專利名稱：從哺乳類細(xì)胞中獲得腦型乙酰膽堿酯酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物細(xì)胞中分離純化酶的方法，尤其是關(guān)于從非神經(jīng)、非紅細(xì)胞源的哺乳類細(xì)胞中分離純化腦型乙酰膽堿酯酶的方法。
乙酰膽堿酯酶(EC 3.1.17，acetylcholinesterase，AChE)是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶。主要存在于電鰩的電器官、哺乳動(dòng)物的膽堿能神經(jīng)、神經(jīng)-肌接頭、紅細(xì)胞膜(Zakut H，et al.J-Clin-Invest.1990，86(3)900-8)以及嚙齒動(dòng)物的巨核細(xì)胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan，Multidisplinary approaches tocholinesterase functions.1992 Plenum Press，New York)。乙酰膽堿酯酶以所在位置可分為神經(jīng)肌肉型和紅細(xì)胞型。按照分子結(jié)構(gòu)可分為‘不同亞單位多聚體型’(heteromeric class)和‘相同亞單位多聚體型’(homomeric class)。不同亞單位多聚體型的催化亞單位與三螺旋膠原亞單位連接或與脂類連接。相同亞單位多聚體型又分為親水性(hydrophilic)和親脂性(glycophospholipid-linked)等亞型。紅細(xì)胞膜上的乙酰膽堿酯酶四聚體分子量約260KDa。乙酰膽堿酯酶的功能，在膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)是水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，使之生成膽堿和乙酸。也有報(bào)道認(rèn)為乙酰膽堿酯酶具有絲氨酸蛋白酶的水解蛋白活性。近年來，由于體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株也檢測(cè)到AChE mRNA的轉(zhuǎn)錄和化療后的卵巢癌患者的血清檢測(cè)到乙酰膽堿酯酶活性，有作者認(rèn)為乙酰膽堿酯酶與腫瘤發(fā)生有關(guān)(Lev-LehmanE，et al.Blood.1997，89(10)3644-53)。
目前世界上商品化的乙酰膽堿酯酶，主要從人紅細(xì)胞，牛紅細(xì)胞，血清和電鰩等放電魚類的電器官分離得到的，沒有人腦的乙酰膽堿酯酶，究其原因，就是很難獲得人腦用以分離純化乙酰膽堿酯酶，因此，就人腦乙酰膽堿酯酶而言，市場(chǎng)供應(yīng)是空白。
乙酰膽堿酯酶是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的酶，除了作為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶之外，其它細(xì)胞表達(dá)的乙酰膽堿酯酶的功能和意義仍然不清楚，研究人類乙酰膽堿酯酶，必需要以人類細(xì)胞產(chǎn)生的酶為對(duì)象，因此，對(duì)該酶的需要量很大。以人腦為來源分離得到乙酰膽堿酯酶的途徑是有限的。如果有一個(gè)來源廣泛易得，簡(jiǎn)單可靠的方法得到這種酶，就為研究開了方便之門。
另外，研究證明老年性癡呆患者病灶處有大量的乙酰膽堿酯酶存在，而且，與神經(jīng)遞質(zhì)降解功能無關(guān)，那么它的出現(xiàn)意義是什么？如何研究它們？還有，已經(jīng)證明老年性癡呆患者病灶處有凋亡細(xì)胞存在，那么二者有什么關(guān)系？這些都不清楚。要得到大量人腦來源的乙酰膽堿酯酶又很困難。本發(fā)明人多年來一直致力于在這領(lǐng)域中從事研究工作，從凋亡細(xì)胞中分離到腦型乙酰膽堿酯酶，用這種酶替代從人腦分離純化的乙酰膽堿酯酶，其意義十分重大。
本發(fā)明目的是提供從哺乳動(dòng)物包括人類的細(xì)胞株，除了已知的神經(jīng)和紅細(xì)胞外，正常狀態(tài)下并不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)凋亡后得到乙酰膽堿酯酶的方法。
本發(fā)明是一種從哺乳類細(xì)胞中獲得乙酰膽堿酯酶的方法，是從哺乳動(dòng)物包括人類的一切細(xì)胞株(神經(jīng)細(xì)胞和紅細(xì)胞除外)經(jīng)過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使之表達(dá)乙酰膽堿酯酶，再經(jīng)過裂解細(xì)胞，tacrine親和柱層析分離純化，獲得腦型乙酰膽堿酯酶的方法。
