專利名稱：淀粉含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾的、產(chǎn)淀粉能力增強(qiáng)的植物，以及能夠再生成這種植物的植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于質(zhì)量增強(qiáng)淀粉的生產(chǎn)方法和用于植物轉(zhuǎn)化的重組DNA分子。
淀粉是在高等植物中所發(fā)現(xiàn)的主要的貯存碳水化合物，并且因此是全球人類飲食中最大的單一能量來源。除其本身作為重要的糧食之外，淀粉的物理特性(形成凝膠和膠體)導(dǎo)致它主要作為加工食品的天然添加劑(增稠劑)。淀粉還有重要的非食品用途，在造紙和紡織工業(yè)中可作為膠粘劑的組分。在后一種情況下，淀粉的物理特性尤為重要。運用淀粉的其它工業(yè)有塑料工業(yè)和制藥工業(yè)；在制藥工業(yè)中淀粉例如可用作惰性載體。淀粉的物理特性部分取決于直鏈淀粉(長而直的聚糖鏈)與更高度分支的支鏈淀粉之比。在最近幾年中，人們對用生物工程產(chǎn)業(yè)改變淀粉的質(zhì)量和數(shù)量產(chǎn)生了很大興趣。尤其是主要目的在于產(chǎn)生經(jīng)過遺傳修飾的、淀粉含量增加或所含淀粉的結(jié)構(gòu)不同于自然界淀粉的植物。由于馬鈴薯易于應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，所以到目前為止，大多數(shù)工作集中于馬鈴薯植物種上。
對淀粉質(zhì)量的操作已取得了一些成功。例如，雖然對內(nèi)源性淀粉生物合成酶的操作只微微影響產(chǎn)量，但所產(chǎn)淀粉的物理特性卻常常大幅度改變(Müller-Rber等，1994)；這些變化從機(jī)械學(xué)方面尚無較好的理解。最近一種細(xì)菌淀粉分支酶在馬鈴薯的無直鏈淀粉變種中的表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)生非常高度分支的支鏈淀粉(Kortstee等，1996)。目前產(chǎn)生的許多淀粉結(jié)構(gòu)變異具有潛在的商業(yè)用途。
提高淀粉產(chǎn)量的方法只取得有限的成功。無論從馬鈴薯本身或其它物種，一些編碼淀粉生物合成酶的基因的過量表達(dá)，尚未使塊莖的淀粉含量提高(Müller-Rber等，1994)。通過編碼非調(diào)節(jié)形式的ADP-葡萄糖焦磷酸酶的突變細(xì)菌基因的表達(dá)，使塊莖的淀粉含量適度提高大約20％(Stark等，1992)，這是獲取的有限進(jìn)展。但是最近在較高產(chǎn)馬鈴薯變種中重復(fù)該方法的工作，無論在大田或溫室條件下，并未表現(xiàn)出淀粉含量提高(Herbers等，1996)。總之，仍有相當(dāng)大的余地來提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的塊莖淀粉含量。
NAD-蘋果酸酶(NAD-ME)是普遍存在于高等植物中的代謝酶，但對其功能目前有爭議。它催化蘋果酸的氧化脫羧
總體來說，該酶是NAD-聯(lián)動(linked)的蘋果酸脫氫酶(脫羧)(非OAA脫羧)，酶分類為EC 1.1.1.39。在此稱為NAD-ME。
作為對三羧酸(TCA)循環(huán)(參見

圖1)通量控制的一般性研究的一部分，分離了編碼NAD-ME亞基的cDNA克隆。在馬鈴薯中，存在分別為62kDa和59kDa的兩種NAD-ME亞基(Winning等，1994)。為了更好地了解NAD-ME的功能，產(chǎn)生了以反義方向表達(dá)編碼59kDa亞基的cDNA克隆的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物，總目的在于降低植物中的NAD-ME活性，并確定代謝結(jié)果(Hill等，1996)。先前的研究表明，這些轉(zhuǎn)基因植物中的NAD-ME活性已降低至野生型植物中NAD-ME活性的40％，但未顯示明顯的形態(tài)學(xué)表型或生長速率的改變。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，降低馬鈴薯植物中的NAD-ME活性，該植物塊莖的淀粉含量顯著提高。NAD-ME定位于線粒體中，因此在代謝方面不同于在馬鈴薯塊莖的造粉體中進(jìn)行的淀粉合成途徑(參見圖1)。觀察到的淀粉合成效應(yīng)通過一個或多個代謝物濃度而介導(dǎo)。這就為提高淀粉含量提供了新方法。如前所述，先前操縱淀粉合成的的努力集中在淀粉生物合成酶本身。一旦一種其濃度通過NAD-ME活性的降低而改變的代謝物得以鑒定，則有可能設(shè)計另一種策略來操縱該代謝物濃度、繼而控制淀粉含量。事實上，已經(jīng)表明3-磷酸甘油酸(3-PGA)含量的增加與淀粉含量的增加相關(guān)。預(yù)期這種情況也適用于其它代謝物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定更多代謝物并操縱其濃度。
因此本發(fā)明一方面提供產(chǎn)生淀粉的方法，有以下步驟a)提供一種植物，該植物經(jīng)過修飾，以便因改變了為糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間物的一個或多個代謝物的濃度，而使植物中的淀粉含量提高；并且b)從該植物收集含淀粉的材料。
另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)過修飾的植物，作為在糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間物的一個或多個代謝物的濃度改變后的結(jié)果，該植物中的產(chǎn)淀粉能力增強(qiáng)，條件是排除通過反義技術(shù)降低NAD-ME活性的馬鈴薯植物；本發(fā)明還提供經(jīng)過遺傳修飾、以便能夠再生成經(jīng)過修飾的植物的植物細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供上述修飾植物的用途，即用于產(chǎn)生含淀粉材料；以及上述修飾細(xì)胞的用途，即再生成產(chǎn)生含淀粉材料的植物。
