專利名稱：血小板生成素/粒、巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程產(chǎn)品，及該產(chǎn)品的用途，具體地說涉及重組人血小板生成素/粒、巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白(recombinant humanthrombopoietin/granulocyte-macrophage colony-stimulating factor fusion protein,rhTPO/GM-CSF)，及其對(duì)各類造血組織損傷的治療作用。
人類各類惡性腫瘤的治療，除手術(shù)外以放療及化療最為常用。然而有效的放療及化療常常造成機(jī)體造血組織的嚴(yán)重?fù)p傷，引起阻礙治療進(jìn)一步進(jìn)行的貧血、感染及出血癥狀，甚至死亡。目前臨床上除了血液制品的支持治療外，已應(yīng)用了紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子(erythropoietin EPO)、粒、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor GM-CSF)及血小板生成素(thrombopoietin TPO)等生物因子來治療繼發(fā)性全血細(xì)胞減少，并收到了良好的效果。TPO單獨(dú)使用時(shí)可刺激紅細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系造血，不能刺激粒細(xì)胞系的造血(Molineux G,et al.Stem Cell.1997,15:43-49)；GM-CSF單獨(dú)使用時(shí)可刺激粒細(xì)胞系的造血，不能刺激紅細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系造血(Broxmeyer HE,et al,Exp Hematol.1988,16:594-602)。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們不但研究單一的天然生物因子，而且為了不同的目的構(gòu)建融合的生物活性因子。自1986年日本的Masahata等在大腸桿菌中表達(dá)了人干擾素γ(IFN-γ)/白細(xì)胞介素2(IL-2)的融合蛋白以來，迄今國(guó)內(nèi)外已有了PLXY321、IFN-γ/腫瘤壞死因子(TNF)、IL-2/IL-6、IL-3/EPO及CH925等具不同作用的融合蛋白因子的研究報(bào)道(白介素6-白介素2融合蛋白及其制法和用途專利申請(qǐng)?zhí)?93100115.3)。目前尚未見到TPO和GM-CSF融合蛋白的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是獲得一個(gè)具有能同時(shí)促進(jìn)機(jī)體紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系造血的生物細(xì)胞因子，以治療臨床上各類造血組織損傷綜合癥。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)將編碼hTPO N-端1-174位氨基酸的DNA片段利用酶切及連接的方法，融合于完整的127個(gè)氨基酸的hGM-CSF成熟蛋白編碼序列N-端，獲得編碼hTPO/GM-CSF的融合基因。將融合基因插入合適的表達(dá)質(zhì)粒pBV220，并轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞JM101，表達(dá)融合基因編碼的融合蛋白。該融合蛋白N-端含hTPO分子第1-174位氨基酸序列，C-端為hGM-CSF成熟蛋白的127個(gè)氨基酸序列，在原核細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白以包涵體形式存在。將包涵體用2％Triton X100和1％脫氧膽酸洗滌后得到純度為70％的包涵體。將包涵體溶于6M鹽酸胍20mMDTT溶液中溶解后，在含1.4M鹽酸胍的復(fù)性液中復(fù)性。復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)過Q-SepharoseFF陰離子交換柱層析純化和透析，得到高活性的hTPO/GM-CSF融合蛋白。高活性的hTPO/GM-CSF融合蛋白也可用SDS-PAGE電泳幾ZnSO4負(fù)染法直接從凝膠上分離純化獲得。以純化的、1∶10至1∶10000倍比稀釋的rhTPO/GM-CSF融合蛋白培養(yǎng)小鼠骨髓造血祖細(xì)胞，結(jié)果各個(gè)濃度的rhTPO/GM-CSF融合蛋白對(duì)小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的CFU-E,BFU-E,CFU-Meg與CFU-GM均有明顯的刺激作用。說明rhTPO/GM-CSF融合蛋白即有與TPO相同的刺激小鼠骨髓紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系的作用，又有與GM-CSF相同的刺激粒細(xì)胞系的作用，具備了TPO和GM-CSF雙重的生物活性。