專利名稱：樹的基因轉(zhuǎn)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過導(dǎo)入異源基因(即來自特定樹本身以外的其它途徑的基因)進(jìn)行的樹種的轉(zhuǎn)化。
將新基因?qū)胫参镂锓N已有許多論著，對(duì)于包括蕃茄、土豆、油菜和水稻在內(nèi)的許多一年生和常年生作物已成為常規(guī)作法。導(dǎo)入的基因已被用于修飾多種特定和一般性狀，包括，例如，蛋白質(zhì)和碳水化合物的品質(zhì)，采后生理學(xué)，光合能力以及抗蟲特性，在整株植物和植物特定部位均可表達(dá)。依照植物物種的天然特性，已發(fā)展起各種導(dǎo)入新基因的方法，包括DNA直接轉(zhuǎn)移(微注射，生物發(fā)射(biolistics)，微纖維法，化學(xué)穿孔，電擊)和用微生物根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行類天然感染。
迄今為止森林物種的基因轉(zhuǎn)化被標(biāo)記基因的使用極大地限制著，雖然在一些例子中已導(dǎo)入了包括影響昆蟲抗性，除草劑耐受性，創(chuàng)傷反應(yīng)和木質(zhì)化的基因的更為商業(yè)化的相關(guān)特性。
樹種的基因轉(zhuǎn)化存在著特殊問題(Jouanin等，1993)，其中之一是其組織自身的天然執(zhí)拗限制了對(duì)轉(zhuǎn)化的敏感性。許多樹在體外生長(zhǎng)不佳，包括體外幼苗系統(tǒng)的低繁殖率，以及芽和根的低再生力。另外，根據(jù)個(gè)體基因型樹通常比經(jīng)過培育的當(dāng)年生田間作物顯示出更廣范圍的體外行為。還有，對(duì)于基因轉(zhuǎn)化的敏感性存在著很大的種間和種內(nèi)的不同，一些樹還顯示出隨著生理年齡的增大敏感性明顯降低。能夠獲得新DNA對(duì)植物細(xì)胞的瞬間導(dǎo)入，但是DNA不能夠穩(wěn)定整合入植物基因組，導(dǎo)入基因的表達(dá)是短暫的。進(jìn)一步的問題是在轉(zhuǎn)化前，轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選期間和轉(zhuǎn)化的整株植物再生期間難以在培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行維持和增殖組織。組織的健康和存活亦對(duì)轉(zhuǎn)化和以上描述的整合有關(guān)系并與本發(fā)明目的相關(guān)。
獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的最通常運(yùn)用的方法是通過修飾的農(nóng)桿菌。許多樹種對(duì)野生型根癌農(nóng)桿菌的感染敏感但用另外基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化僅在少數(shù)品種中獲得，如Brackpool等1990；DeBlock,1990和McGranahan等，1990。成功僅限制于這些物種的特定基因型，主要是那些易于轉(zhuǎn)化和繁殖的基因型。
使用的方法通常需要一系列步驟，例如ⅰ)從植物組織上切下靶下植體，例如，葉盤，根塊，莖段，胚軸，子葉，胚或細(xì)胞懸浮物，ⅱ)外植體在適合的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)或數(shù)天時(shí)間，ⅲ)外植體與含DNA載體的細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)以通過切傷的植物細(xì)胞進(jìn)行感染，ⅳ)轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基以a)阻止殘留細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)，以及b)篩選已被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并ⅴ)一個(gè)或更多轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基使其從外植體來源的愈傷組織開始再生為完整的植株。