另一方面，本發(fā)明提供淀粉儲存植物用于產(chǎn)生含淀粉材料的用途，該植物經(jīng)過遺傳修飾，因而可降低NAD-ME活性；并提供淀粉儲存植物的植物細(xì)胞用于產(chǎn)生含淀粉材料的用途，該細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾，因而可降低從該植物細(xì)胞再生的植物的NAD-ME活性。
另一方面，本發(fā)明提供含有在植物中發(fā)揮功能的啟動子的重組雙鏈DNA分子，該啟動子能夠在植物的淀粉儲存組織中優(yōu)先發(fā)揮功能，該啟動子操作性地連接于能夠降低植物中NAD-ME活性的DNA序列上。
另一方面，本發(fā)明提供用所述重組DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；并提供含有這種植物細(xì)胞的植物，其中NAD-ME活性在該植物的淀粉儲存組織中優(yōu)先降低。
在附圖中
圖1A表示糖酵解和三羧酸循環(huán)之間的互作，以及淀粉儲存植物中的淀粉生物合成；圖1B表示糖酵解的完整步驟；圖2表示載有以反義方向編碼59kDa NAD-ME亞基的cDNA的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系中NAD-ME的活性，(A)在花椰菜花椰病毒35S啟動子的控制之下；(B)在B33 patatin啟動子控制下；圖3表示轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物塊莖中的淀粉含量和淀粉合成通量，該轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物在花椰菜花椰病毒35S啟動子的控制下，表達(dá)以反義方向編碼NAD-ME的cDNA；圖4表示轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物塊莖中的淀粉含量，該轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物在花椰菜花椰病毒35S啟動子的控制下，表達(dá)以反義方向編碼NAD-ME的cDNA；圖5表示正發(fā)育的馬鈴薯塊莖中NAD-ME活性和淀粉含量的關(guān)系；圖6表示來自NAD-ME活性降低的正發(fā)育塊莖的塊莖圓盤的14C-葡萄糖代謝；以及圖7表示在NAD-ME活性降低的野生型植物和轉(zhuǎn)基因植物的正發(fā)育塊莖中，NAD-ME活性和3-PGA含量、以及3-PGA含量和淀粉含量之間的關(guān)系。
圖8表示編碼馬鈴薯NAD-ME的59kDa和62kDa亞基的cDNA序列(Winning等，1994；數(shù)據(jù)庫編號分別為Z23002和Z23023)。
在馬鈴薯的正發(fā)育塊莖中，TCA循環(huán)和淀粉生物合成之間的互作示于圖1A。NAD-ME催化TCA循環(huán)中蘋果酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，該酶位于線粒體中。進(jìn)入TCA循環(huán)的蘋果酸和丙酮酸，均為糖酵解過程(圖1B)的產(chǎn)物，參與己糖降解。在糖酵解過程鏈中早于蘋果酸和丙酮酸的代謝物包括草酰乙酸(OAA)、磷酸(烯醇式)丙酮酸(PEP)和3-磷酸甘油酸(3-PGA)。已知這些代謝物中，PEP和3-PGA通過激活A(yù)DP-葡萄糖焦磷酸酶(AGP酶)而對淀粉合成產(chǎn)生正效應(yīng)(Preiss，1988)。NAD-ME活性下降時，包括3-PGA在內(nèi)的一個或多個這些代謝物的形成導(dǎo)致淀粉合成的增加。
為糖酵解和TCA循環(huán)中間物的代謝物，被認(rèn)為是來自圖1A和1B流程中果糖-6-磷酸直至TCA循環(huán)的所有代謝物，并包括在TCA循環(huán)中的代謝物。
參與馬鈴薯塊莖糖酵解的代謝物和酶示于圖1A中，其細(xì)節(jié)示于圖1B中。這些相同的代謝物參與所有有機(jī)體的糖酵解(例如參見Dennis等，1996)。所涉及的酶類在它們催化相同的反應(yīng)方面也相同，但是它們在每種有機(jī)體中的氨基酸序列不同(雖然有關(guān))。因此來自不同有機(jī)體、催化相同反應(yīng)的酶可描述為同功的。
類似地，在高等植物中參與TCA循環(huán)的代謝物和酶類相同(例如參見Hill等，1996)。
本發(fā)明涉及的植物可以是任何或長久或暫時儲存淀粉的高等植物。通常，所述植物具有淀粉儲存組織，可為諸如塊莖、根、種子以及谷粒等器官。其它淀粉儲存組織例如包括諸如玉米、草和苜蓿的飼料作物中的葉片和莖。淀粉儲存組織包括暫時儲存淀粉的組織，例如諸如種子的儲油組織和儲蛋白組織。因而根據(jù)發(fā)明的修飾植物對于生產(chǎn)淀粉是有用的，這種情況下可采集含淀粉材料，或在產(chǎn)生其它材料時有用，這種其它材料在存在修飾淀粉合成時其產(chǎn)量增加。該種其它材料例如包括分別來自諸如蕓苔和亞麻的作物的油和纖維。
本發(fā)明涉及的植物包括下列植物組(i) 水果和蔬菜(例如馬鈴薯、番茄、香蕉)；(ii) 谷類(例如玉米(大谷粒谷物)、小麥、水稻和大麥(小谷粒谷物)；(iii) 含油種子(例如大豆、云苔、向日葵)。
還包括其它不在以上三組中任何一組的高等植物，例如諸如樹和亞麻的纖維作物。
本發(fā)明涉及的植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。期望在其中能夠提高淀粉合成的特殊組織包括玉米胚乳、水稻胚乳、豌豆胚乳、小麥胚乳、大豆子葉、馬鈴薯塊莖和木薯塊莖。本發(fā)明可提供商業(yè)用途的植物實例除馬鈴薯和其它塊莖作物外，包括玉米、小麥、水稻、大麥、高粱、黍、蕓苔、番茄、糖甜菜、木薯、薯蕷、蕪菁、swede、胡蘿卜、香蕉、以及諸如豌豆和大豆的豆科植物。每種這些植物的商業(yè)用途至少一部分取決于該植物的淀粉含量或產(chǎn)淀粉能力。
植物一般在稱為質(zhì)體的細(xì)胞器中合成淀粉，質(zhì)體包括光合組織的葉綠體、以及非光合組織的造粉體。淀粉合成還發(fā)生于儲油組織的白色體中。
或許將增加的淀粉含量優(yōu)先定位于植物中的淀粉儲存組織是有益的。這使得能夠避免任何對光合作用的不利影響?！暗矸蹆Υ娼M織”表達(dá)在長期或短期的基礎(chǔ)上，將包括長久地或暫時儲存淀粉的組織。淀粉儲存組織通常為非光合組織，因此排除例如葉片。然而某些淀粉儲存組織在其發(fā)育中可具有光合階段。例如，香蕉未成熟時是綠色的(光合作用)，并儲存淀粉直至成熟，這時淀粉轉(zhuǎn)化為糖。番茄未成熟時也進(jìn)行光合作用；淀粉短期暫時儲存，起緩沖糖份含量的作用。
