專利名稱：具有果膠酯酶活性的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有果膠酯酶活性的酶、編碼具有果膠酯酶活性的酶的DNA構(gòu)建體、產(chǎn)生酶的方法、包含所說的具有果膠酯酶活性的酶的酶組合物及所說的酶和酶組合物在許多工業(yè)應用中的用途。
背景技術(shù)：
果膠聚合物是植物初生細胞壁的重要組分。它們由1,4-連接的α-D-半乳糖醛酸和其甲基化衍生物的鏈組成。利用果膠降解酶(如多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、果膠裂合酶或果膠酸酯裂合酶)對食品工業(yè)，主要在水果和蔬菜加工(如果汁的生產(chǎn)或酒的釀制)中是重要的，其中在水果和蔬菜加工中，利用這些酶催化降解果膠聚合物主鏈的能力。
為了許多目的，理想的是提供各種果膠降解酶，例如，這些酶以不含其它組分的形式存在于包含許多不同果膠降解酶的商業(yè)制劑(這類制劑的例子是Pectinex Ultra SP，從棘孢曲霉制備，由Novo NordiskA/S提供)中。按照這一點，將可能產(chǎn)生適應于特定的目的的酶制劑(如或包含一種單一的果膠降解酶或包含它們的任意結(jié)合物的酶制劑)。為此，利用重組DNA技術(shù)提供單一組分的果膠降解酶是方便的。
果膠甲基酯酶(EC 3.1.1.11)催化甲醇從果膠除去，導致果膠酸(多聚半乳糖醛酸)的形成。
果膠甲基酯酶由許多微生物產(chǎn)生，并已發(fā)現(xiàn)存在于許多高等植物的葉、根、柄和果實中。微生物果膠甲基酯酶已由Khanh等(1990)，“從黑曲霉菌株RH5344分離的果膠酯酶的核苷酸及衍生的氨基酸序列”，核酸研究18:4262；Khanh等(1991)，“黑曲霉中編碼基因組果膠甲基酯酶的基因的特征化和表達”，基因106:71-77；Spok等，(1991)，“青枯假單胞菌的果膠酯酶基因的分子克隆和測序”，微生物遺傳學雜志137:131-140；Plastow(1988)，“菊歐文氏菌B374的果膠甲基酯酶基因的分子克隆和核苷酸測序”，分子微生物2:247-254；Laurent等，(1993)，“編碼菊歐文氏菌菌株3937的果膠甲基酯酶pem基因的特征化和超量表達”，基因131:17-25；Tierny等，(1994)，“編碼來自多形擬桿菌的果膠酸酯裂合酶和果膠酶甲基酯酶活性的基因的分子克隆和在大腸桿菌中的表達”，應用細菌學雜志，76:592-602。
WO 94/25575描述了來自棘孢曲霉的果膠甲基酯酶的克隆。
發(fā)明概述按照本發(fā)明，發(fā)明人現(xiàn)已成功地分離并特征化來自擔子菌門真菌的DNA序列，因此使制備單一組分的果膠酯酶組合物成為可能，其中，所說的DNA序列編碼一種顯示果膠甲基酯酶活性的酶，該果膠甲基酯酶也稱為果膠酯酶。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示果膠酯酶活性的酶的DNA序列，此DNA序列包含a)克隆進存在于大腸桿菌DSM 10357中的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列果膠酯酶編碼部分，或b)與a)中限定的DNA序列類似的序列，該序列ⅰ)與a)中限定的DNA序列至少60％是同源的，或ⅱ)與SEQ ID NO:1中位置4-933顯示的DNA序列在嚴格性差的條件下雜交，或ⅲ)編碼一種多肽，該多肽與由包含a)中限定的DNA序列的DNA序列編碼的多肽有至少50％的同源性，或ⅳ)編碼一種多肽，該多肽與針對純化的果膠酯酶產(chǎn)生的抗體是免疫反應性的，其中所說的果膠酯酶由a)中限定的DNA序列編碼。
編碼果膠酯酶的全長cDNA序列已從絲狀真菌Meripilus giganteus菌株獲得，并已克隆進存在于大腸桿菌菌株DSM No.10357的質(zhì)粒pYES 2.0中。
人們相信所說的大腸桿菌DSM 10357中包含的編碼果膠酯酶的DNA序列具有與SEQ ID NO:1代表的DNA序列相同的序列。因此，只要提及克隆進存在于DSM 10357中的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分，也旨在于包括SEQ ID NO:1代表的DNA序列的果膠酯酶編碼部分。
因此，術(shù)語“克隆進存在于DSM 10357中的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分”和“SEQ ID NO:1代表的DNA序列的果膠酯酶編碼部分”可互換。
另一方面，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的表達載體、包含所說的DNA構(gòu)建體或所說的表達載體的細胞及產(chǎn)生顯示果膠酯酶活性的酶的方法，此方法包括在允許這種酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)所說的細胞，并從培養(yǎng)物中回收該酶。
另一方面，本發(fā)明還提供了顯示果膠酯酶活性的酶，這種酶(a)由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體編碼；或(b)由本發(fā)明的方法產(chǎn)生；和/或(c)與針對純化的果膠酯酶產(chǎn)生的抗體是免疫反應性的，這種純化的果膠酯酶由克隆進存在于大腸桿菌DSM 10357的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分編碼。在一個優(yōu)選的實施方案中，這種酶具有推斷的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
另一方面，本發(fā)明提供了對降解或修飾植物材料或其組分有用的酶組合物、所說的組合物富含顯示出如上所述的果膠酯酶活性的酶。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的酶或酶組合物在各種工業(yè)應用中的用途。
最后，本發(fā)明涉及大腸桿菌菌株DSM 10357的分離的實質(zhì)上純化的生物培養(yǎng)物，該菌株包含編碼果膠酯酶的DNA序列(克隆進存在于大腸桿菌DSM 10357的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分)，該DNA序列來源于絲狀真菌Meripilus gigantrus的菌株或所說的保持果膠酯酶編碼能力的大腸桿菌菌株的任意突變體，本發(fā)明也涉及分離的實質(zhì)上純化的絲狀真菌Meripilus giganters CBS 521.95的生物培養(yǎng)物，從其中已獲得了SEQ ID No.1所示的DNA序列。
發(fā)明詳述DNA構(gòu)建體本發(fā)明提供了一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含編碼顯示果膠酯酶活性的酶的DNA序列，該DNA序列包含a)克隆進存在于大腸桿菌DSM 10357的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分，或b)與a)中限定的DNA序列類似的序列，其中該類似序列ⅰ)與a)中所限定的DNA序列至少60％是同源的，或ⅱ)與SEQ ID NO:1中4-933位置顯示的DNA序列以低嚴格性雜交，或ⅲ)編碼一種多肽，該多肽與由包含a)中限定的DNA序列的DNA序列編碼的多肽至少50％是同源的，或ⅳ)編碼一種多肽，該多肽與針對純化的果膠酯酶產(chǎn)生的抗體是免疫反應性的，其中，所說的果膠酯酶由a)中限定的DNA序列編碼。
如本文所限定的，與克隆進存在于大腸桿菌DSM 10357的質(zhì)粒pYES2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分類似的DNA序列旨在表明編碼顯示果膠酯酶活性的酶的任意DNA序列，其中，所說的顯示果膠酯酶活性的酶具有一種或多種以上(ⅰ)-(ⅳ)指出的性質(zhì)。
因此，類似的DNA序列可從產(chǎn)生具有果膠酯酶活性的酶的絲狀真菌Meripilus giganteus或另一種或相關(guān)的生物(例如，克隆進存在于大腸桿菌DSM 10357的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分的等位基因或物種變體)的菌株分離。
此外，類似序列可基于SEQ ID NO:1的果膠酯酶編碼部分所代表的DNA序列(例如，可以是它的子序列)構(gòu)建，和/或通過引入核苷酸取代構(gòu)建(其中，該取代不產(chǎn)生DNA序列編碼的果膠酯酶的另一種氨基酸序列，但符合產(chǎn)生酶需要的宿主生物的密碼子選擇)，或通過引入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代構(gòu)建。
