的酸性磷酸酶編碼基因。按照Murray和Thomson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，從培養(yǎng)的斯托氏普羅威登斯菌ATCC29851的微生物細胞中提取染色體DNA。將染色體DNA(0.1ng)作為模板，寡核苷酸PRPl和PRP2(每種2.5μmol)作為引物以及TaqDNA聚合酶(2.5單位，由TakaraShuzo生產(chǎn))加入含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP(每種200μM)、氯化鉀(50mM)和氯化鎂(1.5mM)的100mMTris-鹽酸緩沖液(pH8.3，100μl)中，進行PCR反應(yīng)，其中一個循環(huán)包括在94℃下30秒、在55℃下2分鐘和在72℃下3分鐘，重復(fù)該循環(huán)30次。該反應(yīng)溶液經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，然后借助于玻璃粉(由TakaraShuzo生產(chǎn))回收大約為1kbp的擴增的DNA片斷。該基因片斷用BamHI降解，與用BamHI降解的pUC118連接。按上述方法獲得的質(zhì)粒命名為pPRP100。測定導(dǎo)入pPRP100的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌JM109/pPRP100的磷酸單酯酶活性和轉(zhuǎn)磷酸活性。結(jié)果，菌株表現(xiàn)出將磷酸轉(zhuǎn)移到核苷的活性以及磷酸單酯酶活性。按照堿裂解法，從大腸桿菌JM109/pPRP100轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，以測定核苷酸順序。一個測定的開放閱讀框架的核苷酸順序和從該核苷酸順序得出的蛋白質(zhì)的氨基酸順序示于順序表的SEQIDNO21和22中。開放閱讀框架的核苷酸順序與已知的斯托氏普羅威登斯菌酸性磷酸酶基因的核苷酸順序完全吻合。實施例24得自產(chǎn)氣腸桿菌、Planticola克雷伯氏桿菌和Serratiaficaria染色體的酸性磷酸酶基因的分離和這些基因的核苷酸順序的測定按照Murray和Thomson(Nucl.AcidRes.，4321,8(1980))的方法，從培養(yǎng)的產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010、KlebsiellaplanticolaIFO14939和SerrtiaficariaIAM13540的微生物細胞中提取染色體DNA。然后，按照實施例7(2)中描述的方法，構(gòu)建包含大約20,000個大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化體的染色體基因表達文庫并進行篩選，獲得表現(xiàn)轉(zhuǎn)磷酸活性的轉(zhuǎn)化體。我們認為這些轉(zhuǎn)化體中的每個都包含得自每個原始菌株的酸性磷酸酶基因。按照堿裂解法，從認為具有得自產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010的酸性磷酸酶基因的一個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA，分析質(zhì)粒內(nèi)插入的DNA。上述質(zhì)粒命名為pENP100。得自產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010的插入DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜示于圖9中。通過亞克隆具體分析酸性磷酸酶基因區(qū)的結(jié)果顯示，該酸性磷酸酶基因包含在用限制性內(nèi)切酶SalI和KpnI剪切的1.6kbp片斷中。然后，將該SalI-KpnI片斷與用SalI和KpnI降解的pUC118連接，構(gòu)建一個質(zhì)粒。所得的質(zhì)粒命名為pENP110。按照上述步驟，按照堿裂解法從認為具有得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的酸性磷酸酶基因的一個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA，分析質(zhì)粒內(nèi)插入的DNA。上述質(zhì)粒命名為pKLP100。得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的插入DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜示于圖10中。通過亞克隆具體分析酸性磷酸酶基因區(qū)的結(jié)果顯示，該酸性磷酸酶基因包含在用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI剪切的2.2kbp片斷中。然后，將該KpnI-EcoRI片斷與用KpnI和EcoRI降解的pUC118連接，構(gòu)建一個質(zhì)粒。所得的質(zhì)粒命名為pKLP110。同樣地，按照堿裂解法，從認為具有得自SerrtiaficariaIAM13540的酸性磷酸酶基因的一個大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA，分析質(zhì)粒內(nèi)插入的DNA。上述質(zhì)粒命名為pSEP100。得自SerrtiaficariaIAM13540的插入DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜示于圖11中。通過亞克隆具體分析酸性磷酸酶基因區(qū)的結(jié)果顯示，該酸性磷酸酶基因包含在用限制性內(nèi)切酶HindIII剪切的1.4kbp片斷中。然后，將該HindIII片斷與用HindIII降解的pUC118連接，構(gòu)建一個質(zhì)粒。所得的質(zhì)粒命名為pSEP110。然后，按照堿裂解法，從分別導(dǎo)入pENP110、pKLP110和pSEP110的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌JM109/pENP110、大腸桿菌JM109/pKLP110、大腸桿菌JM109/pSEP110中提取質(zhì)粒DNA。按照實施例8描述的方法，測定這些質(zhì)粒的插入核苷酸順序。