植物中淀粉含量的增加通過遺傳操作而獲得，且最好作為遺傳特征。最好是，該植物具有穩(wěn)定整合到該植物基因組中的遺傳物質(zhì)，該遺傳物質(zhì)能夠?qū)е碌矸郛a(chǎn)量增強(qiáng)。在此處描述的本發(fā)明特定實施例中，用在啟動子控制下、以反義方向相應(yīng)于NAD-ME亞基基因的雙鏈cDNA分子轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物細(xì)胞。結(jié)果表明，需要降低50％的NAD-ME活性來獲得馬鈴薯中淀粉含量的顯著提高。因此，可能最好降低至少50％的NAD-ME活性。該閾值可根據(jù)植物的特定物種和所涉及的特定組織而變化，可以通過試驗直接決定。
插入植物細(xì)胞基因組中產(chǎn)生淀粉含量提高植物的雙鏈DNA分子，可通過任何適合的方法導(dǎo)入該植物細(xì)胞中。人們熟知將基因轉(zhuǎn)入植物中的適合載體。兩種最廣泛運用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(在此處在實施例中使用)，以及通過微彈轟擊(“基因槍”)或用碳化硅須晶進(jìn)行的DNA直接轉(zhuǎn)化。從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生成植株的技術(shù)也為人們所熟知。其中導(dǎo)入的或異源的DNA變成以孟德爾方式表現(xiàn)的真正遺傳的基因座，這常被稱作“轉(zhuǎn)基因”。
為了在植物細(xì)胞中表達(dá)異源DNA分子，需要適合的啟動子。適合的啟動子是在所涉及植物中發(fā)揮功能的啟動子；本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適合的啟動子。該啟動子可為基本上組成型活性的啟動子，例如花椰菜花椰病毒35S啟動子、水稻肌動蛋白啟動子、擬南芥遍在蛋白(UBQ3)啟動子、或玉米遍在蛋白啟動子；或可為條件型啟動子，在特定條件下優(yōu)先有活性。條件型啟動子包括在特定組織中優(yōu)先有活性的啟動子，例如patatin啟動子，它使馬鈴薯塊莖的基因表達(dá)增強(qiáng)。patatin啟動子也作用于番茄中，這時它是有效的果實專一性的。patatin啟動子由糖誘導(dǎo)。其它塊莖增強(qiáng)啟動子包括馬鈴薯的GBSS/蠟質(zhì)啟動子。谷粒/種子增強(qiáng)啟動子例如包括玉米的玉米醇溶蛋白(zen)啟動子和來自淀粉生物合成基因的啟動子。果實增強(qiáng)啟動子包括番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)啟動子。
將DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞時，為了獲得希望的效果(通常是轉(zhuǎn)化細(xì)胞中該DNA的表達(dá))，需要考慮諸多因素。轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞基因組中的定位將影響其表達(dá)，細(xì)胞基因組中存在的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)也影響其表達(dá)。不同的啟動子會有不同的強(qiáng)度，因此轉(zhuǎn)基因DNA轉(zhuǎn)錄為RNA的速率會變動。所以啟動子強(qiáng)度影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
另外，諸如轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物穩(wěn)定性的因素需要考慮，特別是當(dāng)異源DNA對于引入其的物種來說為非天然時。將該DNA導(dǎo)入的目的為蛋白表達(dá)時，可將DNA進(jìn)行修飾，除去已知的mRNA不穩(wěn)定基序和/或偶然剪接區(qū)；或采用該重組DNA欲插入的有機(jī)體的偏愛密碼子，這樣所述有機(jī)體中經(jīng)修飾DNA的表達(dá)產(chǎn)生大致類似的蛋白，該蛋白的活性或功能與該有機(jī)體中由未修飾的重組DNA的表達(dá)而獲得的大致相類似，其中該有機(jī)體中編碼未修飾重組DNA組分的蛋白是內(nèi)源性的。在運用反義技術(shù)或共抑制技術(shù)時，可采取適合的步驟來增強(qiáng)負(fù)責(zé)抑制希望降低活性的蛋白表達(dá)的RNA產(chǎn)物的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員能夠設(shè)計適當(dāng)?shù)?、顧及所有這些因素的遺傳操作策略。
有關(guān)降低NAD-ME活性對于淀粉在馬鈴薯塊莖中積累的影響，提出了四種假設(shè)，可排除其中三種假設(shè)。
1.碳重定向(redirection)。碳作為蔗糖進(jìn)入正發(fā)育的塊莖，蔗糖分解為磷酸己糖。然后這些磷酸己糖進(jìn)入三種路徑淀粉合成；細(xì)胞組分、主要是用于細(xì)胞擴(kuò)增的纖維素及其它細(xì)胞壁組分的合成；以及進(jìn)行呼吸作用，提供生物合成所需的ATP。該第一種假說認(rèn)為NAD-ME活性降低抑制碳流向呼吸作用，因此“多余”的碳轉(zhuǎn)向淀粉合成。排除這種假說的理由有兩條第一，由于淀粉合成所需的ATP得自呼吸作用，因此呼吸速率的顯著降低會導(dǎo)致淀粉合成速度的下降而非提高。第二，尚未檢測到轉(zhuǎn)基因操作對呼吸率的影響。
2.淀粉生物合成酶的誘導(dǎo)。這種假說認(rèn)為，或許在接近NAD-ME的代謝物(例如在TCA循環(huán)中的中間體)中，代謝物含量的某些變化起著改變一個或多個淀粉生物合成酶編碼基因表達(dá)的信號的作用。后一種改變似乎會導(dǎo)致淀粉生物合成速度的提高。通過測量六個淀粉合成專一步驟中的四個步驟的活性，對這種假說進(jìn)行了檢驗。未發(fā)現(xiàn)磷酸葡萄糖變位酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、無機(jī)焦磷酸酶或可溶性淀粉合酶活性的顯著升高。(參見圖1)。
