專利名稱：哺乳動(dòng)物趨化因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明考慮了涉及蛋白的組合物，所述蛋白在控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)細(xì)胞)的發(fā)育、分化、運(yùn)輸和生理學(xué)上起作用。具體地說，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)或證明不同細(xì)胞類型(包括造血細(xì)胞)的發(fā)育、分化和功能的蛋白。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)組分包括不同的細(xì)胞類型，包括類紅細(xì)胞和髓樣細(xì)胞譜系的紅細(xì)胞和白細(xì)胞。參見例如，Rapaport(1987)Introduction to Hematology(第2版)Lippincott，費(fèi)城，賓西法尼亞；Jandl(1987)Blood Textbook of Hematologv，Little，Brown and Co.，波士頓，MA.；和Paul(編輯)(1993)Fundamental Immunology(第3版)Raven出版社，NY。
一段時(shí)間以來，已知哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答是以一系列叫做“免疫網(wǎng)絡(luò)”的復(fù)雜細(xì)胞相互作用為基礎(chǔ)。近來的研究對(duì)這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部工作提供了新的理解。盡管明確的是，實(shí)際上在多數(shù)所述應(yīng)答確實(shí)圍繞淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和其它細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)樣的相互作用進(jìn)行，但現(xiàn)在免疫學(xué)家一般持下述觀點(diǎn)，即已知為淋巴因子、細(xì)胞因子和單核因子的可溶性蛋白，在控制這些細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。因此，值得研究細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的分離、特征鑒定和作用機(jī)制，了解其應(yīng)對(duì)診斷和治療眾多醫(yī)學(xué)異常(例如免疫系統(tǒng)失調(diào)和其它失調(diào))取得顯著進(jìn)展。
淋巴因子顯然以種種方式介導(dǎo)細(xì)胞活性。已顯示它們支持多能造血干細(xì)胞增殖、發(fā)育和分化為大量的祖細(xì)胞(progenitor)，所述祖細(xì)胞包括構(gòu)成復(fù)雜免疫系統(tǒng)的不同細(xì)胞譜系。這些在所述細(xì)胞組分之間的相互作用對(duì)于健康免疫應(yīng)答是必需的。在淋巴因子和其它介質(zhì)一起給藥時(shí)，這些不同的細(xì)胞譜系經(jīng)常以不同的方式應(yīng)答。
所述趨化因子是大且各異的蛋白超家族。根據(jù)在所述趨化因子基元中的前兩個(gè)半胱氨酸是否相鄰(稱為“C-C”分支)，或是否由間插殘基間隔(“C-X-C”)，所述超家族再分為兩個(gè)典型分支。新近鑒定的趨化因子的分支在對(duì)應(yīng)的基元中缺少兩個(gè)半胱氨酸，并由稱為淋巴趨化因子(lymphotactins)的趨化因子代表。另一近來鑒定的分支在所述兩個(gè)半胱氨酸之間有三個(gè)間插殘基，例如CX3C趨化因子。參見例如Schall和Bacon(1994)Current Opinion in Immunology 6865-873；和Bacon和Schall(1996)int.Arch.Allergy & Immunol.10997-109。
人們已經(jīng)鑒定了許多影響前體細(xì)胞分化程序、或調(diào)節(jié)特定細(xì)胞類型生理或遷移特性的因子。這些發(fā)現(xiàn)表明，存在至今未識(shí)別在免疫功能中中作用的其它因子。這些因子提供多種生物活性，其作用范圍與已知的分化或激活因子可能不同。對(duì)有關(guān)在體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理學(xué)的調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)、生物和生理特性缺乏了解，妨礙了對(duì)這種因子作用的調(diào)變。因此，需要調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞發(fā)育或生理學(xué)的疾病仍然難以控制。
發(fā)明摘要本發(fā)明揭示了先前未知的趨化因子基元的存在，所述趨化因子基元包括本文稱為DNAX Vic-1(DVic-1)和DNAX腹股溝傷口表達(dá)的CC(DNAX Groin Wound expressed CC)趨化因子(DGWCC)的分子。根據(jù)對(duì)下文所述的趨化因子蛋白序列的序列分析，顯然所述DVic-1和DGWCC屬于CC趨化因子家族。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由下述物質(zhì)中選擇的物質(zhì)組合物大體純或重組的DVic-1蛋白或肽，所述蛋白或肽在至少大約12個(gè)氨基酸長(zhǎng)度內(nèi)同SEQ ID NO2顯示至少大約85％的序列同一性；SEQID NO2的天然序列DVic-1；包含DVic-1序列的融合蛋白；大體純或重組的DGWCC蛋白或肽，所述蛋白或肽在至少大約12個(gè)氨基酸長(zhǎng)度內(nèi)同SEQ ID NO6或8顯示至少大約85％的序列同一性；SEQ ID NO6或8的天然序列DGWCC；和包含DGWCC序列的融合蛋白。在大體純或分離的蛋白實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含下述區(qū)段的蛋白，所述區(qū)段同DVic-1或DGWCC的對(duì)應(yīng)部分顯示同一性的序列；對(duì)于同DVic-1的對(duì)應(yīng)部分顯示同一性的序列，其中所述同源是至少大約90％同一性，而所述部分是至少大約9個(gè)氨基酸；所述同源是至少大約80％的同一性，而所述部分是至少大約17個(gè)氨基酸；或所述同源是至少大約70％的同一性，而所述部分是至少大約25個(gè)氨基酸；對(duì)于同DGWCC的對(duì)應(yīng)部分顯示同一性的序列，其中所述同源是至少大約90％同一性，而所述部分是至少大約9個(gè)氨基酸；所述同源是至少大約80％同一性，而所述部分是至少大約17個(gè)氨基酸；或所述同源是至少大約70％同一性，而所述部分是至少大約25個(gè)氨基酸。其它多肽實(shí)施例包括那些多肽，其中DVic-1包含SEQ ID NO2的成熟序列；DVic-1蛋白或肽來自包括人的靈長(zhǎng)類；包含至少一個(gè)SEQ ID NO2的多肽區(qū)段；顯示多個(gè)部分顯示同一性；是DVic-1的天然等位變異體；有至少大約30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度；顯示至少兩個(gè)對(duì)靈長(zhǎng)類DVic-1特異的非重疊表位；在至少大約20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度內(nèi)同DVic-1顯示至少大約90％的序列同一性；顯示至少兩個(gè)對(duì)DVic-1特異的非重疊表位；在至少大約20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度內(nèi)同DVic-1顯示至少大約90％的序列同一性；是糖基化的；是合成多肽；附著于固相基質(zhì)上；和另一個(gè)化學(xué)部分綴合；為來自天然序列的5重取代或更少取代的取代體(a 5-fold or less substitution)；或是天然序列的缺失或插入變異體；DGWCC包含SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的成熟序列；或DGWCC蛋白或肽來自包括靈長(zhǎng)類或嚙齒類的哺乳動(dòng)物；包含至少一個(gè)SEQ ID NO6或8的多肽區(qū)段；顯示多個(gè)部分顯示同一性；是DGWCC的天然等位變異體；有至少大約30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度；顯示至少兩個(gè)對(duì)靈長(zhǎng)類DGWCC特異的非重疊表位；在至少大約20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度內(nèi)同DGWCC顯示至少大約90％的序列同一性；顯示至少兩個(gè)對(duì)DGWCC特異的非重疊表位；在至少大約20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度內(nèi)同DGWCC顯示至少大約90％的序列同一性；是糖基化的；是合成多肽；附著于固相基質(zhì)上；和另一個(gè)化學(xué)部分綴合；為來自天然序列的5重取代或更少取代的取代體；或是天然序列的缺失或插入變異體。提供的其它多肽制劑包括組合物，所述組合物包含無菌的DVic-1蛋白或肽；所述DVic-1蛋白或肽和載體，其中所述載體是包括水、鹽水和/或緩沖液的水性化合物；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、體表或腸胃外給藥；無菌的DGWCC蛋白或肽；或所述DGWCC蛋白或肽和載體，其中所述載體是包括水、鹽水和/或緩沖液的水性化合物；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、體表或腸胃外給藥。
其它多肽形式包括融合蛋白，包含SEQ ID NO2或12的成熟蛋白·序列；SEQ ID NO6或8的成熟蛋白序列；檢測(cè)或純化標(biāo)記，包括FLAG、His6或Ig序列；或另一趨化因子蛋白序列。提供包含這樣的蛋白或多肽的試劑盒，所述試劑盒還包括包含所述DVic-1蛋白或多肽的區(qū)室；包含所述DVic-1蛋白或多肽的區(qū)室；或使用或處理所述試劑盒中試劑的說明。
提供包含例如抗體的抗原結(jié)合部分的結(jié)合化合物和組合物，所述抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合天然的DVic-1蛋白、DGWCC蛋白，對(duì)于所述DVic-1蛋白，其中所述蛋白是靈長(zhǎng)類蛋白；所述結(jié)合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；所述結(jié)合化合物綴合于另一化學(xué)部分；或產(chǎn)生針對(duì)包含SEQ ID NO2或12的成熟多肽的肽序列的抗體；產(chǎn)生針對(duì)成熟DVic-1的抗體；產(chǎn)生針對(duì)純化的DVic-1的抗體；免疫選擇抗體；所述抗體是多克隆抗體；所述抗體結(jié)合變性的DVic-1；所述抗體顯示對(duì)抗原的Kd至少為30mM；所述抗體附著于包括珠?；蛩芰夏さ墓滔嗷|(zhì)上；所述抗體是在無菌組合物中；或可檢測(cè)地標(biāo)記所述抗體，包括放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記；對(duì)于所述DGWCC蛋白，其中所述蛋白是靈長(zhǎng)類或嚙齒類蛋白；所述結(jié)合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；所述結(jié)合化合物綴合于另一化學(xué)部分；或產(chǎn)生針對(duì)包含SEQ ID NO6或8的成熟多肽的肽序列的抗體；產(chǎn)生針對(duì)成熟DGWCC的抗體；產(chǎn)生針對(duì)純化的DGWCC的抗體；免疫選擇所述抗體；所述抗體是多克隆抗體；所述抗體結(jié)合變性的DGWCC；所述抗體顯示對(duì)抗原的Kd至少為30mM；所述抗體附著于包括珠?；蛩芰夏さ墓滔嗷|(zhì)上；所述抗體是在無菌組合物中；或可檢測(cè)地標(biāo)記所述抗體，例如放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。
使用結(jié)合組合物的試劑盒實(shí)施方案包括那些使用這種結(jié)合化合物的試劑盒，所述試劑盒還包括包含所述結(jié)合化合物的區(qū)室；和/或使用或處理試劑盒中試劑的說明。所述試劑盒一般能夠進(jìn)行定性或定量分析。提供其它不同的組合物，所述組合物例如包括這種無菌結(jié)合化合物；或這種結(jié)合化合物和一載體，其中所述載體是包括水、鹽水和/或緩沖液的水性化合物；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、表面或腸胃外給藥。
提供的核酸包括編碼所述蛋白或肽或融合蛋白的分離或重組的核酸，其中所述DVic-1蛋白來自包括人的靈長(zhǎng)類；或所述DVic-1核酸編碼SEQ ID NO1-4或11-12中任何一個(gè)的抗原肽序列；編碼SEQ IDNO1-4或11-12中的多個(gè)抗原肽序列；顯示同編碼所述區(qū)段的天然cDNA至少大約80％的同一性；是表達(dá)載體；還包含復(fù)制起點(diǎn)；來自天然來源；包含可檢測(cè)的標(biāo)記；包含合成核苷酸序列；少于6kb，優(yōu)選少于3kb；來自包括人的靈長(zhǎng)類；包含天然全長(zhǎng)編碼序列；是用于編碼所述DVic-1蛋白的基因的雜交探針；或是PCR引物、PCR產(chǎn)物或誘變引物；而所述DGWCC蛋白來自包括人或小鼠的靈長(zhǎng)類或嚙齒類；或所述DGWCC核酸編碼SEQ ID NO6或8的抗原肽序列；編碼SEQ ID NO6或8的多個(gè)抗原肽序列；顯示同編碼所述區(qū)段的天然cDNA至少大約80％的同一性；是表達(dá)載體；還包含復(fù)制起點(diǎn)；來自天然來源；包含可檢測(cè)的標(biāo)記；包含合成核苷酸序列；少于6kb，優(yōu)選少于3kb；來自包括人或小鼠的靈長(zhǎng)類或嚙齒類；包含天然全長(zhǎng)編碼序列；是用于編碼所述DGWCC蛋白的基因的雜交探針；或是PCR引物、PCR產(chǎn)物或誘變引物。
也提供包含這種重組核酸的細(xì)胞或組織，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、靈長(zhǎng)類細(xì)胞或人類細(xì)胞。提供包括所述核酸的試劑盒，所述試劑盒例如包含所述核酸和包含所述核酸的區(qū)室；還包含DVic-1或DGWCC蛋白或多肽的區(qū)室；和/或使用或處理所述試劑盒中試劑的說明。所述試劑盒一般能夠進(jìn)行定性或定量分析。
這類核酸包括以下那些核酸，所述核酸在30℃和低于2M鹽、45℃和/或500mM鹽、或55℃和/或150mM鹽洗滌條件下同SEQ ID NO1雜交；在至少大約30個(gè)核苷酸的序列內(nèi)同DVic-1顯示至少大約85％的同一性、顯示同DVic-1至少大約90％的同一性和/或所述序列至少大約55個(gè)核苷酸、或顯示同DVic-1至少大約95％的同一性和/或所述序列至少為大約75個(gè)核苷酸；在30℃或低于2M鹽、45℃和/或500mM鹽、或55℃和/或150mM鹽的洗滌條件下同SEQ ID NO5或7雜交；在至少大約30個(gè)核苷酸的序列內(nèi)同DGWCC顯示至少大約85％的同一性、顯示同DGWCC至少大約90％的同一性和/或所述序列至少為大約55個(gè)核苷酸、或顯示同DGWCC至少大約95％的同一性和/或所述序列至少為大約75個(gè)核苷酸。
另外，提供調(diào)制細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞的生理學(xué)或發(fā)育的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞處于DVic-1或DGWCC的激動(dòng)劑或拮抗物作用之下。本發(fā)明也提供檢測(cè)與一化合物的特異性結(jié)合的方法，包括使所述化合物和選自以下的一種組合物接觸特異結(jié)合DVic-1趨化因子的抗原結(jié)合位點(diǎn)；編碼DVic-1趨化因子或其片段的表達(dá)載體；大體純的蛋白，上述抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性地識(shí)別所述蛋白；大體純的DVic-1趨化因子或其肽，或包含DVic-1趨化因子序列的30個(gè)氨基酸序列部分的融合蛋白；特異性結(jié)合DGWCC趨化因子的抗原結(jié)合位點(diǎn)；編碼DGWCC趨化因子或其片段的表達(dá)載體；大體純的蛋白，上述抗原結(jié)合位點(diǎn)特異識(shí)別所述蛋白；和大體純的DGWCC趨化因子或其肽，或包含DGWCC趨化因子序列的30個(gè)氨基酸序列部分的融合蛋白；或檢測(cè)所述化合物同所述組合物的結(jié)合。
詳細(xì)描述I.一般描述本發(fā)明提供編碼蛋白的靈長(zhǎng)類DNA序列，其中所述蛋白顯示細(xì)胞因子或趨化因子特征性的結(jié)構(gòu)特性或基元。對(duì)于趨化因子家族的綜述，參見例如Lodi等(1994)Science 2631762-1767Gronenborn和Clore(1991)Protein Engineering 4263-269；Miller和Kranger(1992)Proc.Nat′1 Acad. Sci. USA 892950-2954Matsushima和Oppenheim(1989)Cytokine 12-13；Stoeckle和Baker(1990)New Biol.2313-323；Oppenheim等(1991)Ann.Rev.Immunol.9617-648；Schall(1991)Cvtokine 3165-183；和細(xì)胞因子手冊(cè)Academic Press，NY。
本文所述新細(xì)胞因子命名為DNAX Vic-1(DVic-1)和DNAX腹股溝傷口表達(dá)CC趨化因子(DGWCC)。
SEQ ID NO3和4確定了兩個(gè)分別從HHFFQ25R人胎心文庫和HOEDH11R人成骨細(xì)胞文庫獲得的EST′s。這些顯示了高同源性，并且可能是來自相似轉(zhuǎn)錄物的EST′s。比較這兩個(gè)EST′s的趨化因子基元，并衍生共有序列，接著證實(shí)所述共有序列編碼人DVic-1(SEQ ID NO1)。在Ala和Ile之間顯示一個(gè)信號(hào)序列，盡管該信號(hào)序列在不同的細(xì)胞系中可能不同。也公開了另一個(gè)人DVic-1的更長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物具有未顯示特征性趨化因子基元(SEQ ID NO11和12)的N-末端延伸。
在SEQ ID NO5和6中公開了人DGWCC的多肽和核酸序列。所述人DGXCC趨化因子核酸序列的編碼序列在SEQ ID NO5的大約核苷酸1開始，并在大約核苷酸336結(jié)束。在SEQ ID NO6的氨基酸殘基9-10中可以發(fā)現(xiàn)特征性CC基元。表明一個(gè)信號(hào)序列，但以相關(guān)基因?yàn)榛A(chǔ)，在不同的細(xì)胞類型中可能發(fā)生稍微不同的加工。SEQ ID NO7和8中公開了小鼠DGWCC趨化因子(先前稱作mDVic-1，參見USSN08/761,071)的核酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。polyA信號(hào)來自核苷酸384-389，并包括終止密碼子部分。信號(hào)P預(yù)示了在Ala(-1)和Leul之間的切割；但實(shí)際的切割可能在殘基的兩側(cè)或左右。
為示范目的，下文所述涉及例如人的靈長(zhǎng)類實(shí)施方案，但同樣適用于其它實(shí)施方案(例如天然)包括嚙齒類的哺乳動(dòng)物源的相關(guān)實(shí)施方案。這些來源應(yīng)當(dāng)包括各種脊椎動(dòng)物，一般是溫血?jiǎng)游?，例如鳥和哺乳動(dòng)物，尤其是家畜、嚙齒類和靈長(zhǎng)類。表1提供了同其它趨化因子的對(duì)比。表1線型蛋白序列。人MCP-1(SEQ ID NO9)是核苷酸序列庫新增號(hào)S71513；人MIP-3a(SEQ ID NO10)是核苷酸序列庫新增號(hào)U77035；以及人DVic-1(SEQ IDNO2)。相似的線型核苷酸序列將指示同一和差別的區(qū)域。hMCP-1 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNF-TNRKISVQRLASY-RRITShMIP-3a MCCTKSLLLAALMSVLLLHLCGESEA--ASNFDCCLGY---TDRILHPKFIVGFTRQLANhDVicMQ-QRGLAIVALAVCAALHASEAILP---IASSCCTEVSHHISRRLLERVNMCR-IQRADhDGWCC M-KGPPTFCSLLLLSLLLSPDPTAAFLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADmDGWCCMMEGLSPASSLPLLLLLLSPAPEAALPLPSSTSCCTQLYRQPLPSRLLRRIVHMELQEAD* . . ** . .hMCP-1 SKCPKEAVIFKTIVAKEICADPK--QKWVQDSMDHLDKQTQTPKT-----------hMIP-3a EGCDINAIIFHTKKKLSVCANPK---QTWVKYIVRLLSKKVKDM-----------hDVic GDCDLAAVILHVKRRR-ICVSPHNHTVKQWMKVQAAKKNGKGNVCHRKKHHGKRNSNRAHhDGWCC GDCHLQAFVLHLAQRS-ICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKMG------mDGWCC GDCHLQAVVLHLARRS-VCVHPQNRSLARWLERQGKRLQGTVPSLNLVLQKKMYSNPQQQ* *. .** *hMCP-1 --------hMIP-3a --------hDVic QGKHETYGHKTPYhDGWCC --------mDGWCC N--------本發(fā)明的趨化因子蛋白，由其物理化學(xué)和生物特性而部分確定。本文所述的例如DVic-1或DGWCC的趨化因子的生物性質(zhì)，由其氨基酸序列和成熟大小部分確定。它們還應(yīng)當(dāng)同其它相似的趨化因子享有至少一些生物性質(zhì)。一名技術(shù)人員容易識(shí)別一些可以耐受、且沒有明顯改變所述分子的生物活性的序列變異，例如對(duì)于受體相互作用或重要的三級(jí)結(jié)構(gòu)特征的關(guān)鍵的殘基的保守置換或遠(yuǎn)離該殘基的位置。相反，非保守置換可能適合于刪除選擇的功能。