基本方法包括使組織外植體受到切割導(dǎo)致物理性創(chuàng)傷、與細(xì)菌共培養(yǎng)、置于化學(xué)選擇劑，每個(gè)步驟均施加嚴(yán)重壓力于轉(zhuǎn)化細(xì)胞和組織，通常會(huì)對(duì)組織所擁有的菌再生能力產(chǎn)生負(fù)面影響。如果排除使用與健康性，存活力及再生能力相關(guān)的分離的組織外植體的必要性，這些處理步驟的影響將會(huì)減小。
特別地在樹作物中，以下的改良種質(zhì)的有性或無性繁殖是一項(xiàng)已成熟的操作，這種繁殖能力在改良材料中為了克隆造林(forestry)的目的作為一個(gè)重要特性而被保持。產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的過程不應(yīng)當(dāng)排除通過以下任何產(chǎn)生本來可以正常繁殖的轉(zhuǎn)化物種的繁殖方法。
本發(fā)明的目的為提供一個(gè)對(duì)植物組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞僅引起微小壓力的樹的轉(zhuǎn)化方法。
本發(fā)明也希望得到一個(gè)樹的轉(zhuǎn)化方法，在具有較高存活和好的再生能力的植物組織中運(yùn)用該方法，它們的性能有助于保證經(jīng)轉(zhuǎn)化或改良后的種質(zhì)的繁殖能力仍然保留。
進(jìn)一步的目標(biāo)是定靶于預(yù)定的苗生長(zhǎng)能力的層以最大限度地提高含有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的苗再生的可能性。
本發(fā)明提供了一種將任意DNA序列導(dǎo)入樹的方法。更具體地，此方法可運(yùn)用那些能夠影響表型特性，例如，造林學(xué)特性，木材，果實(shí)或葉子加工過程的質(zhì)量特性，或成熟樹木再生產(chǎn)的物候?qū)W的基因或DNA序列。所以，本發(fā)明將使通過克隆繁殖改良樹生產(chǎn)以及種籽園的有性生殖結(jié)果更好地控制成為可能。含有新基因的轉(zhuǎn)化樹的后代也可以進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，若需要，可以進(jìn)行逐漸提高的改良。
Ellis等，1992描述了一種針葉樹的轉(zhuǎn)化方法，它包括將野生型發(fā)根農(nóng)桿菌導(dǎo)入歐洲落葉松幼苗子葉節(jié)的切口。但是，這種方法僅產(chǎn)生了芽原基的腫瘤團(tuán)，并未得到再生的完整轉(zhuǎn)化植株。
本發(fā)明克服了腫瘤生長(zhǎng)的問題，并提供了適合轉(zhuǎn)化植物從至少一種迄今為止轉(zhuǎn)化困難且尚無公開報(bào)道其完整轉(zhuǎn)化植株的其它樹種再生的方法。
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化根類或其它類樹的轉(zhuǎn)化方法，此方法包括下列的步驟在芽能夠萌動(dòng)的位點(diǎn)引入切口，在切口處導(dǎo)入載有一個(gè)或多個(gè)外源DNA序列的卸甲(disarmed)農(nóng)桿菌細(xì)胞，以及一個(gè)篩選步驟，其中使此位點(diǎn)與含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生長(zhǎng)調(diào)控因子和篩選劑(轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)此具有抗性)的培養(yǎng)基相接觸一段時(shí)間以足以產(chǎn)生含有外源DNA序列的轉(zhuǎn)化苗。
優(yōu)選位于芽萌動(dòng)位點(diǎn)的切口形成一個(gè)裂縫。根據(jù)所處理的樹的大小，切口可以是大約1mm或更深。此處所用術(shù)語“樹”包括幼苗，苗(從剪枝或其它方式得到)以及剪枝，或更大的植株。
芽萌動(dòng)位點(diǎn)可以適當(dāng)?shù)厥且粋€(gè)子葉節(jié)，腋生分生組織或頂生分生組織。