進行核苷酸取代時，優(yōu)選地，氨基酸變化是一種次要的性質(zhì)，即，是保守的氨基酸取代(它不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊或活性)、小的缺失(典型地，為1至約30個氨基酸的缺失)、小的氨基或羧基末端突出(如氨基末端甲硫氨酸殘基、達約20-25個殘基的小接頭肽)或有利于純化的小突出(如多聚組氨酸片段、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。
保守取代的例子在堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)以及小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)組內(nèi)。對于核苷酸取代的一般描述，參見，例如Ford等，(1991)，蛋白質(zhì)表達和純化2,95-107。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯的是這類取代可發(fā)生在分子功能關(guān)鍵性區(qū)域外部，并仍然產(chǎn)生活性多肽。對由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體編碼的多肽的活性是必需的，因而優(yōu)選地不易取代的氨基酸，可按照本領(lǐng)域已知的方法(如，定點誘變、丙氨酸掃描誘變)鑒定(參見，例如Cunningham和Wells,(1989)，科學244,1081-1085)。在后一技術(shù)中，在分子的每個殘基上引入突變，并檢驗產(chǎn)生的突變體分子的生物學(即果膠酯酶)活性，以確定對分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。如通過諸如核磁共振分析、晶體學或光親和標記的技術(shù)測定底物-酶相互作用的位點，也可由晶體結(jié)構(gòu)的分析測定底物-酶相互作用的位點(參見，例如，de Vos等，(1992)，科學255,306-312；Smith等，(1992)，分子生物學雜志224,899-904；Wlodaver等，(1992),FEBS Lett.309,59-64)。
以上ⅰ)所提到的同源性作為兩種序列間的同源程度測定，這種同源程度表明第一種序列來源于第二種序列。同源性可通過本領(lǐng)域已知的計算機程序(如GCG程序包提供的GAP)適當?shù)販y定(Wisconsin包的程序手冊，第8版本，1994年8月，遺傳學計算機小組，575 Science Drive,Madison,Wisconsin，美國53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學雜志，48,443-453)。利用GAP(該GAP具有用于DNA序列比較的下列配置GAP產(chǎn)生罰5.0,GAP延伸罰0.3)，DNA序列的編碼區(qū)域顯示與SEQ ID NO:1中所顯示的DNA序列的果膠酯酶編碼部分同源程度，優(yōu)選地至少60％，更優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，更優(yōu)選地至少97％。
以上(ⅱ)中提到的雜交旨在表明類似的DNA序列與相同于編碼果膠酯酶的DNA序列的探針在一定的規(guī)定條件下雜交，這些條件在下文材料和方法部分中詳述。利用的寡核苷酸探針是與SEQ ID NO:1中顯示的DNA序列的果膠酯酶編碼部分對應的。
以上ⅲ)中提到的同源性作為兩種序列間的同源程度測定，這種同源程度表明第一種序列來源于第二種序列。同源性可通過本領(lǐng)域已知的計算機程序(如GCG程序包提供的GAP)適當?shù)販y定(Wisconsin包的程序手冊，第8版本，1994年8月，遺傳學計算機小組，575 Science Drive,Madison,Wisconsin，美國53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學雜志，48,443-453)。利用GAP(該GAP具有用于DNA序列比較的下列配置GAP產(chǎn)生罰3.0,GAP延伸罰0.1)，由類似的DNA序列編碼的多肽與DNA構(gòu)建體編碼的酶(如與SEQ ID NO:2氨基酸序列)顯示的同源程度，優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少60％，更優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，尤其優(yōu)選地至少97％，其中，該DNA構(gòu)建體包含SEQ ID NO:1中所顯示的DNA序列的果膠酯酶編碼部分。
本發(fā)明也涉及果膠酯酶變體，這些變體具有的氨基酸序列由于最多三個氨基酸，優(yōu)選地由于最多兩個氨基酸，更優(yōu)選地由于最多一個氨基酸，因而與SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列的成熟部分不同。
關(guān)于性質(zhì)ⅳ)，免疫反應性可通過以下材料和方法部分中所述的方法測定。
編碼本發(fā)明的果膠酯酶的DNA序列可利用標準方法，從大腸桿菌DSM 10357菌株中分離，例如，如由Sambrook等，(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室；冷泉港，NY描述的。
編碼顯示本發(fā)明的果膠酯酶活性的酶的DNA序列也可通過任何普通的方法分離，這些方法包括在合適的載體中，克隆來自任何期望產(chǎn)生興趣果膠酯酶的生物的cDNA文庫，以所說的載體，轉(zhuǎn)化合適的酵母宿主細胞，在合適的條件下，培養(yǎng)宿主細胞，以表達任何由cDNA文庫的克隆編碼的興趣酶，通過測定任何由這類克隆產(chǎn)生的酶的果膠酯酶活性，篩選陽性克隆，并從這類克隆分離編碼該酶的DNA。
普通分離方法已在WO 93/11249或WO 94/14953中公開，其內(nèi)容本文一并參考。篩選方法的更詳細描述在以下的實施例1中給出。
此外，編碼本發(fā)明的果膠酯酶的DNA，依照眾所周知的方法，通過利用基于本文公開的DNA序列制備的合成寡核苷酸探針，可方便地從合適的源(如以下提及的任何生物)分離。例如，合適的寡核苷酸探針可基于作為SEQ ID NO:1表達的核苷酸序列的果膠酯酶編碼部分或其任何適合的子序列制備或基于SEQ ID NO:2氨基酸序列制備。
微生物源在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼果膠酯酶的DNA序列來源于屬于多孔菌科的菌株，按照entrez browser NCBI分類學，3,3版本(最新95.12.13)，該科是非褶菌目內(nèi)的一個科，此非褶菌目屬于擔子菌門層菌綱。
現(xiàn)在預期編碼與本發(fā)明的酶同源的酶的DNA序列(即，類似的DNA序列)可得自其它微生物。例如，DNA序列可通過類似地篩選其它微生物(如曲霉屬、酵母屬、擬桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、梭菌屬的菌株)的cDNA文庫衍生。
本發(fā)明的果膠酯酶可從中衍生的Meripilus giganteus菌株的分離物已按照國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約，由發(fā)明人保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures,P.O.Box 273,3740 AGBaarn，荷蘭(CBS)。
保藏日期04.07.95保藏者的參考號NN006040
CBS指定號Meripilus giganteus CBS No.521.95包含編碼本發(fā)明的果膠酯酶的全長cDNA序列的表達質(zhì)粒pYES 2.0已轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌菌株，且按照國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約，該菌株由發(fā)明人保藏在Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH.,Masheroder Weg 1b,D-38124 Raunschweig，聯(lián)邦德國，(DSM)。
保藏日期06.12.95保藏者的參考號NN049144DSM指定號大腸桿菌DSM 10357表達載體另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的重組表達載體。
本發(fā)明的表達載體可以是任何表達載體，這些載體易于方便地進行重組DNA過程，因而，載體的選擇將經(jīng)常取決于將要引入的宿主細胞。因此，這種載體可以是自主復制載體，即作為染色體外實體存在的載體，它們的復制不依賴于染色體的復制，例如質(zhì)粒。另外，載體可以是這樣的載體，當把它引入宿主細胞時，整合進入宿主細胞基因組，并與已整合進入的染色體一起復制。