這些趨化因子存在于特定組織類型中，例如皮膚組織，而所述蛋白與受體的相互作用對(duì)介導(dǎo)不同方面的細(xì)胞生理或發(fā)育很重要。表達(dá)編碼DVic-1或DGWCC的信息的細(xì)胞類型表明，在細(xì)胞分化和發(fā)育中重要的信號(hào)由所述細(xì)胞傳遞。參見例如，Gilbert(1991)發(fā)育生物學(xué)(第3版)Sinauer Associates，桑德蘭，馬薩諸塞州；Brower等，(1991)發(fā)育生物學(xué)(第3版)Saunders，費(fèi)城，賓西法尼亞州Russo等(1992)發(fā)育分子遺傳方案Springer-Verlag，紐約，紐約州；和Wilkins(1993)動(dòng)物發(fā)育的遺傳分析(第2版)Wiley-Liss，紐約，紐約州。并且，DVic-1或DGWCC的表達(dá)或應(yīng)答性應(yīng)起標(biāo)記的作用，例如，限定某些細(xì)胞亞群。
通過對(duì)數(shù)據(jù)庫序列的檢索和細(xì)致分析發(fā)現(xiàn)了所述新的趨化因子。序列在可用數(shù)據(jù)庫中不存在強(qiáng)有力地表明，所述信息表達(dá)很少和/或在很低水平表達(dá)。這樣可能反映出在多數(shù)細(xì)胞類型中細(xì)胞表達(dá)的高度限制和/或水平很低。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行RNA印跡分析，參見例如，Maniatis等(1982)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社，NY；Sambrook等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南(第2版)，第1-3卷，CSH出版社，NY；Ausubel等，生物學(xué)Greene Publishing Associates，布魯克林，NY；和Ausubel等(1987和增補(bǔ)本)分子生物學(xué)現(xiàn)時(shí)方案Wiley/Greene，NY。II.定義所述術(shù)語“結(jié)合組合物”表示例如在抗體-抗原相互作用中特異性和選擇性地結(jié)合DVic-1或DGWCC趨化因子的分子。然而，其它化合物，例如受體蛋白，也可以特異性和/或選擇性地結(jié)合DVic-1或DGWCC趨化因子，以便排斥其它分子。所述結(jié)合一般將在天然生理相關(guān)的蛋白-蛋白相互作用中為或者共價(jià)或者非共價(jià)的，并可以包括多蛋白復(fù)合物的成員，包括載體化合物或二聚化配偶體(partner)。所述分子可以是聚合物或化學(xué)試劑。關(guān)于DVic-1還是DGWCC趨化因子一定是凸起形狀的分子，例如配體-受體相互作用中的配體或受體，這種含意不必說明，除了所述相互作用是否顯示相似特異性，例如特異親和性。功能類似物可以是具有修飾結(jié)構(gòu)的配體，或者可以是完全不相關(guān)的分子，例如具有同適當(dāng)配體相互作用的分子形狀的分子，其中所述配體結(jié)合決定基。所述配體可以用做所述受體的激動(dòng)劑或拮抗劑，參見例如，Goodman等(編輯)(1990)Goodman & Gilman’sThe PharmacologicalBases of Therapeutics(第8版)Pergamon出版社，Tarrytown，NY。
本文使用的所述術(shù)語“結(jié)合劑趨化因子蛋白復(fù)合物”，是指結(jié)合劑和趨化因子(例如DVic-1或DGWCC)蛋白通過所述結(jié)合劑同所述趨化因子蛋白的特異結(jié)合形成的復(fù)合物。所述結(jié)合劑的特異性或選擇性結(jié)合是指所述結(jié)合劑具有特異性結(jié)合位點(diǎn)，例如抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合劑在DVic-1趨化因子蛋白上識(shí)別在許多其它蛋白中不共用的位點(diǎn)。例如，產(chǎn)生的針對(duì)DVic-1趨化因子蛋白并識(shí)別所述趨化因子蛋白上的表位的抗體，能夠通過特異性和選擇性結(jié)合形成結(jié)合劑DVic-1趨化因子蛋白復(fù)合物。結(jié)合劑DVic-1趨化因子蛋白復(fù)合物的形成，一般允許在其它蛋白和生物制品的混合物中測(cè)定DVic-1趨化因子蛋白。同樣，所述術(shù)語“抗體DGWCC趨化因子蛋白復(fù)合物”是指一個(gè)實(shí)施方案，在所述實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑例如是抗體的抗原結(jié)合部分。所述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或抗體的結(jié)合片段，例如Fab或F(ab)2片段。所述抗體優(yōu)選是用于交叉反應(yīng)性測(cè)試目的的多克隆抗體。
在對(duì)比時(shí)，“同源的”核酸序列顯示顯著的相似性或同一性。在核酸中同源性的標(biāo)準(zhǔn)，或者是通過序列比較和/或系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系一般在本領(lǐng)域中使用的同源性的衡量，或者基于雜交條件。在下文更詳細(xì)地描述了雜交條件。
“分離的”核酸是例如RNA、DNA或混合多聚體的核酸，所述核酸基本上與其它生物組分分離，所述生物組分天然伴隨天然序列，例如來自原始種的蛋白和側(cè)翼基因組序列。所述術(shù)語包含從其天然產(chǎn)生環(huán)境中取出的核酸序列，并包括重組的或克隆的DNA分離物和化學(xué)合成類似物，或由異源系統(tǒng)生物合成的類似物。大體純的分子包括分離形式的所述分子。分離的核酸通常包含同源核酸分子，但在某些實(shí)施方案中，所述核酸包含序列異源性小的核酸。一般在對(duì)所需生物功能或活性不重要的多聚體末端或部分中發(fā)現(xiàn)這種異源性。
當(dāng)在蛋白范圍內(nèi)使用時(shí)，本文使用的所述術(shù)語“DVic-1趨化因子蛋白”將包括這樣的蛋白，其氨基酸序列特別是來自SEQ ID NO2所示的趨化因子基元部分，或者包括這種蛋白特有的和/或特征性有效片段，優(yōu)選是天然實(shí)施方案。同樣對(duì)于人和小鼠DGWCC，應(yīng)包含SEQ IDNO6和8所示的氨基酸序列的蛋白。本發(fā)明也包括同這種趨化因子顯示相似結(jié)構(gòu)的多肽，例如同DVic-1或DGWCC特異性結(jié)合組分的相互作用的多肽。這些結(jié)合組分，例如抗體，一般高親合性地(例如以至少大約100nM，通常優(yōu)于大約30nM，優(yōu)選優(yōu)于大約10nM，更優(yōu)選優(yōu)于大約3nM)結(jié)合或者DVic-1趨化因子或者DGWCC趨化因子。
本文使用的術(shù)語“多肽”或“蛋白”包括例如DGWCC趨化因子的趨化因子基元部分的有效片段或區(qū)段，并包括至少大約8個(gè)氨基酸的一段氨基酸殘基，一般至少10個(gè)氨基酸，更一般至少12個(gè)氨基酸，經(jīng)常至少14個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少16個(gè)氨基酸，典型至少18個(gè)氨基酸，更典型至少20個(gè)氨基酸，通常至少22個(gè)氨基酸，更通常至少24個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少26個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少28個(gè)氨基酸，而在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少大約30個(gè)或更多的氨基酸，例如35、40、45、50、60、70、80等等。所述區(qū)段可能具有合適長(zhǎng)度的氨基和羰基末端，例如在例如殘基1、2、3等開始，和在例如殘基95、94、93、92等結(jié)束。本發(fā)明包括由包含多個(gè)所述區(qū)段的蛋白。
“重組”核酸或者由其生產(chǎn)方法定義，或者由其結(jié)構(gòu)定義。關(guān)于其生產(chǎn)方法，例如通過工藝制造產(chǎn)物，所述工藝使用重組核酸技術(shù)，例如包括在核苷酸序列中人的干涉，一般為選擇或生產(chǎn)。另一方面，它可以是通過產(chǎn)生包含兩個(gè)片段的融合體的序列制造的核酸，所述片段互相不是天然連接的，而是指除去天然產(chǎn)物，例如天然產(chǎn)生的突變體。因此，例如包括通過用任何非天然產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞制造的產(chǎn)物，也包括包含使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的核酸。經(jīng)常用編碼相同或保守的氨基酸的豐余密碼子進(jìn)行密碼子置換，同時(shí)引入或除去序列的識(shí)別位點(diǎn)。或者，將所需功能的核酸區(qū)段連接在一起，以產(chǎn)生單一遺傳實(shí)體(entity)，所述實(shí)體包含在通常可利用的天然形式中未發(fā)現(xiàn)的所需功能的組合。限制酶識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)常是這種人工操作的靶，但是可以通過設(shè)計(jì)引入其它位點(diǎn)特異靶，例如啟動(dòng)子、DNA復(fù)制位點(diǎn)、調(diào)節(jié)序列、控制序列或其它有用的特征。相似的觀念準(zhǔn)備用作重組體，例如融合體、多肽。特別包括合成核酸，所述核酸優(yōu)于遺傳密碼豐余性，編碼同這些抗原的片段相似的多肽和來自各種不同物種變異體的序列融合體。
在Svedberg裝置中測(cè)定的沉降反映了“溶解度”，所述裝置是在特定條件下分子沉降速度的測(cè)量工具。用分析超離心機(jī)對(duì)所述沉降速度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定，但現(xiàn)在一般用標(biāo)準(zhǔn)超離心機(jī)測(cè)定所述沉降速度。參見Freifelder(1982)物理生物化學(xué)(第2版)W.H.Freeman & Co.，舊金山，CA；和Cantor和Schimmel(1980)生物物理化學(xué)第1-3章，W.H.Freeman & Co.，舊金山，CA。作為粗測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)滿容量超離心機(jī)，以大約50K rpm離心包含估計(jì)可溶的多肽的樣品大約10分鐘，則可溶分子保留在上清液中?？扇苄晕⒘；蚨嚯囊话阈∮诖蠹s30S，更一般小于大約15S，通常小于大約10S，更通常小于大約6S，而在具體實(shí)施方案中，優(yōu)選小于大約4S，更優(yōu)選小于大約3S。多肽或片段的溶解性取決于所述環(huán)境和所述多肽。許多參數(shù)影響多肽的溶解性，包括溫度、電解質(zhì)環(huán)境、所述多肽的大小和分子特征和溶劑的性質(zhì)。一般在從大約4℃到大約65℃的溫度范圍內(nèi)使用所述多肽。通常使用的所述溫度大約高于18℃，更通常大約高于22℃。為診斷目的，所述溫度通常大約在室溫或更高，但低于在所述測(cè)定中組分的變性溫度。為治療目的，盡管在某些情況下在原位或在體外可以升高或降低所述溫度，但所述溫度通常是體溫，對(duì)于人一般是大約37℃。
所述多肽的大小和結(jié)構(gòu)一般應(yīng)在大致穩(wěn)定的狀態(tài)，而通常不處于變性狀態(tài)。例如所述多肽在四級(jí)結(jié)構(gòu)中可以和其它多肽結(jié)合(例如賦予溶解性可溶性)，或者可以同脂質(zhì)或去污劑以近似天然類脂體雙分子層相互作用的方式結(jié)合。
所述溶劑通常是一種用于保存生物活性類型的生物相容性緩沖液，通常近似于生理溶劑。通常所述溶劑的pH值為中性，典型的大約在5和10之間，而優(yōu)選約為7.5。在某些時(shí)候，加入去污劑，一般是溫性非變性去污劑，例如CHS(膽固醇半琥珀酸酯)或CHAPS(3-[3-膽氨基丙基(cholaminopropyl)-二甲基銨基]-1-丙烷磺酸鹽)，或加入足夠低濃度的去污劑，以避免顯著破壞所述蛋白的結(jié)構(gòu)或生理特性。
在蛋白范圍內(nèi)的“大體純的”一般指與其它污染蛋白、核酸和其它得自原始源生物的生物制品分離的蛋白?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)純度或“分離”，普通至少大約50％純度，更普通至少大約60％純度，一般至少大約70％純度，更一般至少大約80％純度，經(jīng)常至少大約85％純度，更經(jīng)常至少大約90％純度，優(yōu)選至少大約95％純度，更優(yōu)選至少大約98％純度，而在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少99％純度。相似的概念適用于例如抗體或核酸。
在所述核酸序列比較范圍內(nèi)，“大體相似性”指當(dāng)對(duì)比時(shí)，或者所述區(qū)段或者其互補(bǔ)鏈，在以插入或缺失合適的核苷酸進(jìn)行最佳對(duì)比時(shí)，至少大約50％的核苷酸相一致，一般至少56％，更一般至少59％，普通至少62％，更普通至少65％，經(jīng)常至少68％，更經(jīng)常至少71％，典型至少74％，更典型至少77％，通常至少80％，更通常至少大約85％，優(yōu)選至少大約90％，更優(yōu)選至少大約95％-98％或更多，而在特定實(shí)施方案中，高達(dá)大約99％或更高的核苷酸相一致。另一方面，當(dāng)所述區(qū)段在選擇雜交條件下雜交時(shí)，同一條鏈或其互補(bǔ)鏈存在著大致相似性，所述鏈或其互補(bǔ)鏈一般使用由SEQ ID NO1、5或7衍生的序列。一般當(dāng)一段至少大約30個(gè)核苷酸的序列中至少大約55％相似時(shí)，將發(fā)生選擇雜交，優(yōu)選在一段至少大約25個(gè)核苷酸中至少大約65％相似，更優(yōu)選至少大約75％相似，而最優(yōu)選在大約20個(gè)核苷酸中至少大約90％相似。參見Kanehisa(1984)Nuc.Acids Res.12203-213。所述的相似對(duì)比的長(zhǎng)度可以為更長(zhǎng)的一段序列，在某些實(shí)施方案中為一段至少大約17個(gè)核苷酸的序列，通常至少大約20個(gè)核苷酸，更通常至少大約24個(gè)核苷酸，典型至少大約28個(gè)核苷酸，更典型至少大約40個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少大約50個(gè)核苷酸，而更優(yōu)選至少大約75-100或更多個(gè)核苷酸，例如150，200等等。
涉及雜交范圍內(nèi)的同源性或大致相似性，“嚴(yán)格條件”將是一般在雜交反應(yīng)中控制的那些鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其它參數(shù)的嚴(yán)格組合條件。所述參數(shù)組合比任何單個(gè)參數(shù)的測(cè)定更重要。參見例如，Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。在嚴(yán)格條件下結(jié)合靶核酸的核酸探針對(duì)于所述靶核酸是特異性的。這樣的探針長(zhǎng)度一般多于11個(gè)核苷酸，并在于嚴(yán)格雜交條件下結(jié)合所述靶的探針序列限定的區(qū)域內(nèi)地與靶核酸足夠相同或互補(bǔ)。
可以通過密切相關(guān)的物種的雜交種雜交，克隆和分離來自其它哺乳動(dòng)物物種的DGWCC趨化因子。參見例如下文。在遠(yuǎn)緣物種之間相似性可能相對(duì)較低，因此使相對(duì)密切相關(guān)的物種雜交是合理的。另一方面，制備表現(xiàn)出物種特異性較低的抗體制備物在表達(dá)克隆方法上可能是有用的。
詞組“特異結(jié)合抗體”或“與……特異性免疫反應(yīng)”，當(dāng)適是指蛋白或肽時(shí)，表示一種結(jié)合反應(yīng)，所述結(jié)合反應(yīng)在存在蛋白和其它生物組分的異質(zhì)群體時(shí)，證明存在所述蛋白。因此，在指定的免疫測(cè)定條件下，給定的抗體結(jié)合特定的蛋白，而與存在于所述樣品中的其它蛋白沒有顯著結(jié)合。在這種條件下特異性結(jié)合抗體可能需要抗體，根據(jù)對(duì)特定蛋白的特異性選擇所述抗體。例如，可以選擇針對(duì)具有SEQID NO2或6或8描述的氨基酸序列的DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白免疫原產(chǎn)生的抗體，以獲得與DGWCC趨化因子蛋白特異性免疫反應(yīng)、而不與其它蛋白特異免疫反應(yīng)的抗體。所述抗體可以是物種特異，例如還識(shí)別多態(tài)或剪接或發(fā)育變異體。III.核酸DGWCC趨化因子是結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)蛋白的范例。這些可溶性的趨化因子蛋白在不同細(xì)胞類型之間用于傳遞信號(hào)。在標(biāo)準(zhǔn)步驟中使用公開的優(yōu)選實(shí)施方案，以從不同的個(gè)體或其它物種諸(如鳥和哺乳動(dòng)物)中分離基因。交叉雜交允許分離編碼來自個(gè)體、菌株或物種的蛋白的相關(guān)基因。基于本文提供信息，多種不同的方法可以用于成功分離的合適的核酸克隆。DNA印跡雜交研究可以在特定雜交條件下定性測(cè)定人、猴、大鼠、小鼠、狗、貓、牛和兔基因組中同源基因的存在。
互補(bǔ)序列也用作探針或引物。根據(jù)對(duì)可能的氨基末端的鑒定，例如結(jié)合錨式載體或poly-A互補(bǔ)PCR技術(shù)或結(jié)合其它肽的互補(bǔ)DNA，其它多肽應(yīng)當(dāng)特別有用。
在Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(第2版)第1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社，NY中概述了用于核酸操作編碼DGWCC趨化因子蛋白的基因的技術(shù)，諸如將編碼多肽的核酸序列亞克隆入表達(dá)載體內(nèi)、標(biāo)記探針、DNA雜交等等，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。這個(gè)指南在下文稱為“Sambrook等”。
有各種方法分離編碼DGWCC趨化因子蛋白的DNA序列。例如，用標(biāo)記寡核苷酸探針從基因組或cDNA文庫中分離DNA，所述探針具有同本文公開的序列相同或互補(bǔ)的序列。可以使用全長(zhǎng)探針，或者可以通過對(duì)比公開的所述序列產(chǎn)生寡核苷酸探針。在雜交測(cè)定中可以直接使用這種探針，以分離編碼DGWCC趨化因子蛋白的DNA，或者可以設(shè)計(jì)用于諸如PCR的擴(kuò)增技術(shù)的探針，以分離編碼DGWCC趨化因子蛋白的DNA。反向翻譯計(jì)算機(jī)程序也可以提供可供選擇的編碼相同蛋白的核酸序列。
為制備cDNA文庫，從表達(dá)DGWCC趨化因子蛋白的細(xì)胞中分離mRNA。由mRNA制備cDNA，并將其連接入重組載體。將所述載體轉(zhuǎn)染到重組宿主中，以繁殖、篩選和克隆。制備和篩選cDNA文庫的方法是廣為人知的。參見Gubler和Hoffman(1983)Gene 25263-269和Sambrook等。
關(guān)于基因組文庫，可以從組織中提取所述DNA，并且或者可以機(jī)械剪切所述DNA，或者可以酶促消化所述DNA，以產(chǎn)生大約12-20kb的片段。然后通過梯度離心分離所述片段，并在噬菌體λ載體中克隆所述片段。按在Sambrook等中所述，在體外包裝這些載體和噬菌體。用在Benton和Davis(1977)Science 196180-182中所述的噬菌斑雜交分析重組噬菌體。按照在例如Grunstein等(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.723961-3965中的概述進(jìn)行菌落雜交。
可以在或者cDNA文庫中，或者基因組文庫中，通過其與本文所述的核酸探針雜交的能力，鑒別編碼DGWCC趨化因子蛋白的DNA，例如在菌落雜交或噬菌斑雜交測(cè)定中鑒別。通過本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離對(duì)應(yīng)的DNA區(qū)。參見例如Sambrook等。
也可以使用不同的擴(kuò)增靶序列的方法，諸如多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以制備編碼DGWCC趨化因子蛋白的DNA。使用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，直接從mRNA、從cDNA、和從基因組文庫或cDNA文庫中擴(kuò)增這種核酸序列。也可以使用編碼DGWCC趨化因子蛋白的分離序列作為模板，用于PCR擴(kuò)增。
一般用PCR技術(shù)合成寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物和在待擴(kuò)增的DNA區(qū)中的兩個(gè)5′區(qū)互補(bǔ)。然后用所述兩個(gè)引物進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。參見Innis等(編輯)(1990)PCR方案方法和應(yīng)用指南AcademicPress，San Diego，CA?？梢赃x擇引物，以擴(kuò)增編碼全長(zhǎng)DGWCC趨化因子蛋白的整個(gè)區(qū)域，或擴(kuò)增所述較小的DNA區(qū)段。只要通過PCR擴(kuò)增這個(gè)區(qū)，就可以對(duì)它們測(cè)序，并可以由使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)得到的序列制備寡核苷酸探針。然后可以使用這些探針分離編碼DGWCC趨化因子蛋白的DNA。