3.調(diào)節(jié)淀粉合成的代謝物濃度提高。植物中的淀粉合成由多個代謝物調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)的主要靶似乎是ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，它由多個糖酵解下端的代謝物、特別是3-磷酸甘油酸(3PGA)和磷酸(烯醇式)丙酮酸(PEP)進(jìn)行調(diào)節(jié)(Preiss，1988)。這些分子是AGP酶的激活物，對無機(jī)磷酸有拮抗作用，磷酸是這種酶的負(fù)調(diào)節(jié)劑。NAD-蘋果酸酶活性的降低有可能已導(dǎo)致蘋果酸、草酰乙酸(OAA)、PEP和3PGA(參見圖1)的生成，因為后兩種代謝物的增加導(dǎo)致淀粉合成通量增加。通過測量轉(zhuǎn)基因系中代謝物穩(wěn)態(tài)含量，可輕易地檢驗這種假說。事實上，檢測結(jié)果已表明，在NAD-ME活性降低的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系中，3-PGA含量與淀粉含量相關(guān)。
4.1-磷酸葡萄糖的生成。1-磷酸葡萄糖是淀粉合成的底物，因此如果NAD蘋果酸酶活性的下降引起全部糖酵解中間體的形成，則1-磷酸葡萄糖濃度的增加可僅僅通過底物供應(yīng)效應(yīng)而導(dǎo)致淀粉合成速率增加。這種假說看來不正確，因為細(xì)胞中的代謝物含量通常被嚴(yán)格緩沖。另外，在轉(zhuǎn)基因系中檢測不到1-磷酸葡萄糖水平的明顯變化。
以下描述按照本發(fā)明增加儲存器官中淀粉積累的各種替代策略。應(yīng)該明確，以下只是舉例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，而非施加任何限制。a.降低馬鈴薯中NAD-蘋果酸酶活性的替代方法。
i. 62kDa亞基的反義降低，單獨降低或與59kDa亞基共同降低。
ii.運用共抑制構(gòu)成物降低活性。當(dāng)編碼序列或編碼序列的片段被重導(dǎo)入分離它們的植物物種中時，所編碼的酶的活性常常通過為共抑制現(xiàn)象而降低(例如參見Gottibo-McHugh等，1992和Davies等，1997)。因此，用編碼NAD-蘋果酸酶亞基的其中之一或二者的基因序列以反義方向轉(zhuǎn)化馬鈴薯，就可以降低NAD-蘋果酸酶活性。
iii.通過同源重組(如Kempin等1997)和切除/修復(fù)機(jī)制(如“Kimeroplasty”，May等，1997和Kimiec等1997)破壞靶基因。
iv. 內(nèi)源性NAD-蘋果酸酶基因表達(dá)的操縱。已分離出NAD-蘋果酸酶兩種亞基的基因組克隆，正在分析啟動子的結(jié)構(gòu)。對于參與NAD-蘋果酸酶表達(dá)調(diào)節(jié)的任何特異性DNA結(jié)合蛋白，有可能通過反義抑制或共抑制對這些蛋白的水平進(jìn)行操作，使NAD-蘋果酸酶兩種亞基的表達(dá)均降低。
v. NAD-蘋果酸酶作為兩種亞基的異二聚體而發(fā)揮功能。除了作為這種二聚體存在外，人們相信在體外還可發(fā)現(xiàn)四聚體和八聚體(Grover和Wedding，1984)。二聚體、四聚體和八聚體具有不同的動力學(xué)特性，提示聚集狀態(tài)的變化可能與體內(nèi)該酶的活性調(diào)節(jié)有關(guān)(Grover和Wedding，1984)，盡管尚無確定的證據(jù)支持這一觀點。有可能在酵母中運用“雙雜交”篩選步驟(Fields和Song，1989)來分離破壞59-62互作或四聚體或八聚體形成的多肽。將編碼這些肽的DNA序列導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物中，這可以為降低NAD-蘋果酸酶活性提供再一方法。
b.在淀粉儲存物種中降低NAD-蘋果酸酶活性的方法。
反義方法以及(a)中描述的替代方法能夠同樣好地應(yīng)用于任何高等植物物種，前提為能夠分離出編碼NAD-蘋果酸酶亞基的cDNA和基因組克隆，并可得到轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。從其它物種中分離編碼NAD-蘋果酸酶亞基的cDNA和基因組克隆是常規(guī)方法；PCR擴(kuò)增、異源篩選、以及用現(xiàn)有或能以已知方法產(chǎn)生的抗體篩選表達(dá)文庫，這些方法均預(yù)期可成功。對于許多有經(jīng)濟(jì)價值的物種，包括玉米和水稻，轉(zhuǎn)化系統(tǒng)存在。將有可能為目前尚未得到轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的其它物種開發(fā)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。一個重要要求是，存在驅(qū)動轉(zhuǎn)基因在所需組織中表達(dá)的合適啟動子；通常有可利用的適合啟動子，在文獻(xiàn)中有所描述。
c.增加儲存器官中淀粉含量的選擇性方法。
如以上所討論的，NAD-蘋果酸酶在代謝上遠(yuǎn)離淀粉合成路徑，且對淀粉合成的效應(yīng)通過一個或多個代謝物的濃度的改變來介導(dǎo)?？稍O(shè)計受影響代謝物濃度的替代操作策略。例如，如以上所表明，由于淀粉合成由3-PGA的增加而激活，則通過降低胞質(zhì)中蘋果酸脫氫酶、PEP羧化酶(PEPCase)、或丙酮酸激酶、或這些酶的任意組合，可獲得相似的效應(yīng)(參見圖1)。另一方面，可以預(yù)期提高磷酸甘油酸激酶的活性可使3-PGA的濃度提高。將升高的磷酸甘油酸激酶活性與降低的NAD-ME、胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶、PEPCase、或丙酮酸激酶的活性相組合，能夠潛在性地獲得更顯著的改變。對磷酸甘油酸變位酶或烯醇化酶活性的操作也可有效。