當(dāng)被轉(zhuǎn)化的樹是一棵幼苗時(shí)，優(yōu)選芽萌動(dòng)位點(diǎn)是一個(gè)子葉節(jié)。優(yōu)選轉(zhuǎn)化樹苗的方法進(jìn)一步包括在導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞之前，之中或之后去除所有已存在的萌動(dòng)芽這一步驟。這種導(dǎo)入可已知為接種步驟。
當(dāng)被轉(zhuǎn)化的樹是一段樹苗時(shí)，優(yōu)選芽萌動(dòng)位點(diǎn)是一個(gè)腋生分生組織或頂生分生組織。在此特殊方法中沒必要在接種步驟之前、之中或之后去除已存在的分生組織的細(xì)胞。
優(yōu)選在篩選步驟之前使芽萌動(dòng)位點(diǎn)與含有營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)調(diào)控劑的培養(yǎng)基接觸一段時(shí)間。該步驟被稱為共培養(yǎng)步驟。當(dāng)在一棵幼苗中發(fā)現(xiàn)芽萌動(dòng)點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選共培養(yǎng)步驟用豎直的幼苗進(jìn)行。適合共培養(yǎng)步驟在試管中進(jìn)行。
優(yōu)選篩選步驟的培養(yǎng)基也含有抗生素以殺死農(nóng)桿菌菌株。
優(yōu)選樹最好表現(xiàn)為地上的生植物萌芽。更優(yōu)選此方法應(yīng)用于如桉屬、楊屬、蘋果屬和李屬，以及任何對(duì)根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌的感染敏感的樹種。這種方法尤其對(duì)轉(zhuǎn)化桉樹屬植物的某些種有用，例如藍(lán)桉，迄今為止它以難于成功地轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植株而出名。
優(yōu)選當(dāng)被感染和/或共培養(yǎng)時(shí)，樹具有完整的根系。
優(yōu)選樹是藍(lán)桉或巨桉。
本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)上述方法轉(zhuǎn)化的樹。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供了一種按以上方法轉(zhuǎn)化后載有基因的細(xì)胞。本發(fā)明亦提供了據(jù)此方法轉(zhuǎn)化后樹的繁殖體，根據(jù)此方法轉(zhuǎn)化后的樹的幼苗、根據(jù)此方法轉(zhuǎn)化后的樹的種籽，以及根據(jù)此方法轉(zhuǎn)化后的樹的種質(zhì)。
為使本發(fā)明易于理解和方便實(shí)施現(xiàn)將通過提供以下實(shí)施例參考。
藍(lán)桉幼苗的轉(zhuǎn)化按照以下程序進(jìn)行實(shí)施例1藍(lán)桉幼苗轉(zhuǎn)化的制備用含有次氯酸鈉和去污劑的家用漂白劑溶液對(duì)藍(lán)桉種籽進(jìn)行表面消毒。所用濃度和消毒時(shí)間長(zhǎng)短并不重要，通常將種籽在10％(v/v)家用漂白劑稀釋的無菌反滲透水中孵育，在軌道振蕩器上不斷攪拌。30分鐘后更新無菌液并進(jìn)行第二次60分鐘孵育。在第一次孵育期間，漂白液常變成很黑的顏色。最后，在干凈的無菌水中振搖種籽，按需要重復(fù)洗滌多次以去除氯的氣味以及殘留去污劑的泡沫。
將消毒后的種子撒置于Magenta培養(yǎng)皿中含5g/L蔗糖的0.4％無菌水瓊脂培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)基表面撒播的種籽間留有相當(dāng)?shù)目臻g，密度為每皿25顆種籽。將培養(yǎng)皿置于一個(gè)生長(zhǎng)箱中于20℃進(jìn)行16個(gè)小時(shí)日長(zhǎng)低光照，使種子萌發(fā)和生長(zhǎng)10天。在此期間絕大部分幼苗應(yīng)達(dá)到子葉充分伸展和胚芽剛剛露出的階段。