本發(fā)明從哺乳類細(xì)胞中獲得乙酰膽堿酯酶的方法，在科學(xué)研究中是一個(gè)嶄新創(chuàng)舉。其原理是正常情況下不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞在細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)腦型乙酰膽堿酯酶。因此，本方法首先是要獲得凋亡細(xì)胞，然后收集經(jīng)過誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞，分別抽提mRNA，DNA和蛋白質(zhì)，可分別得到大量的乙酰膽堿酯酶AChE mRNA及其反轉(zhuǎn)錄RT-PCR產(chǎn)物、梯形DNA片斷和有活性的乙酰膽堿酯酶。
本方法使用了非腫瘤細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞株，非腫瘤細(xì)胞株包括人肺成纖維細(xì)胞(HLF)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠內(nèi)皮細(xì)胞(SIEC)、小鼠成纖維細(xì)胞株(NIH/3T3)、大鼠肝細(xì)胞株(BRL)、大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC)。腫瘤細(xì)胞株包括HELA和PC-3、HL-60、M07e、HEL、DAMI等等。
誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以采用多種方法，其中有物理(輻射)、化學(xué)(化療藥物)和生物(加或減細(xì)胞因子)方法和自然衰老法。自然衰老法最簡(jiǎn)單和廉價(jià)。
自然衰老法培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，如HLF和PC-3細(xì)胞株，3-4天不換培養(yǎng)液，這時(shí)，部分細(xì)胞失去貼壁能力，進(jìn)入了凋亡過程，收集這時(shí)的懸浮細(xì)胞可得到大量的乙酰膽堿酯酶。如果是懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，如HL-60在不換培養(yǎng)液的情況下，部分細(xì)胞開始凝聚成團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞已經(jīng)到了凋亡后期(參見圖4，出現(xiàn)DNA斷裂)，呈現(xiàn)出棉絮狀小球，收集這時(shí)的細(xì)胞也可得到大量的乙酰膽堿酯酶。
化療藥物誘導(dǎo)法用抗腫瘤藥物柔紅霉素加入到HELA細(xì)胞培養(yǎng)液中，一定時(shí)間后細(xì)胞大量凋亡，收集這時(shí)的細(xì)胞可得到大量乙酰膽堿酯酶。
去細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方法對(duì)于細(xì)胞因子依賴的細(xì)胞株，如人M07e巨核細(xì)胞株，只要在培養(yǎng)液中不加入GM-CSF，2-3天后，大量細(xì)胞發(fā)生凋亡，收集這時(shí)的細(xì)胞可得到大量的乙酰膽堿酯酶。
輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方法5Gyγ-射線照射培養(yǎng)的細(xì)胞，4小時(shí)后收集細(xì)胞可得到大量乙酰膽堿酯酶。
例如從凋亡HLF和凋亡HL-60細(xì)胞分別抽提DNA，進(jìn)行瓊脂糖電泳，可見200bp以上不同大小的DNA片斷(圖4)，證明這些細(xì)胞的確發(fā)生了凋亡，梯形DNA片斷電泳圖是目前鑒別細(xì)胞凋亡的最可靠的證據(jù)。從沒有凋亡的細(xì)胞中檢測(cè)不到AChE活性，而從凋亡細(xì)胞中檢測(cè)出AChE活性，表明凋亡細(xì)胞能表達(dá)乙酰膽堿酯酶。
得到了含有乙酰膽堿酯酶的凋亡細(xì)胞，然后進(jìn)行乙酰膽堿酯酶分離與鑒定。鑒定腦型乙酰膽堿酯酶可從兩個(gè)層次進(jìn)行，一是在轉(zhuǎn)錄水平，即用RT-PCR的方法，檢測(cè)細(xì)胞是否AChE mRNA的轉(zhuǎn)錄。二是翻譯后的蛋白質(zhì)水平，即通過檢測(cè)該酶的活性和分離到該酶。