由于在馬鈴薯塊莖中觀察到的伴隨NAD-ME活性降低的淀粉合成增加，至少一部分應(yīng)歸因于3-PGA濃度的升高，因此按照本發(fā)明的植物和方法可以利用這種代謝物濃度的升高。在所有植物細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)生的糖酵解順序中，3-PGA是中間物(Dennis等，1996)。圖1B表示該路徑的簡單代謝流程。產(chǎn)生3-PGA的酶是磷酸甘油酸激酶，將其用作底物的酶是磷酸甘油酸變位酶。理論上，在糖酵解順序中，提高3-PGA之前任何酶(磷酸果糖激酶、焦磷酸6-磷酸果糖1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、醛縮酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和磷酸甘油酸激酶)的活性，或降低3-PGA之后任何酶(磷酸甘油酸變位酶、烯醇式酶、丙酮酸激酶、PEP羧化酶、胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶)、以及線粒體中發(fā)現(xiàn)的酶(如NAN-蘋果酸酶)的活性，就能夠提高3-PGA的濃度。但是，可排除下列酶的操作來獲得淀粉合成的增加。
1.磷酸果糖激酶Burrell等，(1994)制造了磷酸果糖激酶活性提高20倍的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物。在這些植物的塊莖中，3-PGA的濃度大幅度升高，但淀粉合成未改變。對此最可能的解釋是塊莖中己糖磷酸濃度降低；特別是1-磷酸-葡萄糖濃度降低。這將導(dǎo)致淀粉合成速率降低，因為1-磷酸-葡萄糖是這條路徑的低物。這些植物中淀粉合成速率的改變是由于1-磷酸-葡萄糖的降低和3-PGA的增加相互抵消的效應(yīng)。
2.丙糖磷酸異構(gòu)酶該酶活性超量存在，所催化的反應(yīng)已十分接近平衡。因此，提高其活性不可能顯著提高3-磷酸-甘油醛的濃度，這樣3-PGA的濃度將保持不變。
不依靠任何降低NAD-蘋果酸酶活性的操作而達(dá)到提高3-PGA濃度的優(yōu)選途徑，即為提高磷酸甘油酸激酶的活性。
除在胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)糖酵解路徑之外，還在質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)順序。在質(zhì)體中未發(fā)現(xiàn)焦磷酸6-磷酸果糖1-磷酸轉(zhuǎn)移酶和PEP羧化酶，但在大多數(shù)植物物種的質(zhì)體中存在所有其它糖酵解酶的同功酶。由于提高3-PGA濃度的靶酶ADP葡萄糖焦磷酸化酶位于質(zhì)體內(nèi)，因此靶目標(biāo)定為提高該細(xì)胞器中的3-PGA濃度可能是有益的。例如，特異性地提高質(zhì)體中磷酸甘油酸激酶的活性即可達(dá)到此目的。
一般情況下，可將與上述3-PGA相類似的策略應(yīng)用于任何代謝物。雖然極少努力將這些方法應(yīng)用于植物系統(tǒng)，但對于通過操作酶活性提高代謝物濃度普遍存在的問題仍進(jìn)行過理論思考(Small和Kacser，1994)。不愿運用這些方法的起因至少一部分是由于通常人們認(rèn)為代謝物濃度在細(xì)胞內(nèi)被精密調(diào)節(jié)，因而難于操作。本發(fā)明的證據(jù)表明與這些看法相反，對糖酵解和TCA循環(huán)中酶活性的操作可有效提高植物的淀粉含量。
現(xiàn)在以下列實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實施例實施例1用反義技術(shù)降低馬鈴薯植物中的NAD-ME活性按Hill等1996年描述的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系(20個獨立轉(zhuǎn)化子)。簡言之，用親和純化的抗體(該抗體以純化的馬鈴薯NAD-ME制備)(Winning等，1994)，從馬鈴薯的cDNA表達(dá)文庫中分離編碼NAD-ME 59 kDa亞基的cDNA克隆。將該cDNA克隆進(jìn)雙元載體pBIN19中(Bevan，1984)。按照Hfgen和Willlmitzer(1988)的直接轉(zhuǎn)化法將該雙元載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化馬鈴薯莖外植體，該法沿用經(jīng)Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)法。然后在將cDNA以反義方向重新導(dǎo)入馬鈴薯植物(cv.Desiree)中，位于35S花椰菜花椰病毒啟動子的控制之下。
測量馬鈴薯塊莖提取物中丙酮酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸的速率，即可確定NAD-ME活性；丙酮酸濃度用分光光度法試驗測定。通過測定用淀粉葡萄糖酶消化后所釋放的葡萄糖量，確定馬鈴薯塊莖提取物的淀粉含量；葡萄糖濃度用分光光度法試驗測定。
為了測定淀粉合成速率，從儲存的塊莖中切取圓盤，在14C-葡萄糖存在下溫育2小時。以淀粉葡萄糖酶消化淀粉后溶解的14評估淀粉合成速率。
結(jié)果示于圖2至圖4。圖2A表示多種轉(zhuǎn)基因系內(nèi)的NAD-ME活性；對照組為野生型(WT)植物，即只含有載體DNA的非轉(zhuǎn)化系或PA7系。圖3表示(A)NAD-ME活性和塊莖組織的淀粉含量之間的關(guān)系；以及(B)馬鈴薯塊莖圓盤的NAD-ME活性和淀粉合成速率之間的關(guān)系。數(shù)值為平均值±SE(n＝3-5)。圖4表示具有一定范圍NAD-ME活性的轉(zhuǎn)基因系的塊莖中淀粉含量的重復(fù)測定。在圖3和圖4中，每個點代表一個獨立的轉(zhuǎn)基因系?？傊@些結(jié)果表明，在幾個獨立轉(zhuǎn)基因系中，淀粉含量提高和NAD-ME活性降低之間有良好的相關(guān)性；淀粉含量提高和碳向淀粉的流向之間有良好的相關(guān)性。產(chǎn)生圖4結(jié)果的轉(zhuǎn)基因植物與產(chǎn)生圖3結(jié)果的轉(zhuǎn)基因植物來自不同批次的植物。圖4的結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因操作引起NAD-ME活性降低，這反過來和塊莖中淀粉含量的實質(zhì)性(2倍)提高有關(guān)。
