專利名稱：：異源基因的表達方法及其所用的媒介物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及異源基因的表達方法及其所用的重組媒介物。更具體地說，本發(fā)明涉及用基因工程技術(shù)在細胞中表達異源基因時，與現(xiàn)有的異源基因表達法相比較更能促進異源基因表達的方法以及涉及其所用的媒介物。促進異源基因的表達是在基因工程中、特別是在將基因工程的技術(shù)用于植物中時最必要的技術(shù)之一。作為該方法之一，已知將來自內(nèi)含子(intron)的DNA片段插入異源基因上游的方法，例如在特開平3-103182號公報中所述，通過將蓖麻過氧化氫酶(catalase)(CAT-1)的來自內(nèi)含子的DNA片段插入異源基因上游，使該異源基因表達，促進該異源基因的表達。報導了有關(guān)來自各種內(nèi)含子的DNA片段的相同現(xiàn)象。為了促進異源基因的表達，一直使用內(nèi)含子，但一般不用多個內(nèi)含子，所以也看不出它的效果。例如玉蜀黍的醇脫氫酶的第一內(nèi)含子和第六內(nèi)含子分別單獨地呈顯基因表達的促進效果，但是兩者結(jié)合時的效果還不及單獨使用第六內(nèi)含子的效果(Mascarenhas等，PlantMolBiol，15，913-920)(1990))。又，結(jié)合兩個玉蜀黍的肌動蛋白的第三內(nèi)含子時，其效果也不如單獨使用的效果(Luehrsen等人Mol.Gen.Genet.，225，81-93(1991))。將來自內(nèi)含子的DNA片段插入的現(xiàn)有方法是有效的，但其促進表達的效果大多不充分，人們期望可能有更強地表達的方法。因此，本發(fā)明的目的是提供一種比現(xiàn)有方法更強烈地表達異源基因的異源基因表達的方法及為此所用的重組媒介物。經(jīng)努力研究的結(jié)果，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，在插入異源基因上游時，通過將具有促進異源基因表達效果的相同或不同多個來自內(nèi)含子的DNA片段插入異源基因的上游的方法比將一個來自內(nèi)含子的DNA片段插入的現(xiàn)有方法能更明顯地提高異源基因的表達。也就是，本發(fā)明提供一種有以下特征的異源基因的表達方法，將異源基因插入啟動子(promoter)下游并在該細胞中表達異源基因的異源基因表達方法中，將多個具有促進異源基因表達效果的、相同或不相同的來自內(nèi)含子的DNA片段插入該異源基因的上游，以表達該異源基因。又，本發(fā)明還提供重組媒介物，該媒介物含有啟動子；在其下游所插入的異源基因；以及在該異源基因的上游所插入的、具有促進異源基因表達效果的相同或不相同的多個來自內(nèi)含子的DNA片段。本申請人等發(fā)現(xiàn)在具有示于序列表中的序列號3中所示的堿基序列的玉蜀黍泛有素(ユビキチン)的內(nèi)含子序列單獨地被插入異源基因的上游時，也具有促進該異源基因表達的效果，從而完成本申請的第二個目的。也就是，本發(fā)明還提供具有以下特征的異源基因的表達方法，在將異源基因插入啟動子下游，并在細胞中表達該異源基因的異源基因表達方法中，將序列表中的序列號3所示的序列或其功能性變異體插入該異源基因的上游，以表達上述異源基因。通過本發(fā)明可提供與現(xiàn)有表達異源基因的方法相比的具有明顯促進異源基因的表達方法以及為其所用的重組媒介物。按照本發(fā)明，能促進以基因工程方法導入的異源基因的表達，因此，在基因工程領(lǐng)域中，本發(fā)明將作出大的貢獻。本發(fā)明方法的特征在于，通過將二個以上的具有促進異源基因表達效果的、來自內(nèi)含子的DNA片段插入要表達的異源基因的上游，以促進異源基因的表達。這里，所謂“具有促進異源基因表達效果的、來自內(nèi)含子的DNA片段”是指，和不插入時表達異源基因的情況相比，具有在能檢出異源基因表達的程度中增加效果的、來自內(nèi)含子的DNA片段。已知有多種這種來自內(nèi)含子的DNA片段，例如有蓖麻的過氧化氫酶(Catalase)基因(CAT-1)的第一內(nèi)含子(特開平3-103182號公報、田中等人，NucleicAcidsRes.18，6767-6770(1990))、玉蜀黍的UDP-葡萄糖黃酮醇糖基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)含子(Callis等人，Genes&Develop.1，1183-1200(1987))、玉蜀黍的醇脫氫酶-1第一內(nèi)含子(Callis等人，Genes&Develop.1，1183-1200(1987))。