在表達載體中，應把編碼果膠酯酶的DNA序列可操作地連接到合適的啟動子與終止子序列上。啟動子可以是任何在選擇的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，且可來源于編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。用于分別連接編碼果膠酯酶的DNA序列，啟動子和終止子，且把它們插入到合適的載體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的(參見，例如，Sambrook等，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港，NY)。
例如，在絲狀真菌宿主細胞中利用的合適的啟動子的例子是ADH3啟動子(McKnight等，EMBO雜志4(1985),2093-2099)或tpiA啟動子。其它有用的啟動子的例子是那些來源于編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucormiehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶的基因的啟動子。
宿主細胞另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的DNA構(gòu)建體和/或本發(fā)明的重組表達載體的宿主細胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細胞是真核細胞，尤其是真菌細胞，如酵母或絲狀真菌細胞。尤其是，細胞可屬于木霉屬物種(優(yōu)選地為Trichodermaharzianum或Trichoderma reesei)或曲霉屬物種(最優(yōu)選地為米曲霉或黑曲霉)或鐮孢屬的物種(尤其是禾谷鐮孢、Fusarium cerealis菌株)。真菌細胞可通過一種方法轉(zhuǎn)化，此方法包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，接著由本身已知的方式再生細胞壁。曲霉屬作為宿主微生物的用途在EP238 023中描述(Novo Nordisk A/S)，其內(nèi)容本文一并參考。宿主細胞也可以是酵母細胞，例如，酵母屬的菌株(尤其是釀酒酵母、克魯弗酵母或葡萄汁酵母)、Schizosaccharomyces sp.菌株(如粟酒裂殖酵母)、Hansenulasp.菌株、Pichia sp.菌株、Yarrowia sp.(如Yarrowia lipolytica)菌株或Kluyveromyces sp.(如乳酸克魯維酵母)菌株。
產(chǎn)生果膠酯酶的方法另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生按照本發(fā)明的酶的方法，其中把以編碼這種酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的合適的宿主細胞在允許這種酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)，并從此培養(yǎng)物回收產(chǎn)生的酶。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞的培養(yǎng)基可以是任何適合談及的宿主細胞生長的常規(guī)培養(yǎng)基。表達的果膠酯酶可方便地分泌進入培養(yǎng)基，并可通過眾所周知的方法從其中回收，該方法包括通過離心或過濾，從培養(yǎng)基分離細胞，通過鹽(如硫酸銨)沉淀培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)組分，接著是層析過程(如離子交換層析、親和層析或類似的過程)。
酶組合物另一方面，本發(fā)明涉及利于修飾或降解植物細胞壁組分的一種酶組合物、所說的組合物富含上述的顯示果膠酯酶活性的酶。
例如，富含本發(fā)明的酶的酶組合物可以是包含多種酶促活性的酶組合物，特別可以是包含多種植物細胞壁降解酶(如Viscozym、Pectinex或Pectinex Ultra SP)的酶組合物(全部由Novo Nordisk A/S提供)。以這種方式，將可提高這種酶組合物的細胞壁降解能力。
在本文中，術(shù)語“富含”旨在表明這種酶組合物的果膠酯酶活性已增加了，例如，富集系數(shù)為1.1，由于方便地添加了通過上述的方法制備的本發(fā)明的一種酶，提高了酶活性。
另外，富含顯示果膠酯酶活性的酶的酶組合物可以是一種把本發(fā)明的酶作為主要的酶促組分包含的酶組合物，例如單一組分的酶組合物。
酶組合物可依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備，并可以是液態(tài)形式的組合物或干燥形式的組合物。例如，酶組合物可以是粒狀形式或微粒狀形式。依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，將要包含在組合物中的酶可以是穩(wěn)定化的。
以下給出本發(fā)明的酶組合物的優(yōu)選用途的例子。本發(fā)明的酶組合物的劑量和利用該組合物的其它條件可基于本領(lǐng)域已知的方法確定。
按照本發(fā)明，該酶組合物可至少對下列目的之一是有用的。
植物材料的降解或修飾該酶組合物可有利地用于處理包含果膠的植物材料，如，蔬菜或水果來源的材料，例如，得自大豆、糖甜菜或蘋果的材料，以降低粘度，因此，改進談論的植物材料的加工或外觀。粘度的降低可利用本發(fā)明的酶制劑，在適于包含果膠的材料全部或部分降解的條件下，通過處理包含果膠的植物材料達到。
這種酶組合物可用于脫果膠及降低蔬菜或水果汁的粘度，尤其是降低蘋果或梨汁的粘度。
這種酶制劑可用于處理來自水果和蔬菜的麥芽汁，例如，可用于生產(chǎn)汁用的蘋果和梨的麥芽汁處理，并可用于生產(chǎn)酒用的葡萄的麥芽汁處理。
這種酶組合物可用于柑橘類的植物汁的生產(chǎn)，例如，壓榨后，用于部分或完全降解汁中存在的果肉。
對于上述用法，優(yōu)選的是，除果膠酯酶外，這種酶組合物包含含有多聚半乳糖醛酸酶的酶制劑。
利用本發(fā)明的酶制劑，調(diào)節(jié)加工的水果或蔬菜的稠度和外觀是可能的。因此，已發(fā)現(xiàn)這種稠度和外觀將是用于加工的酶的實際結(jié)合的產(chǎn)物，即酶(尤其是果膠降解酶)的性質(zhì)，本發(fā)明的果膠甲基酯酶與該酶結(jié)合。
具有可利用本發(fā)明的酶制劑產(chǎn)生的特異性性質(zhì)的產(chǎn)物的例子包括來自蘋果、梨或漿果的澄清汁、來自蘋果、梨、漿果、柑橘類的植物或番茄的混濁穩(wěn)定的汁及來自胡蘿卜和番茄的漿。
由先前公開的內(nèi)容看，明顯的是本發(fā)明的果膠酯酶可作為實質(zhì)上無其它酶活性(如多聚半乳糖醛酸酶和/或果膠裂合酶活性)的單一組分生產(chǎn)，其中所說的酶活性通常發(fā)現(xiàn)存在于商業(yè)上可得的包含果膠酯酶的果膠溶解制劑中。
基于這一方面，本發(fā)明的果膠酯酶的用途對其中這類所說的其它酶活性的作用不受歡迎的目的尤其是有利的。
這類目的的例子包括在加工或未加工的水果和蔬菜中，用于全部或部分使果膠脫甲基化的果膠甲基酯酶的用途。
例如，當要求水果或蔬菜的硬度改進時，部分脫甲基化是重要的。這樣，硬度經(jīng)常在加工(例如罐裝和滅菌)過程中降低。通過利用控制本發(fā)明的果膠酯酶的量，可達到水果與蔬菜中存在的果膠的部分脫甲基化，產(chǎn)生的部分脫甲基化的果膠可與例如，二價離子(如鈣)交聯(lián)，因此，可形成更硬的水果或蔬菜。因此，例如，本發(fā)明的果膠酯酶可用于改進紅和綠胡椒、大豆、豌豆及可切的水果(如梨和蘋果)的硬度。
可進行酶的浸制，例如通過浸漬無助于或通過真空處理有助于此過程。
此目的的另一個例子是果膠的脫甲基化，例如來自柑橘類的植物、蘋果、向日葵和/或糖甜菜的果膠的脫甲基化。
此外，果膠酯酶可用于獲得各種基于蔬菜或水果的產(chǎn)品中原位粘度的增加或凝膠的形成。
本發(fā)明的果膠酯酶可單獨地或與其它酶一起用于改進包含果膠的動物飼料(例如，由大豆、糖甜菜或油菜種子制備的飼料)的可消化性。為了這一目的，把本發(fā)明的酶組合物加至飼料中。
果膠酯酶活性可與其它酶一起用于由包含果膠的材料(如糖甜菜果肉)，依據(jù)眾所周知的方法，產(chǎn)生包含寡糖的單半乳糖醛酸或半乳糖醛酸。單半乳糖醛酸可用于產(chǎn)生半乳糖醛酸或產(chǎn)生脂肪酸和脂肪醇酯和/或半乳糖醛酸的醚。包含寡糖的半乳糖醛酸可用作人類食品或動物飼料的添加劑。
此外，果膠酯酶可與其它酶結(jié)合用于從植物纖維除去果膠物質(zhì)，這種除去是十分重要的，例如，在紡織纖維或其它纖維素材料的生產(chǎn)中是十分重要的。為了這一目的，把植物纖維材料利用適合量的本發(fā)明的果膠酯酶，在適于達到全部或部分降解與植物纖維材料有關(guān)的果膠物質(zhì)的條件下處理。