初步數(shù)據(jù)(未顯示)表明，在這些轉(zhuǎn)基因系的葉片中未發(fā)現(xiàn)淀粉增加。實施例2用patatin啟動子以塊莖-特異性方式降低NAD-ME活性如實施例1中所描述的，與產(chǎn)生所有組織中NAD-ME活性降低的植物相類似，產(chǎn)生含有由馬鈴薯B33 patatin啟動子(Rocha-Sosa等，1989)控制的反義基因的轉(zhuǎn)基因植物。圖2B表示多種這些轉(zhuǎn)基因的NAD-ME活性。如上所述測定該酶活性。在這些植物中觀察到高的淀粉表型(數(shù)據(jù)未出示)。實施例3NAD-ME活性的降低按實施例1和例2的描述產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系，并確定正發(fā)育的塊莖中NAD-蘋果酸酶和淀粉含量之間的關(guān)系。圖5表示一批典型溫室植物的結(jié)果。圖上的各點代表來自生長于相同時間的單批次植物的單個塊莖(采集編號1)。通過線性回歸擬合該線，相關(guān)系數(shù)示于表1。在其它單獨生長的植物批次中已觀察到這批植物所顯示的顯著相關(guān)性(表1)。表1.正發(fā)育的馬鈴薯塊莖中NAD-蘋果酸酶活性、3-磷酸甘油酸含量以及淀粉含量之間的相關(guān)性。測定來自NAD-蘋果酸酶活性降低的多種轉(zhuǎn)基因系和野生型植物的正發(fā)育塊莖中的NAD-蘋果酸酶活性、3-磷酸甘油酸含量和淀粉含量。通過線性回歸測定相關(guān)系數(shù)，通過對相關(guān)系數(shù)的雙尾顯著性檢定而確定相關(guān)性的顯著性。標(biāo)有星號的數(shù)值具有顯著性(P＜0.05)，nd＝未確定。采集 樣品 大小兩者之間相比較的相關(guān)系數(shù)(r)(塊莖編號)NAD-ME和淀粉 NAD-ME和3-PGA 3-PGA和淀粉1 400.345*0.358*0.744*2 200.314 0.453*0.454*3 260.510*0.411*0.539*4 19 nd nd 0.614*重復(fù)圖3B中所示淀粉合成速率的初步測定。特別是，實施例1和實施例2中描述的試驗用貯存的馬鈴薯塊莖進(jìn)行，而現(xiàn)在描述的數(shù)據(jù)適用于正發(fā)育塊莖。給來自生長中塊莖的組織圓盤提供放射性(14C)葡萄糖，并調(diào)查該葡萄糖的代謝結(jié)果。NAD-蘋果酸酶活性最低的三個系和具有野生型NAD-蘋果酸酶活性的轉(zhuǎn)化系的結(jié)果示于圖6中。塊莖圓盤取自最近采集的生長中塊莖，并在14C-葡萄糖存在下溫育2小時。切割該組織，測定個組分中摻入的14C。數(shù)據(jù)以占代謝后總的14C的百分?jǐn)?shù)表示，數(shù)值為三次重復(fù)的平均值。T15系具有與野生型相類似的NAD-蘋果酸酶活性；20系、21系和22系的活性顯著降低。淀粉的增加標(biāo)示和蔗糖的降低標(biāo)示與NAD-蘋果酸酶活性降低的塊莖組織中淀粉合成速率的顯著升高相一致。實施例4馬鈴薯塊莖中3-磷酸甘油酸的增加與淀粉含量提高相關(guān)測定實施例3中轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖的3-PGA含量。典型植物批次的結(jié)果示于圖7中。各點代表來自生長于同一時間的單批植物的單個塊莖(采集編號1)。通過線性回歸擬合該線，相關(guān)系數(shù)示于表1。在NAD-蘋果酸酶活性和3-PGA含量之間存在強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；淀粉含量表示出與3-PGA含量之間強(qiáng)的正相關(guān)。在獨立生長的植物批次中已經(jīng)觀察到NAD-蘋果酸酶活性/3-PGA相關(guān)性，以及淀粉/3-PGA相關(guān)性(表1)。實施例5編碼NAD-蘋果酸酶的cDNA的分離(a)運用已發(fā)表的編碼NAD-蘋果酸酶亞基的兩種馬鈴薯cDNA序列(Winning等，1994)，鑒別在兩種亞基cDNA的兩端(5’和3’)之間保守的序列。在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，例如參見Grof等，1995)中，將相應(yīng)于這兩種序列的合成寡核苷酸用作引物。
(b)從即將進(jìn)行操作的目的物種的組織中分離mRNA，用以產(chǎn)生cDNA文庫。采用來自靶組織的mRNA很重要，這樣就能夠分離到相應(yīng)于NAD-蘋果酸酶的正確的同功酶。
(c)用(a)中產(chǎn)生的引物擴(kuò)增來自(b)中產(chǎn)生的文庫的cDNA，該cDNA含有編碼相應(yīng)于NAD-蘋果酸酶的DNA核苷酸序列。通過與馬鈴薯中的序列相比較(Winning等，1994)，得以確認(rèn)對編碼NAD-蘋果酸酶的序列的鑒別。實施例6塊莖中NAD-蘋果酸酶活性被短的有義抑制的馬鈴薯植物的產(chǎn)生(a)將編碼NAD-蘋果酸酶59 kDa亞基的cDNA的50-100個核苷酸片段以有義方向亞克隆進(jìn)修飾后的雙元載體中。該cDNA片段正好插在B33 patatin啟動子(Rocha-Sosa等，1989)的下游，這使塊莖中該cDNA片段的表達(dá)增強(qiáng)。這種短有義基因的表達(dá)曾顯示可導(dǎo)致靶酶的活性降低(Cameron和Jennings，1991；Que等，1997)。除cDNA和patatin啟動子之外，該雙元載體在T-DNA的兩邊界之間也含有編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接轉(zhuǎn)化法，將(a)中產(chǎn)生的雙元載體轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌(菌株LBA4404)中。
(c)按照Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)的共培養(yǎng)法，將來自農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)馬鈴薯莖外植體中。