玉蜀黍的醇脫氫酶-1第二和第六內(nèi)含子(Mascarenhas等人，PlantMol.Biol，15，913-920(1990))、玉蜀黍的舒蘭肯-1(シユランケン-1)第一內(nèi)含子(Vasil等人，PlantPhysiol.91，1575-1579(1989))、擬南芥屬擬南芥(Arabidopsisthaliana)的翻譯延伸因子(translationelongationfactor)EF-1α第一內(nèi)含子(Curie等人，NucleicAcidsRes.19，1305-1310(1991))以及稻的肌動蛋白的第一內(nèi)含子(McEloy等人，PlantCell2，163-171(1990))等。但是，本發(fā)明所用的來自內(nèi)含子的DNA片段并不限于上述這些，任何能促進這種位于其下游的異源基因表達的都可以使用。又，本發(fā)明人等人首先通過將稻的磷脂酶D(PLD)基因的cDNA和基因組的堿基序列進行比較而發(fā)現(xiàn)稻PLD基因的內(nèi)含子；而且發(fā)現(xiàn)在這些內(nèi)含子中之一具有明顯促進其下游基因表達的效果，因此申請專利(PCT/JP96/00812)。將此內(nèi)含子的堿基序列示于序列表的序列號1中。在本發(fā)明中，可使用這序列號1所示的來自內(nèi)含子的DAN片段。又，也可令人滿意地使用在序列表的序列號2所表示的蓖麻過氧化氫酶內(nèi)含子序列和序列號3所示的玉蜀黍泛有素(Ubiquittin)基因的內(nèi)含子序列。再者，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員往往認為，一般在具有生理作用的DNA序列中，加入、插入、缺失或置換一個或多個核苷酸時還能維持其生理活性。在本發(fā)明中，上述公知的來自內(nèi)含子的DNA片段以及在序列號1所示的來自內(nèi)含子的DNA片段上在進行這種修飾的同時具有促進下游基因的表達的DNA片段也包含在本發(fā)明中的所謂“來自內(nèi)含子的DNA片段”中。也就是，在上述公知的來自內(nèi)含子的DNA片段和來自序列表的序列號1所示的內(nèi)含子的DNA片段上，添加、缺失或置換一個或多個核苷酸并又具有促進其下游存在的基因的表達的DNA片段也包含在本發(fā)明中的“來自內(nèi)含子的DNA片段”中。這里，經(jīng)這樣修飾的來自內(nèi)含子的DNA片段最好與原來的來自內(nèi)含子的DNA片段有70％以上，更好有90％以上的相同性。同樣，在本申請權(quán)利要求中所述的“功能性的變異體”也是在原來的序列上添加、缺失或置換一個或多個核苷酸、而且又具有促進其下游存在的基因表達的序列，與原來的序列較好的有70％以上，更好的有90％以上的相同性。例如所謂“序列號1所示序列的功能性變異體”就是序列號1所示序列中添加、缺失或置換一個或多個核苷酸，而且又具有促進其下游存在的基因表達的序列，這意味著它是與原來序列，較好的有70％以上、更好的有90％以上的相同性的序列。上述的各個來自內(nèi)含子的DNA片段其堿基序列和其來歷都是公知的，因此，通過常規(guī)方法的PCR方法就能容易地制備。又，長度為2000bp程度以下的用化學合成也有可能。又，上述來自修飾內(nèi)含子的DNA片段也能用常規(guī)法的部位特異性變異法或化學合成法而容易制備。在本發(fā)明方法中，將多個上述來自內(nèi)含子的DNA片段插入要表達異源基因的上游、也就是插入該異源基因的復制領(lǐng)域，更好是插入該復制領(lǐng)域的5′末端側(cè)上。來自內(nèi)含子的DNA片段最好插入啟動子和異源基因之間。將上述來自內(nèi)含子的DNA片段也可插入靠近要表達的異源基因的上游；來自內(nèi)含子的DNA片段和異源基因之間介入其它序列也可以。這種介入的序列長度并不受限制，通常約為0～1000bp。又，啟動子和來自內(nèi)含子的DNA片段直接連接也可以；在它們之間有其它序列介入也可以。這些介入的序列長度并不特別受限制，通常約為0～1000bp。在本發(fā)明方法中，將多個、較好是2～5個，更好是2或3個的上述來自內(nèi)含子的DNA片段插入。插入的來自內(nèi)含子的DNA片段可以是相同序列，也可以是不相同的序列。插入的多個來自內(nèi)含子的DNA片段也可相互直接連接，在它們之間也可介入其它序列。該介入的序列的長度不特別受限制，通常約為0～1000bp。再者，作為啟動子也可用能使下游的異源基因表達的任何啟動子，作為較好的實例可以是35S啟動子，但也不限于此。本發(fā)明還提供適用于上述本發(fā)明方法的重組媒介物。也就是，本發(fā)明所提供的重組媒介物，它包含，啟動子；在其下游連接的要表達的異源基因；插入于該異源基因上游的、具有促進異源基因表達效果的相同或不相同的多個來自內(nèi)含子的DNA片段。這樣的重組媒介物可通過將上述多個來自內(nèi)含子的DNA片段和異源基因插入適當?shù)谋磉_媒介物中而獲得。由于表達媒介物的克隆部位的堿基序列為已知，所以通過使用適當?shù)囊种泼负捅匾獣r使用銜接物就容易地進行這種插入操作。