人的乙酰膽堿酯酶在基因組中的全序列已經(jīng)清楚，共10段，其中含有6個(gè)外顯子(Extron)和4個(gè)內(nèi)含子(Intron)，轉(zhuǎn)錄后有不同的剪切形式。常見的有三種，E1-E2-E3-E4-E6型(親水型也即腦型或“突觸型”)；E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI連接疏水型，也即紅細(xì)胞型)和E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI連接通讀型)。
1.轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)PCR引物設(shè)計(jì)及RT-PCR步驟，PCR引物設(shè)計(jì)序列如下(1)1522(+)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3′(2)2003(-)5′-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3′(3)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTrGAACACCGTGCTTC-3’(4)5’-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3’引物1和引物2分別位于AChE基因的E3及E6內(nèi)，用以檢測(cè)腦型AChEmRNA(E1-E2-E3-E4-E6)；引物1和引物3用以檢測(cè)通讀型，即E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI連接通讀型)；引物1和引物4用以檢測(cè)紅細(xì)胞型，即E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI連接疏水型)。本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到紅細(xì)胞型和通讀型。
RT-PCR步驟總RNA抽提后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，步驟按照該試劑的操作程序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.6％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。例如從失去貼壁能力的凋亡PC-3細(xì)胞抽提mRNA，用RT-PCR方法可追蹤到大量AChE mRNA的轉(zhuǎn)錄(圖1)，而貼壁的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC-3細(xì)胞則很難檢測(cè)到AChE mRNA的轉(zhuǎn)錄，也檢測(cè)不到乙酰膽堿酯酶的活性。引物如上所述，結(jié)果檢測(cè)到的是腦型AChE mRNA(E1-E2-E3-E4-E6)。(該引物擴(kuò)增的范圍在AChE基因1522到2003之間，PCR產(chǎn)物應(yīng)該是482bp)，而不是E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI連接疏水型，也即紅細(xì)胞型)也不是E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI連接通讀型)。
2.蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，可用下列步驟檢測(cè)蛋白質(zhì)水平的乙酰膽堿酯酶的特征。
第一步裂解細(xì)胞參照《分子克隆》一書配制裂解液，將裂解液加入細(xì)胞中裂解細(xì)胞，1000g離心5分鐘，去除未裂解的細(xì)胞碎片。
第二步tacrine親和柱分離凋亡細(xì)胞的乙酰膽堿酯酶參照文獻(xiàn)(Richard T，et al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)。
第三步乙酰膽堿酯酶活性鑒定活性鑒定和活性抑制實(shí)驗(yàn)可在細(xì)胞水平和電泳凝膠上進(jìn)行。配制乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液。檢測(cè)細(xì)胞或凝膠乙酰膽堿酯酶活性，使細(xì)胞在反應(yīng)液中室溫孵化4-12小時(shí)，如果有酶存在則出現(xiàn)黃褐色為陽(yáng)性反應(yīng)(見圖2)。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑BW284c51(Sigma公司)。如果活性反應(yīng)被抑制，證明該活性是由乙酰膽堿酯酶催化所至。