關(guān)于測定的插入的開放閱讀框架的核苷酸順序，產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010的示于SEQIDNO23中，KlebsiellaplanticolaIFO14939的示于SEQIDNO25中，而SerrtiaficariaIAM13540的示于SEQIDNO27中。另外，得出的氨基酸順序分別示于SEQIDNO24、26和28中。因為包含這些質(zhì)粒(含有這些片斷)的轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出轉(zhuǎn)磷酸活性，因此鑒定出這些開放閱讀框架為目的酸性磷酸酶基因。分別比較核苷酸順序和得出的氨基酸順序與已知順序的同源性。使用EMBL和SWISS-PROT的數(shù)據(jù)庫。結(jié)果揭示出，在順序表SEQIDNO23、25和27中描述的基因是新基因。我們假定由得自產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010的基因編碼的蛋白質(zhì)包含248個氨基酸殘基，得自KlebsiellaplanticolaIFO14939的基因編碼的蛋白質(zhì)包含248個氨基酸殘基。而得自SerrtiaficariaIAM13540的基因編碼的蛋白質(zhì)包含244個氨基酸殘基。一個可能性是，這些蛋白質(zhì)可能同得自摩氏摩根氏菌和Esherichiablattae的酸性磷酸酶一樣，為前體蛋白。從核苷酸順序得出的氨基酸順序以及在實施例8中獲得的得自摩氏摩根氏菌NCIMB10466酸性磷酸酶得出的氨基酸順序、在實施例12中獲得的得自EsherichiablattaeJCM1650酸性磷酸酶得出的氨基酸順序以及斯托氏普羅威登斯菌的酸性磷酸酶的已知氨基酸順序(EMBL登記號X64820)一起，示于圖12中，用一個字母表示一個氨基酸殘基。在所有氨基酸順序中相同的氨基酸殘基在圖12的順序下用星號表示。如圖12所示，得自6個菌株的酸性磷酸酶的氨基酸順序相互高度同源，在所有氨基酸順序中，130個氨基酸殘基是相同的。因此，我們假定這些酸性磷酸酶具有相似的功能。實施例25通過表達得自產(chǎn)氣腸桿菌、Klebsiellaplanticola和Serratiaficaria的酸性磷酸酶基因放大活性將實施例23中構(gòu)建的大腸桿菌JM109/pPRP100、實施例24中構(gòu)建的大腸桿菌JM109/pENP110、大腸桿菌JM109/pKLP110和大腸桿菌JM109/pSEP110接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的L培養(yǎng)基(50ml)中，在37℃培養(yǎng)16小時。通過離心，從這些培養(yǎng)物中收獲微生物細胞，用生理鹽水洗滌1次。將微生物細胞懸浮于100mM磷酸鉀緩沖液(5ml，pH7.0)中，通過在4℃下超聲處理20分鐘破碎細胞。離心處理后的溶液，以除去不溶部分，由此制備無細胞提取物。測定獲得的無細胞提取物的轉(zhuǎn)磷酸活性，同時使用的對照是從斯托氏普羅威登斯菌ATCC29851、產(chǎn)氣腸桿菌IFO12010、KlebsiellaplanticolaIFO14939、SerrtiaficariaIAM13540和按上述相同方法用質(zhì)粒pUC118轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109。結(jié)果示于表16中。在所有野生型菌株中，轉(zhuǎn)磷酸活性都低。在大腸桿菌JM109/pUC118中沒有檢測到轉(zhuǎn)磷酸活性。另一方面，與野生型菌株相比，導(dǎo)入酸性磷酸酶基因的所有大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)磷酸活性。按照該結(jié)果，證明每個導(dǎo)入的DNA片斷都使得大腸桿菌高水平地表達酸性磷酸酶。表16微生物菌株轉(zhuǎn)磷酸活性(單位/mg)斯托氏普羅威登斯菌ATCC298510.005產(chǎn)氣腸桿菌IFO120100.002KlebsiellaplanticolaIFO149390.002SerrtiaficariaIAM135400.001大腸桿菌JM109/pUC118未檢測到大腸桿菌JM109/pPRP1000.833大腸桿菌JM109/pENP1100.301大腸桿菌JM109/pKLP1100.253大腸桿菌JM109/pSEP1100.123實施例26溫度穩(wěn)定性提高的突變型酸性磷酸酶基因的制備如實施例20、21和22所描述的，實施例19中產(chǎn)生的含得自blattae埃希氏桿菌的突變型酸性磷酸酶基因的菌株表達相當量的酸性磷酸酶。在用該菌株由焦磷酸和肌苷生產(chǎn)5’-肌苷酸的過程中，以高轉(zhuǎn)化率生成并積累5’-肌苷酸。該酸性磷酸酶的最適反應(yīng)溫度為35℃。然而，該反應(yīng)在較高溫度下進行時，反應(yīng)速率增加，在反應(yīng)溶液中增加磷酸受體核苷的濃度時，進行該反應(yīng)。因此，我們預(yù)計，核苷-5’-磷酸酯在較短時間內(nèi)可以更高效地生產(chǎn)。因此，通過用PCR位點專一性突變法，將突變導(dǎo)入實施例19中克隆的得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶基因時，提高了該酶的溫度穩(wěn)定性。使用含有實施例19中描述的得自EsherichiablattaeJCM1650的突變型酸性磷酸酶編碼基因的質(zhì)粒pEPI380，用遺傳工程法，將位點專一性突變導(dǎo)入該質(zhì)粒DNA中，產(chǎn)生溫度穩(wěn)定性提高的突變型酸性磷酸酶的編碼基因。pEPI380是通過將含有得自EsherichiablattaeJCM1650的突變型酸性磷酸酶編碼基因、用限制性內(nèi)切酶ClaI和BamHI剪切的2.4kbpDNA片斷與用ClaI和BamHI剪切的pBluescriptKS(+)(由Stratagene生產(chǎn))連接而得到的質(zhì)粒DNA。由該酸性磷酸酶編碼基因的堿基順序得出的成熟蛋白的氨基酸順序推測為實施例19的表12中所示的11個氨基酸殘基，用順序表的SEQIDNO8的順序來表示。用磷酰胺化物法，使用DNA合成儀(AppliedBiosystems供應(yīng)的394型)合成具有順序表中所示順序的寡核苷酸MUT300(順序表中的SEQIDNO9)、MUT400(順序表中的SEQIDNO29)和MUT410(順序表中的SEQIDNO30)。用PCR法按實施例15的方法，使用實施例19描述的pEPI380作為模板，用MUT300和MUT410作為引物導(dǎo)入突變，產(chǎn)生編碼突變型磷酸酶的突變型基因，其中成熟蛋白的第104位谷氨酸殘基(GAG)用甘氨酸殘基(GG*T*)替代。