專利名稱：抗腫瘤藥物篩選和臨床化療效果判斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物效果判斷方法，尤其是關(guān)于通過檢測(cè)正常不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的哺乳類細(xì)胞中的乙酰膽堿酯酶活性，鑒定是否發(fā)生細(xì)胞凋亡，用于抗腫瘤藥物篩選和臨床化療效果判斷的方法。
已經(jīng)知道臨床用于治療腫瘤的化療藥物，都是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用的。那么抗癌藥物治療腫瘤的效果如何，是否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，至今沒有一種鑒定體內(nèi)細(xì)胞凋亡的手段。人們不可能為了檢測(cè)抗腫瘤藥物的效果而每次從人體內(nèi)取出組織進(jìn)行電泳分析是否發(fā)生了細(xì)胞凋亡。而且，不同的腫瘤，不同的患者，對(duì)各種化療藥物的反應(yīng)是不同的，有的抗腫瘤藥物在這個(gè)患者身上療效很好，而對(duì)另一個(gè)患者療效就不好。如果有一種新的鑒定細(xì)胞凋亡的手段，就象對(duì)細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)菢?，?duì)于臨床指導(dǎo)選擇腫瘤化療藥物和藥物學(xué)研究中抗癌藥物的篩選那就會(huì)有的放矢。給患者帶來福音。
體外實(shí)驗(yàn)鑒別細(xì)胞凋亡常用的可靠手段是瓊脂糖電泳顯示DNA片段梯形(Wylie AH，et al.Am J Pathol 10978-87，1982；Peitsch MC，et al.The EMBOJournal 12371-377，1993；)，涂片或組織切片原位標(biāo)記斷裂DNA，如TUNEL方法(Stammler G and M Volm，Apoptosis 195-99，1996)以及FACS顯示凋亡峰(Bergamaschi G et al.Haematologica 7986-93，1994)。然而，有些凋亡細(xì)胞既追蹤不到DNA片段梯形也沒發(fā)現(xiàn)FACS顯示凋亡峰(Di-Pietro R，et al.Cytokine9463-470，1997)，由此可見，探索一種新的鑒定凋亡細(xì)胞的手段很有必要。
本發(fā)明目的是提供一種抗腫瘤藥物篩選和臨床化療效果判斷的方法，該法是通過檢測(cè)由抗腫瘤藥物體外作用于不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞后，細(xì)胞表達(dá)的乙酰膽堿酯酶活性，或測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶活性來鑒定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，籍此篩選抗腫瘤藥物及對(duì)腫瘤病人臨床化療效果進(jìn)行判斷。
經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)論證，本發(fā)明人首次在國(guó)際上證明哺乳動(dòng)物細(xì)胞(除神經(jīng)細(xì)胞和紅細(xì)胞外)在發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，凋亡細(xì)胞表達(dá)乙酰膽堿酯酶。歸納如下1.哺乳動(dòng)物，如人，小鼠和大鼠細(xì)胞(除神經(jīng)細(xì)胞和紅細(xì)胞外)，一旦發(fā)生了凋亡，均表達(dá)乙酰膽堿酯酶，說明其進(jìn)化過程的保守性。2.不論是腫瘤細(xì)胞株還是原代培養(yǎng)的正常二倍體細(xì)胞，一旦發(fā)生了凋亡，就表達(dá)乙酰膽堿酯酶，說明乙酰膽堿酯酶的表達(dá)與腫瘤發(fā)生關(guān)系不大，而與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，通過實(shí)施例3、實(shí)施例7和實(shí)施例8，提供了非腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)乙酰膽堿酯酶的直接證據(jù)。另外Zakut等作者(Zakut H，et al.Cancer 61727-737，1988)調(diào)查的腫瘤病人治療前血清乙酰膽堿酯酶活性不高，和Karpel等作者(Karpel R，et al。ExperimentalCell Research 210268-277，1994)報(bào)道在原發(fā)性腫瘤的活檢組織中追蹤不到任何乙酰膽堿酯酶mRNA的表達(dá)，都有力地支持我們的論點(diǎn)。
本發(fā)明根據(jù)這個(gè)原理，以檢測(cè)正常不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(除神經(jīng)細(xì)胞和紅細(xì)胞外)是否表達(dá)了乙酰膽堿酯酶為依據(jù)，判斷該細(xì)胞是否發(fā)生了凋亡。通過檢測(cè)由抗腫瘤藥物體外作用于不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞后，細(xì)胞表達(dá)的乙酰膽堿酯酶活性，或測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶活性，作為判斷細(xì)胞凋亡的手段，籍此篩選抗腫瘤藥物，幫助醫(yī)生選擇針對(duì)病人特別敏感的化療藥物，以提高治療效果。
1.體外實(shí)驗(yàn)篩選抗腫瘤藥物研究抗腫瘤新藥，要在眾多的候選藥物中進(jìn)行篩選，能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一個(gè)重要指標(biāo)。本發(fā)明方法可用以體外實(shí)驗(yàn)篩選抗腫瘤新藥。