再者，各種這樣的表達媒介物在本領(lǐng)域是眾所周知的，并有市售。這些表達媒介物至少含有為在宿主細胞內(nèi)復制的復制開始點；啟動子；提供為將異源基因插入的限制酶部位的克隆部位以及耐藥性基因等的選擇標記，通常，含有使復制穩(wěn)定終結(jié)的終止區(qū)和當宿主為細菌時的SD序列。在本發(fā)明方法中，可采用這些公知的表達媒介物中的任何一種。本申請發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，當將具有序列表的序列號3所示的堿基序列的、玉蜀黍的泛有素基因的內(nèi)含子序列單獨地插入在異源基因的上游時，也能具有促進該異源基因表達的效果。因此，代替上述多個來自內(nèi)含子的序列，而只將一個序列號3所示序列或其功能性的衍生物插入的場合下包含于本發(fā)明范圍內(nèi)。但是，即使是以序列3所示的序列，插入多個的情況下，其效果大，特別是與以序列號1所示的稻PLD的內(nèi)含子序列一起插入時呈大的效果。以下，基于實施例對本發(fā)明進行具體說明，只是，本發(fā)明并不限于下述實施例。實施例1在稻PLD的基因中，在與mRNA的5′末端非翻譯領(lǐng)域相對應(yīng)的位置上存在有173bp的第一內(nèi)含子(序列號1.WO95/09234)。就該內(nèi)含子研究了它對植物細胞中基因表達的影響。合成每10個堿基含外顯子(エキソン)部分的20堿基的引物(primer)(5′-TCAC-CACCCGGTAAGCCCAG-3′，3′-CCCCCGCGTCCATCCCGCTC-5′)，以稻基因組純株(クロ-ン)作為鑄型而進行PCR。使用50pmol的各引物的混合物，200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1×PCR緩沖液(寶酒造公司制)和2.5UAmpliTaqDNA聚合酶(寶酒造公司制)，在總?cè)莘e為50μl中進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)按下述的溫度條件反復進行30周期，在DNA熱循環(huán)器(帕金、唉爾馬、西塔斯(パ-キン，ユルマ-シ-タス)公司制)中，在94℃一分鐘、在40℃一分鐘和在72℃為二分三十秒。將PCR產(chǎn)物在PCR11媒介物(インビトロジエン公司制)中進行亞克隆，將從該處切出的ECoR1片段進行平滑末端處理后，制備在東洋紡公司制備的質(zhì)體pBl221[在35S啟動子(以下稱為“35Spro”)的下游插入β-葡糖醛酸酶基因(以下稱為“GUS”)的媒介物質(zhì)體]的Smal位點上嵌入的媒介物pBl221P(35Spro，PLDintron，GUS)。再將質(zhì)體用BanHI消化，并進行平滑末端處理后，將上述片段嵌入，制備媒介物pBl221PP(35Spro.PLDintron×2，GUS)。再用Xbal將特開平03-103182號公報上所述的plG221[在35Spro的下游有蓖麻過氧化氫酶內(nèi)含子(序列表中的序列號2)和GUS按此順序存在]進行消化，在平滑末端處理后，將具有上述PLD內(nèi)含子的序列的DNA片段插入，制成媒介物plG221P(35Spro，PLD內(nèi)含子，過氧化氫酶內(nèi)含子，GUS)。通過日本稻“日本巴雷”品種的未成熟胚體制成稻培養(yǎng)細胞(Hiei等人，ThePlantJournal，6，271-282(1994)]，按照現(xiàn)有報道[島本等人，Nature，338，274-276(1989)]導入上述基因后，測定β-葡糖醛酸酶(GUS)活性，結(jié)果示于表1。如表1所示那樣，可以看出與單獨使用相比，由于導入二個同種或異種的內(nèi)含子，有明顯增大的GUS的活性。同時，很明顯，有PLD內(nèi)含子的堿基序列的DNA片段是，在使用多個具有內(nèi)含子的堿基序列的DNA片段時可獲得基因表達促進效果的DNA片段。表1</tables>實施例2就玉蜀黍的泛有素基因(Ubi-1ChristensenA.H.等人，PlantMol.Biol.，18，675-689(1982))的內(nèi)含子，研究其對異源基因表達的促進效果，所用媒介物有兩種。首先，用以下方法制備用于研究單獨使用時效果的媒介物。用Pst1切出泛有素基因的啟動子和內(nèi)含子(序列號3)，插入pUC18媒介物的Pst1位點。用BglII和BamHI切出內(nèi)含子部分，將其插入pBI221媒介物的BamHI位點，制成媒介物pBI221U(35Spro、泛有素內(nèi)含子、GUS)。其次，用以下方法制備用于研究多個使用時效果的媒介物。用BglII和BamHI切出內(nèi)含子部分，在平滑末端處理后，將其插入pBI221媒介物的SmaI位點。又在該媒介物的BamHI位點進行平滑末端處理，將所述PLD內(nèi)含子插入，從而制成媒介物pBI221PU(35Spro，PLD內(nèi)含子，泛有素內(nèi)含子，GUS)。