含有該突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI410。同樣地，使用pEPI380作為模板，用MUT300、MUT310和MUT420作為引物導(dǎo)入突變，產(chǎn)生編碼突變型磷酸酶的突變型基因，其中第151位蘇氨酸殘基(ACC)用丙氨酸殘基(G*CC)替代。含有該突變型基因的質(zhì)粒命名為pEPI420。從導(dǎo)入含有突變型型磷酸酶基因的質(zhì)粒pEPI410和pEPI420的大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化體中，用堿細菌裂解法制備質(zhì)粒，測定堿基順序，鑒定出目的堿基己被替代。將導(dǎo)入本實施例中制備的突變型酸性磷酸酶基因的大腸桿菌JM109/pEPI410和大腸桿菌JM109/pEPI420和實施例19中描述的大腸桿菌JM109/pEPI380中的每一種接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的50mlL培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。從每個菌株的50ml培養(yǎng)液中收獲細胞，用生理鹽水溶液洗滌1次。將這些細胞懸浮于5ml100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，在4℃下超聲處理20分鐘，以破碎細胞。離心如此處理的溶液，以除去不溶部分，制備無細胞提取物。從每個菌株制備的無細胞提取物在0-80℃、pH7.0下保溫30分鐘。保溫完成后，在pH4.0、30℃下的標準反應(yīng)條件下，用在不同溫度下處理的無細胞提取物進行轉(zhuǎn)磷酸，測定殘留活性。結(jié)果示于圖13中。在實施例19中描述的大腸桿菌JM109/pEPI380中表達的突變型酶在40℃30分鐘的處理中穩(wěn)定，但在較高溫度下觀察到其活性的降低。相反，在導(dǎo)入本實施例中產(chǎn)生的新突變型酶基因的大腸桿菌JM109/pEPI410和大腸桿菌JM109/pEPI420中表達的新突變型酶提高了溫度穩(wěn)定性，即使在50℃處理30分鐘，也沒有觀察到活性的降低。因此我們預(yù)計，使用這些菌株在高溫下生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯時，生產(chǎn)率進一步提高。實施例27用含有溫度穩(wěn)定性提高的突變型酸性磷酸酶基因的菌株生產(chǎn)5’-肌苷酸和5’-鳥苷酸將已導(dǎo)入突變型酸性磷酸酶基因的大腸桿菌JMI09/pEPI410和大腸桿菌JM109/pEPI420和實施例19中描述的大腸桿菌JM109/pEPI380中的每一種接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的50mlL培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時。將焦磷酸(15g/dl)和8g/dl肌苷或鳥苷溶于乙酸鹽緩沖液(pH4.0)中。加入已導(dǎo)入每種突變型酸性磷酸酶基因的大腸桿菌JM109菌株，使得按照細胞干重計的細胞濃度達到100mg/dl。反應(yīng)在50℃下進行9小時，同時將pH保持在4.0，測定生成的5’-肌苷酸或5’-鳥苷酸的量。結(jié)果示于表17中。生成的核苷磷酸酯只有核苷-5’-磷酸酯，根本沒有觀察到核苷-2’-磷酸酯和核苷-3’-磷酸酯副產(chǎn)物的產(chǎn)生。反應(yīng)也在35℃下進行12小時，用大腸桿菌JM109/pEPI380菌株作為對照。結(jié)果也示于表17中。如實施例21所述，用大腸桿菌JM109/pEPI380高效地生成并積累核苷-5’-磷酸酯。相反，用導(dǎo)入了實施例26制備的得自Esherichiablattae的新突變型酸性磷酸酶基因的大腸桿菌JM109/pEPI410和大腸桿菌JM109/pEPI420進行反應(yīng)，在較短時間內(nèi)生成并積累等量的5’-肌苷酸或5’-鳥苷酸。因此，可以更有效地生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯。尤其當使用大腸桿菌JM109/pEPI420時，不僅反應(yīng)時間縮短，而且大量積累5’-肌苷酸和5’-鳥苷酸，表現(xiàn)出相當高的生產(chǎn)率。表17</tables>圖1描述了反應(yīng)pH和在用得自摩氏摩根氏菌的酶進行的反應(yīng)中5’-肌苷酸的產(chǎn)生量之間的關(guān)系。圖2描述了反應(yīng)pH和在用得自Esherichiablattae的酶進行的反應(yīng)中5’-肌苷酸的產(chǎn)生量之間的關(guān)系。圖3描述了含有酸性磷酸酶編碼基因的摩氏摩根氏菌染色體DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖譜。圖4描述了在用包含得自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶基因的菌株進行的反應(yīng)中5’-肌苷酸的產(chǎn)生量。圖5描述了含有酸性磷酸酶編碼基因的Esherichiablattae染色體DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖譜。圖6描述的圖表示在用包含得自Esherichiablattae的酸性磷酸酶基因的菌株進行的反應(yīng)中5’-肌苷酸的產(chǎn)生量。圖7分別描述了在用包含野生型酸性磷酸酶基因的菌株和包含得自Esherichiablattae的突變型酸性磷酸酶基因的菌株進行的反應(yīng)中5’-肌苷酸的產(chǎn)生量。圖8描述了在用包含得自Esherichiablattae的新突變型酸性磷酸酶基因的菌株進行的反應(yīng)中5’-肌苷酸的產(chǎn)生量。圖9描述了含有酸性磷酸酶編碼基因、得自產(chǎn)氣腸桿菌的染色體DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖譜。圖10描述了含有酸性磷酸酶編碼基因、得自Planticola克雷伯氏桿菌的染色體DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖譜。圖11描述了含有酸性磷酸酶編碼基因、得自Serratiaficaria的染色體DNA片斷的限制性內(nèi)切酶圖譜。