SDS-PAGE進(jìn)行分子量鑒定測(cè)定分子量使用目前國(guó)際通用的SDS-PAGE電泳方法。圖3就是SDS-PAGE電泳圖，圖中第5泳道是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物，其中最大的一條帶是牛血清白蛋白，分子量約67KDa，第4泳道是牛血清白蛋白(從Sigma公司購(gòu)買)，第3泳道是人紅細(xì)胞乙酰膽堿酯酶(從Sigma公司購(gòu)買)，第2泳道是本發(fā)明人從DAMI細(xì)胞株分離得的乙酰膽堿酯酶及第1泳道是本發(fā)明人從PC-3細(xì)胞株分離得的乙酰膽堿酯酶，分子量都是66KDa，與人神經(jīng)乙酰膽堿酯酶相似，是腦型乙酰膽堿酯酶。
綜合上述內(nèi)容，本發(fā)明人首次在國(guó)際上證明神經(jīng)和紅細(xì)胞以外的平時(shí)不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，表達(dá)乙酰膽堿酯酶的重要現(xiàn)象.證明1.哺乳動(dòng)物，如人，小鼠和大鼠細(xì)胞，一旦發(fā)生了凋亡，均表達(dá)乙酰膽堿酯酶，而且都是腦型，說明其進(jìn)化過程的保守性；2.腫瘤細(xì)胞株和原代培養(yǎng)的正常二倍體細(xì)胞，一旦發(fā)生了凋亡，就表達(dá)乙酰膽堿酯酶，說明乙酰膽堿酯酶的表達(dá)與腫瘤發(fā)生關(guān)系不大，而與細(xì)胞凋亡有關(guān)。有報(bào)道原發(fā)性腫瘤的組織活檢的材料未見乙酰膽堿酯酶的表達(dá)(Karpel R，et al.Experimental CellResearch，210268-277，1994)和原發(fā)性腫瘤化療前血清中檢測(cè)不到乙酰膽堿酯酶活性以及治療后多數(shù)患者血清中檢測(cè)到乙酰膽堿酯酶活性增高(Zakut H，et al.Cancer61727-737，1988)，這兩例報(bào)道對(duì)本發(fā)明的證明是一個(gè)很有力的支持。
本發(fā)明從哺乳類細(xì)胞中獲得乙酰膽堿酯酶的方法，可用作從凋亡細(xì)胞得到乙酰膽堿酯酶制備各種抗體用于商業(yè)。并在研究細(xì)胞凋亡與乙酰膽堿酯酶的表達(dá)有關(guān)的基礎(chǔ)上，用抗乙酰膽堿酯酶的方法，治療老年性癡呆癥過程中的進(jìn)行性細(xì)胞凋亡，可能有一定的意義。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明從哺乳動(dòng)物包括人類，除了已知的神經(jīng)和紅細(xì)胞外的一切細(xì)胞株，經(jīng)過誘導(dǎo)凋亡后得到腦型乙酰膽堿酯酶，在世界上是首次的。人類的老年性癡呆患者腦組織中存在乙酰膽堿酯酶，從人腦得到乙酰膽堿酯酶很不容易。用本發(fā)明的方法，任何一個(gè)能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件，就有能力并能方便地分離到這種酶。
本發(fā)明通過以下的附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但不限止本發(fā)明的范圍。


圖1.是PC-3細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
1 PCR標(biāo)記(bp)1，543 994 695 515 377；2使用引物1和引物3的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜，證明產(chǎn)物不是通讀型；3使用引物1和引物2的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜，PCR產(chǎn)物是482bp，證明凋亡過程中的PC-3轉(zhuǎn)錄的是腦型乙酰膽堿酯酶mRNA；4使用引物1和引物4的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜，證明產(chǎn)物不是紅細(xì)胞型。
圖2.從PC-3凋亡細(xì)胞中分離得到的乙酰膽堿酯酶活性反應(yīng)帶非變性PAGE電泳圖。
圖3.從PC-3和DAMI凋亡細(xì)胞分離得到的乙酰膽堿酯酶的SDS-PAGE電泳圖。
1從PC-3凋亡細(xì)胞分離得到的乙酰膽堿酯酶，分子量66KDa；2從DAMI凋亡細(xì)胞分離得到的乙酰膽堿酯酶，分子量66KDa；3人紅細(xì)胞乙酰膽堿酯酶，分子量66KDa；4牛血清白蛋白；5蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物，其中最大的一條帶是牛血清白蛋白，分子量67KDa.