幼苗處于這樣的苗齡使它們能為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活和增殖提供一個(gè)茁壯的環(huán)境。幼苗也是足夠大小以便于操作。實(shí)施例2用于共培養(yǎng)的根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的制備共培養(yǎng)是由根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105載有編碼β-葡糖苷酸酶(GUS)基因和對(duì)卡那霉素形成抗性的NPTⅡ基因的質(zhì)粒p35S-GUSint進(jìn)行的。用此質(zhì)粒載體對(duì)藍(lán)桉組織的轉(zhuǎn)化會(huì)產(chǎn)生這兩種標(biāo)記基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)，因此，使得在含有卡那霉素時(shí)生長(zhǎng)表現(xiàn)健康的含有單獨(dú)或大部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞的組織得到篩選，通過加有發(fā)色性底物X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸)上由β-葡萄糖苷酸酶催化的反應(yīng)進(jìn)行這些特定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定。用一些細(xì)菌培養(yǎng)物接種50ml含有50mg/L卡那霉素的L-肉湯培養(yǎng)基制備細(xì)胞。在28℃過夜生長(zhǎng)后離心收集細(xì)胞并在使用前重懸于10ml 1％葡萄糖中。
L-肉湯10g/L細(xì)菌胰蛋白胨(bactotryptone)5g/L酵母提取物5g/L氧化鈉實(shí)施例3藍(lán)桉和根癌農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)在無菌條件下由實(shí)施例1的方法制備的萌發(fā)幼苗中取樣與含有轉(zhuǎn)化栽體的細(xì)菌共培養(yǎng)。為決定藍(lán)桉轉(zhuǎn)化的最適共培養(yǎng)方法，對(duì)用實(shí)施例2中的方法制備的根癌農(nóng)桿菌感染的三種不同方法作為評(píng)價(jià)。方法1．將幼苗沿胚軸從近中部切開并棄去下部及根。用解剖刀尖切去胚芽，去除葉柄。切下的胚軸水平放置于培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基1上。由一個(gè)一次性滴管中將細(xì)菌懸液滴到水平的胚軸上使農(nóng)桿菌接種組織。方法2．沿胚軸從接近中部切割幼苗并棄去下部和根。胚芽用解剖刀尖剔去。用解剖刀垂直地從子葉節(jié)到每個(gè)胚軸的頂部切割一個(gè)1mm深的裂縫。在每次切割之前即刻將解剖刀片浸沒于細(xì)菌懸液中以同時(shí)完成農(nóng)桿菌細(xì)胞的接種。然后將接種后的每一胚軸的底部豎立插入培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基1中。每皿放置20個(gè)胚軸。方法3．用解剖刀尖從幼苗上切下胚芽，但保留根系完整的幼苗。用解剖刀垂直地從子葉節(jié)到每個(gè)胚軸的頂部切割一個(gè)1mm深的裂縫。在每次切割之前將解剖刀片即刻浸沒于細(xì)菌懸液中以同時(shí)完成農(nóng)桿菌細(xì)胞的接種。接種后的去胚芽幼苗被轉(zhuǎn)至直徑25mm的另外試管中并將其根系垂直插入20ml培養(yǎng)基2中。
用方法1和3制備了100棵幼苗，并用方法2制備了200棵幼苗。
在24℃日長(zhǎng)16小時(shí)的低光照下繼續(xù)共培養(yǎng)10天。之后，將由方法2和方法3制備的外植體從各自的培養(yǎng)皿或試管中取出并接受進(jìn)一步操作。
從胚軸切下以方法2制備的子葉葉片，從方法3制備的幼苗中取出的子葉葉片，根以及胚軸下半部分。
以三種方式處理后的任意外植體的腋生芽也均去除。將三種方法中切削的胚軸水平放置于含有抗生素凱福隆(頭孢噻肟)以去除殘留的農(nóng)桿菌細(xì)胞并含有卡那霉素以篩選表達(dá)NPTⅡ基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的選擇培養(yǎng)基1上。每平皿放置20個(gè)切割后的胚軸。10天后將它們轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基2，再過4星期后再轉(zhuǎn)至含相同培養(yǎng)基的新鮮皿中。在日長(zhǎng)16小時(shí)的低光照下24℃進(jìn)行共培養(yǎng)。