(d)存在甘露糖時，根據(jù)植物的生長能力鑒定轉(zhuǎn)化植物。甘露糖一般對植物細(xì)胞有毒，但是轉(zhuǎn)化植物由于存在磷酸甘露糖異構(gòu)酶的序列而能夠耐受。實施例7種子胚乳中NAD-蘋果酸酶活性短有義抑制的玉米植物的產(chǎn)生(a)按以上實施例5的方法，獲得來自玉米的編碼NAD-蘋果酸酶59 kDa亞基的cDNA的50-100個核苷酸片段，將其亞克隆進(jìn)質(zhì)粒中。將該cDNA片段正好插在玉米醇溶蛋白啟動子(Schernthaner等，1988)的下游，這使胚乳中該cDNA片段的表達(dá)增強(qiáng)。這種短有義基因的表達(dá)曾顯示可導(dǎo)致靶酶的活性降低(Cameron和Jennings，1991；Que等，1997)。除cDNA和玉米醇溶蛋白啟動子之外，該質(zhì)粒也含有編碼由組成型CaMV 35S啟動子驅(qū)動的草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的cDNA。后一種基因賦子對草銨膦(glufosinate ammonium)的抗性。
(b)用碳化硅須晶轉(zhuǎn)化方法(Frame等，1994)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)胚發(fā)生玉米懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，并按Frame等(1994)的方法從懸浮培養(yǎng)細(xì)胞再生植株。
(c)在除草劑草銨膦存在的情況下，通過植物生長能力鑒別轉(zhuǎn)基因植物。實施例8種子胚乳中NAD-蘋果酸酶活性短有義抑制的云苔(Brassica napus)植物的產(chǎn)生(a)按以上實施例5的方法，獲得來自蕓苔的編碼NAD-蘋果酸酶59 kDa亞基cDNA的50-100個核苷酸的片段，將其以有義方向亞克隆進(jìn)經(jīng)修飾的雙元質(zhì)粒中。將該cDNA片段正好插在種子特異性的油質(zhì)蛋白啟動子(Keddie等，1994)下游，這使該cDNA片段在種子中的表達(dá)增強(qiáng)。這種短有義基因的表達(dá)曾顯示可導(dǎo)致靶酶的活性降低(Cameron和Jennings，1991；Que等，1997)。除該cDNA和油質(zhì)蛋白啟動子之外，該雙元載體在T-DNA的兩邊界之間也含有編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接轉(zhuǎn)化法，將(a)中產(chǎn)生的雙元載體轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌(菌株LBA4404)中。
(c)用共培養(yǎng)法，將來自農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)葉圓盤中。
(d)存在甘露糖時，根據(jù)植物的生長能力鑒定轉(zhuǎn)化植物。甘露糖一般對植物細(xì)胞有毒，但是轉(zhuǎn)化植物由于存在磷酸甘露糖異構(gòu)酶的序列而能夠耐受。實施例9提高胞質(zhì)中磷酸甘油酸激酶的活性從而提高馬鈴薯塊莖中3-PGA的濃度(a)從馬鈴薯之外的植物種中獲得編碼磷酸甘油酸激酶的cDNA，將其以有義方向亞克隆進(jìn)修飾后的雙元載體中。已經(jīng)分離出來自煙草的編碼這種酶的cDNA(Bringloe等，1996)，并可隨意使用。將該cDNA正好插入B33 patatin啟動子(Rocha-Sosa等，1989)的下游，該啟動子可使該cDNA在塊莖中的表達(dá)增強(qiáng)。除該cDNA和patatin啟動子之外，該雙元載體在T-DNA的兩邊界之間也含有編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接轉(zhuǎn)化法，將(a)中產(chǎn)生的雙元載體轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌(菌株LBA4404)中。
(c)按照Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)的共培養(yǎng)法，將來自農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)馬鈴薯的莖外植體中。
(d)存在甘露糖時，根據(jù)植物的生長能力鑒定轉(zhuǎn)化植物。甘露糖一般對植物細(xì)胞有毒，但是轉(zhuǎn)化植物由于存在磷酸甘露糖異構(gòu)酶的序列而能夠耐受。實施例10提高質(zhì)體中磷酸甘油酸激酶的活性可提高馬鈴薯塊莖造粉體中3-PGA的濃度(a)從馬鈴薯之外的植物種中獲得編碼磷酸甘油酸激酶的cDNA，將其以有義方向亞克隆進(jìn)修飾后的雙元載體中。已經(jīng)分離出來自煙草的編碼該酶質(zhì)體同功酶的cDNA(Bringloe等，1996)，并可隨意使用。將該cDNA正好插入B33 patatin啟動子(Rocha-Sosa等，1989)的下游，該啟動子可使塊莖中該cDNA的表達(dá)增強(qiáng)。將來自煙草核酮糖二磷酸羧化酶的質(zhì)體導(dǎo)向序列作為與該cDNA的翻譯融合物插入該cDNA和啟動子之間。這將保證馬鈴薯塊莖中產(chǎn)生的煙草磷酸甘油酸激酶被引至造粉體中。除該cDNA和patatin啟動子外，該雙元載體在T-DNA的兩邊界之間也含有編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶的cDNA。
(b)用Hfgen和Willmitizer(1988)的直接轉(zhuǎn)化法，將(a)中產(chǎn)生的雙元載體轉(zhuǎn)移進(jìn)根癌農(nóng)桿菌(菌株LBA4404)中。
(c)按照Sheerman和Bevan(1988)修改的Twell和Ooms(1987)的共培養(yǎng)法，將來自農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)馬鈴薯的莖外植體中。
(d)存在甘露糖時，根據(jù)植物的生長能力鑒定轉(zhuǎn)化植物。甘露糖一般對植物細(xì)胞有毒，但是轉(zhuǎn)化植物由于存在磷酸甘露糖異構(gòu)酶的序列而能夠耐受。實施例11提高馬鈴薯塊莖胞質(zhì)中的3-PGA濃度，同時對糖酵解通量的影響甚微這種方法以Kacser和Acerrenza(1993)提出的理論方法為基礎(chǔ)。為了減小對代謝通量的影響，將產(chǎn)生3-PGA、磷酸甘油酸激酶的酶活性提高；而將消耗它的磷酸甘油酸變位酶的酶活性降低。按實施例9所述使磷酸甘油酸激酶增加；而采用實施例6所述的類似方法，可以從馬鈴薯中獲得編碼烯醇式酶的cDNA后，使烯醇化酶活性降低。