在對(duì)Co60照射所致小鼠造血組織損傷模型的治療中可見，hTPO/GM-CSF融合蛋白可促進(jìn)受照小鼠血像的早期恢復(fù)。說明，rhTPO/GM-CSF融合蛋白是一個(gè)具有TPO和GM-CSF雙重生物活性的新的生物因子，對(duì)骨髓紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系三系造血均有明顯的刺激活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白可用于治療電離輻射，化學(xué)藥物及生物病源體等因素造成的紅細(xì)胞，白細(xì)胞及血小板減少和缺乏引起的貧血、感染和出血等癥狀。本發(fā)明的主要內(nèi)容是在獲取hTPO/GM-CSF融合蛋白cDNA，并成功構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝，以獲得rhTPO/GM-CSF融合蛋白純品，并對(duì)rhTPO/GM-CSF融合蛋白的生物學(xué)性能進(jìn)行了描述，表明了rhTPO/GM-CSF融合蛋白能同時(shí)促進(jìn)機(jī)體紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系三系造血，可用于治療放、化療等各種原因造成的造血組織損傷綜合癥。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實(shí)施方法如下圖1為rhTPO/GM-CSF融合蛋白基因的鹼基序列(bp)。
圖2為rhTPO/GM-CSF融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖中1是pUC18-TPO:2是pUC18-GM-CSF；3是TPO基因片段；4是GM-CSF基因片段；5是pBV220；6是pBV220-TPO/GM-CSF。
實(shí)施例一．rhTPO/GM-CSF融合基因的構(gòu)建圖1為rhTPO/GM-CSF融合蛋白基因的鹼基序列。提取pUC18/hTPO及pUC18/hGM-CSF質(zhì)粒DNA，純化。以EcoRⅠ及SacⅠ酶切取編碼hTPO N-端1-174位氨基酸的DNA片段，以EcoRⅠ和BamHⅠ酶切取編碼hGM-CSF127個(gè)氨基酸成熟蛋白的DNA片段，以T4連接酶將hTPO的DNA片段融合于hGM-CSF的DNA片段的N-端，獲得編碼hTPO/GM-CSF的融合基因。將融合基因插入原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220的多克隆酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ之間，如圖2所示，并轉(zhuǎn)入原核宿主細(xì)胞大腸桿菌JM101，經(jīng)篩選得到了含重組質(zhì)粒pBV220/TPO/GM-CSF的陽(yáng)性克隆。
實(shí)施例二．rhTPO/GM-CSF融合蛋白的表達(dá)及小量制備1rhTPO/GM-CSF融合蛋白在大腸桿菌JM101中的表達(dá)挑取轉(zhuǎn)化陽(yáng)性的大腸桿菌JM101菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接2％于新鮮LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)至OD600達(dá)0.4，調(diào)溫至42℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。離心收菌，以PBS緩沖液洗滌后超聲破碎，離心收集包涵體。行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。結(jié)果表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳見一個(gè)分子量為34KDa的新的蛋白條帶，其分子量大小與預(yù)算一致。經(jīng)激光密度掃描測(cè)定表達(dá)量約占菌體總蛋白量的18.22％，占包涵體蛋白的51.82％。
2rhTPO/GM-CSF融合蛋白的小量制備以咪唑-SDS-硫酸鋅負(fù)染凝膠，切下負(fù)染的SDS-PAGE電泳凝膠上的rhTPO/GM-CSF融合蛋白條帶，以50mmol/L PBS浸出蛋白因子。經(jīng)50-20mmol/L的PBS緩沖液4℃透析、復(fù)性72小時(shí)。最后離心除雜質(zhì)，過濾除菌，收集rhTPO/GM-CSF融合蛋白。以紫外分光光度計(jì)測(cè)得蛋白濃度為102.1ug/ml。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定顯示，rhTPO/GM-CSF融合蛋白與hGM-CSF的單克隆抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)，說明本發(fā)明所構(gòu)建的rhTPO/GM-CSF基因的閱讀框架正確，所表達(dá)的融合蛋白確為hTPO/GM-CSF。