分塊對隨機切割的作用方式羧基基團在果膠中的分布對果膠的功能性質(zhì)是重要的。
已描述了用于測定果膠上游離羧基基團的分布的幾種方法(Grasdalen,H.等，碳水化合物研究289,105(1995))。為了使果膠酯酶的作用方式特征化，酸基團的分布通過由Mort等描述的方法測定(Mort,A.J.等，碳水化合物研究247,21(1993))。酯化的半乳糖醛酸通過以氫硼化鈉的還原轉(zhuǎn)化為半乳糖。此后，產(chǎn)生的半乳糖殘基的糖苷鍵通過HF溶劑解選擇性地切割。這導致了低聚物(Gal A)n-Gal的產(chǎn)生。這些低聚物表明了果膠中甲基酯化的殘基間的Gal A殘基的鄰近伸展。比較本發(fā)明的克隆的酯酶與桔子酯酶及堿處理。通過高效陰離子交換層析，把六個半乳糖醛酸殘基的低聚物分離和量化。由這些寡聚物的分布，可確定果膠中酸基團是隨機分布還是分塊分布。
Grasdalen等，1995描述了作為獲得關(guān)于組合物的定量信息和果膠的順序結(jié)構(gòu)的一種有用方法的NMR光譜法。與由Mort等定義的方法相反，1993 NMR光譜法表明了檢驗順序結(jié)構(gòu)的一種直接方法，僅需要中等程度的聚合物降解。
不受任何理論的束縛，現(xiàn)在人們相信用于許多工業(yè)應用(如在果醬的凝膠化中)的本發(fā)明的果膠酯酶的改進的性能(見下文中實施例4)是由于本發(fā)明的酶的作用方式，此方式優(yōu)選地提供了果膠中酸基團的分塊分布。
在下列實施例中，進一步詳細描述本發(fā)明，其中，下列實施例不打算以任何方式限制如權(quán)利要求中要求的本發(fā)明的范圍。
材料和方法保藏的生物Meripilus giganteus CBS 521.95包含本發(fā)明的編碼果膠酯酶的DNA序列。
包含含有穿梭載體pYES 2.0中編碼本發(fā)明的果膠酯酶的全長cDNA序列的質(zhì)粒的大腸桿菌DSM 10357。
其它菌株酵母菌株所利用的釀酒酵母菌株是W3124(MATα；ura 3-52；leu2-3,112；his 3-D200；pep 4-1137；prc1::HIS3；prb1::LEU2；cir+)大腸桿菌菌株DH10B(生命技術(shù)公司)質(zhì)粒曲霉屬表達載體pHD414是質(zhì)粒p775(在EP 238 023中描述)的衍生物。pHD414的構(gòu)建在WO 93/11249中進一步描述。
pYES 2.0(Invitrogen)pA2PE18(參見實施例1)全部RNA的抽提以硫氰酸胍，接著是通過5.7M CsC1墊層的超速離心，聚(A)+RNA的分離利用WO 94/14953中描述的方法，通過寡(dT)-纖維素的親和層析進行。
cDNA合成雙鏈cDNA是由5μg聚(A)+RNA通過RNase H方法(Gubler和Hoffman(1983)，基因25:263-269,Sambrook等，(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY)，利用由F.S.Hagen開發(fā)的發(fā)夾修飾(pers.comm.)合成的。把聚(A)+RNA(5μg在5μl DEPC處理的水中)在預先硅化的無RNA酶的Eppendorph試管中在70℃下加熱8分鐘，在冰上淬火，并在50μl的終體積中與逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(50mMTris-Cl,pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT,Bethesda研究實驗室)合并，該緩沖液包含1mM的dATP、dGTP和dTTP及0.5mM的5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40個單位的人胎盤核糖核酸酶抑制劑(RNasin,Promega)、1.45μg的寡(dT)18-NotⅠ引物(Pharmacia)和1000個單位的SuperScriptⅡ RNA酶H的逆轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda研究實驗室)。第一條鏈cDNA通過在45℃溫育反應混合物1小時合成。合成后，把mRNA:cDNA雜交混合物按照制造廠商的指導通過MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)旋轉(zhuǎn)柱凝膠過濾。
凝膠過濾后，把雜交物在250μl的第二鏈緩沖液(20mM Tris-Cl,pH7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、0.16mMβNAD+)中稀釋，這種第二鏈緩沖液包含每種dNTP各200μM、60個單位的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(Pharmacia)、5.25個單位的RNA酶H(Promega)和15個單位的大腸桿菌DNA連接酶(BoehringerMannheim)。第二條鏈cDNA的合成通過在16℃溫育反應試管2小時及在25℃溫育15分鐘完成。反應通過加入EDTA至20mM的終濃度停止，接著以苯酚和氯仿提取。
綠豆核酸酶處理把雙鏈cDNA在-20℃下，通過加入2體積96％EtOH、0.2體積10M NH4Ac沉淀12小時，通過離心回收，以70％EtOH洗滌，干燥，并重新懸浮在包含25個單位綠豆核酸酶(Pharmacia)的30μl綠豆核酸酶緩沖液(30mM NaAc,pH4.6、300mMNaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油)中。單鏈發(fā)夾DNA通過在30℃溫育反應物30分鐘夾住，接著加入70μl 10mM pH7.5Tris-Cl、1mM EDTA、苯酚抽提，并以2體積96％EtOH和0.1體積3MpH5.2 NaAc在冰上沉淀30分鐘。
以T4 DNA聚合酶鈍化末端雙鏈cDNAs通過離心回收，并在30μl包含每種dNTP各0.5mM及5個單位的T4 DNA聚合酶(新英格蘭Biolabs)的T4 DNA聚合酶緩沖液(20mM pH7.9 Tris-乙酸鹽、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)中，通過在16℃溫育反應混合物1小時鈍化末端。反應通過加入EDTA至20mM的終濃度停止，接著以苯酚和氯仿抽取，并通過加入2體積96％EtOH和0.1體積3M pH5.2 NaAc在-20℃沉淀12小時。
銜接頭連接、NotⅠ消化以及大小選擇
填充反應后，cDNAs通過離心回收，以70％EtOH洗滌，并干燥。把cDNA沉淀重新懸浮在25μl包含2.5μg非回文BstXⅠ銜接頭(Invitrogen)和30個單位T4連接酶(Promega)的連接緩沖液(30mM pH7.8 Tris-Cl、10mM MgCl2、10mMDTT、0.5mMATP)中，并在16℃下溫育12小時。反應通過在65℃下加熱20分鐘停止，然后在冰上冷卻5分鐘。連接的cDNA通過加入20μl水、5μl10×NotⅠ限制酶緩沖液(新英格蘭Biolabs)和50個單位的NotⅠ(新英格蘭Biolabs)，以NotⅠ限制酶消化，接著在37℃下溫育2.5小時。反應通過在65℃下加熱10分鐘停止。把cDNAs通過在1×TBE中的0.8％SeaPlaque GTG低熔點瓊脂糖凝膠(FMC)上的凝膠電泳進行大小分餾，以分離未連接的銜接頭和小的cDNA。cDNA是以0.7kb為截止進行大小選擇的，并按照制造廠商的指導，通過利用β-瓊脂酶(新英蘭格Biolabs)，從凝膠中釋放，通過加入2體積96％EtOH和0.1體積3M pH5.2 NaAc在-20℃下沉淀12小時。
文庫的構(gòu)建定向的、以大小選擇的cDNA通過離心回收，以70％的EtOH洗滌，干燥，并重新懸浮在30μl pH7.5 10mM Tris-Cl、1mMEDTA中。按照制造廠商的指導，把cDNAs通過穿過MicroSpin S-300HR(Pharmacia)旋轉(zhuǎn)柱的凝膠過濾脫鹽。三種檢驗連接在10μl的連接緩沖液(30mM pH7.8 Tris-Cl、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mMATP)中進行，該緩沖液包含5μl雙鏈cDNA(反應試管#1和#2)、15個單位的T4連接酶(Promega)和30ng(試管#1)、40ng(試管#2)以及40ng(試管#3，載體背景對照)BstXⅠ-NotⅠ切割的pYES 2.0載體。連接反應通過在16℃下溫育12小時，70℃下加熱20分鐘，并向每根試管加入10μl水完成。如描述的，把1μl每種連接混合物電穿孔進入40μl電感受態(tài)大腸桿菌DH10B細胞(Bethesda研究實驗室)(Sambrook等，(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY)。利用最佳條件，在由庫組成的大腸桿菌中，建立文庫。每個庫通過在37℃下溫育24小時后，在LB+氨芐青霉素瓊脂平板上涂布轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，且每板涂布15.000-30.000菌落制造。把20mlLB+氨芐青霉素加至這些平板，并把細胞懸浮在其中。把細胞懸浮液在37℃下在50ml的試管中搖動1小時。利用QIAGEN質(zhì)粒試劑盒，按照制造廠商的指導，從細胞中分離質(zhì)粒DNA，并把分離的質(zhì)粒DNA在-20℃保存。