圖4.HLF和HL-60細(xì)胞凋亡的DNA梯形片段瓊脂糖電泳圖。
1 123 DNA標(biāo)記，(從Sigma公司購(gòu)買)；2 人肺成纖維細(xì)胞株(HLF)，經(jīng)過誘導(dǎo)后的凋亡細(xì)胞，顯示DNA梯形片段；3 人白血病細(xì)胞株(HL-60)，經(jīng)過誘導(dǎo)后的凋亡細(xì)胞，顯示DNA梯形片段；4 人白血病細(xì)胞株(HL-60)，生長(zhǎng)良好，無DNA梯形片段，證明沒有發(fā)生細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例1 從人前列腺癌細(xì)胞株(PC-3)獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)人，腫瘤，化療藥物誘導(dǎo)凋亡)培養(yǎng)人PC-3細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)液RPMI Medium 1640(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加誘導(dǎo)藥物，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入2μM柔紅霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
鑒定腦型乙酰膽堿酯酶從兩個(gè)層次進(jìn)行，一是在轉(zhuǎn)錄水平，即用RT-PCR的方法，檢測(cè)細(xì)胞是否AChE mRNA的轉(zhuǎn)錄。二是翻譯后的蛋白質(zhì)水平，即通過檢測(cè)該酶的活性和分離到該酶。
1.轉(zhuǎn)錄水平PC-3細(xì)胞核酸抽提后，獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄到達(dá)cDNA，以該cDNA為模板作PCR。PCR引物及RT-PCR步驟PCR引物設(shè)計(jì)序列如下(1)1522(+)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3′(2)2003(-)5′-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3′(3)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3’(4)5’-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3’引物1和引物2分別位于AChE基因的E3及E6內(nèi)，用以檢測(cè)腦型AChEmRNA(E1-E2-E3-E4-E6)；引物1和引物3用以檢測(cè)通讀型，即E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI連接通讀型)；引物1和引物4用以檢測(cè)紅細(xì)胞型，即E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI連接疏水型。本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到紅細(xì)胞型和通讀型。
RT-PCR步驟總RNA抽提使用Boehringer，Mannheim公司的TripureTM分離試劑。cDNA合成使用Promega公司的隨機(jī)六引物，逆轉(zhuǎn)錄使用Boehringer，Mannheim公司的ExpendTM逆轉(zhuǎn)錄酶，方法按照該試劑的操作程序。PCR擴(kuò)增使用Perkin-Elmer公司的480擴(kuò)增儀，條件如下變性，94℃，1分鐘；退火65℃，1分鐘；延伸，72℃，1分鐘(最后一個(gè)循環(huán)5分鐘)；循環(huán)數(shù)，39次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.6％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
檢測(cè)到凋亡細(xì)胞中有大量AChEmRNA，其剪切形式是E1-E2-E3-E4-E6型(親水型也即腦型)見圖1，(該引物擴(kuò)增的范圍在1522到2003之間，PCR產(chǎn)物應(yīng)該是482bp)，而不是E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI連接疏水型，也即紅細(xì)胞型)也不是E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI連接通讀型)。
2.蛋白質(zhì)水平檢測(cè)第一步裂解細(xì)胞參照《分子克隆》一書配制裂解液(50mmol/Tris，Cl Ph8.0，150mmol/lNaCl，0.02μg疊氮鈉，1μg/ml抑蛋白酶肽(Aprotinin)，1％曲通(Triton X-100)。將裂解液加入細(xì)胞中裂解細(xì)胞，1000g離心5分鐘，去除未裂解的細(xì)胞碎片。
第二步tacrine親和柱分離凋亡細(xì)胞的乙酰膽堿酯酶參照文獻(xiàn)(Richard T，et al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)，用環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B(Epoxy-activated Sepharose 6B)10g，“Sigma公司，E-6754”，和13g9-aminoacridine HCl，“Aldrich公司No.A3840-1”制備Tacrine親和柱，首先用0.2M NaCl 50mMTris-HCl Ph8.0緩沖液平衡柱，樣品放在平衡液中上樣，流速0.3ml/分鐘。洗脫用10mM Tacrine，50mMTris-HClPh8.0洗脫液，洗脫的乙酰膽堿酯酶，再用10mMTris-HCl Ph8.0透析，換透析液三次，透析24小時(shí)。冷凍干燥。
第三步乙酰膽堿酯酶活性鑒定參照文獻(xiàn)(Richard T，et al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)。