體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞株，加入所要檢測(cè)的不同劑量的抗腫瘤候選藥物，在18-20小時(shí)后，采用“血漿凝塊法”或“聚丙烯酰胺凝膠法”，使懸浮的細(xì)胞處于半固體凝塊中。1％多聚甲醛固定10分鐘，用濾紙吸干水分，再作乙酰膽堿酯酶活性染色。配制乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液(0.1M磷酸緩沖液Ph 6.0150ml，乙酰硫代膽堿100mg/200ml，0.1M檸檬酸鈉11ml，30mM硫酸銅20ml，5mM鐵氰化鉀20ml)，進(jìn)行酶反應(yīng)。檢測(cè)細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性時(shí)，使細(xì)胞在反應(yīng)液中室溫孵化6-12小時(shí)，呈黃褐色為陽(yáng)性反應(yīng)。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑。如果活性反應(yīng)被抑制，證明該活性是由乙酰膽堿酯酶催化所至。本實(shí)驗(yàn)中非變性電泳分離的蛋白，乙酰膽堿酯酶活性反應(yīng)陽(yáng)性，該活性可被BW284c51抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。上述陽(yáng)性反應(yīng)，說明該藥物已經(jīng)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，是有效的抗腫瘤藥物。
2.臨床腫瘤患者化療效果判斷在用抗菌素治療細(xì)菌引起的疾病時(shí)，由于抗菌素的廣泛使用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，對(duì)某些人的感染性疾病，有的抗菌素效果不佳。這時(shí)，醫(yī)生往往取出患者病灶部細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，以便找到針對(duì)性抗菌素治療有耐藥菌株的病人，取得最佳效果。
對(duì)于不同的腫瘤，不同的患者，對(duì)各種化療藥物的反應(yīng)是不同的，有的抗腫瘤藥物在這個(gè)患者身上療效很好，而對(duì)另一個(gè)患者療效就不好。本發(fā)明方法，就象上述對(duì)細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)菢樱軒椭R床醫(yī)生有針對(duì)性選擇腫瘤化療藥物，有的放矢，在最短時(shí)間內(nèi)找到最佳藥物，給患者帶來福音。
化療藥物是針對(duì)腫瘤細(xì)胞，使之發(fā)生凋亡，從而達(dá)到治療的目的。本發(fā)明建立在科學(xué)研究新發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)之上。其原理是正常情況下不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞在細(xì)胞凋亡過程中大量表達(dá)乙酰膽堿酯酶，主要集中到細(xì)胞核內(nèi)，隨著細(xì)胞核被形成凋亡小體，乙酰膽堿酯酶就存在于凋亡小體內(nèi)。正常人或腫瘤患者在沒有治療的情況下，體內(nèi)雖然不斷有細(xì)胞凋亡，但數(shù)量少，凋亡細(xì)胞很快被周圍的巨噬細(xì)胞吞噬，凋亡細(xì)胞內(nèi)的乙酰膽堿酯酶不釋放到血液中。但是，如果有效的化療藥物，使得腫瘤細(xì)胞大量凋亡，巨噬細(xì)胞還不能很快吞噬所有的凋亡細(xì)胞，或者受藥物影響，巨噬細(xì)胞吞噬能力降低，不能很快吞噬凋亡細(xì)胞，這時(shí)大量的乙酰膽堿酯酶隨凋亡細(xì)胞及凋亡小體進(jìn)入血液中。此時(shí)取患者血清測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶活性，就會(huì)發(fā)現(xiàn)它的活性比正常人或治療前高出3-6倍。因此，測(cè)定患者治療前后血清乙酰膽堿酯酶活性，就知道化療效果如何，幫助臨床醫(yī)生在最短時(shí)間內(nèi)找到有針對(duì)性最佳的腫瘤化療藥物，有的放矢，為挽救病人的生命，爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。
如果患者是白血病，可直接取病人血液，用FICOLL 400(Gibco BRL公司)分離，去紅細(xì)胞后，分成若干分，培養(yǎng)在35mm的培養(yǎng)皿中，加入不同的化療藥物，18-20小時(shí)后，采用“血漿凝塊法”或“聚丙烯酰胺凝塊法”，使懸浮的細(xì)胞處于半固體凝塊中。1％多聚甲醛固定10分鐘，用濾紙吸干水分，再作乙酰膽堿酯酶活性染色。配制乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液(0.1M磷酸緩沖液Ph 6.0 150ml，乙酰硫代膽堿100mg/200ml，0.1M檸檬酸鈉11ml，30mM硫酸銅20ml，5mM鐵氰化鉀20ml)，進(jìn)行酶反應(yīng)。檢測(cè)細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性時(shí)，使細(xì)胞在反應(yīng)液中室溫孵化6-12小時(shí)，呈黃褐色為陽(yáng)性反應(yīng)。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑。如果活性反應(yīng)被抑制，證明該活性是由乙酰膽堿酯酶催化所至。本實(shí)驗(yàn)中非變性電泳分離的蛋白，乙酰膽堿酯酶活性反應(yīng)陽(yáng)性，該活性可被BW284c51抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶，表明患者使用的化療藥物誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，是有效的化療藥物。