通常按照由Beaucage和Carruthers(1983)Tetrahedron Lett.22(20)1859-1862中首先描述的固相亞磷酰胺三酯方法，或如Needham-VanDevanter等(1984)Nucleic Acids Res. 126159-6168所述使用自動(dòng)合成儀，化學(xué)合成用作探針的寡核苷酸。例如，通過天然丙烯酰胺凝膠電泳，或通過在Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255137-149中所述的陰離子交換HPLC進(jìn)行寡核苷酸純化?？梢允褂美鏜axam和Gilbert在Grossman和Moldave(編輯1980)Methods in Enzvmology 65499-560Academic Press，紐約中的化學(xué)降解法，證實(shí)所述合成寡核苷酸的序列。
鑒定編碼DGWCC趨化因子蛋白的分離的核酸。在SEQ ID NO1或5或7中提供所述核酸序列和對(duì)應(yīng)的可讀框。
這些DVic-1和DGWCC趨化因子顯示同部分趨化因子有限的相似性。參見例如Matsushima和Oppenheim(1989)Cytokine 12-13；Oppenheim等(1991)Ann.Rev.Immunol. 9617-648；Schall(1991)Cytokine 3165-183；和Gronenborn和Clore(1991)Protein Engineering4263-269。所述DGWCC趨化因子和趨化因子家族之間其它特征的對(duì)比很明顯。參見例如Lodi等(1994)Science 2631762-1766。具體而言，可以使用例如RASMOL程序確定b-折疊和a-螺旋殘基，參見Sayle和Milner-White(1995)TIBS 20374-376；或Gronenberg等(1991)ProteinEngineering 4263-269；并在Lodi等(1994)Science 2631762-1767中詳細(xì)說明了其它結(jié)構(gòu)特征。除了合適的半胱氨酸殘基間隔之外，這些二級(jí)和三級(jí)特征幫助進(jìn)一步確定了C、CC、CXC和CX3C結(jié)構(gòu)特征。
本發(fā)明提供編碼DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白的分離的DNA或片段。另外，本發(fā)明提供分離或重組的編碼蛋白或多肽的DNA，所述DNA能夠在例如高嚴(yán)格性的合適條件下，同本文所述的DNA序列雜交。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整配體或片段，并具有如在SEQID NO2或6或8中公開的氨基酸序列，尤其是天然實(shí)施方案。優(yōu)選實(shí)施方案將是全長(zhǎng)天然序列，它來自例如在非糖基化時(shí)大小約為11,000至12,500道爾頓的分離物，或來自至少大約6,000道爾頓、更優(yōu)選至少大約8,000道爾頓的片段。在糖基化形式時(shí)，所述蛋白可以超過12,500道爾頓。而且，本發(fā)明考慮編碼下述蛋白的分離或重組的DNA或其片段的用途，所述蛋白同DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白同源，或使用編碼DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白的cDNA作為探針分離的。所述分離的DNA可以在5′和3′側(cè)翼具有各自的調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、poly-A添加信號(hào)和其它信號(hào)。還包括制備具有這些序列的表達(dá)載體的方法、或者制備(例如表達(dá)或純化)蛋白產(chǎn)物的方法。IV. 制備DVic-1、DGWCC趨化因子可以通過化學(xué)合成、篩選cDNA文庫，或通過篩選由各種各樣的細(xì)胞系或組織樣品制備的基因組文庫，獲得編碼DVic-1或DGWCC趨化因子或其片段的DNA。本文描述了用于上述操作或制備表達(dá)載體的方法。
可以在各種各樣的宿主細(xì)胞中表達(dá)這些DNA，用于合成全長(zhǎng)的蛋白或片段，所述蛋白或片段可以依次，例如用于產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體；用于結(jié)合研究；用于構(gòu)建和表達(dá)修飾分子；并用于結(jié)構(gòu)/功能研究。每種DVic-1或DGWCC趨化因子或其片段可以在用合適的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)?？梢源篌w純化這些分子，以除去蛋白或細(xì)胞污染物，而不是純化那些由所述重組宿主衍生的分子，并因此在和藥學(xué)上接受的載體和/或稀釋劑結(jié)合時(shí)，特別可用于藥物組合物。所述抗原，例如DGWCC趨化因子或其部分，可以作為與其它蛋白的融合體或具有表位標(biāo)記的融合體表達(dá)。
表達(dá)載體通常是自主復(fù)制DNA或RNA構(gòu)成物，所述構(gòu)成物包括所需抗原基因或其片段，通?？刹僮鞯倪B接到在合適宿主細(xì)胞中識(shí)別的合適的遺傳控制元件。實(shí)現(xiàn)表達(dá)所需的特定類型的控制元件取決于最后使用的宿主細(xì)胞。一般來說，所述遺傳控制元件可以包括原核生物啟動(dòng)子系統(tǒng)或真核生物啟動(dòng)子表達(dá)控制系統(tǒng)，一般包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、控制轉(zhuǎn)錄開始的可選的操作子、提高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、編碼合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、和終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)載體通常也包含復(fù)制起點(diǎn)，所述復(fù)制起點(diǎn)允許所述載體獨(dú)立于所述宿主細(xì)胞而復(fù)制。
本發(fā)明的載體包括編碼DVic-1或DGWCC趨化因子或其片段的DNA，所述DNA一般編碼例如生物活性多肽或蛋白。所述DNA可以處于病毒啟動(dòng)子控制之下，并可以編碼選擇標(biāo)記。本發(fā)明還考慮了這種表達(dá)載體的用途，所述載體能夠在原核生物或真核生物宿主中表達(dá)編碼DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白的真核生物cDNA，其中所述載體和所述宿主相容，并且將編碼所述蛋白的真核生物cDNA插入到所述載體中，以使包含載體的所述宿主生長(zhǎng)，其中所述載體表達(dá)上述cDNA。通常設(shè)計(jì)表達(dá)載體用于在其宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，或用于擴(kuò)增，以大大增加每個(gè)細(xì)胞的所需基因拷貝總數(shù)。通常不必需要在宿主細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)載體，例如，使用不包括所述宿主細(xì)胞識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)的載體可能影響所述蛋白或其片段在不同的宿主中瞬時(shí)表達(dá)。也可能使用引起DVic-1或DGWCC趨化因子基因或其片段通過重組整合到所述宿主DNA中的載體，或者也可能整合控制內(nèi)源基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
本文使用的載體，考慮了質(zhì)粒、病毒、噬菌體、可整合DNA片段和其它能夠?qū)NA片段整合到所述宿主基因組中的載體。表達(dá)載體是包含遺傳控制元件的特殊的載體，所述遺傳控制元件影響可操作連接的基因的表達(dá)。質(zhì)粒是最通常使用的載體形式，但許多其它形式的起相同作用的載體也適于本文。參見例如Pouwels等(1985和增補(bǔ)本)克隆載體實(shí)驗(yàn)室指南Elsevier，紐約；和Rodriquez等(編輯)(1988)載體分子克隆載體及其應(yīng)用的調(diào)查Buttersworth，波士頓，MA。
合適的宿主細(xì)胞包括原核生物、低等真核生物和高等真核生物。原核生物包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌生物，例如大腸桿菌和枯草桿菌。低等真核生物包括酵母，例如啤酒酵母和畢赤酵母屬和網(wǎng)柄菌屬。高等真核生物既包括來自例如昆蟲細(xì)胞和鳥類的非哺乳動(dòng)物起源的動(dòng)物細(xì)胞的確立組織培養(yǎng)細(xì)胞株，也包括來自例如人、靈長(zhǎng)類和嚙齒類的哺乳動(dòng)物起源的動(dòng)物細(xì)胞的確立組織培養(yǎng)細(xì)胞株。
原核宿主載體系統(tǒng)包括各種各樣的用于多種不同物種的載體。本文使用的大腸桿菌及其載體一般包括在其它原核生物中使用的相當(dāng)?shù)妮d體。用于擴(kuò)增DNA的代表性的載體是pBR322或其衍生物?？梢杂糜诒磉_(dá)DGWCC趨化因子或DGWCC趨化因子片段的載體包括但不限于，諸如那些包含lac啟動(dòng)子(pUC系列)、trp啟動(dòng)子(pBR322-trp)、Ipp啟動(dòng)子(所述pIN系列)、λ-pP或pR啟動(dòng)子(pOTS)、或諸如ptac(pDR450)的雜種啟動(dòng)子的載體。參見Brosius等(1988)“使用λ-、trp-、lac-和Ipp-衍生啟動(dòng)子的表達(dá)載體”，在Rodriguez和Denhardt(編輯)載體分子克隆載體及其應(yīng)用的調(diào)查10205-236 Buttersworth，波士頓，MA。
低等真核生物，例如酵母和網(wǎng)柄菌屬，可以用包含DVic-1或DGWCC趨化因子序列的載體轉(zhuǎn)化。對(duì)本發(fā)明來說，最普通的低等真核生物宿主是面包酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。盡管也可以利用多種其它菌株和物種，但所述低等真核生物宿主一般用來代表低等真核生物。酵母載體一般由復(fù)制起點(diǎn)(除了所述整合類型)、選擇基因、啟動(dòng)子、編碼所需蛋白或其片段的DNA和用于翻譯終止、多腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的序列組成。用于酵母的合適的表達(dá)載體包括諸如3-磷酸甘油酸激酶和其它各種糖酵解酶基因啟動(dòng)子的組成型啟動(dòng)子，或諸如乙醇脫氫酶2啟動(dòng)子或金屬硫蛋白啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。合適的載體包括下述類型的衍生物自主復(fù)制低拷貝數(shù)(諸如YRp系列)、自主復(fù)制高拷貝數(shù)(諸如YEp系列)；整合類型(諸如YIp系列)，或微型染色體(諸如YCp系列)。
高等真核生物組織培養(yǎng)細(xì)胞一般是優(yōu)選的用于表達(dá)功能活性的DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白的宿主細(xì)胞。原則上，可以使用許多高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系，例如昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，不論其來自無脊椎動(dòng)物源還是來自脊椎動(dòng)物源。然而，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞是為了獲得共翻譯以及翻譯后兩者的正確加工。這種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染和繁殖是常規(guī)技術(shù)。有用的細(xì)胞系包括海拉細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、幼鼠腎(BRK)細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、鳥細(xì)胞系和猴(COS)細(xì)胞系。用于這些細(xì)胞系的表達(dá)載體一般包括復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、翻譯起始位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)(例如如果使用基因組DNA)、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。這些載體也可以包括一個(gè)選擇基因或擴(kuò)增基因。合適的表達(dá)載體可以是攜帶啟動(dòng)子的質(zhì)粒、病毒或具有啟動(dòng)子的反轉(zhuǎn)錄病毒，所述啟動(dòng)子例如得自諸如腺病毒、SV40、細(xì)小病毒、痘苗病毒或巨細(xì)胞病毒的來源。合適的表達(dá)載體的代表性實(shí)施方案包括pCDNA1；pCD，參見Okayama等(1985)Mol.Cell Biol. 51136-1142；pMClneo Poly-A，參見Thomas等(1987)Cell 51503-512；和諸如pAC373或pAC 610的桿狀病毒載體。
可能DVic-1或DGWCC趨化因子不需要糖基化，以引起生物應(yīng)答。然而，偶爾希望它在提供特別或限定的糖基化型式的系統(tǒng)中表達(dá)DVic-1或DGWCC趨化因子多肽。在這種情況下，常用的型式將是由所述表達(dá)系統(tǒng)天然提供的型式。然而，通過將例如非糖基化形式的所述多肽暴露于引入到異源表達(dá)系統(tǒng)中的合適糖基化蛋白，而修飾所述型式。例如，所述DGWCC趨化因子基因可以同一個(gè)或多個(gè)編碼哺乳動(dòng)物或其它糖基化酶的基因共轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在更加了解過度糖基化可能損害DGWCC趨化因子生物活性，而技術(shù)人員可以進(jìn)行常規(guī)的測(cè)試，以最優(yōu)化提供最佳生物活性的糖基化程度。
可以工程改造DVic-1或DGWCC趨化因子或其片段，以將磷脂酰肌醇(PI)連接到細(xì)胞膜上，但可以通過用磷脂酰肌醇切割酶，例如磷脂酰肌醇磷脂酶-C處理，從膜上除去所述磷脂酰肌醇(PI)。這釋放了生物活性形式的抗原，并允許用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白化學(xué)步驟純化。參見例如Low(1989)Biochem. Biophhvs. Acta 988427-454；Tse等(1985)Science 2301003-1008；和Brunner等(1991) J.Cell Biol.1141275-1283。
現(xiàn)在已特征鑒定了DVic-1和DGWCC趨化因子，可以通過用于合成肽的常規(guī)方法制備其片段或其衍生物。這些包括諸如在Stewart和Young(1984)固相肽合成Pierce Chemical Co.，洛克福德，伊力諾伊州；Bodanszky和Bodanszky(1984)肽合成實(shí)踐Springer-Verlag，紐約，紐約州；和Bodanszky(1984)肽合成原理Springer-Verlag，紐約，紐約州中所述的方法。例如可以使用疊氮化物法、鹽酸工法、酸酐法、混合酐法、活性酯法(例如對(duì)硝基苯酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯或氰甲酯)、碳化二咪唑法、氧化還原法、或二環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)/加成法。固相和液相合成都適用于前述方法。也參見化學(xué)連接，例如Dawson等(1994)Science 266776-779，通過肽鍵連接長(zhǎng)合成肽的方法。
可以通過肽分離，例如通過提取、沉淀、電泳和不同形式的層析等等，從所述反應(yīng)混合物中分離和純化所述制備的蛋白和其片段。根據(jù)其希望的用途，可以以不同的純度獲得本發(fā)明的DVic-1或DGWCC趨化因子。通過使用已知的蛋白純化技術(shù)或例如在免疫吸收親合性層析中使用本文所述的抗體或結(jié)合配偶體，可以完成純化。首先通過將抗體同固相支持體連接，然后將連接的抗體與可溶性的合適源細(xì)胞的裂解液、表達(dá)所述配體的其它細(xì)胞的裂解液、或利用重組DNA技術(shù)(參見下文)產(chǎn)生所述DVic-1或DGWCC趨化因子的細(xì)胞的裂解液或上清液接觸，進(jìn)行此免疫吸附親合層析。
可以篩選多個(gè)細(xì)胞系，得到同其它細(xì)胞相比，以高水平表達(dá)DGWCC趨化因子的細(xì)胞系。可以從天然源，或通過使用合適表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表達(dá)，分離天然DVic-1或DGWCC趨化因子。通過標(biāo)準(zhǔn)步驟獲得表達(dá)蛋白的純化，或者可以將表達(dá)蛋白的純化與工程方法組合，以高效率地有效地從細(xì)胞裂解液進(jìn)行純化裂解液?？梢允褂帽砦换蚱渌鼧?biāo)記，例如FLAG或His6區(qū)段，作為這種純化特征。V.抗體可以產(chǎn)生不同的針對(duì)各種DVic-1或DGWCC趨化因子的抗體，包括個(gè)體的、多態(tài)的、等位的、菌株或物種的變異體及其片段，不論其是天然產(chǎn)生(全長(zhǎng))形式，還是重組形式。另外，可以產(chǎn)生針對(duì)或者活體形式、或者非活體形式的DVic-1或DGWCC趨化因子的抗體。也可以使用抗獨(dú)特型抗體。所述抗體可以顯示對(duì)于物種、個(gè)體或多態(tài)變異體的不同的結(jié)合特異性。
A.生產(chǎn)抗體可以使用多種免疫原生產(chǎn)與DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白特異反應(yīng)的抗體。重組蛋白是優(yōu)選的用于生產(chǎn)單克隆或多克隆抗體的免疫原。也可以使用或者純形式或者非純形式的天然產(chǎn)生的蛋白。也可以使用用本文所述的DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白序列制備的合成肽，作為用于生產(chǎn)針對(duì)DVic-1或DGWCC趨化因子的抗體的免疫原?？梢栽诒疚乃龅恼婧嘶蛟思?xì)胞中表達(dá)重組蛋白，并如所述對(duì)其純化。可以適當(dāng)?shù)厥褂锰烊徽郫B或變性的材料生產(chǎn)抗體。可以生產(chǎn)或者單克隆抗體或多克隆抗體，以后將其應(yīng)用于檢測(cè)所述蛋白的免疫測(cè)定中。
生產(chǎn)多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。一般來說，將免疫原，優(yōu)選是純化的蛋白，同佐劑混合，并用此混合物對(duì)動(dòng)物免疫。通過取測(cè)試血和測(cè)定對(duì)目的DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白的反應(yīng)效價(jià)，監(jiān)視動(dòng)物對(duì)所述免疫原制備物的免疫應(yīng)答。當(dāng)獲得針對(duì)所述免疫原的合適的高效價(jià)抗體時(shí)，通常在重復(fù)免疫后，從所述動(dòng)物中收集血液，并制備抗血清。如果需要，可以對(duì)所述抗血清進(jìn)行進(jìn)一步的分級(jí)分離，以富集對(duì)所述蛋白反應(yīng)的抗體。參見例如Harlow和Lane；或Coligan。
可以通過本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟悉的各種技術(shù)獲得單克隆抗體。一般來說，通常通過和骨髓瘤細(xì)胞融合(參見Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol. 6511-519，通過引用結(jié)合到本文中)，使來自用所需抗原免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞無限增殖化。無限增殖化的替代方法包括用埃-巴二氏病毒、癌基因或反轉(zhuǎn)錄病毒或本領(lǐng)域已知的其它方法轉(zhuǎn)化。篩選由單種無限增殖化細(xì)胞產(chǎn)生的集落，以生產(chǎn)對(duì)所述抗原具有所需特異性和親合性的抗體，可以用各種技術(shù)，包括注射到脊椎動(dòng)物宿主的腹膜腔中，增加由這種細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的產(chǎn)量。或者，例如按照由Huse等(1989)Science 2461275-1281概述的一般方案，通過篩選來自人B細(xì)胞的DNA文庫，可以分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。
可以通過用如上所述的片段和載體蛋白的綴合物使動(dòng)物免疫，產(chǎn)生針對(duì)DGWCC趨化因子的預(yù)定測(cè)片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈形式。由分泌所需抗體的細(xì)胞制備單克隆抗體?？梢院Y選這些抗體，根據(jù)結(jié)合正?；蛉毕莸腄Vic-1或DGWCC趨化因子，或者根據(jù)例如通過受體介導(dǎo)的激動(dòng)或拮抗活性，篩選這些抗體。這些單克隆抗體結(jié)合的KD通常至少大約1mM，更通常至少大約300μm，典型至少大約10μm，更典型至少大約30μm，優(yōu)選至少大約10μm，和更優(yōu)選至少大約3μM或更少。