再過四個(gè)星期，將那些變綠(原色的)的外植物體轉(zhuǎn)至含相同培養(yǎng)基的新皿中。將篩選到的組織進(jìn)一步按一定的間隔轉(zhuǎn)到新鮮盤上加以維持。
結(jié)果
從藍(lán)桉的轉(zhuǎn)化中僅得到了少數(shù)量的再生體，從與培養(yǎng)基水平接觸進(jìn)行共培養(yǎng)的切割胚軸未獲得再生體(方法1)，且組織的健康狀況很快下降。從方法2和3均獲得了再生體。存活數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減少可能表明一些由非轉(zhuǎn)化細(xì)胞(經(jīng)不起卡那霉素的篩選)形成的再生位點(diǎn)。以方法2制備和共培養(yǎng)的組織的再生率稍微低于以方法3制備的組織的再生率。
方法3的特點(diǎn)是組織傷口微小但精確，根與胚軸間的維管系統(tǒng)保留，胚軸與含有外源生長(zhǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基輕微直接接觸，以及細(xì)菌細(xì)胞接種精確，細(xì)菌較少過量生長(zhǎng)。方法3被選作轉(zhuǎn)化藍(lán)桉組織的方法。實(shí)施例4．轉(zhuǎn)化方法修改和轉(zhuǎn)基因表達(dá)按實(shí)施例1和2制備藍(lán)桉幼苗和農(nóng)桿菌懸浮液。對(duì)實(shí)施例3的最佳接種法3種修改評(píng)估如下1．去頭和裂縫(即去除全部子葉節(jié)和子葉)2．去胚芽和裂縫(如實(shí)施例3，方法3)
3．去胚芽和刻痕(用解剖刀片沿胚軸在其長(zhǎng)度部分表面刻痕)。
另外，也對(duì)三種修改進(jìn)行調(diào)查4．去胚芽和用皮下注射針戳5．去胚芽，刻痕并用鑷子壓碎頂端6．去胚芽并壓碎接種后，將所有幼苗均轉(zhuǎn)植于含培養(yǎng)基3的單獨(dú)試管中，并置于生長(zhǎng)室的暗架上進(jìn)行共培養(yǎng)。
三周后，經(jīng)三種主要方式處理的幼苗抽樣用x-gluc按下述做β-葡萄糖苷酸酶活性(GUS+)檢測(cè)。將溶解于100ml二甲基甲酰胺中的3mg x-gluc用含0.5％Triton x 100和1mM EDTA的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)補(bǔ)足成10ml。將抽樣組織于黑暗中37℃培育在小體積這種試劑中達(dá)16小時(shí)。之后于室溫在異丙醇中培育脫色4小時(shí)至數(shù)天。β-葡萄糖苷酸酶活性由組織出現(xiàn)藍(lán)色區(qū)而被檢測(cè)得到。
僅一周后在抽樣幼苗上也進(jìn)行了x-gluc檢測(cè)。從六種方法選出的大部分樣品顯示了GUS活性。
在實(shí)施例3中選出的方法，在此例中是處理2，具有最高存活率和最大的轉(zhuǎn)化或大多數(shù)的持續(xù)反應(yīng)。這是外源基因穩(wěn)定，而非瞬時(shí)表達(dá)的表現(xiàn)。
在所有處理中大概是區(qū)別出轉(zhuǎn)化細(xì)胞的主要的染藍(lán)部分均分布在裂縫周圍。在處理1中，是形成獨(dú)立細(xì)胞的不連續(xù)的點(diǎn)，而在處理2中較大的染色更深的蘭色區(qū)域更加顯著，顯示著從這些區(qū)域再生的苗將會(huì)長(zhǎng)成轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)刻痕的胚軸的轉(zhuǎn)化一般較那些在頂剖有切縫的為差。
為作進(jìn)一步比較，對(duì)切割胚軸的轉(zhuǎn)化方法(實(shí)施例3，方法1)還做了一些細(xì)致的改進(jìn)。改進(jìn)包括用解剖刀刻痕胚軸以產(chǎn)生多個(gè)不同長(zhǎng)度的傷口，也用滅菌的淺刷在胚軸組織上刺孔。所有這些處理均未產(chǎn)生成功的轉(zhuǎn)化株的再生。實(shí)施例5．表達(dá)轉(zhuǎn)基因苗的再生按實(shí)施例3中描述的方法制備和共培養(yǎng)了120棵幼苗。在共培養(yǎng)階段后，隨機(jī)選了16個(gè)胚軸進(jìn)行x-gluc檢測(cè)。其余胚軸留做篩選和再生。去除胚軸的下半部分和根以及子葉葉片和所有已萌發(fā)的子葉腋部。將胚軸的剩余部分以每皿10個(gè)的密度水平置于皿中。用封口膜封住皿并置于生長(zhǎng)室的暗架上。四周后將胚軸轉(zhuǎn)至含相同培養(yǎng)基的新皿中，并檢查綠色愈傷組織的生長(zhǎng)。然后將所有綠色愈傷組織轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基3，并將那些看起來接近芽分化的轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基4。