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權(quán)利要求
1.產(chǎn)生淀粉的方法，包括下列步驟a)提供一種植物，對該植物進(jìn)行遺傳修飾，改變一個或多個在植物糖酵解和TCA循環(huán)中為中間體的代謝物的濃度，從而使該植物淀粉含量提高；并b)從該植物采集含淀粉材料。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述一個或多個代謝物包括來自蘋果酸、草酰乙酸、磷酸(烯醇式)丙酮酸和3-磷酸甘油酸的一個或多個代謝物。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述一個或多個代謝物包括3-磷酸甘油酸。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中修飾該植物使該植物的一個或多個酶的活性提高或降低，從而改變所述一個或多個代謝物的濃度。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述一個或多個酶包括如圖1A所示參與糖酵解或TCA循環(huán)的酶。
6.按照權(quán)利要求4或5的方法，其中降低NAD-蘋果酸酶(NAD-ME)的活性。
7.按照權(quán)利要求4-6中任一項的方法，其中該植物是轉(zhuǎn)基因植物，在該轉(zhuǎn)基因植物中異源DNA序列的表達(dá)影響所述酶活性的提高或降低。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中該植物是淀粉儲存植物。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中該植物淀粉儲存組織中的淀粉含量優(yōu)先提高。
10.經(jīng)過遺傳修飾的植物，由于改變了在該植物糖酵解和TCA循環(huán)中為中間體的一個或多個代謝物的濃度，該植物的產(chǎn)淀粉能力增強(qiáng)；條件是排除通過反義技術(shù)使NAD-ME活性降低的馬鈴薯植物。
11.按照權(quán)利要求7的經(jīng)修飾植物，其中所述一個或多個代謝物包括來自蘋果酸、草酰乙酸、磷酸(烯醇式)丙酮酸和3-磷酸甘油酸的一個或多個代謝物。
12.按照權(quán)利要求10或11的經(jīng)修飾植物，其中所述一個或多個代謝物包括3-磷酸甘油酸。
13.按照權(quán)利要求9-12中任一項的經(jīng)修飾植物，其中該植物經(jīng)過修飾，以提高或降低該植物一個或多個酶的活性，從而改變所述一個或多個代謝物的濃度。
14.按照權(quán)利要求13的經(jīng)修飾植物，其中所述一個或多個酶包括如圖1A所示參與糖酵解或TCA循環(huán)的酶。
15.按照權(quán)利要求13或14的經(jīng)修飾植物，其中NAD-ME的活性被降低。
16.按照權(quán)利要求13-15中任一項的經(jīng)修飾植物，其中該植物是轉(zhuǎn)基因植物，在該轉(zhuǎn)基因植物中異源DNA序列的表達(dá)影響所述酶活性的提高或降低。
17.按照權(quán)利要求9-16中任一項的經(jīng)修飾植物，其中該植物是淀粉儲存植物。
18.按照權(quán)利要求9-17中任一項的經(jīng)修飾植物，其中該植物淀粉儲存組織中的產(chǎn)淀粉能力優(yōu)先提高。
19.一種植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾，以便能夠再生成按照權(quán)利要求8-18中任一項的經(jīng)修飾植物。
20.按照權(quán)利要求8-18中任一項的經(jīng)修飾植物的用途，即用于產(chǎn)生含淀粉材料。
21.按照權(quán)利要求19的經(jīng)修飾植物細(xì)胞的用途，即用于再生成產(chǎn)生含淀粉材料的植物。
22.淀粉儲存植物在產(chǎn)生含淀粉材料中的用途，該植物經(jīng)過遺傳修飾，以便降低NAD-ME活性。
23.淀粉儲存植物的植物細(xì)胞在再生成產(chǎn)生含淀粉材料的植物中的用途；所述細(xì)胞經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化，以便降低從該植物細(xì)胞再生的植物中的NAD-ME活性。
24.重組的雙鏈DNA分子，含有在植物中發(fā)揮功能的啟動子，該啟動子能夠在淀粉儲存組織中優(yōu)先作用，所述啟動子與能夠降低植物中NAD-ME活性的DNA序列操作性連接。
25.重組的雙鏈DNA分子，含有在植物中發(fā)揮功能啟動子，該啟動子與能夠降低植物中NAD-ME活性的DNA序列操作性連接；條件是所述DNA序列非來源于馬鈴薯植物。
26.按照權(quán)利要求24或25的重組DNA分子，其中所述能夠降低NAD-ME活性的DNA序列包括以反義方向編碼NAD-ME亞基的序列。
27.按照權(quán)利要求24或25的重組DNA分子，其中所述啟動子在馬鈴薯的塊莖中優(yōu)先有活性。
28.按照權(quán)利要求27的重組DNA分子，其中所述啟動子為patatin啟動子或來自patatin啟動子。
29.按照權(quán)利要求24-28中任一項的重組DNA分子，包含在適合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體中。
30.用按照任何權(quán)利要求24-29中任一項的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
31.含有按照權(quán)利要求30的植物細(xì)胞的植物，其中NAD-ME活性在該植物的淀粉儲存組織中優(yōu)先降低。
全文摘要
公開了經(jīng)過修飾的植物,由于改變了參與植物糖酶解和TCA循環(huán)的一個或多個代謝物的濃度,該植物的產(chǎn)淀粉能力增強(qiáng)。這種效應(yīng)例如可通過遺傳修飾來降低NAD－蘋果酸酶的活性而達(dá)到。
文檔編號C12N15/82GK1245535SQ9718149
公開日2000年2月23日 申請日期1997年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月27日
發(fā)明者C·J·勒維, S·A·希爾, H·L·詹納, B·M·溫靈 申請人:埃西斯創(chuàng)新有限公司