把來自每個庫的1μl等分試樣的純化的質(zhì)粒DNA(100ng/μl)，通過電穿孔法，轉(zhuǎn)化進入釀酒酵母W3124((Becker和Guarante(1991)，酶學方法194:182-187)，并把轉(zhuǎn)化體涂布在包含2％葡萄糖的SC瓊脂板上，并在30℃下溫育。
陽性克隆的鑒定溫育3-5天后，這些SC瓊脂平板是涂布在一系列SC+半乳糖瓊脂平板上的復制品。把那些SC平板在30℃溫育2-4天，并以在一種適合緩沖液中的包含1％蘋果果膠DE 75％、1％HSB瓊脂糖的果膠高嵌體凝膠覆蓋，以檢測溶果膠酶的活性。在30℃溫育過夜后，把10-15ml的1％MTAB(混合烷基三甲基溴化銨)溶液注入高嵌體，1小時后除去。果膠甲基酯酶陽性菌落作為由一白暈輪圍繞的菌落鑒定。
陽性克隆的特征化陽性克隆作為單一菌落獲得，cDNA插入序列利用生物素化多接頭引物直接從酵母菌落擴增，利用磁珠(Dynabead M-280,Dynal)系統(tǒng)純化，利用鏈終止法(桑格等，(1977)，美國國家科學院學報74:5463-5467)和測序酶系統(tǒng)(美國生物化學)，通過每種cDNA克隆5’末端的測序，使每種特征化。
在曲霉屬中表達的cDNA基因的分離把產(chǎn)生果膠酯酶的酵母菌落接種進入50ml玻璃試管中的20ml YPD肉湯中。把試管在30℃下?lián)u動2天。通過以3000rpm離心10分鐘收獲細胞。
按照WO 94/14953分離DNA，并把DNA溶解在50μl水中。通過標準方法，把DNA轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌。利用標準方法，把質(zhì)粒DNA從大腸桿菌中分離，并通過限制酶分析，分析此質(zhì)粒DNA。把cDNA插入序列利用適合的限制酶切斷并連結(jié)進入曲霉屬表達載體。
米曲霉或黑曲霉的轉(zhuǎn)化如在WO 95/02043,16頁21行-17頁12行中描述的，可制備原生質(zhì)體，這些本文一并參考。
把100μl原生質(zhì)體懸浮液與10μl STC(1.2M山梨醇、10mM pH=7.5Tris-HCl、10mM CaCl2)中5-25μg適合的DNA混合。把原生質(zhì)體與p3SR2(攜帶構(gòu)巢曲霉基因的質(zhì)粒)混合。把混合物在室溫下放置25分鐘。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl2和10mM pH7.5Tris-HCl，并小心地混合(兩次)，最后加入0.85ml的相同溶液，并細心地混合。把混合物在室溫下放置25分鐘，以2500g旋轉(zhuǎn)15分鐘，并把沉淀重新懸浮在2ml 1.2M山梨醇中。又一次沉降后，把原生質(zhì)體涂布在基本平板(Cove，生物化學生物物理學報113(1966)51-56)上，該平板包含1.0M pH7.0蔗糖、作為氮源的10mM乙酰胺，并包含20mM CsCl以抑制背景生長。在37℃下溫育4-7天后，挑選孢子，并把它作為單一菌落涂布。重復此過程，并把第二次再分離后的單一菌落的孢子作為指定的轉(zhuǎn)化體保藏。
米曲霉轉(zhuǎn)化體的檢驗把每種轉(zhuǎn)化體在10ml的YPM(參見以下)中接種，并繁殖。在30℃下溫育2-5天后，除去上清液。果膠酯酶活性通過把10μl上清液施用于在包含1％蘋果果膠DE 75％的瓊脂糖凝膠中打開的直徑4mm的孔，如上所述，在30℃溫育過夜，并用MTAB沉淀鑒定。然后，果膠酯酶活性由一白暈輪鑒定。
分批進料發(fā)酵發(fā)酵以作為碳源的麥芽糖糊精、作為氮源的尿素和酵母提取物分批進料的方法進行。整個過程中，使pH保持在7.0，溫度保持在34℃。發(fā)酵后，通過離心和細菌過濾回收果膠酯酶。
酶的純化來自米曲霉的重組果膠酯酶純化如下培養(yǎng)5天后，收獲培養(yǎng)物上清液，并離心，細菌過濾，及在3kDa截止的Filtron盒(Minisette)上超濾至最小量。把25ml超濾液以50mM H3BO3、5mM DMG、1mM CaCl2pH7.0透析，并施用于40ml以相同緩沖液預平衡的Q-瓊脂糖凝膠FF柱(Pharmacia，瑞典)。洗滌此柱后，把結(jié)合的蛋白質(zhì)以線型NaCl梯度(從0-0.5M NaCl)洗脫。通過如上述的蘋果果膠測定，分析柱上組分的果膠酯酶活性。大多數(shù)果膠酯酶活性在進行過程中看見，而大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合至柱上。
進行過程中的pH以CH3COOH調(diào)整到pH4.5，并施用于以25mMCH3COOH/NaOH pH4.5平衡的50ml S-瓊脂糖凝膠HP柱(Pharmacia，瑞典)。洗滌柱后，結(jié)合的蛋白質(zhì)以線型NaCl梯度(從0至0.25M NaCl)洗脫。分析柱上組分的果膠酯酶活性。果膠酯酶活性的主要部分在一個峰中洗脫，集中峰組分。
把硫酸銨(AMS)加至庫至最后1.6M的AMS濃度，并把酶加至以100mM H3BO3、10mM DMG、2mM CaCl2、1.6M pH7.0平衡的40ml苯基Toyopearl柱。洗滌柱后，把結(jié)合的蛋白質(zhì)以線型AMS梯度(從1.6至0M AMS)洗脫。洗脫果膠酯酶峰的緩沖液通過在以25mMCH3COOH/NaOH pH4.5平衡的1.4L G25葡聚糖凝膠柱上的穿過交換為25mM CH3COOH/NaOH pH4.5。
把果膠酯酶施用于以25mM CH3COOH/NaOH pH4.5平衡的50ml S-葡聚糖凝膠HP柱。洗滌柱后，結(jié)合的蛋白質(zhì)以線型NaCl梯度(從0至0.1M NaCl)洗脫。具有果膠酯酶活性的組分通過SDS-PAGE分析。該組分僅僅包含一個帶。
電泳SDS-PAGE電泳在作為Laemli方法(Laemmli(1970)自然227:680-685)的改進形式的Mini-Leak 4電泳裝置(Kem-En-Tec，丹麥)中完成。把凝膠按照制造廠商的指導進行考馬斯染色。
SEQ ID No:1中顯示的DNA序列的分離編碼本發(fā)明的果膠酯酶的SEQ ID NO1中所顯示的DNA序列的果膠酯酶編碼部分可按本領(lǐng)域已知的方法(Sambrook等，(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY)通過抽提質(zhì)粒DNA，得自保藏的生物大腸桿菌DSM 10357。
雜交用于測定核苷酸探針與本發(fā)明的“類似的”DNA序列之間雜交的合適的雜交條件可如下述的規(guī)定。將利用的寡核苷酸探針是與SEQ ID NO:1中顯示的DNA序列的果膠酯酶編碼部分對應的DNA序列，即SEQ IDNO:1的核苷酸4-933。
雜交條件雜交條件參見本文，以定義如在本發(fā)明的第一個方面b)部分限定的類似的DNA序列，其中，該類似的DNA序列與SEQ ID NO:1中顯示的DNA序列的果膠酯酶編碼部分(即，核苷酸4-933)如以下詳述的，在至少嚴格性低的條件，但優(yōu)選地在嚴格性中等或高的條件下雜交。
用于測定核苷酸和同源DNA或RNA序列在低、中等或高嚴格性條件下雜交的合適的實驗條件包括使包含DNA片段或RNA的濾膜預先浸水以在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等，1989)雜交10分鐘，及在5×SSC、5×Denhardt溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理的鮭精DNA(Sambrook等，1989)預雜交濾膜，接著在包含10ng/ml濃度的隨機引物(Feinberg,A.p.和Vogelstein,B.(1983)生物化學年評132:6-13)、以32p-dCTP標記的(比活性＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中在大約45℃雜交12小時。然后，把濾膜以2×SSC、0.5％SDS在至少55℃(嚴格性差)，更優(yōu)選地至少60℃(中等嚴格性)，更優(yōu)選地至少65℃(中等/高嚴格性)，更優(yōu)選地至少70℃(高嚴格性)，更優(yōu)選地至少75℃(十分高的嚴格性)下洗滌兩次達30分鐘。
在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子利用X-射線膠片檢測。