活性鑒定和活性抑制實(shí)驗(yàn)可在細(xì)胞水平和電泳凝膠上進(jìn)行。配制乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液(0.1M磷酸緩沖液Ph6.0150ml，乙酰硫代膽堿100mg/200ml，0.1M檸檬酸鈉11ml，30mM硫酸銅20ml，5mM鐵氰化鉀20ml)。本實(shí)驗(yàn)中使用了Bio-RAD mini-PROTEIN II電泳儀，6％PAGE凝膠，取細(xì)胞裂解液，加入0.2％曲通X-100，進(jìn)行非變性電泳，電壓20伏，12小時(shí)，電泳后取出凝膠，放置在配制的乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液中反應(yīng)4小時(shí).結(jié)果有乙酰膽堿酯酶的地方出現(xiàn)黃褐色陽(yáng)性帶(圖2)，而其它蛋白質(zhì)則沒有陽(yáng)性反應(yīng)。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μMBW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。
SDS-PAGE進(jìn)行分子量鑒定使用SDS-PAGE電泳方法測(cè)定分子量，證明從凋亡的PC-3細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa(圖3中的第一泳道)，是腦型乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例2從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)人，非腫瘤，因子誘導(dǎo)凋亡)原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)液M199(Gibco)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加因子，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入5μg/ml TGF-β，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，所有步驟同實(shí)施例1。
SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分子量鑒定，證明從凋亡的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例3從人肺成纖維細(xì)胞獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)人，非腫瘤，自然衰老細(xì)胞凋亡)貼壁生長(zhǎng)的人肺成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)液RPMI1640(Gibco)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。不加因子，4天不換培養(yǎng)液，4天后收集細(xì)胞。
1.核酸水平檢測(cè)同實(shí)施例1，凋亡細(xì)胞用RT-PCR可追蹤到腦型AChEmRNA表達(dá)，而貼壁的正常細(xì)胞則無腦型AChE mRNA表達(dá)。2.蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，所有步驟同實(shí)施例1。
SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分子量鑒定，證明從凋亡的人肺成纖維細(xì)胞獲得乙酰膽堿酯酶中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例4從人白血病細(xì)胞株(HL-60)獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)人，腫瘤，化療藥物誘導(dǎo)凋亡)懸浮培養(yǎng)人白血病細(xì)胞株(HL-60)，培養(yǎng)液RPMI Medium 1640(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加誘導(dǎo)藥物，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入2μM柔紅霉素(daunombicin，Italy)，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
1.核酸水平檢測(cè)同實(shí)施例1，凋亡細(xì)胞用RT-PCR可追蹤到腦型AChEmRNA表達(dá)，而正常細(xì)胞則無腦型AChE mRNA表達(dá)。
2.蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，所有步驟同實(shí)施例1。
SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分子量鑒定，證明從凋亡的HL-60細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例5從人巨核細(xì)胞株(M07e)獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)人，腫瘤細(xì)胞，去細(xì)胞因子誘導(dǎo)凋亡)培養(yǎng)人M07e細(xì)胞，懸浮生長(zhǎng)。培養(yǎng)液α-Medium，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于該細(xì)胞株是細(xì)胞因子GM-CSF依賴型的，因此對(duì)照組加GM-CSF 2.5ng/ml，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組不加入GM-CSF，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，所有步驟同實(shí)施例1。
SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分子量鑒定，證明從凋亡的M07e細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶.
實(shí)施例6從人巨核細(xì)胞株(DAMI)獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)人，腫瘤細(xì)胞，自然衰老細(xì)胞凋亡)培養(yǎng)人DAMI細(xì)胞，懸浮生長(zhǎng)。培養(yǎng)液RPMI Medium 1640，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4天不換培養(yǎng)液，4天后收集凋亡細(xì)胞。
蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，所有步驟同實(shí)施例1。
SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分子量鑒定，證明從凋亡的DAMI細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶.