在16個(gè)進(jìn)行x-gluc檢測(cè)的胚軸樣品中，除一例外均顯示了藍(lán)染區(qū)域。
一周后，所有胚軸外植體均看起來完全變白且觀察不到一個(gè)子葉腋芽。四周后在選擇培養(yǎng)基上，100個(gè)胚軸中有8個(gè)表現(xiàn)出很深綠色的愈傷組織和健康外觀，另有10個(gè)具有中等綠色的俞傷組織。將13個(gè)愈傷組織轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基3并將5個(gè)轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基4。
轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基4后，4個(gè)愈傷組織再生出芽，又過六周后經(jīng)x-gluc檢測(cè)它們?yōu)镚US+。
本發(fā)明對(duì)所用的DNA序列或結(jié)合序列未作限制，所以可被用于導(dǎo)入任意范圍如前所述的特性。本發(fā)明亦可用于同代或早先已被轉(zhuǎn)化過的材料。
對(duì)以上幼苗法的另一個(gè)替代法是可將在體外培養(yǎng)的樹苗的芽萌發(fā)位點(diǎn)，如腋生分生組織或頂生分生組織，用相同方式進(jìn)行切割分生組織區(qū)域的處理并用經(jīng)基因改造的農(nóng)桿菌菌株感染。一段時(shí)間以后轉(zhuǎn)化細(xì)胞可被分離作為外植體并培養(yǎng)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植株。
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附錄所用培養(yǎng)基-均基于全強(qiáng)度Linsmaier和Skoog(1965)的培養(yǎng)基，使用半強(qiáng)度培養(yǎng)基2和使用四分之一強(qiáng)度的培養(yǎng)基3除外。培養(yǎng)基含有以下添加物培養(yǎng)基1 15g/L 葡萄糖10μM 玉米素5μM 吲哚基-3-乙酸0.01％pluronic F-684g/L 瓊脂培養(yǎng)基2 10g/L 蔗糖4g/L 瓊脂培養(yǎng)基3 10g/L 蔗糖4g/L 瓊脂1g/L 活性炭選擇培養(yǎng)基1 15g/L 葡萄糖10μM 玉米素5μM 吲哚基-3-乙酸250mg/L 凱福隆30mg/L 卡那霉素7g/L 瓊脂選擇培養(yǎng)基2 15g/L葡萄糖4μM 玉米素1μM 吲哚基-3-乙酸
250mg/L 凱福隆35mg/L 卡那霉素7g/L 瓊脂選擇培養(yǎng)基34μM 玉米素2μM 吲哚基-3-乙酸250mg/L 凱福隆30mg/L 卡那霉素7g/L 瓊脂選擇培養(yǎng)基42μM 6-芐基氨基嘌呤1μM 吲哚基-3-乙酸250mg/L 凱福隆30mg/L 卡那霉素7g/L 瓊脂
權(quán)利要求
1．一種轉(zhuǎn)化具根樹或其它的方法，所述方法包括的步驟有在能夠芽萌發(fā)的部位引入切口，將載有一個(gè)或多個(gè)外源DNA序列的御甲(disarmed)農(nóng)桿菌細(xì)胞導(dǎo)入此切口，進(jìn)行篩選步驟，在此步驟使所述位點(diǎn)與含有營(yíng)養(yǎng)物、生長(zhǎng)調(diào)控劑及選擇劑的培養(yǎng)基相接觸，細(xì)胞對(duì)此選擇劑是抗性的，一段時(shí)間足以產(chǎn)生含有外源DNA序列的轉(zhuǎn)化苗。
2．按權(quán)利要求1的方法，其中所述的切口在芽萌發(fā)位點(diǎn)形成一切縫。
3．按權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的切口大約1mm深或更深。