免疫交叉反應性用于測定免疫交叉反應性的抗體可通過利用純化的果膠酯酶制備。更具體地說，抗本發(fā)明的果膠酯酶的抗血清可按照由N.Axelsen等，在定量免疫電泳手冊，Blackwell科學出版社，1973，第23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，實用免疫化學，Blackwell科學出版社，1982(更具體地說，p.27-31)描述的方法通過免疫兔(或其它嚙齒動物)產(chǎn)生。純化的免疫球蛋白可獲自抗血清，例如，可通過鹽沉淀((NH4)2SO4)，接著進行透析和離子交換層析(例如，在DEAE-Sephadex(交聯(lián)葡聚糖凝膠)上進行)獲得。蛋白質(zhì)的免疫化學特征化可通過Outcherlony雙擴散分析(O.Ouchterlony在實驗免疫學手冊(D.M.Weir，編者)，Blackwell科學出版社，1967,pp.655-706)或通過交叉免疫電泳(N.Axelsen等，同上，第3和4章)或通過火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)進行。
培養(yǎng)基YPD:10g酵母提取物、20g蛋白胨、加水至900ml，高壓滅菌，加入100ml 20％的葡萄糖(無菌過濾)。
YPM:10g酵母提取物、20g蛋白胨、加水至900ml，高壓滅菌，加入100ml 20％的麥芽糖糊精(無菌過濾)。
10×基礎(chǔ)鹽75g酵母含氮堿基、113g琥珀酸、68g NaOH、加水至1000ml，然后，無菌過濾。
SC-URA:100ml 10×基礎(chǔ)鹽、28ml不含維生素的20％酪蛋白氨基酸、10ml 1％色氨酸、加水至900ml，高壓滅菌，加入3.6ml 5％的蘇氨酸和100ml 20％的葡萄糖或20％的半乳糖。
SC-瓊脂加入SC-URA、20g/l瓊脂。
PEG 4000(聚乙二醇，分子量=4,000)(BDH，英國)1％蘋果果膠DE 75％(Herbstreith，德國)1％HSB瓊脂糖(FMC Litex A/S，丹麥)MTAB(混合的烷基三甲基溴化銨)(Sigma)實施例實施例1來自Meripilus giganteus CBS 521.95的果膠酯酶的克隆和表達把mRNA從在包含纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長的Meripilus giganteusCBS No.521.95中以攪拌分離以確保充分通氣。生長3-5天后，收獲菌絲體，把它立即在液氮中冷凍，并在-80℃保存。如所述的，以1％的載體背景，在大腸桿菌中構(gòu)建來自M.giganteus CBS No.521.95且由大約106單個克隆組成的文庫。把來自某些庫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進入酵母，包含250-400個酵母菌落的50-100個平板得自每個庫。
果膠酯酶陽性菌落在SC-瓊脂平板上通過蘋果果膠測定鑒定和分離。cDNA插入序列直接從酵母菌落擴增，并如以上材料和方法部分中所述的特征化。編碼果膠酯酶的cDNA的DNA序列在SEQ ID NO.1中顯示，對應的氨基酸序列在SEQ ID NO.2中顯示。SEQ ID NO.1中的從No.4至No.933的DNA核苷酸限定果膠酯酶的編碼區(qū)域。
cDNA可得自DSM 10357中的質(zhì)粒。
把全部DNA從酵母菌落中分離，如上述，通過大腸桿菌的轉(zhuǎn)化拯救質(zhì)粒DNA。為在曲霉屬中表達果膠酯酶，把DNA以適當?shù)南拗泼赶?，在凝膠上進行大小分餾，并純化與果膠酯酶基因?qū)钠?。其后，把該基因連接到pHD414，以適當?shù)南拗泼赶a(chǎn)生質(zhì)粒pA2PE18。
在大腸桿菌中擴增DNA后，如上述，把該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入米曲霉。
米曲霉轉(zhuǎn)化體的檢驗如上述，檢驗每種轉(zhuǎn)化體的酶活性。某些轉(zhuǎn)化體具有果膠酯酶活性，且該酶活性比米曲霉背景顯著的大。這表明果膠酯酶在米曲霉中充分表達。
實施例2與公開的果膠酯酶的同源性同源性檢索以本發(fā)明的果膠酯酶與核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對照完成。同源性檢索表明最相關(guān)的果膠酯酶是來自棘孢曲霉的果膠酯酶和來自Aspergillus tubigensis(以前所說的來自黑曲霉)的果膠酯酶。
按照“發(fā)明詳述”中描述的方法，本發(fā)明的果膠酯酶與大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)果膠酯酶的DNA同源性，利用計算機程序GAP測定。本發(fā)明的果膠酯酶與來自棘孢曲霉的果膠酯酶僅有54％的DNA同源性(WO 94/25575)，本發(fā)明的果膠酯酶與來自Aspergillus tubigensis的果膠酯酶僅有56％的DNA同源性(Khanh等，(1990)，“從黑曲霉菌株RH5344分離的果膠酯酶cDNA的核苷酸及衍生的氨基酸的序列”，核酸研究18:4262；Khanh等，(1991)，“編碼基因組果膠甲基酯酶的基因在黑曲霉中的特征化和表達”，基因106:71-77)。
按照“發(fā)明詳述”中描述的方法，本發(fā)明的果膠酯酶與大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)果膠酯酶的DNA同源性，利用計算機程序GAP測定。本發(fā)明的果膠酯酶與來自棘孢曲霉的果膠酯酶僅有47％的多肽同源性，本發(fā)明的果膠酯酶與來自Aspergillus tubigensis的果膠酯酶僅有44％的多肽同源性。
這表明本發(fā)明的果膠酯酶確實與任何已知的果膠酯酶關(guān)系遠。
實施例3本發(fā)明的重組果膠酯酶的純化和特征化如以上材料和方法中描述的，果膠酯酶是通過表達該酶的米曲霉的分批加料發(fā)酵產(chǎn)生的。
重組果膠酯酶用材料和方法部分中所描述的方法純化和特征化。酶的分子量通過SDS-PAGE測定達37kDa。
實施例4草莓果醬的原位膠凝作用作為膠凝作用性質(zhì)指示物的游離甲醇材料和方法果膠酯酶批PPJ 4300,423 PEU/g果膠酯酶Meripulus giganteus,2,4 PEU/g冷凍的草莓種類Senga sengana果膠酯酶活性以果膠酯酶單位(PEU)給出，其中，果膠酯酶單位(PEU)定義為在標準條件下，每分鐘釋放1毫摩爾羧基基團的酶量(NovoNordisk測定ABT-SM-0005.02.1，可向Novo Nordisk A/S索取)。
果醬制備果醬的制備按照用于果醬制備的標準方法(Novo Nordisk標準操作方法，ABF-SP-4002.02/01，可向Novo Nordisk A/S索取)進行。
制備300g一份的果醬。草莓和食糖的比例是180g草莓+120g食糖。初始預蒸煮后，把水果泥分成2×3-50g的部分，把樣品冷卻到40℃，并如下加入酶1)不加酶的對照2)PE,PPJ 4300,10 PEU/kg水果3)PE,Meripulus giganteus,10 PEU/kg水果密封樣品，允許放置1小時，然后，把樣品在90℃下熱處理3分鐘以滅活酶。
在本試驗中，游離甲醇的量化在Alfred Jφrgensens實驗室，A/S，哥本哈根進行。開始，蒸餾樣品，然后與質(zhì)譜檢測結(jié)合利用具有毛細管的氣相色譜儀分析。
結(jié)果和討論結(jié)果在下表1顯示表1 甲醇形成甲醇，ppm對照 12ppmPE,PPJ 4300 200ppm10 PEU/kg水果PE,M.gig.340ppm10 PEU/kg水果此表清楚的表明來自Meripulus giganteus的果膠酯酶產(chǎn)生340ppm游離甲醇，此果膠酯酶優(yōu)于更傳統(tǒng)的曲霉屬衍生的PE，該PE導致200ppm的游離甲醇形成。
如果草莓的果膠含量估計為0.6％，酯化度(DE)估計為70％，可以計算，傳統(tǒng)PE產(chǎn)物的最終DE為52，而Meripulus giganteus-PE的DE為38。
酯化度對原位膠凝的果醬的質(zhì)地特征具有重要性，對其它PE修飾的蔬菜產(chǎn)品也是重要的。酯化度決定可形成的Ca-橋的數(shù)量，因此，與凝膠強度有關(guān)，或與某種產(chǎn)物的粘度有關(guān)。
因此，明顯的是Meripulus giganteus衍生的酶在構(gòu)造強而有用的凝膠中是一個有用的工具。這種酶也可能作為一種比傳統(tǒng)的曲霉屬衍生的PE產(chǎn)物對提取的果膠的化學修飾更強的替代品。序列表SEQ ID No.1顯示了包含在轉(zhuǎn)化進保藏的大腸桿菌DSM 10357中的DNA構(gòu)建體中的全長cDNA序列的DNA序列。