在某些情況下，最好是由不同的哺乳動(dòng)物宿主，諸如小鼠、嚙齒類、靈長(zhǎng)類、人等制備單克隆抗體。例如在通過引用結(jié)合到本文中的Stites等(編輯)基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(第4版)Lange Medical Press，LosAltos，CA；Harlow和Lane(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室指南CSH出版社；Goding(1986)單克隆抗體原理與實(shí)踐(第2版)Academic Press，紐約，紐約州中可以發(fā)現(xiàn)制備這種單克隆抗體的技術(shù)的描述；特別是在Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497中，討論了一個(gè)產(chǎn)生單克隆抗體的方法。簡(jiǎn)單來說，這個(gè)方法涉及用免疫原注射動(dòng)物。然后處死所述動(dòng)物，并從其脾臟中取出細(xì)胞，將所述細(xì)胞然后同骨髓瘤細(xì)胞融合。結(jié)果得到能夠在體外繁殖的雜種細(xì)胞或“雜交瘤”。然后篩選雜交瘤種群，以分離單個(gè)克隆，每個(gè)所述單個(gè)克隆分泌針對(duì)所述免疫原的單個(gè)抗體物質(zhì)。以這種方式，獲得的單個(gè)抗體物質(zhì)是來自所述免疫動(dòng)物的無限增殖化和克隆單種B細(xì)胞的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物響應(yīng)在免疫原性物質(zhì)上的特異識(shí)別位點(diǎn)而產(chǎn)生。
其它合適的技術(shù)涉及選擇在噬菌體或相似的載體中的抗體文庫。參見例如Huse等(1989)“在λ噬菌體中的免疫球蛋白所有組成成分的大組合文庫的產(chǎn)生”Science 2461275-1281；和Ward等(1989)Nature341544-546。也可以使用修飾或未修飾的本發(fā)明所述多肽和抗體，包括嵌合抗體或人源化抗體。常常通過或者共價(jià)或者非共價(jià)的連接提供檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)，標(biāo)記所述多肽或抗體。已知各種各樣的標(biāo)記和綴合技術(shù)，并在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中都大量報(bào)道了所述技術(shù)。合適的標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制子、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等等。說明這些標(biāo)記應(yīng)用的專利包括第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241號(hào)美國(guó)專利。而且也可以生產(chǎn)重組免疫球蛋白。參見Cabilly，第4,816,567號(hào)美國(guó)專利；和Queen等(1989)Proc. Nat’l Acad.Sci.USA 8610029-10033。
本發(fā)明所述抗體可用于分離DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白的親合層析?？梢灾苽渲?，其中所述抗體連接到固相支持體，例如，諸如瓊脂糖、SEPHADEX等等的微粒，其中可以使細(xì)胞裂解液或上清液通過所述柱，洗滌所述柱，接著增加溫和變性劑濃度，由此釋放純化的DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白。同樣，結(jié)合所述趨化因子的抗體可能能夠中和受體的結(jié)合，并可以用作受體拮抗劑。它們也可以用做蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑或ELISA試劑。
也可以使用所述抗體篩選用于特定表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)文庫。通常用一個(gè)部分標(biāo)記在該方法中使用的所述抗體，使可以易于通過抗體結(jié)合檢測(cè)抗原的存在。
針對(duì)DVic-1或DGWCC趨化因子的抗體可以用于鑒別表達(dá)DVic-1或DGWCC趨化因子的細(xì)胞群。通過檢測(cè)表達(dá)例如DGWCC趨化因子的細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)品，可以診斷疾病，例如無免疫應(yīng)答疾病。
針抗每種DVic-1或DGWCC趨化因子產(chǎn)生的抗體也可以用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。這些抗體將可用于檢測(cè)或診斷與所述抗體表達(dá)相關(guān)的不同的免疫疾病。
B.免疫測(cè)定可以通過各種免疫測(cè)定方法檢測(cè)特定蛋白。一般關(guān)于免疫學(xué)和免疫測(cè)定方法的綜述，參見Stites和Terr(編輯)(1991)基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(第7版)。此外，本發(fā)明所述免疫測(cè)定可以以許多形式進(jìn)行，所述免疫測(cè)定在Maggio(編輯)(1980)酶免疫測(cè)定CRC出版社，Boca Raton，佛羅里達(dá)州；Tijan(1985)“酶免疫測(cè)定的實(shí)踐和理論”，生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，Elsevier Scienee Publishers B.V.，阿姆斯特丹；和Harlow和Lane(1988)抗體，實(shí)驗(yàn)室指南中廣泛的綜述，上述每個(gè)文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。也參見Chan(編輯)(1987)免疫測(cè)定實(shí)踐指南Academic Press，奧蘭多，佛羅里達(dá)州；Price和Newman(編輯)(1991)免疫測(cè)定的原理和實(shí)踐Stockton出版社，紐約；和Ngo(編輯)(1988)非同位素免疫測(cè)定Plenum出版社，紐約。
可以通過本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的各種方法，進(jìn)行用于檢測(cè)例如DVic-1趨化因子蛋白的免疫測(cè)定。簡(jiǎn)單的說，檢測(cè)所述蛋白的免疫測(cè)定或者可以是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，或者可以是非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定中，待分析樣品和標(biāo)記的分析物競(jìng)爭(zhēng)捕捉劑上的特異結(jié)合位點(diǎn)，所述捕捉試劑與固體表面結(jié)合。最好是所述捕捉劑是同如上所述產(chǎn)生的DVic-1趨化因子蛋白特異反應(yīng)的抗體。與捕捉劑結(jié)合的標(biāo)記分析物的濃度與所述樣品中存在的游離分析物的量成反比。
在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫測(cè)定中，存在于所述樣品中的DVic-1趨化因子蛋白與標(biāo)記蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性結(jié)合劑，例如與所述DVic-1趨化因子蛋白特異反應(yīng)的抗體。所述結(jié)合劑可以與固體表面結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)結(jié)合的標(biāo)記蛋白與非結(jié)合的標(biāo)記蛋白的分離。另一方面，可以在液相中進(jìn)行所述競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，并可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)分離所述結(jié)合的標(biāo)記蛋白與非結(jié)合的標(biāo)記蛋白。在分離后，檢測(cè)結(jié)合標(biāo)記蛋白的量。存在于所述樣品中的蛋白的量與標(biāo)記蛋白結(jié)合的量成反比。
或者，可以進(jìn)行均相免疫測(cè)定，在所述均相免疫測(cè)定中不需要分離步驟。在這些免疫測(cè)定中，通過所述蛋白與其特異性結(jié)合劑的結(jié)合改變所述蛋白上的標(biāo)記。在所述標(biāo)記蛋白中的這種改變?cè)斐捎蓸?biāo)記發(fā)射的信號(hào)減少或增加，以使在所述免疫測(cè)定結(jié)束時(shí)標(biāo)記的檢測(cè)便于所述蛋白的檢測(cè)與定量。
也可以通過各種非競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定方法檢測(cè)DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白。例如可以使用雙位點(diǎn)固相夾心免疫測(cè)定。在這種類型的測(cè)定中，用于所述蛋白的結(jié)合劑，例如抗體，附著于固體支持體上。標(biāo)記第二個(gè)蛋白結(jié)合劑，所述結(jié)合劑也可以是抗體，并在不同的位點(diǎn)結(jié)合所述蛋白，將該結(jié)合劑標(biāo)記。在所述蛋白上的兩個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)結(jié)合后，除去未結(jié)合的標(biāo)記結(jié)合劑，并檢測(cè)結(jié)合于所述固相的標(biāo)記結(jié)合劑的量。標(biāo)記結(jié)合劑的結(jié)合量與所述樣品中的蛋白量成正比。
可以使用蛋白質(zhì)印跡分析，檢測(cè)樣品中例如DGWCC趨化因子蛋白的存在。例如，對(duì)懷疑含有所述蛋白的組織樣品進(jìn)行電泳。在電泳分離所述蛋白后，將所述蛋白轉(zhuǎn)移至合適的固相支持體上，例如硝化纖維濾膜，用和所述蛋白反應(yīng)的抗體溫育所述固相支持體?？梢詷?biāo)記這個(gè)抗體，或者可以通過隨后用結(jié)合所述初級(jí)抗體的第二種標(biāo)記抗體溫育檢測(cè)這個(gè)抗體。
上述的免疫測(cè)定程式使用標(biāo)記的測(cè)定組分。所述標(biāo)記可以按照本領(lǐng)域熟知的方法，直接或間接地同所需檢測(cè)組分偶聯(lián)。可以使用各種各樣的標(biāo)記和方法。傳統(tǒng)上使用摻入3H、125I、35S、14C或32P的放射性標(biāo)記。非放射性標(biāo)記包括結(jié)合標(biāo)記抗體的配體、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光介質(zhì)、酶和可以用作用于標(biāo)記配體的特異結(jié)合配對(duì)成員的抗體。根據(jù)所需的敏感性、易于與所述化合物綴合、穩(wěn)定性需要和可使用的儀器選擇標(biāo)記。關(guān)于可以使用的各種標(biāo)記或信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，參見通過引用結(jié)合到本文中的第4,391,904號(hào)美國(guó)專利。
也可以通過各種免疫測(cè)定方法檢測(cè)與特定蛋白反應(yīng)的抗體。關(guān)于適用于通過免疫測(cè)定技術(shù)檢測(cè)抗體的免疫學(xué)和免疫測(cè)定方法的綜述，參見上述的Stites和Terr(編輯)基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(第7版)；上述的Maggio(編輯)酶免疫測(cè)定；和上述的Harlow和Lane抗體，實(shí)驗(yàn)室指南。
簡(jiǎn)單地說，檢測(cè)與例如DVic-1趨化因子蛋白反應(yīng)的抗血清的免疫測(cè)定可以是或者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，或者非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定中，所述樣品分析物與標(biāo)記分析物競(jìng)爭(zhēng)在捕捉劑上的特定結(jié)合位點(diǎn)，所述捕捉劑結(jié)合于固體表面。最好是所述捕捉劑是如上所述生產(chǎn)的純化的重組DVic-1趨化因子蛋白。也可以使用其它的DVic-1趨化因子蛋白源，包括分離的或部分純化的天然產(chǎn)生的蛋白。非競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定包括夾心測(cè)定，在所述夾心測(cè)定中，所述樣品分析物結(jié)合于兩個(gè)分析物特異性結(jié)合試劑之間。所述結(jié)合劑之一用做捕捉劑，并同固體表面結(jié)合。標(biāo)記第二個(gè)結(jié)合劑，并通過目視或儀表方法用其測(cè)量或檢測(cè)得到的復(fù)合物?？梢允褂枚喾N組合的捕捉劑和標(biāo)記結(jié)合劑。也可以使用與上述那些相似的用于檢測(cè)DGWCC趨化因子蛋白的各種不同的免疫測(cè)定程式、分離技術(shù)和標(biāo)記。VI.純化的DVic-1或DGWCC趨化因子在SEQ ID NO1和2中提供了人DVic-1核苷酸序列和氨基酸序列。在SEQ ID NO5和6中提供了人DGWCC核苷酸序列和氨基酸序列；在SEQ ID NO7和8中提供了小鼠DGWCC核苷酸序列和氨基酸序列。
純化的蛋白或確定的多肽可用來通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生抗體?？梢詫⒑铣呻幕蚣兓鞍滋岢式o免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。參見例如Coligan(1991)免疫學(xué)現(xiàn)時(shí)方案Wilev/Greene，紐約；和Harlow和Lane(1989)抗體實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港出版社，紐約，上述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。另一方面，DVic-1或DGWCC趨化因子受體可以用作特異性結(jié)合試劑，并可以利用其結(jié)合特異性進(jìn)行例如純化DGWCC趨化因子配體的。
可以使用特異性結(jié)合組合物，篩選由表達(dá)DGWCC趨化因子的細(xì)胞系產(chǎn)生的表達(dá)文庫?？梢岳迷S多篩選方法，例如表面表達(dá)的配體的標(biāo)準(zhǔn)染色或通過淘選。也可以通過不同的染色或免疫熒光方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的篩選。所述結(jié)合組合物可以用于親合純化或分選出表達(dá)所述配體的細(xì)胞。
所述肽區(qū)段，除了與同源基因?qū)Ρ?，也可以用于產(chǎn)生合適的寡核苷酸，以篩選文庫。所述遺傳密碼可以用于選擇合適的可用作篩選探針的寡核苷酸。結(jié)合多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，合成寡核苷酸將可用于從包括天然等基因多態(tài)變異體的文庫中選擇所需克隆。
所述多肽序列使得可以制備多肽，以產(chǎn)生識(shí)別這種區(qū)段的抗體，并使得可以制備編碼這種序列的寡核苷酸。所述序列也可以供合成制備之用，例如參見Dawson等(1994)Science 266776-779。因?yàn)镈Vic-1和DGWCC趨化因子可以是分泌性蛋白，所以所述基因一般具有N-末端信號(hào)序列，加工和分泌時(shí)除去所述信號(hào)序列。然而，在不同的細(xì)胞類型中可以改變確切的加工點(diǎn)，并且也經(jīng)常檢測(cè)到不同長(zhǎng)度的形式。例如使用Nielsen等(1997)Protein Eng. 101-8中所述方法，可以進(jìn)行所述信號(hào)切割點(diǎn)的預(yù)測(cè)。與最密切相關(guān)的報(bào)道序列相比，對(duì)所述結(jié)構(gòu)特征的分析已顯示同其它細(xì)胞因子，特別是同已知為CC和CXC趨化因子的該類蛋白的相似性。VII.物理變異體本發(fā)明也包括其的氨基酸序列和DVic-1或DGWCC趨化因子的氨基酸序列大致相似的蛋白或多肽。天然變異體包括個(gè)體、多態(tài)、等位、菌株或物種變異體。
通過最優(yōu)化殘基匹配，如果需要，通過根據(jù)需要導(dǎo)入間隙，檢測(cè)氨基酸序列相似性或序列同一性。在將保守置換考慮為匹配時(shí)，這種相似性或同一性會(huì)改變。保守置換一般包括在下列組別中的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸。同源氨基酸序列包括在所述蛋白序列中的天然多態(tài)、等位和種間變異。典型的同源蛋白或肽將具有同所述DGWCC趨化因子的氨基酸序列從50-100％的相似性(如果可以導(dǎo)入間隙)，至75-100％的相似性(如果包括保守置換)。相似性檢測(cè)為至少大約50％，一般至少60％，更一般至少65％，通常至少70％，更通常至少75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少80％，而在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，為至少85％或更高。也參見Needleham等(1970)J.Mol.Biol. 48443-453；Sankoff等(1983)TimeWarps，String Edits，and MacromeleculesThe Theorv amd Practice ofSequence Comparison第一章，Addison-Wesley，Reading，馬薩諸塞州；和來自IntelliGenetics軟件包裝，Mountain View，加利福尼亞州；和威斯康星大學(xué)遺傳計(jì)算機(jī)組，麥迪遜，威斯康星州。
編碼哺乳動(dòng)物DVic-1趨化因子蛋白的核酸一般在嚴(yán)格條件下同SEQ ID NO1的核酸序列雜交。例如，編碼DVic-1趨化因子蛋白的核酸一般在嚴(yán)格雜交條件下，同SEQ ID NO1的核酸雜交。一般來說，是在確定的離子強(qiáng)度和pH下，選擇比用于探針序列的熱變性點(diǎn)(Tm)低大約10℃的嚴(yán)格條件。Tm是(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)50％的所述靶序列同完全匹配探針雜交的溫度。嚴(yán)格條件一般是那些條件，在所述條件下，鹽濃度在pH7時(shí)大約為0.2M，而溫度為至少大約50℃。其它因素可以顯著影響雜交嚴(yán)格性，其中包括堿基組成和互補(bǔ)鏈的大小、存在諸如甲酰胺的有機(jī)溶劑和堿基錯(cuò)配的程度。優(yōu)選的實(shí)施方案包括在50％甲酰胺和200mM NaCl中于42℃結(jié)合所公開序列的核酸。
可以通過核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入和一段核苷酸序列的短倒位，輕易修飾分離的DGWCC趨化因子DNA。這些修飾產(chǎn)生編碼DVic-1或DGWCC趨化因子抗原、其衍生物或具有高度相似生理、免疫原性或抗原活性的新DNA序列。
修飾序列可以用于產(chǎn)生突變抗原或增強(qiáng)表達(dá)。增強(qiáng)表達(dá)可以包括基因擴(kuò)增、增加轉(zhuǎn)錄、增加翻譯和其它機(jī)制。這種突變DGWCC趨化因子衍生物包括所述蛋白或其片段的預(yù)定或位點(diǎn)特異性的突變?！巴蛔僁GWCC趨化因子”包括在其它方面屬于上述人DGWCC趨化因子的同源物定義的多肽，但無論是由于缺失、置換還是插入，該多肽具有不同于天然發(fā)現(xiàn)的DGWCC趨化因子的氨基酸序列。具體而言，“位點(diǎn)特異性突變DGWCC趨化因子”一般包括同具有SEQ ID NO6或8的序列的蛋白具有明顯相似的蛋白，例如天然實(shí)施方案，和由于享有各種各樣的生物活性(例如抗原性或免疫原性)而同那些序列具有相似性的蛋白，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，“位點(diǎn)特異性突變DGWCC趨化因子”包括大部分或全部公開的序列。這也適用于來自不同個(gè)體的多態(tài)變異體。相似的概念適合于不同的DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白，特別是那些在各種溫血?jiǎng)游?例如哺乳動(dòng)物或鳥)中發(fā)現(xiàn)的DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白。如前所述，需強(qiáng)調(diào)指出，描述一般指包括其它DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白，不限于具體討論的小鼠或人的實(shí)施方案。
盡管預(yù)先確定了位點(diǎn)特異性突變的位點(diǎn)，但突變體不需要是位點(diǎn)特異性的。例如，可以通過制造氨基酸插入或缺失，進(jìn)行DGWCC趨化因子誘變?？梢援a(chǎn)生置換、缺失、插入或任何組合，以得到最終構(gòu)成物。插入包括氨基或羧基末端融合物，例如表位標(biāo)記。對(duì)靶密碼子進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后可以根據(jù)所需活性篩選表達(dá)突變。在具有已知序列的DNA中在預(yù)定位點(diǎn)上進(jìn)行置換突變的方法在本領(lǐng)域是廣為人知的，例如通過M13引物誘變或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。也參見Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987和增補(bǔ)本)。在所述DNA中的突變一般不應(yīng)將編碼序列置于讀框之外，最好將創(chuàng)造可以雜交的互補(bǔ)區(qū)，以產(chǎn)生諸如環(huán)狀結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明也提供重組蛋白，例如使用來自這些蛋白的區(qū)段的異源融合蛋白。異源融合蛋白是蛋白或區(qū)段的融合體，所述融合體一般不以相同的方式天然融合。因此，免疫球蛋白與DGWCC趨化因子多肽的融合產(chǎn)物是具有下述序列的連續(xù)蛋白分子，所述序列以典型肽鏈接融合，一般作為單一翻譯產(chǎn)物產(chǎn)生，并顯示得自每個(gè)源肽的特性。相似的概念適用于異源核酸序列。