用上述方法將這些媒介物導入原生質(zhì)體，測定GUS活性。正如表2所示，可看出由于單獨使用泛有素內(nèi)含子(Ubiquitmintron)有表達的促進效果。又，可看出由于并用PLD內(nèi)含子和泛有素內(nèi)含子使所得的比單獨使用各內(nèi)含子具有更強的促進效果。表2以下是序列表序列表序列號1序列長度173序列類型核酸序列種類基因組的DNA來源生物名稻(OryzaSativa)拓樸學直鏈狀鏈數(shù)雙鏈序列GTAAGCCCAGTGTGCTTAGGCTAAGCGCACTAGAGCTTCTTGCTCGCTTGCTTCTTCTCC60GCTCAGATCTGCTTGCTTGCTTGCTTCGCTAGAACCCTACTCTGTGCTGCGAGTGTCGCT120GCTTCGTCTTCCTTCCTCAAGTTCGATCTGATTGTGTGTGTGGGGGGGCGCAG173序列號2序列長度217序列類型核酸序列種類基因組的DNA來源生物名蓖麻拓樸學直鏈狀鏈數(shù)雙鏈序列ACATGGATCCCTACAGGGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCC60TTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTG120ATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTG180TGTCTATGATGATGATGATAGTTACAGAACCGTCGAC217序列號3序列長度1010序列類型核酸序列種類基因組的DNA來源生物名玉蜀黍拓樸學直鏈狀鏈數(shù)雙鏈序列GTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTC60CATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGT120TAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGAT180TGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGA240CGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCT300TTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTC360TTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTT420CAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATA480GTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGC540GGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTG600TGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGG660TGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTA720AGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGC780ATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTAT840TATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATA900TGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGT960ACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAG1010權(quán)利要求1.異源基因的表達方法，其特征在于，將異源基因插入啟動子的下游，使該異源基因在細胞中表達的異源基因的表達方法中，將多個具有促進異源基因表達效果的、來自相同或不相同內(nèi)含子的DNA片段插入該異源基因的上游，以表達所述異源基因。2.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段是在上述啟動子和上述異源基因之間插入。3.按照權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述細胞是植物細胞。4.按照權(quán)利要求1到3任何一項所述的方法，其特征在于，在所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段中至少有一個含有以序列表中序列號1所示的序列或其功能性的變異體。