如果是實(shí)體腫瘤則可通過測(cè)定治療前后的血清乙酰膽堿酯酶活性來判斷，如果治療后酶活性比治療前活性高出3-6倍，這表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡，說明化療效果好，可以幫助臨床醫(yī)生針對(duì)性選擇化療藥物。測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶的方法，參見Uete T，et alClin.Biochem.J 327-333，1970。
還有一種測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶被抑制后剩余活性的方法，本發(fā)明人借助Zakut H et alCancer 61727-737，1988的方法.Zakut等作者測(cè)定了77例治療后患者、11例治療前患者和21例正常人血清乙酰膽堿酯酶BW抑制后的剩余活性，結(jié)果經(jīng)過1×10-5BW抑制后測(cè)定的乙酰膽堿酯酶發(fā)現(xiàn)治療后酶活性明顯升高，但是他們沒有證明與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，更沒有提出作為判斷細(xì)胞凋亡和治療效果的作用。根據(jù)本發(fā)明人證明凋亡細(xì)胞表達(dá)乙酰膽堿酯酶的結(jié)果，提出借助他們測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶的方法，鑒定化療效果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法是通過檢測(cè)由抗腫瘤藥物體外作用于不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞后，細(xì)胞表達(dá)乙酰膽堿酯酶活性，或測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶活性來鑒定是否發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞乙酰膽堿酯酶反應(yīng)陽(yáng)性，說明該藥物已經(jīng)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，是有效的抗腫瘤藥物，籍此能方便有效地篩選抗腫瘤藥物，還可幫助醫(yī)生選擇針對(duì)病人特別敏感的化療藥物，以提高治療效果。用本發(fā)明方法檢測(cè)乙酰膽堿酯酶活性來鑒定體外培養(yǎng)的凋亡細(xì)胞的結(jié)果與經(jīng)典方法是一致的。而且定位準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)單易行，不需要昂貴的設(shè)備，也不要太昂貴的試劑，可以定性也可以定量分析。
本發(fā)明通過以下的附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限止本發(fā)明的范圍。


圖1.HLF和HL-60細(xì)胞凋亡的DNA梯形片段瓊脂糖電泳圖。
(1)123 DNA標(biāo)記，(從Sigma公司購(gòu)買)；(2)人肺成纖維細(xì)胞株(HLF)，經(jīng)過誘導(dǎo)后的凋亡細(xì)胞，顯示DNA梯形片段；(3)人白血病細(xì)胞株(HL-60)，經(jīng)過誘導(dǎo)后的凋亡細(xì)胞，顯示DNA梯形片段；(4)人白血病細(xì)胞株(HL-60)，生長(zhǎng)良好，無DNA梯形片段，證明沒有發(fā)生細(xì)胞凋亡。
圖2.FACS顯示HL-60細(xì)胞凋亡的凋亡峰圖。其中A是凋亡峰，B是G0-G1期，C是G2-M期。
圖3.光學(xué)顯微鏡顯示HL-60細(xì)胞，左側(cè)園而光滑并無底物陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞是正常細(xì)胞，右側(cè)形態(tài)不規(guī)則，棕色反應(yīng)的細(xì)胞是凋亡細(xì)胞?！?00。
圖4.光學(xué)顯微鏡顯示HL-60細(xì)胞，左側(cè)園而光滑并無底物陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞是正常細(xì)胞，右側(cè)形態(tài)不規(guī)則，棕色反應(yīng)的細(xì)胞是凋亡細(xì)胞?！?00。
圖5.光學(xué)顯微鏡顯示HL-60細(xì)胞，左側(cè)園而光滑并無底物陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞是正常細(xì)胞，右側(cè)形態(tài)不規(guī)則，已經(jīng)形成凋亡小體，棕色反應(yīng)的細(xì)胞是凋亡細(xì)胞?！?00。
圖6.光學(xué)顯微鏡顯示HL-60細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，已經(jīng)形成凋亡小體，棕色反應(yīng)的細(xì)胞是凋亡細(xì)胞。×300。
圖7.HL-60細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
(1)PCR標(biāo)記(bp)1,543 994 695 515 377；(2)使用引物1和引物2的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜，PCR產(chǎn)物是482bp，證明凋亡過程中的HL-60細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的是腦型乙酰膽堿酯酶mRNA；(3)使用引物1和引物3的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜，證明產(chǎn)物不是通讀型；(4)使用引物1和引物4的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜，證明產(chǎn)物不是紅細(xì)胞型。
圖8.用聚丙烯酰胺凝膠塊法檢測(cè)HLF細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是凋亡細(xì)胞，×500。