實(shí)施例三．rhTPO/GM-CSF融合蛋白的高效表達(dá)及大量制備1．rhTPO/GM-CSF在大腸桿菌JM101中的高效表達(dá)挑取JM101(pBV/TPO/GM-CSF)工程菌單菌落，接種于10ml LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50ug/ml),200轉(zhuǎn)/分振搖，30℃培養(yǎng)過夜。次日接種1％過夜菌于1升LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50ug/ml),30℃振搖培養(yǎng)4小時(shí)。在4℃,3000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體。
2．包涵體的制備及洗滌將收集的菌體懸于50ml裂解緩沖液(50mM Tris-Hcl pH8.0,1MNacl,,0.5mg/ml溶菌酶)，室溫孵育30分鐘。超聲破碎細(xì)菌，然后加入2％Triton X100,12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心10分鐘，收集沉淀。用1％脫氧膽酸洗滌一次，再用蒸餾水洗滌一次。
3．包涵體的溶解及復(fù)性將包涵體溶于8ml 6M鹽酸胍，50mM Tris-Hcl pH8.0,20mMDTT溶液，37℃孵育1小時(shí)。4℃離心10分鐘，收集上清，棄去不溶性沉淀。將溶解后的包涵體按1∶10(V/V)稀釋于復(fù)性液，25℃復(fù)性36小時(shí)，復(fù)性液含50mMTris-Hcl pH8.0,1mM EDTA,4mM GSH,2mM GSSH,1.4M鹽酸胍。將復(fù)性液對(duì)10升50mM Tris-Hcl pH8.0,1mM EDTA透析緩沖液徹底透析。12000轉(zhuǎn)/分，4℃離心10分鐘，去除沉淀。
4．純化將透析液按0.5ml/分鐘流速上樣于用50mM Tris-Hcl pH8.0,1mM EDTA平衡緩沖液平衡的(Q-Sepharose FF)陰離子交換層析柱。用平衡緩沖液洗脫未吸附雜蛋白。然后用含0-500mM Nacl的平衡緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分步收集洗脫峰，將活性蛋白峰合并于0.9％的生理鹽水徹底透析。
實(shí)施例四．rhTPO/GM-CSF融合蛋白的生物活性1rhTPO/GM-CSF融合蛋白的體外活性測(cè)定小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)取昆明種正常小鼠骨髓有核細(xì)胞，按每體系1×105個(gè)有核細(xì)胞接種于含有10-4mol/L β-巰基乙醇，3％L-谷氨酰胺，10％馬血清及2.7％甲基纖維素的McCoy′s培養(yǎng)體系中。陽(yáng)性對(duì)照組中每體系加入EPO2u,-IL-340ng,IL-12000u，或GM-CSF100ng。TPO組每體系加入本實(shí)驗(yàn)室制備的真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的rhTPO因子200ng。陰性對(duì)照組中只有培養(yǎng)體系，不含造血因子。實(shí)驗(yàn)組中加入1∶10,1∶100,1∶1000,1∶10000倍比稀釋的rhTPO/GM-CSF融合蛋白。于37℃,5％CO2及一定的濕度下培養(yǎng)7天，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成數(shù)，并將BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM集落形成數(shù)結(jié)果與陽(yáng)性及陰性對(duì)照相比較。結(jié)果4個(gè)濃度的rhTPO/GM-CSF融合蛋白對(duì)小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系均有明顯的刺激作用，其中以1∶100-1∶1000稀釋度的活性較高，過高或過低的因子濃度將對(duì)細(xì)胞集落的形成有影響。以析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，得出實(shí)驗(yàn)組的BFU-E,CFU-Meg及CFU-GM計(jì)數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，與陰性對(duì)照組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。BFU-E及CFU-Meg計(jì)數(shù)與單用TPO組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。CFU-GM計(jì)數(shù)與單用TPO組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。單用TPO組的BFU-E及CFU-Meg計(jì)數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，與陰性對(duì)照組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。單用TPO組CFU-GM計(jì)數(shù)與陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照組比較有非常顯著的差異(P＜0.01)。說明單用TPO有刺激紅細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系的作用，但沒有刺激粒細(xì)胞系的作用。rhTPO/GM-CSF融合蛋白即有與TPO相同的刺激小鼠骨髓BFU-E,CFU-Meg的作用，又有與GM-CSF相同的刺激CFU-GM的作用，具備了TPO和GM-CSF雙重的生物活性。