另外，可以組合來自其它蛋白的相似功能域產(chǎn)生新構(gòu)成物。例如，結(jié)合蛋白區(qū)段或其它區(qū)段可以在不同的新融合多肽或片段之間“交換”。參見例如Cunningham等(1989)Science 2431330-1336；和O′Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。因此，顯示特異性新組合的新嵌合多肽將由蛋白結(jié)合特異性和其它功能域的功能鏈接產(chǎn)生。VIII.結(jié)合劑趨化因子蛋白復(fù)合物一般在免疫測(cè)定中測(cè)定DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白，所述蛋白特異性地或選擇性地結(jié)合下述抗體，或特異性地與該抗體免疫反應(yīng)的，所述抗體是針對(duì)免疫原、諸如SEQ ID NO2或8的氨基酸序列組成的免疫原而產(chǎn)生的。所述免疫測(cè)定使用針對(duì)SEQ ID NO2、6或8的蛋白產(chǎn)生的多克隆抗血清。選擇對(duì)于其它趨化因子具有較低交叉反應(yīng)性的這種抗血清，并在用于所述免疫測(cè)定之前通過免疫吸附除去任何這種交叉反應(yīng)性。
為了生產(chǎn)用于免疫測(cè)定的抗血清，如本文所述分離SEQ ID NO2或6或8的蛋白。例如，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中產(chǎn)生重組蛋白。使用諸如弗氏佐劑的標(biāo)準(zhǔn)佐劑和標(biāo)準(zhǔn)小鼠免疫方案(參見上述Harlow和Lane)，用SEQ ID NO2或6或8的蛋白免疫諸如BALB/c的小鼠近交品系。另一方面，可以使用優(yōu)選是近于全長(zhǎng)的合成肽作為免疫原，所述合成肽由本文公開的序列衍生，并綴合于載體蛋白。收集多克隆血清，并在免疫測(cè)定中測(cè)其對(duì)免疫原蛋白的效價(jià)，所述免疫測(cè)定例如在固相支持體上具有固定化免疫原的固相免疫測(cè)定。選擇104或更大效價(jià)的多克隆抗血清，并使用諸如在上述Harlow和Lane中第570-573頁所述的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫測(cè)定，測(cè)試多克隆抗血清對(duì)C、CC、CX3C和CXC趨化因子的交叉反應(yīng)性。在這個(gè)測(cè)定中最好和人DGWCC趨化因子一起使用兩種趨化因子。
競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形式的免疫測(cè)定可以用于所述交叉反應(yīng)性測(cè)定。例如，可以將SEQ ID NO2或SEQ ID NO6和/或8的蛋白固化到固相支持體上。加入到所述測(cè)定中的蛋白與所述抗血清競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述固定化抗原。將上述蛋白同所述抗血清競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固定化蛋白的能力與SEQ IDNO2的蛋白或SEQ ID NO6和/或8的蛋白相比較。使用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算法計(jì)算上述蛋白的交叉反應(yīng)性百分比。選擇并合并那些和上文列出的每種蛋白的交叉反應(yīng)性低于10％的抗血清。然后用上文列出的蛋白通過免疫吸附，從合并的抗血清中除去交叉反應(yīng)抗體。
然后如上所述，在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫測(cè)定中使用免疫吸附和合并的抗血清，以將第二個(gè)蛋白和所述免疫原蛋白(例如SEQ ID NO6或8的DGWCC趨化因子基元)相比。為了進(jìn)行該對(duì)比，在較大濃度范圍內(nèi)測(cè)定所述兩種蛋白的每一種，并測(cè)定每種蛋白抑制所述抗血清與固定化蛋白50％的結(jié)合所需的量。如果需要的所述第二種蛋白的量少于所述蛋白(例如SEQ ID NO6或8的蛋白)量的兩倍，則一般認(rèn)為所述第二種蛋白特異性地結(jié)合針對(duì)所述免疫原產(chǎn)生的抗體。
不用說，DGWCC趨化因子蛋白是一組同源蛋白雜交種的物質(zhì)形式，所述雜交種包括密切相關(guān)的基因。對(duì)特定的基因產(chǎn)物，諸如所述DGWCC趨化因子，所述術(shù)語不僅指本文公開的氨基酸序列，而且指其它為多態(tài)、等位或非等位變異體的蛋白。也不用說，術(shù)語“DGWCC”包括下述非天然突變，所述突變通過使用諸如單位點(diǎn)突變的常規(guī)重組技術(shù)進(jìn)行有意突變，或通過切下編碼DGWCC趨化因子蛋白的DNA的短片段，或通過置換新氨基酸或加入新氨基酸而引入的。這種小改變應(yīng)當(dāng)大致保持了原始分子的免疫同一性和/或其生物活性。因此，這些改變包括同定為天然產(chǎn)生的DGWCC趨化因子蛋白(例如在SEQ ID NO6或8中顯示的DGWCC趨化因子蛋白)特異性免疫反應(yīng)的蛋白。可以通過在合適的細(xì)胞系中表達(dá)所述蛋白，并測(cè)定合適的生物活性，例如趨化作用，測(cè)定所述改變蛋白的生物特性。認(rèn)為較小的特定的蛋白修飾應(yīng)包括具有相似化學(xué)特性的氨基酸的保守置換，所述化學(xué)特性如上對(duì)于作為整體的DGWCC趨化因子所述。通過將一種蛋白與SEQ ID NO6或8的蛋白進(jìn)行最佳序列對(duì)比，和通過使用本文所述的測(cè)定免疫同一性的常規(guī)免疫測(cè)定，或通過使用淋巴細(xì)胞趨化性測(cè)定，可以測(cè)定本發(fā)明所述蛋白組合物。IX.功能變異體對(duì)DVic-1或DGWCC趨化因子的生理反應(yīng)的阻斷，可能是因?yàn)橐种扑龅鞍淄涫荏w的結(jié)合，例如通過競(jìng)爭(zhēng)抑制。因此，本發(fā)明的體外測(cè)定通常使用分離蛋白、來自表達(dá)重組膜結(jié)合DVic-1或DGWCC趨化因子的細(xì)胞的膜、包含這些蛋白的受體結(jié)合區(qū)段的可溶性片段、或附著于固相基質(zhì)上的片段。這些測(cè)定也便于診斷測(cè)定或者結(jié)合區(qū)段突變和修飾的影響，或者例如蛋白類似物的蛋白突變和修飾的影響。本發(fā)明也考慮了競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選檢測(cè)的應(yīng)用，例如其中針對(duì)抗原或受體片段的中和抗體同測(cè)試化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述蛋白。以這種方式，可以使用所述抗體檢測(cè)多肽的存在，所述多肽享有一個(gè)或多個(gè)所述蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)，也可以使用所述多肽占據(jù)在其它情況下同受體相互作用的所述蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)。
例如DGWCC趨化因子抗原的“衍生物”包括氨基酸序列突變體、糖基化變異體和同其它化學(xué)部分共價(jià)或聚集的綴合物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，通過同在DGWCC趨化因子氨基酸側(cè)鏈或在N-末端或C-末端發(fā)現(xiàn)基團(tuán)的進(jìn)行官能團(tuán)連接，制備共價(jià)衍生物。這些衍生物可以包括但不限于，羧基末端的脂族酯或酰胺、或包含羧基側(cè)鏈的殘基的脂族酯或酰胺、含羥基殘基的O-酰基衍生物和氨基末端氨基酸或含氨基殘基(例如賴氨酸或精氨酸)的N-酰基衍生物。?；x自烷基部分，包括例如C3至C18正烷基，由此形成烷?；减；镔|(zhì)。當(dāng)免疫原性部分是半抗原時(shí)，同載體蛋白共價(jià)結(jié)合可能很重要。
具體而言，包括糖基化變化，例如在多肽合成和加工中，或在進(jìn)一步的加工步驟過程中，通過修飾多肽的糖基化型式產(chǎn)生的糖基化變化。特別優(yōu)選的用于完成該糖基化變化的方法是通過將所述多肽暴露于糖基化酶中，所述酶由一般提供這種加工的細(xì)胞衍生，例如哺乳動(dòng)物糖基化酶。也考慮了去糖基化酶。也包括具有其它小修飾的相同一級(jí)氨基酸序列的形式，包括磷酸化氨基酸殘基(例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸)或其它部分，包括核酸基基團(tuán)或交聯(lián)試劑。
一組主要的衍生物是DGWCC趨化因子或其片段同其它蛋白或多肽的共價(jià)綴合物?？梢栽谥亟M培養(yǎng)物中合成諸如N-末端或C-末端融合體的這些衍生物，或者利用在本領(lǐng)域已知的可用于通過反應(yīng)性側(cè)基交聯(lián)蛋白中的試劑，合成這些衍生物。優(yōu)選的具有交聯(lián)劑的蛋白衍生物位點(diǎn)是在游離氨基基團(tuán)、糖部分和半胱氨酸殘基上。
也提供在DGWCC趨化因子和其它同源或異源蛋白之間的融合多肽。許多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子是同二聚體實(shí)體，重復(fù)構(gòu)成物可能具有各種優(yōu)勢(shì)，包括降低對(duì)蛋白水解酶降解的敏感性。而且，許多受體需要配體二聚化以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，可能需要不同的二聚體蛋白或域重復(fù)片段。異源多肽可以是不同的表面標(biāo)記之間的融合體，產(chǎn)生例如顯示受體結(jié)合特異性的雜種蛋白。同樣，可以構(gòu)建異源融合體，所述融合體將顯示所述衍生物蛋白的特性或活性的組合。典型的例子是受體多肽融合體，例如具有蛋白區(qū)段或域(例如受體結(jié)合區(qū)段)的熒光素酶，以便可以容易測(cè)定所述融合蛋白的存在或位置。參見例如Dull等，第4,859,609號(hào)美國(guó)專利。其它基因融合配偶體包括細(xì)菌b-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-內(nèi)酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脫氫酶和酵母α交配因子。參見例如Godowski等(1988)Science 241812-816。
這種多肽也可以具有這樣的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基通過磷酸化、磺化、生物素?；蚣尤牖虺テ渌糠?、特別是那些分子性狀同磷酸酯基團(tuán)相似的部分而化學(xué)修飾。在某些實(shí)施方案中，所述修飾可用于標(biāo)記試劑，或用作純化靶，例如親合配體。
本發(fā)明也考慮了DGWCC趨化因子衍生物的用途，所述衍生物沒有氨基酸序列或糖基化中的變異。這種衍生物可以包括同化學(xué)部分共價(jià)結(jié)合或聚集結(jié)合。這些衍生物一般屬于三種類型(1)鹽，(2)側(cè)鏈和末端殘基共價(jià)修飾和(3)例如與細(xì)胞膜的吸附復(fù)合物。這種共價(jià)或聚集衍生物可用作免疫原，在免疫測(cè)定或在諸如用于配體或其它結(jié)合配體的親合純化的純化方法中用作試劑。例如，可以通過同諸如溴化氰活化的SEPHAROSE的固相支持體共價(jià)結(jié)合，利用本領(lǐng)域熟知的方法，固定化DGWCC趨化因子抗原，或者可以在用或不用戊二醛交聯(lián)時(shí)，在聚烯烴表面吸附近DGWCC趨化因子抗原，用于測(cè)定或純化抗-DGWCC趨化因子抗體或其受體。也可以用檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記DGWCC趨化因子，例如可以將DGWCC趨化因子通過氯胺T法放射性碘化，共價(jià)結(jié)合于稀土螯合物，或者綴合與另一用于診斷檢測(cè)的熒光部分。固定化抗體或受體可以影響DGWCC趨化因子的純化。
分離的DGWCC趨化因子基因?qū)⒃试S轉(zhuǎn)化缺乏對(duì)應(yīng)DGWCC趨化因子表達(dá)的細(xì)胞，例如缺乏對(duì)應(yīng)蛋白并顯示陰性本底活性的或者物種類型或者細(xì)胞。轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)使得可以用確定的變異體或單個(gè)物種變異體分離抗原性純的細(xì)胞系。這個(gè)方案便于敏感性更高地檢測(cè)和鑒別DGWCC趨化因子受體蛋白的生理作用?？梢苑蛛x和使用亞細(xì)胞片段，例如胞質(zhì)體或膜片段。使用DGWCC作為實(shí)施例的描述一般也同時(shí)適用于DVic-1。X.用途本發(fā)明提供發(fā)現(xiàn)用于診斷應(yīng)用的試劑，所述診斷應(yīng)用如在本文別處所述，例如在在對(duì)發(fā)育異常的一般描述中，或下文對(duì)診斷試劑盒的描述。
DGWCC趨化因子核苷酸，例如DGWCC趨化因子DNA或RNA，可以作為法醫(yī)檢測(cè)中的組分使用。例如，可以使用例如32P或生物素標(biāo)記提供的核苷酸序列，并將其用作探針探測(cè)標(biāo)準(zhǔn)限制片段多態(tài)性印跡，提供可檢測(cè)特征來幫助區(qū)分個(gè)體或例如物種源?？梢栽谥T如基因指紋的熟知的法醫(yī)技術(shù)中使用這種探針。另外，可以在原位檢測(cè)中使用由DGWCC趨化因子序列產(chǎn)生的核苷酸探針，以測(cè)定染色體異常。例如可以通過廣為人知的原位技術(shù)，使用和其它已知染色體標(biāo)記結(jié)合的DGWCC趨化因子探針，檢測(cè)編碼DGWCC趨化因子基因的人染色體的重排。
可以使用針對(duì)DGWCC趨化因子蛋白或核酸的抗體和其它結(jié)合劑，以純化對(duì)應(yīng)的DGWCC趨化因子分子。如下文實(shí)施例所述，抗體純化DGWCC趨化因子組分既是可能的，也是可行的。也可以在診斷方式中使用抗體和其它結(jié)合劑，以使用本文所述的熟知的技術(shù)，測(cè)定DGWCC趨化因子組分是否存在于組織樣品或細(xì)胞群中。結(jié)合劑結(jié)合DGWCC趨化因子的能力提供了一個(gè)診斷與DGWCC趨化因子不規(guī)則有關(guān)的疾病的方法。抗體和其它DGWCC趨化因子結(jié)合劑也可以用作組織標(biāo)記。如下文實(shí)施例所述，DGWCC趨化因子表達(dá)限于特定的組織類型。通過將諸如抗體和核酸的探針導(dǎo)向DGWCC趨化因子，使用所述探針原位或體外區(qū)分組織和細(xì)胞類型是可能的。
本發(fā)明也提供具有顯著治療價(jià)值的試劑。除了鑒別為對(duì)DGWCC趨化因子具有結(jié)合親合性的化合物，所述DGWCC趨化因子(天然產(chǎn)生或重組)、其片段和其抗體可用于治療與異常生理或發(fā)育有關(guān)的疾病，包括異常增殖，例如癌癥或退行性疾病?？梢允褂帽疚奶峁┑慕M合物，通過合適的治療性治療，調(diào)制異常增殖、再生、退化和萎縮。例如，與DGWCC趨化因子異常表達(dá)或異常信號(hào)有關(guān)的疾病或病征是用于所述蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑的靶。所述蛋白可能在神經(jīng)元細(xì)胞或例如淋巴細(xì)胞的造血細(xì)胞的調(diào)節(jié)或發(fā)育上起作用，影響免疫應(yīng)答。
已知在RNA印跡分析顯示具有DVic-1或DGWCC趨化因子mRNA的細(xì)胞類型中的其它異常發(fā)育病征。參見Berkow(編輯)默克診斷和治療指南Merck & Co，Rahway，新澤西州；和Thorn等Harrison’s Principlesof Internal Medicine McGraw-Hill，紐約。例如所述神經(jīng)元或免疫系統(tǒng)的發(fā)育或功能異常，引起明顯的醫(yī)學(xué)異常和病征，所述異常和病征可能對(duì)使用本文提供的混合物預(yù)防或治療敏感。
某些趨化因子也和病毒復(fù)制機(jī)制有關(guān)。參見例如Cohen(1996)Science 272809-810；Feng等(1996)Science 272872-877；和Cocchi等(1995)Science 2701811-1816。所述DVic-1或DGWCC趨化因子可以在相似的范圍內(nèi)使用。
可以純化重組的DVic-1或DGWCC趨化因子或趨化因子抗體，然后將其給予病人?？梢岳缭诔Ｒ?guī)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑(例如免疫佐劑)與生理上無害的穩(wěn)定劑和賦形劑中，將這些試劑與額外活性成分或惰性成分混合，用于治療用途?？梢詿o菌過濾這些組合物，并通過在劑量瓶中凍干將其以劑量形式放置，或以穩(wěn)定的水性制劑貯藏。本發(fā)明也考慮了抗體或其片段的作用，包括不是補(bǔ)體結(jié)合的形式。
使用抗體或其受體或其片段的藥物篩選可以鑒別具有對(duì)DVic-1或DGWCC趨化因子的結(jié)合親合性的化合物，包括分離有關(guān)組分。然后可以利用后來的生物測(cè)定，以檢測(cè)所述化合物是否具有內(nèi)在的刺激活性，以及所述化合物是否因此是阻滯劑或拮抗劑，因?yàn)樗钄嗨龅鞍谆钚?。同樣，具有?nèi)在刺激活性的化合物可以激活所述受體，并因此是一個(gè)激動(dòng)劑，因?yàn)樗碳ち死鏒GWCC趨化因子的活性。本發(fā)明還考慮了針對(duì)DGWCC趨化因子的抗體作為拮抗劑的治療用途。這個(gè)方案對(duì)其它DGWCC趨化因子物種變異體應(yīng)當(dāng)特別有用。
用于有效治療所必需的試劑量取決于許多不同因素，包括給藥方法、靶位點(diǎn)、病人的生理狀態(tài)和給服的其它藥物。因此應(yīng)當(dāng)確定治療劑量，以最優(yōu)化安全性和有效性。一般在體外使用的劑量可以為這些試劑的原位給藥用量提供有用的指南。用于治療特定病狀的有效劑量的動(dòng)物測(cè)試將對(duì)人的劑量提供進(jìn)一步的推斷指南。例如在Gilman等(編輯)(1990)Goodman和Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第8版)Pergamon出版社；和(1990)Remington’sPharmaceutical Sciences(第17版)Mack Publishing Co.，Easton，CA中描述了各種考慮。在其中和下文討論了給藥方法，例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或肌內(nèi)給藥、經(jīng)皮膚擴(kuò)散和其它方法。藥學(xué)上可接受的載體包括水、鹽、緩沖液和例如在Merck Index，Merck & Co.，Rahway，NJ中所述的其它化合物。一般預(yù)期具有合適載體的劑量范圍低于1mM濃度，一般低于大約10μM濃度，通常低于大約100nM，優(yōu)選低于大約10pM(皮摩爾濃度)，最優(yōu)選低于大約1fM(費(fèi)摩爾濃度)。為了連續(xù)給藥，經(jīng)常使用緩釋配方或緩釋設(shè)備。
可以直接向待治療的宿主給予DVic-1或DGWCC趨化因子、其片段和其抗體或其片段、拮抗劑和激動(dòng)劑，或者可以根據(jù)所述化合物的大小，可能最好在給藥前將所述化合物同載體蛋白綴合，所述載體蛋白諸如卵清蛋白或血清白蛋白?？梢砸匀魏纬Ｒ?guī)給藥制劑給予治療制劑。盡管可能獨(dú)自給予活性成分，但最好是作為藥用制劑將其提呈。制劑一般包括至少一種如上文定義的活性成分，連同一種或多種可接受的載體。每種載體在與其它成分相容、且傷害病人的意義上，應(yīng)當(dāng)既是藥學(xué)上可接受的，也是生理上可接受的。制劑包括那些適于口服、直腸、鼻或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈在內(nèi)和皮內(nèi))給藥的制劑。所述制劑通?？梢砸詥挝粍┝啃问酱嬖冢⒖梢酝ㄟ^任何藥劑學(xué)領(lǐng)域熟知的方法制備。參見例如Gilman等(編輯)(1990)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Bases of Therapeutics療(第8版)Pergamon出版社；和(1990)Remington’s Pharmaceutical Sciences(第17版)MackPublishing Co.，Easton，賓西法尼亞州；Avis等(編輯)(1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications Dekker，紐約州；Lieberman等(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsParentalMedications Dekker，紐約州；和Lieberman等(編輯)(1990)PharmaceuticalDosage FormsDisperse Systems Dekker，紐約州。本發(fā)明所述療法可以和其它治療因子組合，或與其它治療因子結(jié)合使用。
本發(fā)明所述DVic-1或DGWCC趨化因子，不論是天然產(chǎn)生形式，還是重組形式，在能夠篩選對(duì)所述蛋白具有結(jié)合活性的化合物的試劑盒和測(cè)定方法中特別有用。近幾年發(fā)展了幾個(gè)自動(dòng)檢測(cè)的方法，以使在短期內(nèi)篩選幾萬個(gè)化合物成為可能。參見例如Fodor等(1991)Science251767-773和其它化學(xué)多樣性文庫的描述，所述描述介紹了檢測(cè)大量化合物的結(jié)合親合性的方法?？梢酝ㄟ^使用本發(fā)明提供的大量純化的可溶性DGWCC趨化因子，大大促進(jìn)合適測(cè)定的發(fā)展。