圖9.直接檢測(cè)貼壁的HLF細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是凋亡細(xì)胞，其中有凋亡小體，×300。
圖10.用血漿凝塊法檢測(cè)PC-3細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是凋亡細(xì)胞?！?00。
圖11.用血漿凝塊法檢測(cè)M07e細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是凋亡細(xì)胞，凋亡小體尤其明顯。×400圖12.用血漿凝塊法檢測(cè)HELA細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是后期凋亡細(xì)胞，并且出現(xiàn)泡狀突起?！?00。
圖13.用血漿凝塊法檢測(cè)HELA細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是早期凋亡細(xì)胞，酶分布于整個(gè)細(xì)胞。×400。
圖14.用血漿凝塊法檢測(cè)HELA細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是中期凋亡細(xì)胞，酶集中于細(xì)胞核內(nèi)?！?00。
圖15.用血漿凝塊法檢測(cè)HIH/3T3細(xì)胞，棕色反應(yīng)的是凋亡細(xì)胞，×300。
圖16.大鼠主動(dòng)脈平滑肌凋亡細(xì)胞透射電子顯微鏡圖，核內(nèi)乙酰膽堿酯酶陽(yáng)性，核開始形成凋亡小體，×11500。
實(shí)施例1抗腫瘤藥物作用于HL-60細(xì)胞引起凋亡的鑒定懸浮培養(yǎng)人白血病細(xì)胞株(HL-60)，培養(yǎng)液RPMI Medium 1640(GibcoBRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加抗腫瘤藥物，實(shí)驗(yàn)組加入1μM抗腫瘤藥物柔紅霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小時(shí)后收集凋亡細(xì)胞。為了確認(rèn)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)，本發(fā)明人首先用經(jīng)典的方法鑒別細(xì)胞凋亡，然后，用本發(fā)明的方法鑒定凋亡細(xì)胞，并且進(jìn)行比較。
經(jīng)典的方法鑒別細(xì)胞凋亡(1)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA片段HL-60細(xì)胞的DNA抽提方法參見文獻(xiàn)(Jaffrezou JP，et al The EMBOJournal 152417-2424，1996)，正常及凋亡的細(xì)胞(2-3×106)分別離心，沉淀物用PBS洗滌，再離心后沉淀物用40μl的0.2M磷酸氫二鈉/0.1M檸檬酸(192∶8)重懸，室溫放置60分鐘。然后2000g離心30分鐘，上清轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管，加入3μl 0.25％NP-40及3μl RNase A(10mg/ml)，37℃溫育60分鐘，再加入3μl蛋白酶K(10mg/ml)，50℃溫育30分鐘。反應(yīng)完畢加入5μl加樣緩沖液，1％瓊脂糖凝膠電泳。見圖1中的3，顯示DNA片段呈梯形，而正常組則無梯形變化(圖1中的4)，這是細(xì)胞凋亡最可靠的證據(jù)。
(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡峰(參見Bedi A，et a1.Blood 832-38-2-44，1994)50％乙醇固定誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞，0.1％曲通(Triton X-100)室溫處理細(xì)胞5分鐘，再用5μg/ml RNAse在37℃孵化15分鐘，50μg/ml PI(Propidium iodide)在4℃染色60分鐘，然后用流式細(xì)胞儀(FACscan，USA)追蹤特征性的DNA碎片形成的凋亡峰和G0/G1，S/G2和M期的細(xì)胞(見圖2)。
(3)凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖3-圖6中可見部分細(xì)胞核固縮，細(xì)胞膜呈泡狀結(jié)構(gòu)，凋亡小體，這些是典型的凋亡細(xì)胞(Kerr JFR，et al.26239-257，1972；Plunkett W.Apoptosis-the story of suicide in the cell，CBC Oxford，UK，1995)。
本發(fā)明對(duì)體培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性鑒定可在細(xì)胞水平實(shí)施。細(xì)胞可以在懸浮狀態(tài)進(jìn)行酶活性反應(yīng)，也可以在貼壁狀態(tài)進(jìn)行酶活性反應(yīng)，采用血漿凝塊法，目的是使細(xì)胞處于半固體的網(wǎng)狀支架中，以避免酶反應(yīng)后的游離生成物附著在細(xì)胞表面，造成假陽(yáng)性。整個(gè)步驟是血漿凝塊法(使細(xì)胞處于半固體的網(wǎng)狀支架中)-固定-吸干-酶反應(yīng)-顯微鏡觀察。
操作過程血漿凝塊法取上述經(jīng)過抗腫瘤藥物作用后，并且用經(jīng)典方法證明是凋亡的同一批的細(xì)胞懸液(凋亡細(xì)胞和原培養(yǎng)液)0.8ml，3.4％CaCl20.1ml，牛純血漿(Gibco公司)0.1ml，將三者混勻后，立即加入到直徑35mm的塑料培養(yǎng)碟中，放置在37℃孵化15分鐘，凝固后固定。
固定1％多聚甲醛1ml加入塑料培養(yǎng)碟中固定10分鐘，倒掉固定液。
吸干用直徑34mm的濾紙5張，吸干剩余的水分。加入底物進(jìn)行酶反應(yīng)。