實(shí)施例7從小鼠成纖維細(xì)胞株(NIH/3T3)獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)小鼠，非腫瘤，自然衰老細(xì)胞凋亡)貼壁生長(zhǎng)的NIH/3T3細(xì)胞，培養(yǎng)液RPMI Medium 1640(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。不加因子，3-4天不換培養(yǎng)液，第四天收集細(xì)胞。
蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，所有步驟同實(shí)施例1，凋亡的細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性反應(yīng)陽(yáng)性。
SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分子量鑒定，證明從凋亡的NIH/3T3細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例8從大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株獲得乙酰膽堿酯酶(特點(diǎn)大鼠，非腫瘤，因子誘導(dǎo)凋亡)貼壁生長(zhǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)液M199(GibcoBRL)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加因子，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入5μg/ml TGF-β，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，所有步驟同施例1。凋亡的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中乙酰膽堿酯酶活性反應(yīng)陽(yáng)性。
SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行分子量鑒定，證明從凋亡的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)是66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例9檢測(cè)HLF凋亡細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)HLF細(xì)胞的DNA抽提方法參見文獻(xiàn)(Jaffrezou JP，et al.The EMBOJournal，152417-2424，1996)，正常及衰老的細(xì)胞(2-3×106)分別離心，沉淀用PBS洗滌，再離心后沉淀用40μl的0.2M磷酸氫二鈉/0.1M檸檬酸(1928)重懸，室溫放置60分鐘。然后2000g離心30分鐘，上清轉(zhuǎn)入1.5mlEppendorf管，加入3μl 0.25％NP-40及3μlRNaseA(10mg/ml)，37℃溫育60分鐘，再加入3μl蛋白酶K(10mg/ml)，50℃溫育30分鐘。反應(yīng)完畢加入5μl加樣緩沖液，1％瓊脂糖凝膠電泳。見圖4中的2，顯示DNA片段呈梯形，這是細(xì)胞凋亡最可靠的證據(jù)。
實(shí)施例10檢測(cè)HL-60凋亡細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)HL-60細(xì)胞的DNA抽提方法參見文獻(xiàn)(Jaffrezou JP，et al.The EMBOJournal，152417-2424，1996)，正常及衰老的細(xì)胞(2-3×106)分別離心，沉淀用PBS洗滌，再離心后沉淀用40μl的0.2M磷酸氫二鈉/0.1M檸檬酸(192∶8)重懸，室溫放置60分鐘。然后2000g離心30分鐘，上清轉(zhuǎn)入1.5mlEppendorf管，加入3μl 0.25％NP-40及3μl RNaseA(10mg/ml)，37℃溫育60分鐘，再加入3μl蛋白酶K(10mg/ml)，50℃溫育30分鐘。反應(yīng)完畢加入5μl加樣緩沖液，1％瓊脂糖凝膠電泳。見圖4中的3，顯示DNA片段呈梯形，這是細(xì)胞凋亡最可靠的證據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種從哺乳類細(xì)胞中獲得乙酰膽堿酯酶的方法，其特征在于該法是從哺乳動(dòng)物包括人類的一切細(xì)胞(除神經(jīng)細(xì)胞和紅細(xì)胞外)經(jīng)過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使之表達(dá)乙酰膽堿酯酶，再經(jīng)過裂解細(xì)胞，tacrine親和柱層析，分離純化得到乙酰膽堿酯酶。
2.如權(quán)利要求1所述的從哺乳類細(xì)胞中獲得乙酰膽堿酯酶的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以采用自然衰老法、化療藥物誘導(dǎo)法、去細(xì)胞因子誘導(dǎo)法或輻射誘導(dǎo)法。
3.如權(quán)利要求1所述的從哺乳類細(xì)胞中獲得乙酰膽堿酯酶的方法，其特征在于得到的乙酰膽堿酯酶是分子量66KDa的腦型乙酰膽堿酯酶。
全文摘要
本發(fā)明在世界上首次證明凋亡的哺乳細(xì)胞表達(dá)乙酰膽堿酯酶,提出從哺乳動(dòng)物的一切細(xì)胞(除神經(jīng)細(xì)胞和紅細(xì)胞外),經(jīng)過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使之表達(dá)乙酰膽堿酯酶,再經(jīng)過裂解細(xì)胞,tacrine親和柱層析,分離純化獲得純度較高的分子量66KDa的腦型乙酰膽堿酯酶的方法。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1186117SQ9712521
公開日1998年7月1日 申請(qǐng)日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者張學(xué)軍, 趙倩, 賀恒益, 莫彤惟, 郭禮和 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所