例如，一旦在結(jié)構(gòu)上定義所述蛋白，一般可以發(fā)現(xiàn)拮抗劑。現(xiàn)在，使用純化受體，依靠高度自動(dòng)化測(cè)定方法的發(fā)展，檢測(cè)潛在的蛋白類似物是可能的。具體而言，通過使用本文所述的篩選技術(shù)，將發(fā)現(xiàn)新的激動(dòng)劑和拮抗劑。特別重要的化合物是發(fā)現(xiàn)對(duì)多種DGWCC趨化因子受體具有組合結(jié)合親合性的化合物，例如可以用作對(duì)DGWCC趨化因子物種變異體的拮抗劑。
本發(fā)明特別可用于通過使用重組蛋白，以各種藥物篩選技術(shù)篩選化合物。使用重組蛋白篩選特定配體的優(yōu)勢(shì)包括(a)提高來自特定來源的DGWCC趨化因子的可再生源；(b)在測(cè)定中每個(gè)細(xì)胞潛在的產(chǎn)生更好的信號(hào)與噪音之比的配體數(shù)目大；和(c)物種變異體特異性(理論上給予較大生物學(xué)特異性和疾病特異性)。
一個(gè)藥物篩選方法使用真核或原核宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞用表達(dá)趨化因子受體的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在與任何其它細(xì)胞分離中可以分離表達(dá)受體的細(xì)胞?？梢詫⑦@種或者以活體形式、或者以固定形式的細(xì)胞用于標(biāo)準(zhǔn)配體/受體結(jié)合測(cè)定。也參見Parce等(1989)Science246243-247；和Owicki等(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 874007-4011，其描述了靈敏地檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)的方法。競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定特別有用，其中，用標(biāo)記受體或同所述配體具有已知結(jié)合親合性的抗體(諸如125I-抗體)以及待測(cè)試其同所述結(jié)合組合物的結(jié)合親合性的測(cè)試樣品，接觸并溫育所述細(xì)胞(DGWCC趨化因子源)。然后分離所述結(jié)合和游離的標(biāo)記結(jié)合組合物，以評(píng)價(jià)配體結(jié)合程度。測(cè)試化合物的結(jié)合量同結(jié)合已知源的標(biāo)記受體結(jié)合量成反比?？梢允褂帽姸嗉夹g(shù)中的任何一個(gè)，從游離配體中分離結(jié)合配體，以評(píng)價(jià)配體結(jié)合程度。這個(gè)分離步驟一般可以包括諸如附著于濾膜后洗滌，附著于塑料后洗滌或離心所述細(xì)胞膜。也可以使用活體細(xì)胞，以根據(jù)篩選藥物對(duì)DGWCC趨化因子介導(dǎo)功能的影響例如第二信使水平，即Ca++；細(xì)胞增殖；肌醇磷酸庫變化等等進(jìn)行篩選。一些檢測(cè)方法允許去掉分離步驟，例如近靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)。鈣敏感性染料對(duì)于用熒光計(jì)或熒光細(xì)胞分類器檢測(cè)Ca++水平是有用的。
另一個(gè)方法使用來自轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞的膜作為DGWCC趨化因子源。用指導(dǎo)表達(dá)DGWCC趨化因子(例如工程改造膜結(jié)合形式)的DNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞。實(shí)質(zhì)上，可以由所述細(xì)胞制備所述膜，并在諸如上文所述的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的受體/配體結(jié)合測(cè)定中使用所述膜。
再一個(gè)方案是使用可溶性未純化的、或可溶性純化的DGWCC趨化因子，所述趨化因子來自轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞。這使“分子”結(jié)合測(cè)定具有增加特異性、自動(dòng)化能力和藥物檢測(cè)通過量高的優(yōu)勢(shì)。
另一個(gè)用于藥物篩選的技術(shù)包括提供高通過量地篩選化合物的方法，其中所述化合物對(duì)DGWCC趨化因子抗體具有穩(wěn)定結(jié)合親合性，在1984年9月13日公開的Geysen的第84/03564號(hào)歐洲專利申請(qǐng)中詳細(xì)描述了這個(gè)技術(shù)。首先在固體基質(zhì)(例如在塑料桿(pin))或其它一些合適的表面上合成大量不同的小肽測(cè)試化合物，參見上述Fodor等。然后所有的所述桿同可溶性未純化的或可溶性純化的DGWCC趨化因子抗體反應(yīng)，并洗滌。下一步包括檢測(cè)結(jié)合的DGWCC趨化因子抗體。
也可以根據(jù)對(duì)DGWCC趨化因子和其它效應(yīng)物或類似物的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究，合理地設(shè)計(jì)藥物。參見例如Methods in Enzymology第202和203卷。效應(yīng)物可以是響應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)其它功能的蛋白，或一般和受體相互作用的其它蛋白。一個(gè)測(cè)定哪些位點(diǎn)同特定的其它蛋白相互作用的方法是物理結(jié)構(gòu)測(cè)定，例如X射線晶體學(xué)或雙向NMR技術(shù)。這些將提供關(guān)于哪些氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)域的指南。對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定的詳細(xì)描述，參見例如Blundell和Johnson(1976)蛋白質(zhì)晶體學(xué)Academic Press，NY。
可以將純化的DGWCC趨化因子直接包被到平板上，以用于前述的藥物篩選技術(shù)。然而，可以使用對(duì)這些配體的非中和抗體作為捕捉抗體，以將相應(yīng)的配體固化在所述固相上。用DVic-1趨化因子替換進(jìn)行使用DGWCC的實(shí)施例。XI.試劑盒本發(fā)明也考慮了DVic-1或DGWCC趨化因子蛋白、其片段、肽和其融合產(chǎn)物，在檢測(cè)趨化因子或趨化因子受體存在的各種診斷試劑盒和方法中的應(yīng)用。一般所述試劑盒有一個(gè)區(qū)室，所述區(qū)室包括識(shí)別一種或另一種例如受體片段或抗體的或者確定的DVic-1或DGWCC趨化因子肽、或者基因區(qū)段、或者試劑。
例如，檢測(cè)測(cè)試化合物對(duì)DGWCC趨化因子的結(jié)合親合性的試劑盒，一般包括測(cè)試化合物；標(biāo)記化合物，例如，具有已知對(duì)所述DGWCC趨化因子結(jié)合親合性的受體或抗體；DGWCC趨化因子源(天然產(chǎn)生或重組)；和從游離標(biāo)記化合物中分離結(jié)合標(biāo)記化合物的工具，諸如用于固化所述DGWCC趨化因子的固相。一旦篩選出化合物，則可以在合適的本領(lǐng)域中熟知的生物測(cè)定中，評(píng)價(jià)那些對(duì)所述DGWCC趨化因子具有合適結(jié)合親合性的化合物，以測(cè)定它們是否作為對(duì)所述受體的激動(dòng)劑或拮抗劑起作用?？衫玫闹亟MDGWCC趨化因子多肽也提供用于校準(zhǔn)這種測(cè)定的完全確定的標(biāo)準(zhǔn)。
優(yōu)選的用于檢測(cè)樣品中例如DGWCC趨化因子濃度的試劑盒一般包括標(biāo)記化合物，例如已知對(duì)所述DGWCC趨化因子具有結(jié)合親合性的受體或抗體；DGWCC趨化因子源(天然產(chǎn)生或重組)；和用于從游離標(biāo)記化合物中分離結(jié)合標(biāo)記化合物的工具，例如用于固化所述DGWCC趨化因子的固相。一般將提供包含試劑的區(qū)室和說明。
對(duì)DGWCC趨化因子或配體片段特異的抗體，包括抗原結(jié)合片段，在檢測(cè)提高水平的DGWCC趨化因子和/或其片段的存在的診斷應(yīng)用中是有用的。這種診斷測(cè)定可以使用裂解液、活細(xì)胞、固定細(xì)胞、免疫熒光、細(xì)胞培養(yǎng)物、體液，并且還可以包括檢測(cè)與血清中配體相關(guān)的抗原等等。診斷檢測(cè)可以是均相(在游離試劑和抗原-DGWCC趨化因子復(fù)合物之間沒有分離步驟)或異相的(有分離步驟)。存在各種商業(yè)測(cè)定，諸如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、酶倍增免疫測(cè)定技術(shù)(enzyme-multipliedimmunoassay)(EMIT)、底物標(biāo)記熒光免疫測(cè)定(SLFIA)等等。例如通過使用標(biāo)記的第二抗體，可以使用未標(biāo)記抗體，所述第二抗體識(shí)別針對(duì)DGWCC趨化因子或其特定片段的抗體。在文獻(xiàn)中也廣泛討論了相似的測(cè)定。參見例如Harlow和Lane(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室指南CSH出版社，紐約州；Chan(編輯)(1987)免疫測(cè)定實(shí)踐指南Academic Press，奧蘭多，佛羅里達(dá)州；Price和Newman(編輯)(1991)免疫測(cè)定的原理和實(shí)踐Stockton出版社，紐約州；和Ngo(編輯)(1988)非同位索免疫測(cè)定Plenum出版社，紐約州。
抗獨(dú)特型抗體可以相似地用來診斷抗DGWCC趨化因子抗體的存在，因此這種抗體可以診斷各種異常狀態(tài)。例如，過量產(chǎn)生DGWCC趨化因子可以導(dǎo)致產(chǎn)生各種免疫學(xué)反應(yīng)或其它醫(yī)學(xué)反應(yīng)，所述其它醫(yī)學(xué)反應(yīng)可以診斷例如在細(xì)胞生長(zhǎng)、活化或分化中的異常生理狀態(tài)。
常常在試劑盒中提供所述用于診斷檢測(cè)的試劑，以便最優(yōu)化所述檢測(cè)的靈敏性。為了本發(fā)明目的，根據(jù)測(cè)定的性質(zhì)、方案和標(biāo)記，或者提供標(biāo)記或未標(biāo)記的抗體或受體，或者提供標(biāo)記的DGWCC趨化因子。這通常和其它附加物結(jié)合，諸如緩沖液、穩(wěn)定劑、諸如酶底物的信號(hào)產(chǎn)生必需的材料等等。最好是所述試劑盒也包括對(duì)正確使用和使用后處理內(nèi)容物的說明。一般所述試劑盒有用于每種有用試劑的區(qū)室。最好是，以凍干粉提供所述試劑，其中所述試劑可以在水性介質(zhì)中重建，提供合適的用于進(jìn)行所述測(cè)定的試劑濃度。
可以不加修改地使用上述的藥物篩選和診斷測(cè)定的許多組分，或者可以對(duì)其以各種方式修改。例如，通過共價(jià)或非共價(jià)地連接直接或間接提供檢測(cè)信號(hào)的部分，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。在任何這些檢測(cè)中，可以或者直接者間接地標(biāo)記所述蛋白、測(cè)試化合物、DGWCC趨化因子或其抗體?？赡苡糜谥苯訕?biāo)記的包括標(biāo)記基團(tuán)諸如125I的放射標(biāo)記、諸如過氧化物酶和堿性磷酸酶的酶(第3,645,090號(hào)美國(guó)專利)和能夠監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)改變或熒光偏振的熒光標(biāo)記(第3,940,475號(hào)美國(guó)專利)。可能用于間接標(biāo)記的包括一個(gè)組分的生物素?；?，接著結(jié)合偶聯(lián)于上述標(biāo)記基團(tuán)之一的抗生物素蛋白。
也有許多從游離配體中分離結(jié)合配體，或者從游離的測(cè)試化合物中分離結(jié)合化合物的方法?？梢栽诟鞣N基質(zhì)上固化所述DGWCC趨化因子，然后洗滌。合適的基質(zhì)包括諸如ELISA板的塑料、濾膜和珠粒。將DGWCC趨化因子固化到基質(zhì)上的方法包括但不限于，直接附著到塑料上、使用捕捉抗體、化學(xué)偶聯(lián)和生物素-抗生物素蛋白。在這個(gè)方案中最后的步驟包括通過使用幾個(gè)方法中的任何一個(gè)，包括那些例如使用諸如聚乙二醇的有機(jī)溶劑或諸如硫酸銨的鹽的方法，沉淀配體/受體或配體/抗體復(fù)合物。其它合適的分離技術(shù)包括但不限于，在Rattle等(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的熒光素抗體可磁化微粒法，和在第4,659,678號(hào)美國(guó)專利中所述的雙抗體磁性微粒分離。
在所述文獻(xiàn)中廣泛報(bào)告了用于將蛋白或其片段同各種標(biāo)記連接的方法，本文并不需要詳細(xì)討論。所述技術(shù)許多涉及活化羧基的應(yīng)用，或者通過使用碳二亞胺或者通過使用活性酯形成肽鍵，涉及通過巰基與諸如氯乙酰的活化鹵素或諸如馬來酰亞胺的活化鏈烯烴反應(yīng)，形成硫醚等等。在這些應(yīng)用中也發(fā)現(xiàn)使用融合蛋白。
本發(fā)明另一診斷方面包括使用取自DGWCC趨化因子序列的寡核苷酸或多核苷酸序列。可以使用這些序列作為檢測(cè)樣品中DGWCC趨化因子信使(message)水平的探針，所述樣品來自天然源或懷疑有異常病癥(例如癌癥或發(fā)育問題)的病人。RNA和DNA二者核苷酸序列的制備、所述序列的標(biāo)記和所述序列的優(yōu)選大小在所述文獻(xiàn)中得到了充分描述和討論。一般寡核苷酸探針應(yīng)當(dāng)具有至少大約14個(gè)核苷酸，通常至少大約18個(gè)核苷酸，而所述多核苷酸探針最多可以達(dá)到幾千個(gè)堿基?？梢允褂酶鞣N標(biāo)記，最常用的是放射性核素，特別是32P。然而，也可以使用其它技術(shù)，諸如使用生物素修飾的核苷酸，用于引入到多核苷酸中。然后所述生物素用作結(jié)合抗生物素蛋白或抗體的位點(diǎn)，所述抗生物素蛋白或抗體可以用各種各樣的標(biāo)記物標(biāo)記，諸如放射性核素、熒光團(tuán)、酶等等。另一方面，可以使用可以識(shí)別特異雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA-RNA雜種雙鏈體或DNA-蛋白雙鏈體。可以按順序標(biāo)記所述抗體，并進(jìn)行所述測(cè)定，其中所述雙鏈體結(jié)合于一表面，以便可以根據(jù)在所述表面上的雙鏈體的形成，檢測(cè)結(jié)合于所述雙鏈體的抗體的存在。使用許多常規(guī)技術(shù)，諸如核酸雜交、加減篩選、重組探針探測(cè)、雜交分子釋放翻譯(HRT)和雜交分子終止翻譯(HART)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)新反義RNA的探針的應(yīng)用。這也包括諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增技術(shù)。
也考慮了診斷試劑盒，所述試劑盒也用于定性或定量測(cè)試這些標(biāo)記和其它標(biāo)記的存在。診斷或預(yù)后可以依靠用做標(biāo)記的多種指示的組合。因此，試劑盒可以測(cè)試標(biāo)記組合。參見例如Viallet等(1989)Progressin Growth Factor Res.189-97。可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法，在蛋白或mRNA水平上評(píng)價(jià)每種趨化因子定性或定量的表達(dá)。XII.受體分離只要分離了特異相互作用的結(jié)合配偶體，就存在分離反配偶體的方法。參見Gearing等(1989)EMBO J.83667-3676。例如，可以檢測(cè)標(biāo)記DVic-1或DGWCC趨化因子、而不干擾同其受體結(jié)合的方法。例如，親合標(biāo)記或表位標(biāo)記可以同所述配體的或者氨基末端或者羧基末端融合?？梢院Y選表達(dá)文庫，以特異性地結(jié)合DVic-1或DGWCC趨化因子，例如通過細(xì)胞分類或其它篩選以檢測(cè)表達(dá)這種結(jié)合組分的亞群。參見例如Ho等(1993)Proc.Nat’l Sci.USA 9011267-11271。另一方面，可以使用淘選法。參見例如Seed和Aruffo(1987) Proc.Nat’l Sci.USA843365-3369。也可以使用雙雜交體選擇系統(tǒng)，產(chǎn)生合適的具有可利用趨化因子序列的構(gòu)成物。參見例如Fields和Song(1989)Nature 340245-246。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)Ca++通量法。參見例如Coligan等(編輯)(1992和定期增補(bǔ)本)免疫學(xué)現(xiàn)時(shí)方案Greene/Wiley，紐約，紐約州。
具有標(biāo)記的蛋白質(zhì)交聯(lián)接技術(shù)可以用于分離DVic-1或DGWCC趨化因子的結(jié)合配偶體。這應(yīng)當(dāng)允許鑒別例如以配體-受體樣方式同DVic-1或DGWCC趨化因子特異相互作用的蛋白。所述趨化因子家族一般結(jié)合七跨膜受體家族的受體，而所述DVic-1或DGWCC趨化因子的受體可能顯示相似的結(jié)構(gòu)。因此，通過在下述系統(tǒng)中表達(dá)而發(fā)現(xiàn)所述受體是合理的，所述系統(tǒng)能夠以可以顯示配體結(jié)合能力的形式表達(dá)這種膜蛋白。
參照下述實(shí)施例，可以最好的理解本發(fā)明的廣闊范圍，所述實(shí)施例無意將本發(fā)明限制在特定實(shí)施例中。
實(shí)施例I.一般方法例如在以下文獻(xiàn)中描述和引用了許多下文中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法Maniatis等(1982)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社，紐約；Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(第2版)第1-3卷，CSH出版社，NY；Ausubel等，生物學(xué)Greene Publishing Associates，Brooklin，NY；或Ausubel等(1987和增補(bǔ)本)分子生物學(xué)現(xiàn)時(shí)方案Wiley/Greene，NY；Innis等(編輯)(1990)PCR方案方法和應(yīng)用指南Academic Press，NY。用于蛋白純化的方法包括諸如硫酸銨沉淀、柱層析、電泳、離心、結(jié)晶等等的方法。參見例如Ausubel等(1987和定期增補(bǔ)本)；Deutscher(1990)“蛋白質(zhì)純化指南”Methods in Enzvmology第182卷和在這個(gè)系列中的其它卷；和生產(chǎn)商使用蛋白純化產(chǎn)品的文獻(xiàn)，例如Pharmacia，Piscataway，NJ或Bio-Rad，Richmond，CA。結(jié)合重組技術(shù)允許同合適的區(qū)段(表位標(biāo)記)融合，例如同F(xiàn)LAG序列或可以融合的例如通過蛋白酶可去除序列的相當(dāng)序列融合。參見例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)“用金屬螯合物吸收劑純化重組蛋白”載于Setlow(編輯)遺傳工程、原理和方法1287-98，Plenum出版社，NY；和Crowe等(1992)OIAexpress高水平表達(dá)和蛋白純化系統(tǒng)QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
例如在Coligan(1991)免疫學(xué)現(xiàn)時(shí)方案Wiley/Greene，NY；和Methods in Enzymology第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷中描述了標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)。例如在Wouterlood(1995年編輯)神經(jīng)科學(xué)方案第10單元，Elsevier；神經(jīng)科學(xué)方法Academic Press；和神經(jīng)方法Humana出版社，Totowa，新澤西中描述了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生物活性的檢測(cè)。例如在Meisami(編輯)人類生長(zhǎng)和發(fā)育生物學(xué)手冊(cè)CRC出版社；和Chrispeels(編輯)發(fā)育生物學(xué)中的分子技術(shù)和方案Interscience中描述了發(fā)育系統(tǒng)方法學(xué)。
在Melamed等(1990)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)和分類Wiley-Liss，Inc.，NY，NY；Shapiro(1988)實(shí)用流動(dòng)式胞計(jì)量術(shù)Liss，紐約，紐約州；和Robinson等(1993)流式細(xì)胞計(jì)量法手冊(cè)Wiley-Liss，紐約，紐約州中描述了FACS分析。II.分離DVic-1或DGWCC趨化因子克隆通過許多不同可能的方法，從天然源中分離編碼DVic-1或DGWCC趨化因子的克隆。已知本文提供的序列，選擇和/或構(gòu)建PCR引物或雜交探針，以分離或者基因組DNA區(qū)段或者cDNA反轉(zhuǎn)錄物。合適的細(xì)胞源包括下列組織，例如皮膚或上皮或傷口愈合文庫。通過篩選個(gè)體種群，分離遺傳和多態(tài)或等位變異體。
通過標(biāo)準(zhǔn)方法，最好使用來自所述編碼序列的相反末端的引物，進(jìn)行基于PCR的檢測(cè)，但是為了特定目的可以選擇側(cè)翼區(qū)段。
另一方面，選擇雜交探針。根據(jù)預(yù)期的同源性和預(yù)期的錯(cuò)配，選擇探針的具體的AT或GC含量。選擇合適的嚴(yán)格條件，以平衡合適的陽性信號(hào)與背景之比。使用連續(xù)的清洗步驟，以收集具較大同源性的克隆。
使用基于抗體的選擇方法分離另外的克隆。使用的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)克隆方法包括例如膜結(jié)合表達(dá)產(chǎn)物的FACS染色。使用所述抗體鑒別產(chǎn)生識(shí)別蛋白的克隆。另一方面，使用抗體純化DVic-1或DGWCC趨化因子，用蛋白序列和標(biāo)準(zhǔn)方法分離編碼該蛋白的基因。
基于基因組序列的方法也可供鑒別天然可用的序列，或相反，可供鑒別同提供的序列顯示同源性的序列。III.分離用于趨化因子克隆的靈長(zhǎng)類對(duì)應(yīng)物使用如上所述的相似的方法分離來自另一靈長(zhǎng)類的合適的靈長(zhǎng)類趨化因子基因。使用相似的源材料分離天然基因，包括遺傳、多態(tài)、等位或菌株變異體。也使用相似的方法分離其它物種的變異體。另一方面，可以從基因數(shù)據(jù)庫中檢索合適的基元。IV.分離嚙齒類趨化因子克隆如上選擇合適的嚙齒類源，例如大鼠、倉鼠等等。與人、其它靈長(zhǎng)類序列相比，盡管嚙齒類趨化因子的相似性程度一般較低，但仍可使用相似的方法分離物種變異體。V.染色體定位例如用生物素-14 dATP切口平移標(biāo)記所述cDNA，并以5ng/μl的最終濃度同中期原位雜交，所述中期來自兩個(gè)正常動(dòng)物，優(yōu)選為雄性?？梢愿鶕?jù)Callen等(1990)Ann.Genet.33219-221所述的方法修改熒光原位雜交法(FISH)，在所述方法中，在分析前用碘化丙錠(作為復(fù)染)和DAPI(用于鑒別染色體)二者將染色體染色。通過CCD照相機(jī)捕捉中期制備物的影象，并用計(jì)算機(jī)加強(qiáng)。檢查合適的標(biāo)記染色體的鑒定。對(duì)于這些分子的標(biāo)準(zhǔn)位置或不同位置的定位也可以提供關(guān)于功能的信息。
已將人DVic-1定位于人染色體9p13中。VI.表達(dá)；純化；特征鑒定關(guān)于來自上述的合適的克隆，將所述編碼序列插入到合適的表達(dá)載體中。這可以在特別選擇的載體中，用于原核生物、酵母、昆蟲或高等脊椎動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)表達(dá)系統(tǒng)。將標(biāo)準(zhǔn)方法用于生產(chǎn)所述基因產(chǎn)物，優(yōu)選為可溶的分泌分子，但在某些情況下，也作為分子內(nèi)蛋白產(chǎn)生。一般分子內(nèi)蛋白需要細(xì)胞裂解，以回收所述蛋白，而不溶性內(nèi)含體是用于進(jìn)一步純化的常用的原材料。
關(guān)于編碼DVic-1或DGWCC趨化因子的克隆，盡管可以從合適的源中純化天然形式，但仍使用重組生產(chǎn)方法。通過蛋白純化的標(biāo)準(zhǔn)方法純化所述蛋白產(chǎn)物，在某些情況下，例如同免疫親合法聯(lián)合。免疫親合法或者用作如上所述的純化步驟，或者用作檢測(cè)測(cè)定，以測(cè)定所述蛋白的分離特性。
優(yōu)選將所述蛋白分泌到所述培養(yǎng)基中，并由可溶形式的培養(yǎng)基純化可溶性產(chǎn)物。另一方面，如上所述，來自原核生物表達(dá)系統(tǒng)的內(nèi)含體是有用的材料源。一般由所述內(nèi)含體溶解所述不溶蛋白，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法重折疊。如上所述制定純化方法。
特征鑒定上述純化方法的產(chǎn)物，以確定許多結(jié)構(gòu)特征。使用標(biāo)準(zhǔn)物理方法，例如氨基酸分析和蛋白質(zhì)序列分析。產(chǎn)生的蛋白須經(jīng)CD波譜法和其它波譜法，例如NMR、ESR、質(zhì)譜法等檢測(cè)。特征鑒定所述產(chǎn)物，以測(cè)定其分子形式和大小，例如使用凝膠層析和相似的技術(shù)。了解所述層析特性將產(chǎn)生更溫和或更有效的純化方法。
例如按照在Hansen等(1995)Biochem.J.308801-813中的報(bào)告，可以進(jìn)行糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。VII.制備抗趨化因子的抗體使用用于表達(dá)的DNA、或例如如上所述產(chǎn)生的蛋白，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫以產(chǎn)生抗體。在某些情況下，使用未純化抗原產(chǎn)生多克隆抗血清，盡管所得的血清將顯示較高的背景值。優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)，包括例如使用如上指出的多克隆血清的親合層析，純化所述抗原。使用確定的合成肽片段測(cè)定特定抗體的存在。
產(chǎn)生抗純化抗原(按上文指出的純化)的多克隆血清，或使用例如許多合成肽產(chǎn)生多克隆血清。一系列包括所有所述全長(zhǎng)序列的重疊合成肽，如果存在于動(dòng)物中，將產(chǎn)生識(shí)別所述蛋白上大多數(shù)線性表位的血清。使用這樣的抗血清親合純化蛋白，再使用所述純化蛋白，以將完整的全長(zhǎng)蛋白引入到另一動(dòng)物中，以產(chǎn)生另一抗血清制備物。
使用相似的技術(shù)產(chǎn)生針對(duì)或者未純化抗原、或者優(yōu)選為純化抗原的誘導(dǎo)單克隆抗體。所述抗血清或抗體可以識(shí)別天然蛋白，或者可以識(shí)別變性抗原?？梢愿鶕?jù)需要，免疫選擇或免疫純化所述制備物。VIII.細(xì)胞和組織的分布例如使用具有如上產(chǎn)生的抗體試劑的免疫組織化學(xué)，或通過篩選編碼所述趨化因子的核酸，測(cè)定所述蛋白或基因產(chǎn)物的分布。使用雜交或PCR法測(cè)定DNA、cRNA或信使含量。組織化學(xué)允許測(cè)定組織中表達(dá)較高或較低水平的信使或DNA的特定細(xì)胞類型?？贵w技術(shù)可用于定量測(cè)定在生物樣品中的蛋白，所述生物樣品包括體液或組織樣品。制定免疫測(cè)定，以定量測(cè)定蛋白。而且可以使用FACS分析，以評(píng)價(jià)在細(xì)胞群中的表達(dá)。
已在胎鼠中測(cè)定了小鼠DGWCC序列，1個(gè)序列來自受孕后14.5天的胎鼠，3個(gè)序列來自受孕后19.5天的胎鼠。三個(gè)序列來自成熟鼠，每1個(gè)序列來自肝、胎盤和皮膚。Northern分析顯示，在測(cè)試中的信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在腦中的信號(hào)，在腦中的信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在肺中的信號(hào)。IX.微量趨化性檢測(cè)在微量趨化性測(cè)定中評(píng)價(jià)DGWCC趨化因子的促遷移(pro-migratory)活性。參見例如Bacon等(1988)Br.J.Pharmacol.95966-974。也使用其它的運(yùn)輸測(cè)定。參見例如Quidling-Jrbrink等(1995)Eur.J.Immunol. 25322-327；Koch等(1994)J.Clinical Investigation 93921-928；和Antony等(1993)J.Immunol.1517216-7223。
也可以在例如由H.Broxmeyer所述的造血檢測(cè)中測(cè)定趨化因子的活性。參見Bellido等(1995)J.Clinical Investigation 952886-2895；和Jilka等(1995)Exptl Hematology 23500-506?？梢匀缋缬蒘treiter等(1992)Am.J.Pathol.1411279-1284所述測(cè)定它們的血管生成活性?；?qū)τ谠谘装Y中的作用，參見例如Wakefield等(1996)J.Surgical Res.6426-31。X.生物活性，直接和間接的如上所述例如在免疫細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞或干細(xì)胞上選擇粗壯和敏感的試樣。將趨化因子以增加的劑量加入到所述試樣中，以觀察是否檢測(cè)到劑量反應(yīng)。例如在增殖檢測(cè)中，將細(xì)胞接種到平板上。提供合適的培養(yǎng)基，并將趨化因子以不同的量加入到所述細(xì)胞中。在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)，檢測(cè)所述趨化因子或者對(duì)所述細(xì)胞直接影響，或者其間接影響。
另一方面，使用激活測(cè)定或吸引測(cè)定。選擇合適的細(xì)胞類型，例如造血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性細(xì)胞、多形核細(xì)胞等等)或淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞或NK細(xì)胞)、神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等等)或干細(xì)胞，例如分化為其它細(xì)胞類型(例如腸隱窩細(xì)胞)的祖細(xì)胞和未分化細(xì)胞類型。
其它測(cè)定將是那些用其它趨化因子證明的測(cè)定。參見例如Schall和Bacon(1994)Current Qpinion in Immunology 6865-873；和Bacon和Schall(1996)Int.Arch.Allergy & Immunol.10997-109。XI.結(jié)構(gòu)活性關(guān)系使用標(biāo)準(zhǔn)方法和分析，測(cè)定具體殘基的關(guān)鍵性信息。例如通過在測(cè)定位置，例如在上述鑒別位置，產(chǎn)生許多不同的變異體，并評(píng)價(jià)所述變異體的生物活性，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的誘變分析?？梢栽谝韵路秶鷥?nèi)進(jìn)行該誘變分析測(cè)定修飾活性的位置，或者集中在特定位置，以測(cè)定可以置換以或者保留、阻斷或者調(diào)節(jié)生物活性的殘基。
另一方面，分析天然變異體可以指出耐受天然突變的位置。這可以由在個(gè)體或跨過菌株或物種中變異的種群分析得出。例如通過PCR分析和測(cè)序，分析來自所選擇個(gè)體的樣品。這可以評(píng)價(jià)種群多態(tài)現(xiàn)象。XII.篩選激動(dòng)劑/拮抗物篩選能夠誘導(dǎo)或阻斷生物活性的激動(dòng)劑或拮抗劑。測(cè)定候選化合物(例如天然DGWCC趨化因子的序列變異體)的生物活性。另一方面，篩選單獨(dú)或組合的化合物，以測(cè)定其對(duì)生物活性的影響。XIII.分離趨化因子的受體DVic-1或DGWCC趨化因子可以用作特異結(jié)合的試劑，通過利用其結(jié)合的特異性，鑒別其結(jié)合配偶體，非常象使用抗體?；蛘呷缟纤?例如熒光或其它)標(biāo)記結(jié)合試劑，或者將結(jié)合試劑固化到用于淘選法的基質(zhì)上。典型的趨化因子受體是七跨膜受體。
使用所述結(jié)合組合物，例如趨化因子，篩選由細(xì)胞系表達(dá)結(jié)合配偶體(即受體)的細(xì)胞系產(chǎn)生的表達(dá)文庫。使用標(biāo)準(zhǔn)染色技術(shù)檢測(cè)或分類細(xì)胞內(nèi)或表面表達(dá)的受體，或者通過淘選篩選表面表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過不同的染色或免疫熒光技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的篩選。也參見McMahan等(1991)EMBO J.102821-2832。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)Ca++通量方案鑒別DGWCC的受體，參見例如Coligan等(編輯)(1992和定期增補(bǔ)本)免疫學(xué)現(xiàn)時(shí)方案Greene/Wiley，紐約，紐約州。
例如在第0天，用每室1ml的10ng/ml纖連蛋白的PBS，于室溫下在PBS中預(yù)包被2室permanox載玻片30分鐘。用PBS清洗一次。然后以每室2-3×105細(xì)胞將COS細(xì)胞接種于1.5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。于37℃溫育過夜。
在第一天為每個(gè)樣品制備0.5ml的66mg/ml DEAE-右旋糖酐、66mM氯奎和4mgDNA的無血清DME溶液。為每個(gè)組制備一個(gè)陽性對(duì)照，例如以1和1/200稀釋的人DGWCC趨化因子cDNA，制備一個(gè)陰性模擬。用無血清DME清洗細(xì)胞。加入所述DNA溶液并于37℃溫育5小時(shí)。除去所述培養(yǎng)基并加入0.5ml在DME中的10％ DMSO共2.5分鐘。除去并用DME洗滌一次。加入1.5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基并過夜溫育。
在第二天，更換所述培養(yǎng)基。在第三天或第四天，固定所述細(xì)胞并染色。用Hank’s緩中鹽溶液(HBSS)清洗所述細(xì)胞兩次，并在4％的低聚甲醛(PFA)/葡萄糖中固定所述細(xì)胞5分鐘。用HBSS洗滌3次。在除去所有的液體后可以將載玻片貯存在-80℃。對(duì)于每個(gè)室，如下進(jìn)行0.5ml溫育。加入具有32ml/ml 1M NaN3的HBSS/皂苷(0.1％)共20分鐘。然后HBSS/皂苷洗滌細(xì)胞1次。向細(xì)胞加入趨化因子或趨化因子/抗體復(fù)合物，并溫育30分鐘。用HBSS/皂苷洗滌細(xì)胞兩次。如果合適，加入第一抗體共30分鐘。加入第二抗體，例如以1/200稀釋的Vector抗小鼠抗體，并溫育30分鐘。制備ELISA溶液，例如Vector Elite ABC辣根過氧化物酶溶液，并預(yù)溫育30分鐘。使用例如每2.5ml HBSS/皂苷1滴A溶液(抗生物素蛋白)和1滴B溶液(生物素)。用HBSS/皂苷兩次洗滌細(xì)胞。加入ABC HRP溶液并溫育30分鐘。用HBSS兩次洗滌細(xì)胞，第二次清洗2分鐘，封閉細(xì)胞。然后加入Vector二氨基苯甲酸(DAB)共5至10分鐘。使用每5ml玻璃蒸餾水2滴緩沖液加上4滴DAB加上2滴H2O2。仔細(xì)地去除室，并用水清洗載玻片。風(fēng)干幾分鐘，然后加入1滴Crystal Mount和蓋玻片。于85-90℃烘烤5分鐘。
評(píng)價(jià)陽性染色混合物并逐漸亞克隆，以分離負(fù)責(zé)所述結(jié)合的單個(gè)基因。
另一方面，使用趨化因子試劑，以親合純化或分類表達(dá)受體的細(xì)胞。參見例如Sambrook等或Ausbel等。
另一個(gè)策略是通過淘選篩選膜結(jié)合受體。如上所述構(gòu)建所述受體cDNA。可以固定化所述配體，并使用其固定化表達(dá)細(xì)胞。通過使用合適的識(shí)別例如趨化因子融合構(gòu)成物的FLAG序列的抗體，或通過使用針對(duì)所述第一抗體產(chǎn)生的抗體，可以實(shí)現(xiàn)固化。選擇和擴(kuò)增的遞歸循環(huán)導(dǎo)致合適的克隆富集和表達(dá)受體的克隆完全分離。
用趨化因子可以篩選噬菌體表達(dá)文庫。合適的標(biāo)記技術(shù)，例如抗-FLAG抗體，將允許特異標(biāo)記合適的克隆。XIV.免疫組織化學(xué)定位使用上述抗體在不同的組織中鑒別DVic-1或DGWCC的表達(dá)。例如在Sheehan等(編輯)(1987)組織化學(xué)的理論與實(shí)踐，Battelle出版社，Columbus，OH中描述了免疫組織化學(xué)染色的方法。
如同具體并單獨(dú)指明將每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過引用整個(gè)結(jié)合到本文中一樣，將在本文中提及的所有參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
可以不脫離本發(fā)明的精神和范圍，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修改與改變，所述修飾和改變對(duì)本領(lǐng)域那些技術(shù)人員是顯而易見的。本文描述的具體實(shí)施方案僅僅是為了提供實(shí)施例，并且僅有所附的權(quán)利要求書以及全部范圍的這種權(quán)利要求給予權(quán)利的相當(dāng)物限制本發(fā)明。
序列表(i)申請(qǐng)人(A)申請(qǐng)人Schering Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州新澤西(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼07033-0530(G)電話號(hào)碼(908)298-5056(ii)發(fā)明名稱哺乳動(dòng)物趨化因子(iii)序列數(shù)12(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)蘋果MacIntosh(C)操作系統(tǒng)MacIntosh 7.1(D)軟件Microsoft Word 5.1a(v)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)申請(qǐng)?zhí)?vi)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/031,805(B)提交日期1996年11月27日(vi)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/761,071(B)提交日期1996年12月5日(vi)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S ××/×××，×××(B)提交日期1997年10月24日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度731個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置56..436(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置122..436(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征
(B)位置565(D)其它信息/注釋＝“設(shè)計(jì)為C的核苷酸565和581，可以是A或C”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置712(D)其它信息/注釋＝“設(shè)計(jì)為C的核苷酸712，可以是A、C、G或T”(ix)序列描述SEQ ID NO1GGCTGATCGA ACAGCCTCAC TTGTGTTGCT GTCAGTGCCA GTAGGGCAGG CAGGA ATG58Met-22CAG CAG AGA GGA CTC GCC ATC GTG GCC TTG GCT GTC TGT GCG GCC CTA 106Gln Gln Arg Gly Leu Ala Ile Val Ala Leu Ala Val Cys Ala Ala Leu-20 -15 -10CAT GCC TCA GAA GCC ATA CTT CCC ATT GCC TCC AGC TGT TGC ACG GAG 154His Ala Ser Glu Ala Ile Leu Pro Ile Ala Ser Ser Cys Cys Thr Glu-51 5 10GTT TCA CAT CAT ATT TCC AGA AGG CTC CTG GAA AGA GTG AAT ATG TGT 202Val Ser His His Ile Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met Cys15 2025CGC ATC CAG AGA GCT GAT GGG GAT TGT GAC TTG GCT GCT GTC ATC CTT 250Arg Ile Gln Arg Ala Asp Gly Asp Cys Asp Leu Ala Ala Val Ile Leu3035 40CAT GTC AAG CGC AGA AGA ATC TGT GTC AGC CCG CAC AAC CAT ACT GTT 298His Val Lys Arg Arg Arg Ile Cys Val Ser Pro His Asn His Thr Val4550 55AAG CAG TGG ATG AAA GTG CAA GCT GCC AAG AAA AAT GGT AAA GGA AAT 346Lys Gln Trp Met Lys Val Gln Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly Asn6065 7075GTT TGC CAC AGG AAG AAA CAC CAT GGC AAG AGG AAC AGT AAC AGG GCA 394Val Cys His Arg Lys Lys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg Ala808590CAT CAG GGG AAA CAC GAA ACA TAC GGC CAT AAA ACT CCT TAT 436His Gln Gly Lys His Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr95100 105TAGAGAGTCT ACAGATAAAT CTACAGAGAC AATTCCTCAA GTGGACTTGGCCATGATTGG 496TTGTCCTGCA TACTGATGAA ACTACTGATG TCVGCTGGTC TGAAAGGACC TACGAGAAGC556TAAATCTCCA AGAATGCCAT TTCCCTATCC CTAATGATTC AATCTCCCTT