酶反應(yīng)配制乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液(0.1M磷酸緩沖液Ph 6.0 150ml，乙酰硫代膽堿100mg/200ml，0.1M檸檬酸鈉11ml，30mM硫酸銅20ml，5mM鐵氰化鉀20ml)。在室溫下反應(yīng)6-12小時(shí)，去反應(yīng)液，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。
光學(xué)顯微鏡下觀察乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞出現(xiàn)黃褐色反應(yīng)(圖3，圖4，圖5，圖6)，而正常細(xì)胞沒有陽(yáng)性反應(yīng)。圖3-5中，左側(cè)的細(xì)胞正常，細(xì)胞表面平滑，細(xì)胞內(nèi)無酶陽(yáng)性反應(yīng)；右側(cè)的細(xì)胞是凋亡細(xì)胞，細(xì)胞固縮，表面有小泡狀突起，有些細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)凋亡小體(圖6十分明顯)，正是這樣的凋亡細(xì)胞，乙酰膽堿酯酶呈陽(yáng)性反應(yīng)。這個(gè)結(jié)果與經(jīng)典方法判斷細(xì)胞凋亡是一致的。而且，非常具體地顯示那個(gè)細(xì)胞凋亡，還可定量分析各個(gè)階段凋亡數(shù)和凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞數(shù)的比例，不象電泳和FACS顯示的是總體細(xì)胞內(nèi)有凋亡細(xì)胞。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。關(guān)于乙酰膽堿酯酶的類型證明，見實(shí)施例2。
從這個(gè)結(jié)果可見，HL-60凋亡細(xì)胞乙酰膽堿酯酶反應(yīng)陽(yáng)性，正常細(xì)胞則陰性反應(yīng)，將細(xì)胞形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道的凋亡細(xì)胞形態(tài)比較，結(jié)果完全相吻合，表明該腫瘤藥物已經(jīng)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，是有效的抗腫瘤藥物。
實(shí)施例2乙酰膽堿酯酶類型的鑒定實(shí)施例1中證明HL-60凋亡細(xì)胞表達(dá)乙酰膽堿酯酶，那么是哪個(gè)類型的AChE呢？這里作了進(jìn)一步的證明。鑒定乙酰膽堿酯酶從兩個(gè)層次進(jìn)行，一是在轉(zhuǎn)錄水平，即用RT-PCR的方法，檢測(cè)細(xì)胞是否有AChE mRNA的轉(zhuǎn)錄。二是翻譯后的蛋白質(zhì)水平，即通過檢測(cè)該酶的活性和分離到該酶。
1.轉(zhuǎn)錄水平正常的和誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞核酸分別抽提后，獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以該cDNA為模板作PCR，PCR引物及RT-PCR步驟PCR引物設(shè)計(jì)序列如下(1)1522(+)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3′(2)2003(-)5′-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3′(3)5’-CGGGTCTACGCCTACGTCTTTGAACACCGTGCTTC-3’(4)5’-CACAGGTCTGAGCAGCGATCCTGCTTGCTG-3’引物1和引物2分別位于AChE基因的E3及E6內(nèi)，用以檢測(cè)腦型AChEmRNA(E1-E2-E3-E4-E6)；引物1和引物3用以檢測(cè)通讀型，即E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI連接通讀型)；引物1和引物4用以檢測(cè)紅細(xì)胞型，即E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI連接疏水型)。本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到紅細(xì)胞型和通讀型。
RT-PCR步驟總RNA抽提使用Boehringer，Mannheim公司的TripureTM分離試劑。cDNA合成使用Promega公司的隨機(jī)六引物，逆轉(zhuǎn)錄使用Boehringer，Mannheim公司的ExpendTM逆轉(zhuǎn)錄酶，方法按照該試劑的操作程序。PCR擴(kuò)增使用Perkin-Elmer公司的480擴(kuò)增儀，條件如下變性，94℃，1分鐘；退火65℃，1分鐘；延伸，72℃，1分鐘(最后一個(gè)循環(huán)5分鐘)；循環(huán)數(shù)，39次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.6％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
檢測(cè)到凋亡細(xì)胞中有大量AChEmRNA，其剪切形式是E1-E2-E3-E4-E6型(親水型也即腦型)見圖 7(該引物擴(kuò)增的范圍在1522到2003之間，PCR產(chǎn)物應(yīng)該是482bp)，而不是E1-E2-E3-E4-E5-E6型(PI連接疏水型，也即紅細(xì)胞型)也不是E1-E2-E3-E4-I4-E5-E6型(PI連接通讀型)。
2.蛋白質(zhì)水平檢測(cè)第一步，裂解細(xì)胞，參照《分子克隆》一書配制裂解液(50mmol/Tris。Cl Ph8.0，150mmol/LNaCl，0.02μg疊氮鈉，1μg/ml抑蛋白酶肽(Aprotinin)，1％曲通(Triton X-100)。將裂解液加入細(xì)胞中裂解細(xì)胞，1000g離心5分鐘，去除未裂解的細(xì)胞碎片。