序列表(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1128個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅳ)原始來源(A)有機體Meripilus giganteus(B)菌株CBS 521.95(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置4..933(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AGA ATG CAG TCC CAC TTG TTC TTG CTG TTC TCT TAC CTC ATC GCC TGT 48Met Gln Ser His Leu Phe Leu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile Ala Cys1 5 10 15GCG TCT GCG CTC AGC AGT CCG CCT GCA GGC GCA ATC ACC GTC GGC TCC 96Ala Ser Ala Leu Ser Ser Pro Pro Ala Gly Ala Ile Thr Val Gly Ser20 25 30GGT GGC AAG TAT TCA ACG TTG TCC GCA GCC CTC AAG GAC ACG TCG AGC 144Gly Gly Lys Tyr Ser Thr Leu Ser Ala Ala Leu Lys Asp Thr Ser Ser35 40 45TCC GTC TAC TTC GTG TTC TCC GGG ACA TAC ACG GAC ACC GCG ATT ATT 192Ser Val Tyr Phe Val Phe Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Thr Ala Ile Ile50 55 60ACT CGG CCG AAC GTG AAG GTG TAC GGG CAG ACG AAC ACA CCG TCG TCC 240Thr Arg Pro Asn Val Lys Val Tyr Gly Gln Thr Asn Thr Pro Ser Ser65 70 75TAT ACC GGC AAT ACT GTC ACC ATC ACC AAT AAC ATT CCG GCC TCC AAG 288Tyr Thr Gly Asn Thr Val Thr Ile Thr Asn Asn Ile Pro Ala Ser Lys80 85 90 95GCG GGC TCC AAT GAT GCG AGC GGG ACG GTG CAA GTG CAC GCC GAG AAC 336Ala Gly Ser Asn Asp Ala Ser Gly Thr Val Gln Val His Ala Glu Asn100 105 110GTG TCA CTC TAC AAC CTA AAC ATC GCG AAC ACG TAC GGC AAG ACA GTC 384Val Ser Leu Tyr Asn Leu Asn Ile Ala Asn Thr Tyr Gly Lys Thr Val115 120 125GAC CAG GCG CAA GCG ATC GCA CTG AGC GTG CAG GCG GGC CAG TTC GGC 432Asp Gln Ala Gln Ala Ile Ala Leu Ser Val Gln Ala Gly Gln Phe Gly130 135 140GCA TAC GGA CTC AAG ATT ACG GGG GAC CAG GAC ACC CTC CTA GCT AAC 480Ala Tyr Gly Leu Lys Ile Thr Gly Asp Gln Asp Thr Leu Leu Ala Asn145 150 155GTC GGC GCG CAA TAC TAT GCG AAC AGC TGG ATA GAA GGC GCT GTG GAC 528Val Gly Ala Gln Tyr Tyr Ala Asn Ser Trp Ile Glu Gly Ala Val Asp160 165 170 175TTC ATA TTC GGG ATG CAA GCC TCG ATC TGG ATC ACC CGC TCG GTC ATC 576Phe Ile Phe Gly Met Gln Ala Ser Ile Trp Ile Thr Arg Ser Val Ile180 185 190AAC ACG ATC GGG AGC GGG TGC ATC ACC GCG TCG GGG CGC TCG AGT AAC 624Asn Thr Ile Gly Ser Gly Cys Ile Thr Ala Ser Gly Arg Ser Ser Asn195 200 205GAC GGC TTC TGG TAT GTC ATC GAC AGC TCG ACC GTG CAG GGC ACC GGG 672Asp Gly Phe Trp Tyr Val Ile Asp Ser Ser Thr Val Gln Gly Thr Gly210 215 220ACG GCG TAC CTC GGG CGC CCC TGG CGC GAC TAC GCG CGC GTC GTG TTC720Thr Ala Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Arg Asp Tyr Ala Arg Val Val Phe225 230 235CAG AAG AGC ACG CTC GGG AGC AAC GTG CCC GCG GCC GGC TGG TCG ATT768Gln Lys Ser Thr Leu Gly Ser Asn Val Pro Ala Ala Gly Trp Ser Ile240 245 250 255TGG AAC GTC GGC ACC CCG CAG ACC GAC CAT GTC ACG TTC GCC GAG TAC816Trp Asn Val Gly Thr Pro Gln Thr Asp His Val Thr Phe Ala Glu Tyr260 265 270GGG AAC ACC GGC CCC GGC GCG TCC GGC ACG CGC GCG AGC TTC AGC ACG864Gly Asn Thr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Thr Arg Ala Ser Phe Ser Thr275 280 285AAG CTG TCC GCG CCG GTC GCG ATC AAG ACG GTG CTG AAC TCG ACG AGC912Lys Leu Ser Ala Pro Val Ala Ile Lys Thr Val Leu Asn Ser Thr Ser290 295 300TGG ATC GAC CCC GCC TTC CTC TGACCCCGCC GACGGCAACG ACAAACGAGA 963Trp Ile Asp Pro Ala Phe Leu305 310GAGAGCGAGG GCAGCAGAGG GACGAGTGCC GAGTGCCGGT GCGGCTGAGG GCTATGACGT 1023CGATCGATGG TCGGCTTGAC GTCGTTGTAC ACGTACGGAT GCAGTCATCG AACGTTCGGT 1083TGCGACTTGC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1128(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度310個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Gln Ser His Leu Phe Leu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile Ala Cys Ala1 5 10 15Ser Ala Leu Ser Ser Pro Pro Ala Gly Ala Ile Thr Val Gly Ser Gly20 25 30Gly Lys Tyr Ser Thr Leu Ser Ala Ala Leu Lys Asp Thr Ser Ser Ser35 40 45Val Tyr Phe Val Phe Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Thr Ala Ile Ile Thr50 55 60Arg Pro Asn Val Lys Val Tyr Gly Gln Thr Asn Thr Pro Ser Ser Tyr65 70 75 80Thr Gly Asn Thr Val Thr Ile Thr Asn Asn Ile Pro Ala Ser Lys Ala85 90 95Gly Ser Asn Asp Ala Sar Gly Thr Val Gln Val His Ala Glu Asn Val100 105 110Ser Leu Tyr Asn Leu Asn Ile Ala Asn Thr Tyr Gly Lys Thr Val Asp115 120 125Gln