ACCCTGACCA616ATCAGTGGCC CAAATTTTCC AGCCCCTTGC CTCCCAGAAC CCCAGCCCAG AACTCTTCAG676AGATTTAAGA ATCTCCTCCT ACCTCCTGAC TCAGCCCCAT GTAATCATTA AACTC 731(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度127個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gln Gln Arg Gly Leu Ala Ile Val Ala Leu Ala Val Cys Ala Ala-22 -20-15 -10Leu His Ala Ser Glu Ala Ile Leu Pro Ile Ala Ser Ser Cys Cys Thr-5 1 510Glu Val Ser His His Ile Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met1520 25Cys Arg Ile Gln Arg Ala Asp Gly Asp Cys Asp Leu Ala Ala Val Ile30 35 40Leu His Val Lys Arg Arg Arg Ile Cys Val Ser Pro His Asn His Thr45 50 55Val Lys Gln Trp Met Lys Val Gln Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly6065 70Asn Val Cys His Arg Lys Lys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg75 80 85 90Ala His Gln Gly Lys His Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr95100 105(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度496個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO3TCCTGATCGA ACAGCCTCAC TTGTNTTGCT GTCAGTGCCA GTAGGGCAGG CAGGAATGCA60GCAGAGAGGA CTCGCCATCG TGGCCTTGGN TGTCTGTGCG GCCCTACATG CCTCAAAAGC120CATACTTCCC ATTGCCTCCA GCTGTTGCAC GGAGGTTTCA CATCATATTT CCAGAAGGCT180CCTGGGAAAG AGTGAATATG TGTCGCATCC AGAGAGCTGA TGGGGATTGT NACTTGGCTG240CTGTCATCCT TCATGTCAAG CGCAGAAGAA TCTGTNTCAG CCCGNACAACCATACTGTTA 300AGCAGTGGNT GAAAGTGCAA GTTGCCAGGA AAAATGGTAA AGGAAATTTTTTCCACAGGG 360NGGAAACACC CTGGGNAAGG GGANCCGTTA CCAGGGNACT TNNGGGGAAANGGGAAANTT 420NGGGCNTNAA AAATCCCTTT TNNGGGGNTT TAAGGTAAAT TTTNNNGGGAAATTTTCCNA 480GGGGNTTTGG NCATTT496(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度445個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGCACGAGCT TTGGCAGCTT CTTCACGTCG GTCCTCTCCG CGCGCGGTAG GAACCGTCCA60CGGCCTTAAA GAAGCCTCCT CACCAGCCAT ACTTCCCATT GCCTCCAGCT GTTGCACGGA120GGTTTCACAT CATATTTCCA GAAGGCTCCT GGNAAAGAGT GAATATGTGT CGCATCCAGA180GAGCTGATGG GGATTGTGAC TTGGCTGCTG TCATCCTTCA TGTCAAGCGC AGAAGAATCT240GTGTTCAGCC CGCACAACCA TACTGTTGAA GCAGTGGATG AAAGTGCAAGCTGCCAAGAA 300AAATGGTAAA GGAAATGTTT GCCACAGGAA GAAACACCNG GCAAGAGGAACATTAACAGG 360NACTTCCAGG GGAAACACGA AACTNACGGG CCNGAAAAAT CCTTATTTAGAGATTNACCG 420TTAANCTACC GGGACATTCC CCAAT445(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度362個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..336(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置73..336(xi)序列描述SEQ ID NO5ATG AAG GGG CCC CCA ACC TTC TGC AGC CTC CTG CTG CTG TCA TTG CTC 48Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu-24 -20 -15 -10CTG AGC CCA GAC CCT ACA GCA GCA TTC CTA CTG CCA CCC AGC ACT GCC 96Leu Ser Pro Asp Pro Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala-5 1 5TGC TGT ACT CAG CTC TAC CGA AAG CCA CTC TCA GAC AAG CTA CTG AGG 144Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg101520AAG GTC ATC CAG GTG GAA CTG CAG GAG GCT GAC GGG GAC TGT CAC CTC 192Lys Val Ile Gln Val Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu25 3035 40CAG GCT TTC GTG CTT CAC CTG GCT CAA CGC AGC ATC TGC ATC CAC CCC 240Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gln Arg Ser Ile Cys Ile His Pro4550 55CAG AAC CCC AGC CTG TCA CAG TGG TTT GAG CAC CAA GAG AGA AAG CTC 288Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Leu60 65 70CAT GGG ACT CTG CCC AAG CTG AAT TTT GGG ATG CTA AGG AAA ATG GGC 336His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly758085TGAAGCCCCA ATAGCCAAAT AATAAA 362(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度112個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu-24 -20-15-10Leu Ser Pro Asp Pro Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala-51 5Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg101520Lys Val Ile Gln Val Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu2530 3540Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gln Arg Ser Ile Cys Ile His Pro4550 55Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Leu60 6570His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly758085(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度433個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置23..382(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置98..382
(xi)序列描述SEQ ID NO7GAAACCTCTA GGCTGAGTGA GC ATG ATG GAG GGG CTC TCC CCC GCC AGC AGC 52Met Met Glu Gly Leu Ser Pro Ala Ser Ser-25 -20CTC CCG CTG TTA CTG TTG CTT CTG AGC CCG GCT CCT GAA GCA GCC TTG 100Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Ala Pro Glu Ala Ala Leu-15 -10-51CCT CTG CCC TCC AGC ACT AGC TGC TGT ACT CAG CTC TAT AGA CAG CCA 148Pro Leu Pro Ser Ser Thr Ser Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Gln Pro5 1015CTC CCA AGC AGG CTG CTG AGG AGG ATT GTC CAC ATG GAA CTG CAG GAG 196Leu Pro Ser Arg Leu Leu Arg Arg Ile Val His Met Glu Leu Gln Glu202530GCC GAT GGG GAC TGT CAC CTC CAG GCT GTC GTG CTT CAC CTG GCT CGG 244Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Val Val Leu His Leu Ala Arg35 4045CGC AGT GTC TGT GTT CAT CCC CAG AAC CGC AGC CTG GCT CGG TGG TTA 292Arg Ser Val Cys Val His Pro Gln Asn Arg Ser Leu Ala Arg Trp Leu50 55 6065GAA CGC CAA GGG AAA AGG CTC CAA GGG ACT GTA CCC AGT TTA AAT CTG 340Glu Arg Gln Gly Lys Arg Leu Gln Gly Thr Val Pro Ser Leu Asn Leu7075 80GTA CTA CAA AAG AAA ATG TAC TCA AAC CCC CAA GAG CAA AAC 382Val Leu Gln Lys Lys Met Tyr Ser Asn Pro Gln Gln Gln Asn85 90 95TAATAAAGCA ACATTAGACG ACAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A433(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度120個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Met Glu Gly Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu-25 -20 -15 -10Leu Leu Ser Pro Ala Pro Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Ser Ser Thr-51 5Ser Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Gln Pro Leu Pro Ser Arg Leu Leu101520Arg Arg Ile Val His Met Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His253035Leu Gln Ala Val Val Leu His Leu Ala Arg Arg Ser Val Cys Val His40 45 50 55Pro Gln Asn Arg Ser Leu Ala Arg Trp Leu Glu Arg Gln Gly Lys Arg60 65 70Leu Gln Gly Thr Val Pro Ser Leu Asn Leu Val Leu Gln Lys Lys Met7580 85Tyr Ser Asn Pro Gln Gln Gln Asn9095(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度99個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr1 5 1015Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val202530Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu3540 45Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val50 55 60Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln65 70 75 80Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr85 9095Pro Lys Thr(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度96個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不相關(guān)(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu1 5 1015Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys20 2530Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly35 4045Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile50 5560Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr65 7075 80Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asp Met85 9095(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度543個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..492(xi)序列描述SEQ ID NO11ATG TCG CGA TTG AGG AGA TAC GAG GTG GCG CTG GAA GCG GAG GAG GAG 48Met Ser Arg Leu Arg Arg Tyr Glu Val Ala Leu Glu Ala Glu Glu Glu1 510 15ATC TAC TGG GGC TGC TTC TAC TTT TTT CCT TGG CTG CGA ATG TGG CGC 96Ile Tyr Trp Gly Cys Phe Tyr Phe Phe Pro Trp Leu Arg Met Trp Arg2025 30AGG GAG CGG AGT CCG ATG TCT CCA ACA AGC CAG AGA CTA AGT CTG GAA 144Arg Glu Arg Ser Pro Met Ser Pro Thr Ser Gln Arg Leu Ser Leu Glu3540 45GCC CCC AGC CTC CCA CTG AGA AGC TGG CAT CCG TGG AAC AAG ACT AAG 192Ala Pro Ser Leu Pro Leu Arg Ser Trp His Pro Trp Asn Lys Thr Lys50 5560CAG AAG CAA GAA GCC TTG CCT CTG CCC TCC AGC ACT AGC TGC TGT ACT 240Gln Lys Gln Glu Ala Leu Pro Leu Pro Ser Ser Thr Ser Cys Cys Thr65707580CAG CTC TAT AGA CAG CCA CTC CCA AGC AGG CTG CTG AGG AGG ATT GTC 288Gln Leu Tyr Arg Gln Pro Leu Pro Ser Arg Leu Leu Arg Arg Ile Val859095CAC ATG GAA CTG CAG GAG GCC GAT GGG GAC TGT CAC CTC CAG GCT GTC 336His Met Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Val100 105 110GTG CTT CAC CTG GCT CGG CGC AGT GTC TGT GTT CAT CCC CAG AAC CGC 384Val Leu His Leu Ala Arg Arg Ser Val Cys Val His Pro Gln Asn Arg115 120 125AGC CTG GCT CGG TGG TTA GAA CGC CAA GGG AAA AGG CTC CAA GGG ACT 432Ser Leu Ala Arg Trp Leu Glu Arg Gln Gly Lys Arg Leu Gln Gly Thr130135 140GTA CCC AGT TTA AAT CTG GTA CTA CAA AAG AAA ATG TAC TCA AAC CCC 480Val Pro Ser Leu Asn Leu Val Leu Gln Lys Lys Met Tyr Ser Asn Pro145 150 155160CAA CAG CAA AAC TAATAAAGCA ACATTAGACG ACAAAAAAAA AAAAAAAAAA532Gln Gln Gln AsnAAAAAAAAAA A543(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度164個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Ser Arg Leu Arg Arg Tyr Glu Val Ala Leu Glu Ala Glu Glu Glu1 510 15Ile Tyr Trp Gly Cys Phe Tyr Phe Phe Pro Trp Leu Arg Met Trp Arg202530Arg Glu Arg Ser Pro Met Ser Pro Thr Ser Gln Arg Leu Ser Leu Glu35 4045Ala Pro Ser Leu Pro Leu Arg Ser Trp His Pro Trp Asn Lys Thr Lys50 5560Gln Lys Gln Glu Ala Leu Pro Leu Pro Ser Ser Thr Ser Cys Cys Thr65 707580Gln Leu Tyr Arg Gln Pro Leu Pro Ser Arg Leu Leu Arg Arg Ile Val859095His Met Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Val100 105 110Val Leu His Leu Ala Arg Arg Ser Val Cys Val His Pro Gln Asn Arg115 120125Ser Leu Ala Arg Trp Leu Glu Arg Gln Gly Lys Arg Leu Gln Gly Thr130135 140Val Pro Ser Leu Asn Leu Val Leu Gln Lys Lys Met Tyr Ser Asn Pro145 150 155 160Gln Gln Gln Asn
權(quán)利要求
1.大體純的DVic-1多肽，所述多肽包括SEQ ID NO2中敘述的成熟氨基酸序列。
2.大體純的DGWCC多肽，所述多肽包括SEQ ID NO6或10中提出的成熟氨基酸序列。
3.包括權(quán)利要求1或2的多肽的融合蛋白。
4.特異性結(jié)合權(quán)利要求1或2的多肽的結(jié)合化合物。
5.權(quán)利要求4的結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物是抗體或抗體片段。
6.編碼權(quán)利要求1或2的多肽的核酸。
7.包含權(quán)利要求6的核酸的表達(dá)載體。
8.包含權(quán)利要求7的載體的宿主細(xì)胞。
9.重組生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞。
全文摘要
提供來自人的新CC趨化因子,提供與其相關(guān)的試劑,包括純化蛋白、特異抗體和編碼這些趨化因子的核酸。也提供制備和使用所述試劑的方法和診斷試劑盒。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1245533SQ97181501
公開日2000年2月23日 申請(qǐng)日期1997年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月27日
發(fā)明者A·維卡里, J·莫拉勒斯, J·A·赫德里克, A·茲羅特尼克 申請(qǐng)人:先靈公司