圖12描述了由得自摩氏摩根氏菌、Esherichiablattae、斯托氏普羅威登斯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、Planticola克雷伯氏桿菌和Serratiaficaria的酸性磷酸酶的核苷酸順序得出的氨基酸順序，用一個字母表示一個氨基酸殘基。這些氨基酸順序在頓序表的SEQIDNO4、8、22、24、26和28中進行了描述，用三個字母表示一個氨基酸殘基。在該圖中，在所有氨基酸順序中相同的氨基酸殘基在順序下用*標記。圖13描述了在從包含得自Esherichiablattae的新突變型酸性磷酸酶基因的菌株中制備的無細胞提取物中，酸性磷酸酶活性的溫度穩(wěn)定性曲線。順序表SEQIDNO1的資料(i)順序特性(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型多肽(v)蛋白質(zhì)片斷類型N-末端(vi)來源(A)有機體摩氏摩根氏菌(B)菌株NICMB10466(xi)順序描述SEQIDNO1AlaIleProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysProAspLeuTyrTyr151015LeuLysAsnGlu20SEQIDNO2的資料(i)順序特性(A)長度750個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)來源(A)有機體摩氏摩根氏菌(B)菌株NICMB10466(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...747(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞信號肽(B)位置1...60(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟多肽(B)位置61...747(xi)順序描述SEQIDNO2ATGAAGAAGAATATTATCGCCGGTTGTCTGTTCTCACTGTTTTCCCTT48MetLysLysAsnIleIleAlaGlyCysLeuPheSerLeuPheSerLeu-20-15-10-5TCCGCGCTGGCCGCGATCCCGGCGGGCAACGATGCCACCACCAAGCCG96SerAlaLeuAlaAlaIleProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro1510GATTTATATTATCTGAAAAATGAACAGGCTATCGACAGCCTGAAACTG144AspLeuTyrTyrLeuLysAsnGluGlnAlaIleAspSerLeuLysLeu152025TTACCGCCACCGCCGGAAGTCGGCAGTATTCAGTTTTTAAATGATCAG192LeuProProProProGluValGlySerIleGlnPheLeuAsnAspGln303540GCAATGTATGAGAAAGGCCGTATGCTGCGCAATACCGAGCGCGGAAAA240AlaMetTyrGluLysGlyArgMetLeuArgAsnThrGluArgGlyLys45505560CAGGCACAGGCAGATGCTGACCTGGCCGCAGGGGGTGTGGCAACCGCA288GlnAlaGlnAlaAspAlaAspLeuAlaAlaGlyGlyValAlaThrAla657075TTTTCAGGGGCATTCGGCTATCCGATAACCGAAAAAGACTCTCCGGAG336PheSerGlyAlaPheGlyTyrProIleThrGluLysAspSerProGlu808590CTGTATAAACTGCTGACCAATATGATTGAGGATGCCGGTGATCTTGCC384LeuTyrLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla95100105ACCCGCTCCGCCAAAGAACATTACATGCGCATCCGGCCGTTTGCGTTT432ThrArgSerAlaLysGluHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe110115120TACGGCACAGAAACCTGTAATACCAAAGATCAGAAAAAACTCTCCACC480TyrGlyThrGluThrCysAsnThrLysAspGlnLysLysLeuSerThr125130135140AACGGATCTTACCCGTCAGGTCATACGTCTATCGGCTGGGCAACCGCA528AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla145150155CTGGTGCTGGCGGAAGTGAACCCGGCAAATCAGGATGCGATTCTGGAA576LeuValLeuAlaGluValAsnProAlaAsnGlnAspAlaIleLeuGlu160165170CGGGGTTATCAGCTCGGACAGAGCCGGGTGATTTGCGGCTATCACTGG624ArgGlyTyrGlnLeuGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp175180185CAGAGTGATGTGGATGCCGCGCGGATTGTCGGTTCAGCCGCTGTCGCG672GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaAlaValAla190195200ACATTACATTCCGATCCGGCATTTCAGGCGCAGTTAGCGAAAGCCAAA720ThrLeuHisSerAspProAlaPheGlnAlaGlnLeuAlaLysAlaLys205210215220CAGGAATTTGCACAAAAATCACAGAAATAA750GlnGluPheAlaGlnLysSerGlnLys225229SEQIDNO3的資料(i)順序特性(A)長度249個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)來源(A)有機體摩氏摩根氏菌(B)菌株NICMB10466(xi)順序描述SEQIDNO3MetLysLysAsnIleIleAlaGlyCysLeuPheSerLeuPheSerLeu-20-15-10-5SerAlaLeuAlaAlaIleProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro1510AspLeuTyrTyrLeuLysAshGluGlnAlaIleAspSerLeuLysLeu152025LeuProProProProGluValGlySerIleGlnPheLeuAsnAspGln303540AlaMetTyrGluLysGlyArgMetLeuArgAsnThrGluArgGlyLys45505560GlnAlaGlnAlaAspAlaAspLeuAlaAlaGlyGlyValAlaThrAla657075PheSerGlyAlaPheGlyTyrProIleThrGluLysAspSerProGlu808590LeuTyrLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla95100105ThrArgSerAlaLysGluHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe110115120TyrGlyThrGluThrCysAsnThrLysAspGlnLysLysLeuSerThr125130135140AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla145150155LeuValLeuAlaGluValAsnProAlaAsnGlnAspAlaIleLeuGlu160165170ArgGlyTyrGlnLeuGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp175180185GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaAlaValAla190195200ThrLeuHisSerAspProAlaPheGlnAlaGlnLeuAlaLysAlaLys205210215220GlnGluPheAlaGlnLysSerGlnLys225229SEQIDNO4的資料(i)順序特性(A)長度229個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)來源(A)有機體摩氏摩根氏菌(B)菌株NICMB10466(xi)順序描述SEQIDNO4AlaIleProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysProAspLeuTyrTyr151015LeuLysAsnGluGlnAlaIleAspSerLeuLysLeuLeuProProPro202530ProGluValGlySerIleGlnPheLeuAsnAspGlnAlaMetTyrGlu354045LysGlyArgMetLeuArgAsnThrGluArgGlyLysGlnAlaGlnAla505560AspAlaAspLeuAlaAlaGlyGlyValAlaThrAlaPheSerGlyAla65707580PheGlyTyrProIleThrGluLysAspSerProGluLeuTyrLysLeu859095LeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAlaThrArgSerAla100105110LysGluHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPheTyrGlyThrGlu115120125ThrCysAsnThrLysAspGlnLysLysLeuSerThrAsnGlySerTyr130135140ProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAlaLeuValLeuAla145150155160GluValAsnProAlaAsnGlnAspAlaIleLeuGluArgGlyTyrGln165170175LeuGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrpGlnSerAspVal180185190AspAlaAlaArgIleValGlySerAlaAlaValAlaThrLeuHisSer195200205AspProAlaPheGlnAlaGlnLeuAlaLysAlaLysGlnGluPheAla210215220GlnLysSerGlnLys225229SEQIDNO5的資料(i)順序特性(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型多肽(v)蛋白質(zhì)片斷類型N-末端(vi)來源(A)有機體Esherichiablattae(B)菌株JCM1650(xi)順序描述SEQIDNO5LeuAlaLeuValAlaThrGlyAsnAspThrThrThrLysProAspLeu151015SEQIDNO6的資料(i)順序特性(A)長度750個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)來源(A)有機體Esherichiablattae(B)菌株JCM1650(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...747(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞信號肽(B)位置1...54(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟多肽(B)位置55...747(xi)順序描述SEQIDNO6ATGAAAAAACGTGTTCTGGCAGTTTGTTTTGCCGCATTGTTCTCTTCT48MetLysLysArgValLeuAlaValCysPheAlaAlaLeuPheSerSer-18-15-10-5CAGGCCCTGGCGCTGGTCGCTACCGGCAACGACACTACCACGAAACCG96GlnAlaLeuAlaLeuValAlaThrGlyAsnAspThrThrThrLysPro1510GATCTCTACTACCTCAAGAACAGTGAAGCCATTAACAGCCTGGCGCTG144AspLeuTyrTyrLeuLysAsnSerGluAlaIleAsnSerLeuAlaLeu15202530TTGCCGCCACCACCGGCGGTGGGCTCCATTGCGTTTCTCAACGATCAG192LeuProProProProAlaValGlySerIleAlaPheLeuAsnAspGln354045GCCATGTATGAACAGGGGCGCCTGCTGCGCAACACCGAACGCGGTAAG240AlaMerTyrGluGlnGlyArgLeuLeuArgAsnThrGluArgGlyLys505560CTGGCGGCGGAAGATGCAAACCTGAGCAGTGGCGGGGTGGCGAATGCT288LeuAlaAlaGluAspAlaAsnLeuSerSerGlyGlyValAlaAsnAla657075TTCTCCGGCGCGTTTGGTAGCCCGATCACCGAAAAAGACGCCCCGGCG336PheSerGlyAlaPheGlySerProIleThrGluLysAspAlaProAla808590CTGCATAAATTACTGACCAATATGATTGAGGACGCCGGGGATCTGGCG384LeuHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla95100105110ACCCGCAGCGCGAAAGATCACTATATGCGCATTCGTCCGTTCGCGTTT432ThrArgSerAlaLysAspHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe115120125TATGGGGTCTCTACCTGTAATACCACCGAGCAGGACAAACTGTCCAAA480TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGlnAspLysLeuSerLys130135140AATGGCTCTTATCCGTCCGGGCATACCTCTATCGGCTGGGCTACTGCG528AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla145150155CTGGTGCTGGCAGAGATCAACCCTCAGCGCCAGAACGAGATCCTGAAA576LeuValLeuAlaGluIleAsnProGlnArgGlnAsnGluIleLeuLys160165170CGCGGTTATGAGCTGGGCCAGAGCCGGGTGATTTGCGGCTACCACTGG624ArgGlyTyrGluLeuGlyGlnSe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CCACCGCCGCCGGAAGTGGGCAGCATTGCGTTTTTAAACGATCAG192LeuProProProProGluValGlySerIleAlaPheLeuAsnAspGln505560GCGATGTATGAGAAAGGCCGTCTGCTGCGCGCCACCGCCCGCGGCAAG240AlaMetTyrGluLysGlyArgLeuLeuArgAlaThrAlaArgGlyLys65707580TTGGCGGCAGAAGATGCCAACCTGAGCGCGGGTGGCGTGGCCAACGCC288LeuAlaAlaGluAspAlaAsnLeuSerAlaGlyGlyValAlaAsnAla859095TTCTCCGCAGCATTCGGCTCCCCGATCAGCGAAAAAGACGCCCCGGCG336PheSerAlaAlaPheGlySerProIleSerGluLysAspAlaProAla100105110CTGCACAAACTGCTCACCAACATGATTGAAGACGCGGGCGATCTGGCG384LeuHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla115120125ACCCGAGGCGCGAAAGAGAAGTATATGCGTATTCGTCCGTTTGCCTTC432ThrArgGlyAlaLysGluLysTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe130135140TACGGCGTGTCCACCTGCAATACCACCGAACAGGATAAGCTGTCGAAA480TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGlnAspLysLeuSerLys145150155160AACGGCTCCTACCCTTCCGGACACACCTCTATCGGCTGGGCGACCGCC528AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla165170175CTGGTGCTGGCCGAAATCAACCCGCAGCGCCAGAATGAGATTCTCAAG576LeuValLeuAlaGluIleAsnProGlnArgGlnAsnGluIleLeuLys180185190CGCGGCTATGAGCTCGGTGAAAGTCGGGTGATCTGCGGTTACCACTGG624ArgGlyTyrGluLeuGlyGluSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp195200205CAGAGCGATGTTGACGCCGCGCGGATTGTCGGCTCGGCGGTGGTTGCA672GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaValValAla210215220ACCCTGCATACCAATCCGGCCTTCCAGCAGCAGCTGCAAAAAGCCAAA720ThrLeuHisThrAsnProAlaPheGlnGlnGlnLeuGlnLysAlaLys225230235240GACGAGTTTGCGAAACAGCAGAAATAG747AspGluPheAlaLysGlnGlnLys245SEQIDNO26的資料(i)順序特性(A)長度248個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)來源(A)有機體Klebsiellaplanticola(B)菌株IFO14939(xi)順序描述SEQIDNO26MetLysLysArgValLeuAlaLeuCysLeuAlaSerLeuPheSerVal151015SerAlaPheAlaLeuValProAlaGlyAsnAspAlaThrThrLysPro202530AspLeuTyrTyrLeuLysAsnAlaGlnAlaIleAspSerLeuAlaLeu354045LeuProProProProGluValGlySerIleAlaPheLeuAsnAspGln505560AlaMetTyrGluLysGlyArgLeuLeuArgAlaThrAlaArgGlyLys65707580LeuAlaAlaGluAspAlaAsnLeuSerAlaGlyGlyValAlaAsnAla859095PheSerAlaAlaPheGlySerProIleSerGluLysAspAlaProAla100105110LeuHisLysLeuLeuThrAsnMetIleGluAspAlaGlyAspLeuAla115120125ThrArgGlyAlaLysGluLysTyrMetArgIleArgProPheAlaPhe130135140TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGlnAspLysLeuSerLys145150155160AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerIleGlyTrpAlaThrAla165170175LeuValLeuAlaGluIleAsnProGlnArgGlnAsnGluIleLeuLys180185190ArgGlyTyrGluLeuGlyGluSerArgValIleCysGlyTyrHisTrp195200205GlnSerAspValAspAlaAlaArgIleValGlySerAlaValValAla210215220ThrLeuHisThrAsnProAlaPheGlnGlnGlnLeuGlnLysAlaLys225230235240AspGluPheAlaLysGlnGlnLys245SEQIDNO27的資料(i)順序特性(A)長度735個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(vi)來源(A)有機體Serratiaficartia(B)菌株IAM13540(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...732(xi)順序描述SEQIDNO27ATGAAAAAAATATTATTAGCCACATTAAGCTGCGCCGCGTTGACGCAG48MetLysLysIleLeuLeuAlaThrLeuSerCysAlaAlaLeuThrGln151015TTTTCCTTTGCCGCCAAAGATGTCACTACCCACCCTGAGGTTTATTTT96PheSerPheAlaAlaLysAspValThrThrHisProGluValTyrPhe202530CTGCAAGAATCACAGTCCATCGACAGCCTGGCACTATTGCCGCCGCCG144LeuGlnGluSerGlnSerIleAspSerLeuAlaLeuLeuProProPro354045CCGGCGATGGACAGCATTGATTTCCTGAATGACAAAGCGCAATACGAC192ProAlaMetAspSerIleAspPheLeuAsnAspLysAlaGlnTyrAsp505560GCCGGGAAAATAGTGCGCAATACTCCGCGTGGCAAGCAGGCTTATGAT240AlaGlyLysIleValArgAsnThrProArgGlyLysGlnAlaTyrAsp65707580GACGCCCACGTTGCCGGGGACGGCGTTGCCGCCGCATTTTCCAACGCC288AspAlaHisValAlaGlyAspGlyValAlaAlaAlaPheSerAsnAla859095TTCGGCCTAGAAATAGCCCAACGGAAAACGCCGGAGCTGTTTAAGCTG336PheGlyLeuGluIleAlaGlnArgLysThrProGluLeuPheLysLeu100105110GTGATGAAAATGCGTGAAGACGCCGGCGATTTGGCGACCCGCAGCGCC384ValMetLysMetArgGluAspAlaGlyAspLeuAlaThrArgSerAla115120125AAAAATCACTATATGCGCATTCGCCCCTTTGCGTTTTATAACGAAGCG432LysAsnHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPheTyrAsnGluAla130135140ACCTGCCGACCGGACGAAGAAAGCACCCTGTCGAAGAACGGTTCTTAC480ThrCysArgProAspGluGluSerThrLeuSerLysAsnGlySerTyr145150155160CCTTCCGGCCATACCACCATCGGCTGGGCGACCGCGCTGGTGCTGGCT528ProSerGlyHisThrThrIleGlyTrpAlaThrAlaLeuValLeuAla165170175GAAATCAACCCCGCCAGGCAGGGTGAAATCCTGCAGCGCGGCTATGAT576GluIleAsnProAlaArgGlnGlyGluIleLeuGlnArgGlyTyrAsp180185190ATGGGCCAAAGCCGGGTTATCTGCGGTTATCACTGGCAAAGCGACGTG624MetGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrpGlnSerAspVal195200205ACTGCGGCGCGCATGGCGGCGTCGGCCATGGTGGCGCGTTTGCATGCC672ThrAlaAlaArgMetAlaAlaSerAlaMetValAlaArgLeuHisAla210215220GAACCCACCTTCGCCGCCCAGCTGCAAAAGGCCAAAGACGAATTCAAC720GluProThrPheAlaAlaGlnLeuGlnLysAlaLysAspGluPheAsn225230235240GGCCTGAAAAAGTAA735GlyLeuLysLysSEQIDNO28的資料(i)順序特性(A)長度244個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)來源(A)有機體Serratiaficartia(B)菌株IAM13540(xi)順序描述SEQIDNO28MetLysLysIleLeuLeuAlaThrLeuSerCysAlaAlaLeuThrGln151015PheSerPheAlaAlaLysAspValThrThrHisProGluValTyrPhe202530LeuGlnGluSerGlnSerIleAspSerLeuAlaLeuLeuProProPro354045ProAlaMetAspSerIleAspPheLeuAsnAspLysAlaGlnTyrAsp505560AlaGlyLysIleValArgAsnThrProArgGlyLysGlnAlaTyrAsp65707580AspAlaHisValAlaGlyAspGlyValAlaAlaAlaPheSerAsnAla859095PheGlyLeuGluIleAlaGlnArgLysThrProGluLeuPheLysLeu100105110ValMetLysMetArgGluAspAlaGlyAspLeuAlaThrArgSerAla115120125LysAsnHisTyrMetArgIleArgProPheAlaPheTyrAsnGluAla130135140ThrCysArgProAspGluGluSerThrLeuSerLysAsnGlySerTyr145150155160ProSerGlyHisThrThrIleGlyTrpAlaThrAlaLeuValLeuAla165170175GluIleAsnProAlaArgGlnGlyGluIleLeuGlnArgGlyTyrAsp180185190MetGlyGlnSerArgValIleCysGlyTyrHisTrpGlnSerAspVal195200205ThrAlaAlaArgMetAlaAlaSerAlaMetValAlaArgLeuHisAla210215220GluProThrPheAlaAlaGlnLeuGlnLysAlaLysAspGluPheAsn225230235240GlyLeuLysLysSEQIDNO29的資料(i)順序特性(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它DNA...合成DNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)順序描述SEQIDNO29CCCGGCGTCACCAATCATATT21SEQIDNO30的資料(i)順序特性(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它DNA...合成DNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(xi)順序描述SEQIDNO30GCCGGTAGAGGCATGCCCGGA2權(quán)利要求1.生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，包括讓對核苷具有較高親和性和/或較高溫度穩(wěn)定性的酸性磷酸酶，在pH3.0-5.5條件下作用于核苷和磷酸基團供體，生產(chǎn)并收集核苷-5’-磷酸酯。2.生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，包括讓微生物在pH3.0-5.5條件下作用于核苷和磷酸基團供體，生產(chǎn)并收集核苷-5’-磷酸酯；其中微生物用包含對核苷具有較高親和性和/或較高溫度穩(wěn)定性的酸性磷酸酶編碼基因的重組DNA轉(zhuǎn)化。3.按照權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，其中對核苷的Km值低于100mM。4.按照權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，其中酸性磷酸酶在50℃下是穩(wěn)定的。5.按照權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，其中對核苷具有較高親和性的酸性磷酸酶得自屬于埃希氏桿菌屬、摩根氏菌屬、普羅威登斯菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏桿菌屬或沙雷氏菌屬的細菌。6.按照權(quán)利要求5的生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，其中酸性磷酸酶包含的氨基酸順序與選自順序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述順序的某一個氨基酸順序基本相同，所述酸性磷酸酶在選自順序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述順序的某一個氨基酸順序上具有一個突變，該突變提高了對核苷的親和性和/或溫度穩(wěn)定性。7.按照權(quán)利要求5的生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，其中所述突變選自順序表的SEQIDNO8中的第63位亮氨酸殘基、第65位丙氨酸殘基、第66位谷氨酸殘基、第69位天冬氨酸殘基、第71位絲氨酸殘基、第72位絲氨酸殘基、第74位甘氨酸殘基、第85位絲氨酸殘基、第92位丙氨酸殘基、第94位丙氨酸殘基、第104位谷氨酸殘基、第116位天冬氨酸殘基、第130位絲氨酸殘基、第135位蘇氨酸殘基、第136位谷氨酸殘基、第151位蘇氨酸殘基和/或第153位異亮氨酸殘基用另一氨基酸的替代。8.按照權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)核苷-5’-磷酸酯的方法，其中磷酸基團供體選自多磷酸或其鹽、苯磷酸或其鹽、乙酰磷酸或其鹽和氨甲酰磷酸或其鹽。9.一種突變型酸性磷酸酶，它包含的氨基酸順序與選自順序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述順序的某一個氨基酸順序基本相同，所述酸性磷酸酶在選自順序表的SEQIDNO4、8、25、27、29和31中描述順序的某一個氨基酸順序上具有一個突變，該突變提高對核苷的親和性和/或溫度穩(wěn)定性。10.按照權(quán)利要求9的一種突變型酸性磷酸酶，其中所述突變選自順序表的SEQIDNO8中的第63位亮氨酸殘基、第65位丙氨酸殘基、第66位谷氨酸殘基、第69位天冬氨酸殘基、第71位絲氨酸殘基、第72位絲氨酸殘基、第74位甘氨酸殘基、第85位絲氨酸殘基、第92位丙氨酸殘基、第94位丙氨酸殘基、第104位谷氨酸殘基、第116位天冬氨酸殘基、第130位絲氨酸殘基、第135位蘇氨酸殘基、第136位谷氨酸殘基、第151位蘇氨酸殘基和/或第153位異亮氨酸殘基用另一氨基酸的替代。11.按權(quán)利要求9定義的酸性磷酸酶的編碼基因。12.包含按權(quán)利要求11定義的基因的重組DNA。13.包含按權(quán)利要求12定義的重組DNA的微生物。全文摘要通過用生化方法將核苷磷酸化,便宜并高效地生產(chǎn)核苷－5’－磷酸酯的方法。通過使酸性磷酸酶、尤其是對核苷具有較高親和性和/或溫度穩(wěn)定性提高的酸性磷酸酶以及導(dǎo)入具有所述酸性磷酸酶活性的蛋白質(zhì)編碼基因的微生物,在pH3.0—5.5條件下作用于核苷和磷酸基團供體(選自聚磷酸或其鹽、苯膦酸或其鹽和氨甲酰磷酸或其鹽)產(chǎn)生并收集核苷－5’－磷酸酯,生產(chǎn)核苷－5’－磷酸酯。文檔編號C12N15/00GK1184157SQ9712293公開日1998年6月10日申請日期1997年11月21日優(yōu)先權(quán)日1996年11月21日發(fā)明者三原康博,宇多川隆,山田秀明,淺野泰久申請人:味之素株式會社