第二步，tacrine親和柱分離凋亡細(xì)胞的乙酰膽堿酯酶，參照文獻(xiàn)(RichardTet al.Protein Expression and Purification 6，389-393，1995)，用環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B(Epoxy-activated Sepharose 6B)10g，＂Sigma公司，E-6754＂，和13g 9-aminoacridine HCl，＂Aldrich公司No.A3840-1＂制備Tacrine親和柱，首先用0.2M NaCl 50mMTris-HCl Ph8.0緩沖液平衡柱，樣品放在平衡液中上樣，流速0.3ml/分鐘。洗脫用10mM Tacrine，50 mM Tris-HCl Ph8.0洗脫液，洗脫的乙酰膽堿酯酶，再用10mM Tris-HCl Ph8.0透析，換透析液三次，透析24小時(shí)。冷凍干燥。
第三步，乙酰膽堿酯酶活性鑒定(參照文獻(xiàn)Richard T et al.ProteinExpression and Purification 6，389-393，1995)活性鑒定和活性抑制實(shí)驗(yàn)可在細(xì)胞水平和電泳凝膠上進(jìn)行。配制乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液(0.1M磷酸緩沖液Ph 6.0 150ml，乙酰硫代膽堿100mg/200ml，0.1M檸檬酸鈉11ml，30mM硫酸銅20ml，5mM鐵氰化鉀20ml)。本實(shí)驗(yàn)中使用了Bio-RAD mini-PROTEIN II電泳儀，6％PAGE凝膠，取細(xì)胞裂解液，加入0.2％曲通X-100，進(jìn)行非變性電泳，電壓20伏，12小時(shí)，電泳后取出凝膠，放置在配制的乙酰膽堿酯酶底物反應(yīng)液中反應(yīng)4小時(shí)。結(jié)果有乙酰膽堿酯酶的地方出現(xiàn)黃褐色陽(yáng)性帶，而其它蛋白質(zhì)則沒有陽(yáng)性反應(yīng)。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。
SDS-PAGE進(jìn)行分子量鑒定使用SDS-PAGE電泳方法測(cè)定分子量，證明從凋亡的HL-60細(xì)胞中分離的有活性的蛋白質(zhì)為66KDa，是腦型乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例3凋亡的非腫瘤細(xì)胞人肺成纖維細(xì)胞(HLF)能表達(dá)乙酰膽堿酯酶的實(shí)驗(yàn)貼壁生長(zhǎng)的人肺成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)液RPMI 1640(Gibco公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4天不換培養(yǎng)液，讓其自然衰老凋亡，4天后收集細(xì)胞。
用經(jīng)典的方法鑒定細(xì)胞凋亡(見圖1中的2)同實(shí)施例1。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠塊法，使用該法的原理與“血漿凝塊法”相同，也是為了避免出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。步驟是細(xì)胞+聚丙烯酰胺凝膠塊(使細(xì)胞處于半固體的網(wǎng)狀支架中)-固定-酶反應(yīng)-干膠-顯微鏡觀察。
聚丙烯酰胺凝膠的配制參照《分子克隆》方法，配制8％的聚丙烯酰胺凝膠5ml，各個(gè)組分如下懸浮的凋亡細(xì)胞及原培養(yǎng)液3.65ml30％丙烯酰胺溶液1.3ml10％過硫酸胺0.05mlTEMED 0.003ml混合加入Bio-RAD mini-PROTEIN II的凝膠玻璃板間，室溫20分鐘后，凝塊形成，取出凝膠，固定。
固定將凝膠塊放置在盛有1％多聚甲醛20ml的平底容器中室溫固定10分鐘，倒掉固定液。用0.1M磷酸緩沖液Ph6.0洗滌三次。
然后進(jìn)行酶-底物反應(yīng)。反應(yīng)條件同實(shí)施例1。
干膠放置在Model 583 Gel Dryer(Bio-RAD公司)，2小時(shí)吸干。
在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果凋亡細(xì)胞有乙酰膽堿酯酶黃褐色反應(yīng)(圖8)，而正常沒有陽(yáng)性反應(yīng)。凋亡細(xì)胞，細(xì)胞固縮，表面有小泡狀突起，有細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)凋亡小體。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。進(jìn)一步證明是腦型乙酰膽堿酯酶，見實(shí)施例2。
如果直接在貼壁細(xì)胞中加入固定液，然后進(jìn)行底物反應(yīng)，也能顯示棕色凋亡細(xì)胞，其中有凋亡小體(圖9)。
實(shí)施例4抗腫瘤藥物作用于人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)引起凋亡的鑒定培養(yǎng)人PC-3細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)液RPMI Medium 1640(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加誘導(dǎo)藥物，實(shí)驗(yàn)組加入抗腫瘤藥物2μM柔紅霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
用經(jīng)典的方法鑒別細(xì)胞凋亡和本發(fā)明對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)同實(shí)施例1。兩種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果是一致的。而且，本發(fā)明能顯示具體的細(xì)胞凋亡(見圖10，棕色細(xì)胞是凋亡細(xì)胞)，不象電泳和FACS顯示的是總體細(xì)胞內(nèi)有凋亡細(xì)胞。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。進(jìn)一步證明是腦型乙酰膽堿酯酶，同實(shí)施例2。本實(shí)驗(yàn)表明該抗腫瘤藥物已誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，是有效的抗腫瘤藥物。