5.按照權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，作為上述多個來自內(nèi)含子的DNA片段含有2個以序列表中序列號1所示的序列或其功能性變異體。6.按照權(quán)利要求1到4中任何一項所述方法，其特征在于，在所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段中至少一個含有以序列表中序列號2所示的序列或其功能性變異體。7.按照權(quán)利要求6所記載的方法，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段分別含有以序列表中序列號1所示的序列或其功能性的變異體和以序列表中序列號2所示的序列或其功能性的變異體。8.按照權(quán)利要求1到3中任何一項所述方法，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段中至少有一個含有以序列表中序列號3所示的序列或其功能性的變異體。9.按照權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段分別含有以序列表中序列號1所示的序列或其功能性的變異體和以序列表中序列號3所示的序列或其功能性的變異體。10.重組媒介物，其特征在于，含有啟動子；在其下游聯(lián)結(jié)的要表達的異源基因；插入該異源基因上游的、具有促進異源基因表達效果的相同或不相同的多個來自內(nèi)含子的DNA片段。11.按照權(quán)利要求10所述重組媒介物，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段是插入在所述啟動子和所述異源基因之間。12.按照權(quán)利要求10或11所述重組媒介物，其特征在于，是可在植物細胞內(nèi)復制的重組媒介物。13.按照權(quán)利要求10到12中任何一項所述重組媒介物，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段中至少有一個含有以序列表中序列號1所示的序列或其功能性的變異體。14.按照權(quán)利要求13所述重組媒介物，其特征在于，作為所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段，含有2個以序列表中序列號1所示的序列或其功能性變異體。15.按照權(quán)利要求10到12中任何一項所述重組媒介物，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段中至少有一個含有以序列表中序列號2所示的序列或其功能性的變異體。16.按照權(quán)利要求15所述重組媒介物，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段分別含有以序列表中序列號1所示的序列或其功能性變異體和以序列表中序列號2所示的序列或其功能性變異體。17.按照權(quán)利要求10到12中任何一項所述的重組媒介物，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段中至少有一個含有以序列表中序列號3所示的序列或其功能性變異體。18.按照權(quán)利要求17所述的重組媒介物，其特征在于，所述多個來自內(nèi)含子的DNA片段分別含有以序列表中序列號1所示的序列或其功能性變異體和以序列表中序列號3所示的序列或其功能性變異體。19.異源基因的表達方法，其特征在于，將異源基因插入啟動子的下游、使該異源基因在細胞中表達的異源基因的表達方法中，將以序列表中序列號3所示的序列或其功能性變異體插入該異源基因的上游，以表達所述異源基因。20.按照權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，將所述以序列表中序列號3所示的序列插入。21.按照權(quán)利要求19到20中任何一項所述的方法，其特征在于，所述以序列表中序列號3所示的序列或其功能性變異體插入所述啟動子和所述異源基因之間。22.按照權(quán)利要求19到21中任何一項所述的方法，其特征在于，所述細胞是植物細胞。全文摘要一種用于異源基因表達的方法,使異源基因的表達比通用方法所得的表達更強。該方法包括,將異源基因插入促進子的下游并在細胞中表達,其中在異源基因的上游插入二個或多個相同或不相同的內(nèi)含子序列,并能促進異源基因的表達。文檔編號C12N9/16GK1195376SQ97190687公開日1998年10月7日申請日期1997年6月12日優(yōu)先權(quán)日1996年6月12日發(fā)明者植木潤,太田象三,倉屋芳樹,森岡真二申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社