Ala Gln Ala Ile Ala Leu Ser Val Gln Ala Gly Gln Phe Gly Ala130 135 140Tyr Gly Leu Lys Ile Thr Gly Asp Gln Asp Thr Leu Leu Ala Asn Val145 150 155 160Gly Ala Gln Tyr Tyr Ala Asn Ser Trp Ile Glu Gly Ala Val Asp Phe165 170 175Ile Phe Gly Met Gln Ala Ser Ile Trp Ile Thr Arg Ser Val Ile Asn180 185 190Thr Ile Gly Ser Gly Cys Ile Thr Ala Ser Gly Arg Ser Ser Asn Asp195 200 205Gly Phe Trp Tyr Val Ile Asp Ser Ser Thr Val Gln Gly Thr Gly Thr210 215 220Ala Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Arg Asp Tyr Ala Arg Val Val Phe Gln225 230 235 240Lys Ser Thr Leu Gly Ser Asn Val Pro Ala Ala Gly Trp Ser Ile Trp245 250 255Asn Val Gly Thr Pro Gln Thr Asp His Val Thr Phe Ala Glu Tyr Gly260 265 270Asn Thr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Thr Arg Ala Ser Phe Ser Thr Lys275 280 285Leu Ser Ala Pro Val Ala Ile Lys Thr Val Leu Asn Ser Thr Ser Trp290 295 300Ile Asp Pro Ala Phe Leu305 310
權(quán)利要求
1．一種DNA構(gòu)建體，此構(gòu)建體包含編碼顯示果膠酯酶活性的酶的DNA序列，其中所說的DNA序列包含a)克隆進存在于大腸桿菌DSM 10357中的質(zhì)粒pYES 2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分，或b)a)中限定的DNA序列的類似序列，該序列ⅰ)與a)中限定的DNA序列至少60％是同源的，或ⅱ)與SEQ ID NO:1中位置4-933中顯示的DNA序列在低嚴格性下雜交，或ⅲ)編碼一種多肽，該多肽與由包含a)中限定的DNA序列的DNA序列編碼的多肽至少50％是同源的，或ⅳ)編碼一種多肽，該多肽與針對由a)中限定的DNA序列編碼的純化的果膠酯酶產(chǎn)生的抗體是免疫反應性的。
2．按照權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所說的編碼顯示果膠酯酶活性的酶的DNA序列可得自微生物，優(yōu)選地，得自絲狀真菌、酵母或細菌。
3．按照權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體，其中所說的DNA序列可得自擔子菌綱的菌株，優(yōu)選地得自層菌綱的菌株，更優(yōu)選地得自非褶菌目的菌株，更優(yōu)選地得自多孔菌科的菌株，如Meripilus屬，尤其Meripilusgiganteus菌株。
4．按照權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中所說的DNA序列從菌株Meripilus giganteusCBS 521.95的DNA文庫分離或基于它產(chǎn)生。
5．按照權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體，其中所說的DNA序列可得自曲霉屬、酵母屬、擬桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬或梭菌屬的菌株。
6．按照權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所說的DNA序列是從大腸桿菌DSM 10357中分離的。
7．一種重組表達載體，該載體包含按照權(quán)利要求1-6之任一的DNA構(gòu)建體。
8．一種細胞，該細胞包含按照權(quán)利要求1-6之任一的DNA構(gòu)建體或按照權(quán)利要求7的重組表達載體。
9．按照權(quán)利要求8的細胞，此細胞是真核細胞，尤其是真菌細胞，如酵母細胞或絲狀真菌細胞。
10．按照權(quán)利要求9的細胞，該細胞是鐮孢屬或曲霉屬或木霉屬的菌株，特別是禾谷鐮孢、櫻桃鐮孢(Fusarium cerealis)、黑曲霉、米曲霉、Trichoderma harzianum或Trichoderma reesei的菌株。
11．按照權(quán)利要求9的細胞，該細胞是Meripilus sp.的菌株，特別是Meripilus giganteus的菌株。
12．按照權(quán)利要求11的細胞，該細胞是菌株Meripilus giganteus CBSNo.521.95。
13．按照權(quán)利要求9的細胞，該細胞是酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母的菌株。
14．一種產(chǎn)生顯示果膠酯酶活性的酶的方法，此方法包括在允許該酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)按照權(quán)利要求8-13之任一的細胞，并從培養(yǎng)物回收該酶。
15．一種顯示果膠酯酶活性的酶，此酶(a)由按照權(quán)利要求1-6之任一的DNA構(gòu)建體或按照權(quán)利要求7的重組表達載體編碼，或(b)由按照權(quán)利要求14的方法產(chǎn)生，和/或(c)與一種抗體是免疫反應性的，該抗體是針對純化的果膠酯酶產(chǎn)生的，同時，該果膠酯酶由克隆進大腸桿菌DSM 10357中存在的質(zhì)粒pYES2.0中的DNA序列的果膠酯酶編碼部分編碼。
16．按照權(quán)利要求15的酶，此酶具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。
17．一種組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求15或16的酶。
18．一種酶組合物，該組合物富含按照權(quán)利要求15或16的顯示果膠酯酶活性的酶。
19．按照權(quán)利要求18的組合物，此組合物還包含α-阿拉伯糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、阿聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、果膠乙酰酯酶、半乳聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂合酶、果膠酸酯裂合酶或果膠甲基酯酶。
20．按照權(quán)利要求15或16的酶或按照權(quán)利要求17-19之任一的酶組合物在改進包含果膠物質(zhì)的硬度上的用途。
21．按照權(quán)利要求15或16的酶或按照權(quán)利要求17-19之任一的酶組合物在改進包含果膠物質(zhì)的粘度上的用途。
22．按照權(quán)利要求20和21的用途，其中包含果膠的物質(zhì)是水果或蔬菜物質(zhì)。
23．按照權(quán)利要求15或16的酶或按照權(quán)利要求17-19之任一的酶組合物在果膠的脫甲基化上的用途。
24．按照權(quán)利要求15或16的酶或按照任何權(quán)利要求17-19之任一的酶組合物在飼料制備中的用途。
25．按照權(quán)利要求15或16的酶的用途，該酶與包含多聚半乳糖醛酸酶的酶制劑結(jié)合用于降低植物細胞壁來源的物質(zhì)的粘度。
26．按照任何權(quán)利要求15或16的酶或按照權(quán)利要求17-19之任一的酶組合物在酒或汁的生產(chǎn)中的用途。
27．保藏的大腸桿菌DSM 10357菌株的分離的實質(zhì)上純化的生物培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有果膠酯酶活性的酶、編碼具有果膠酯酶活性的酶的DNA構(gòu)建體、產(chǎn)生這種酶的方法、包含所說的具有果膠酯酶活性的酶的酶組合物及所說的酶和酶組合物在許多工業(yè)應用中的用途。
文檔編號A23L1/0524GK1212010SQ97192500
公開日1999年3月24日 申請日期1997年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月21日
發(fā)明者L·N·安德森, M·S·考普比能, G·布朵夫森 申請人:諾沃挪第克公司