實(shí)施例5抗腫瘤藥物作用于人巨核細(xì)胞(M07e)引起凋亡的鑒定培養(yǎng)人M07e細(xì)胞，懸浮生長(zhǎng)。培養(yǎng)液α-Medium，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于該細(xì)胞株是細(xì)胞因子GM-CSF依賴型的，因此對(duì)照組加GM-CSF，2.5ng/ml，實(shí)驗(yàn)組不加入GM-CSF，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
用經(jīng)典的方法鑒別細(xì)胞凋亡和本發(fā)明對(duì)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)。兩種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果是一致的。而且，本發(fā)明能顯示具體的細(xì)胞凋亡(見圖11)，棕色顯示是凋亡細(xì)胞，凋亡小體尤其明顯)。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。進(jìn)一步證明是腦型乙酰膽堿酯酶同實(shí)施例2，本實(shí)驗(yàn)表明該抗腫瘤藥物已誘導(dǎo)M07e細(xì)胞凋亡，是有效的抗腫瘤藥物。
實(shí)施例6抗腫瘤藥物作用于人HELA細(xì)胞引起凋亡的鑒定培養(yǎng)人HELA細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)液RPMI Medium 1640(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加誘導(dǎo)藥物，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組加入2μM柔紅霉素(daunorubicin，Italy)，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。
用經(jīng)典的方法鑒別細(xì)胞凋亡和本發(fā)明對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)。兩種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果是一致的。而且，本發(fā)明能顯示具體的細(xì)胞凋亡(見圖12，圖13，圖14顯示棕色的是凋亡細(xì)胞)，圖12顯示后期凋亡細(xì)胞，圖13顯示凋亡早期階段，圖14顯示凋亡中期階段。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μM BW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。進(jìn)一步證明是腦型乙酰膽堿酯酶，見實(shí)施例2，本實(shí)驗(yàn)表明該抗腫瘤藥物已誘導(dǎo)HELA細(xì)胞凋亡，是有效的抗腫瘤藥物。
實(shí)施例7凋亡的非腫瘤細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)胞(NIH/3T3)能表達(dá)乙酰膽堿酯酶的實(shí)驗(yàn)貼壁生長(zhǎng)的NIH/3T3細(xì)胞，培養(yǎng)液RPMI Medium 1640(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。不加因子，3-4天不換培養(yǎng)液，讓其自然衰老，第四天收集細(xì)胞。
用經(jīng)典的方法鑒別細(xì)胞凋亡和本發(fā)明對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行乙酰膽堿酯酶活性檢測(cè)。兩種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果是一致的。而且，本發(fā)明能顯示具體的細(xì)胞凋亡(見圖15，棕色顯示凋亡細(xì)胞)。抑制實(shí)驗(yàn)是在反應(yīng)液中加入10μMBW284c51(Sigma公司)乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑，酶活性可被抑制，證明該蛋白的確是乙酰膽堿酯酶。
實(shí)施例8凋亡的非腫瘤細(xì)胞大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞能表達(dá)乙酰膽堿酯酶的實(shí)驗(yàn)貼壁生長(zhǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)液M199(Gibco BRL公司)，添加10％胎牛血清，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組不加因子，實(shí)驗(yàn)組加入5μg/ml TGF-β，18-20小時(shí)后收集細(xì)胞。立即固定-酶底物反應(yīng)(方法同實(shí)施例1)，6小時(shí)后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，用磷酸緩沖液(見實(shí)施例1)洗滌3次，再用1％四氧化鋨(Osmium tetroxide)4℃后固定30分鐘。蒸餾水洗滌3次，乙醇梯度脫水，丙酮處理三次，Epon-812樹脂包埋，超薄切片(LKB公司切片機(jī))，不經(jīng)過電子染色，直接在Philips CM 10型透射電子顯微鏡下觀察。由于乙酰膽堿酯酶反應(yīng)的生成物含有金屬，電子密度高，可清晰顯示生成物的位置，主要集中在核內(nèi)(圖16)，提示酶的位置主要在細(xì)胞核內(nèi)。由此推測(cè)該細(xì)胞處于凋亡的中期，因?yàn)椋嗣黠@固縮，有核小體出現(xiàn)，是典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)表型。