4．按權(quán)利要求1,2或3的方法，所述的能夠芽萌發(fā)的位點(diǎn)是一個(gè)子葉節(jié)、腋生分生組織或頂生分生組織。
5．按照權(quán)利要求4的方法，當(dāng)被轉(zhuǎn)化的樹是一棵幼苗時(shí)，芽萌動(dòng)位點(diǎn)是一個(gè)子葉節(jié)。
6．按照權(quán)利要求5的方法，在導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞之前，之中或之后除去所有現(xiàn)存的(perexisting)萌動(dòng)芽。
7．按照權(quán)利要求4的方法，當(dāng)被轉(zhuǎn)化的樹是一段樹苗，芽萌動(dòng)位點(diǎn)是腋生分生組織或頂生分生組織。
8．按照權(quán)利要求5的方法，共培養(yǎng)步驟采用豎直的幼苗。
9．按照前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，當(dāng)被感染(injected)和/或培養(yǎng)時(shí)樹具有完整的根系。
10．按照前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，篩選步驟的培養(yǎng)基也包含抗生素以殺死農(nóng)桿菌菌株。
11．按照前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，可應(yīng)用于任何一種或多種桉屬、楊屬、蘋果屬和李屬的樹以及任何一種對(duì)根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌的感染敏感的樹種的樹。
12．按照前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)的方法，其中所述樹是藍(lán)桉或巨桉。
13．按照權(quán)利要求1至12中的任何一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的樹。
14．按照權(quán)利要求1至12中的任何一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的載有基因的細(xì)胞。
15．按照權(quán)利要求1至12中的任何一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的樹的繁殖體。
16．按照權(quán)利要求1至12中的任何一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的樹的幼苗。
17．按照權(quán)利要求1至12中的任何一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的樹的種籽。
18．按照權(quán)利要求1至12中的任何一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的樹的種質(zhì)。
19．主要以以上所描述的實(shí)施例為參照進(jìn)行樹轉(zhuǎn)化的方法。
全文摘要
本發(fā)明是樹轉(zhuǎn)化中的一項(xiàng)改進(jìn),提供了對(duì)所轉(zhuǎn)化的樹產(chǎn)生較小壓力的方法。以困難而著名的樹如藍(lán)桉能夠被成功轉(zhuǎn)化。在能夠芽萌發(fā)的位點(diǎn)引入切口,將載有一個(gè)或更多個(gè)外源DNA序列的御甲(disarmed)農(nóng)桿菌細(xì)胞導(dǎo)入切口并使所述位點(diǎn)經(jīng)歷一段時(shí)間的篩選步驟使其足以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化苗。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1213404SQ97192880
公開日1999年4月7日 申請(qǐng)日期1997年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月13日
發(fā)明者M·J·毛恩德爾斯, P·里查德森 申請(qǐng)人:先進(jìn)技術(shù)(劍橋)有限公司