2rhTPO/GM-CSF融合蛋白治療造血組織損傷的活性測(cè)定小鼠造血組織損傷模型的建立以5.0Gy Co r射線照射昆明種正常雄性小白鼠為造血組織損傷模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組分為正常動(dòng)物及受照動(dòng)物兩大組。每大組又分為5個(gè)組1組正常對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水；2組實(shí)驗(yàn)組，腹腔注射rhTPO/GM-CSF融合蛋白200ug/Kg/天；3組腹腔注射TPO200ug/Kg/天和GM-CSF50ug/Kg/天混合給藥組；4組腹腔注射TPO200ug/Kg/天單藥組；5組腹腔注射GM-CSF 50ug/Kg/天單藥組。觀察小鼠外周血像及受照后10天小鼠骨髓造血祖細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。結(jié)果，正常動(dòng)物，給融合蛋白實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓及外周血像較正常對(duì)照組有不同程度的升高；Co60照射動(dòng)物，給融合蛋白實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓及外周血像也較對(duì)照組有明顯的升高。說明，rhTPO/GM-CSF融合蛋白是一個(gè)具有TPO和GM-CSF雙重生物活性的新的生物因子，對(duì)骨髓紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系及巨核細(xì)胞系三系造血均有明顯的刺激活性。rhTPO/GM-CSF融合蛋白可用于治療電離輻射，化學(xué)藥物及生物病源體等因素造成的紅細(xì)胞，白細(xì)胞及血小板減少和缺乏引起的貧血、感染和出血等癥狀。
總之，本發(fā)明公開了利用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)將hTPO基因與hGM-CSF基因相融合，構(gòu)建了新的融合蛋白rhTPO/GM-CSF。在用途上，rhTPO/GM-CSF融合蛋白具有對(duì)紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系及粒細(xì)胞系的刺激作用，可用于臨床治療放、化療等各種原因引起的造血組織損傷綜合癥。
權(quán)利要求
1一種融合蛋白造血因子，其特征在于該融合蛋白由人血小板生成素(hTPO)和人粒、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)組成。
2根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白N-端為hTPO的序列，C-端為hGM-CSF的序列。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白含有圖1所示的DNA序列。
4根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白包含hTPO功能段的第1-174位氨基酸序列及成熟hGM-CSF的127個(gè)氨基酸序列，分子量為34KDa。
5根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白具有對(duì)紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系及粒細(xì)胞系造血的刺激作用，可用于治療各種原因引起的造血組織損傷綜合癥。
全文摘要
一種能刺激全血細(xì)胞生長(zhǎng)的重組人血小板生成素/粒、巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白(rhTPO/GM－CSF)。屬生物產(chǎn)品及用途領(lǐng)域。將人血小板生成素(hTPO)N－端1—174位氨基酸融合于人粒、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM－CSF)127個(gè)氨基酸的N－端,得到具有TPO及GM－CSF雙重生物活性的融合蛋白,分子量為34KDa。rhTPO/GM－CSF融合蛋白具有對(duì)紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系及粒細(xì)胞系造血的刺激作用,可用于治療各種原因引起的造血組織損傷綜合癥。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1221754SQ9712573
公開日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者曹華, 葛忠良, 崔立斌, 張群偉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所殷小剛