實(shí)施例9 實(shí)體腫瘤通過測(cè)定化療前后的血清乙酰膽堿酯酶活性判斷化療效果一前列腺癌病人，未手術(shù)，采用化療，為選擇合適化療藥物，分別收取化療前和化療藥物治療后20-48小時(shí)的血清0.04ml，測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶活性來判斷化療療效。測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶的方法，參照Uete T，et alClin.Biochem.J 327-333，1970.簡(jiǎn)述如下試劑1.Tris緩沖液，0.2 mol/l，pH 7.4 and 8.0，2.乙酰硫代膽堿(Acetylthiocholine)，0.026 mol/l，溶于H2O3.HPO3，25％W/V4.O-phthalaldehyde(OPT)，0.1％，溶于甲醇5.硫代膽堿(Thiocholine)6.還原谷胱甘肽(Reduced glutathione GSH)7.血液樣品取患者化療前血清0.04ml作對(duì)照，再取治療后20-48小時(shí)血清作為實(shí)驗(yàn)組。
操作過程將血清樣品0.03ml加入0.5ml的0.026 0.026 mol/l乙酰硫代膽堿和0.2mol/l Tris緩沖液，pH 7.4混合液中，放置在37℃孵化3分鐘。加入HPO3，25％W/V 0.6ml終止反應(yīng)。充分混勻，離心10分鐘沉淀蛋白質(zhì)。取上清0.1ml加入到2ml pH 8.0的Tris緩沖液與0.1ml 0.1％d的O-phthalaldehyde(OPT)混合液中，15分鐘后分光光度儀檢測(cè)，室溫下激發(fā)波長(zhǎng)350nm，檢測(cè)熒光波長(zhǎng)420nm。作為對(duì)照，反應(yīng)混合液與0.6ml 25％HPO3混合孵育。血清作用后釋放的硫代膽堿，以標(biāo)準(zhǔn)硫代膽堿評(píng)估，標(biāo)準(zhǔn)量的硫代膽堿同樣用OPT處理。一個(gè)酶活性單位是37℃下1分鐘內(nèi)釋放l微摩爾(micromole)硫代膽堿。血清中乙酰膽堿酯酶活性以1毫升血清1分鐘內(nèi)釋放多少微摩爾(micromole)硫代膽堿表示。還原谷胱甘肽被用作判斷血清乙酰膽堿酯酶作用后釋放的巰基。硫代膽堿-OPT的熒光強(qiáng)度大約是GSH-OPT熒光強(qiáng)度的12％。
結(jié)果判斷化療前每毫升血清每分鐘使乙酰硫代膽堿水解成硫代膽堿的量是2.81μmol.化療后11.24μmol，(高出3-6倍是化療有效)。
實(shí)施例10實(shí)體腫瘤通過測(cè)定化療前后的血清乙酰膽堿酯酶被抑制后剩余的活性判斷化療效果一肺癌患者，未手術(shù)，采用化療，為選擇合適化療藥物，分別收取化療前和化療藥物治療后20-48小時(shí)的血清0.04ml，測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶被抑制后剩余的活性來判斷化療療效。測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶活性的方法，參見Zakut H et alCancer 61727-737，1988.
本方法使用試劑1.[3H]-A cetylcholine2.Tetraisopropyl pyrophosphoram ide(iso-OMPA).
3.1，5-bis-(4-ally ld im ethylam m onium pheny1)-pentan-3-one dibrom ide(BW 284C 51).
治療前血清加入乙酰膽堿酯酶特異性抑制劑BW284C51 1×10-5M后，活性基本被抑制，僅有活性9pmol/μgP/hr(即每微克血清蛋白每小時(shí)水解乙酰膽堿的pmol數(shù))，治療后抑制活性上升到29pmol/μgP/hr，化療后酶活性比化療前酶活性高出3.2倍。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)果知道，這是由于體內(nèi)細(xì)胞特別是腫瘤細(xì)胞發(fā)生了凋亡之故，說明化療效果好。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤藥物篩選和臨床化療效果判斷的方法，其特征在于該法是通過檢測(cè)由抗腫瘤藥物體外作用于不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞后，細(xì)胞表達(dá)的乙酰膽堿酯酶活性，或測(cè)定血清乙酰膽堿酯酶活性來鑒定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，籍此篩選抗腫瘤藥物及對(duì)腫瘤病人臨床化療效果進(jìn)行判斷。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗腫瘤藥物篩選和臨床化療效果判斷的方法。該法是基于本發(fā)明人在世界上首次證明的哺乳類凋亡細(xì)胞(除神經(jīng)細(xì)胞和紅細(xì)胞外)表達(dá)腦型乙酰膽堿酯酶,分子量為66KDa,與神經(jīng)中的乙酰膽堿酯酶相似。根據(jù)這個(gè)原理,通過檢測(cè)正常不表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞中的乙酰膽堿酯酶活性,就可以鑒定是否發(fā)生細(xì)胞凋亡?？捎糜谛驴鼓[瘤藥物篩選,臨床幫助醫(yī)生判斷化療藥物效果,針對(duì)患者找到最佳化療藥物。
文檔編號(hào)C12Q1/46GK1186859SQ97125220
公開日1998年7月8日 申請(qǐng)日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者張學(xué)軍, 趙倩, 賀恒益, 莫彤惟, 郭禮和 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所