專利名稱：降鈣素片段的重組制備方法和其在制備降鈣素和相關(guān)類似物中的用途的制作方法
人們已知降鈣素和相關(guān)類似物(如Elcatonin)是可以用于治療骨萎縮(參見，例如美國專利4,086,221)的多肽。天然存在的降鈣素(如鰻魚、鮭魚或者人體降鈣素)是C末端酰胺化的多肽，該多肽由32個(gè)氨基酸組成，在每一種情況中其第一和第七個(gè)氨基酸是L-半胱氨酸，兩個(gè)半胱氨酸的巰基通過二硫鍵的形成來相互連接。可以例如通過從哺乳動(dòng)物甲狀腺中提取獲得天然降鈣素(參見，例如美國專利5,428,129)。
Elcatonin是一種改進(jìn)的合成降鈣素“碳”類似物，其活性可與鰻魚降鈣素相比(Morikawa等，Experienta,32,1004,1976)。與鰻魚降鈣素相比，Elcatonin缺乏氨基末端，并且鰻魚降鈣素的二硫鍵為-(CH2)5-“碳橋”所取代。
當(dāng)前，利用純化學(xué)過程制備Elcatonin的各種方法是已知的。這些化學(xué)方法包括相應(yīng)的氨基酸或者肽的縮合(參見，例如美國專利4,086,221和美國專利5,428,129)。然而純化學(xué)方法都有其缺點(diǎn)，即由于所要求的精細(xì)純化方法，只能以低產(chǎn)率獲得Elcatonin，隨之而來的是它的制備十分昂貴。
因此，在通過利用某一方法制備Elcatonin的過程中能夠避免純化學(xué)方法的不利之處將是有益的，這些方法包括分子部分的重組制備。這一目的是可以實(shí)現(xiàn)的，例如，如果有一種用于重組制備C末端多肽片段的簡單方法。然后可以將重組合成的C末端片段用作為制備降鈣素或者碳類似物(如Elcatonin)的起始肽。部分重組方法也將有利于降鈣素的肽類/肽類似物、Elcatonin和相關(guān)類似物或者衍生物的合成，這些衍生物可能包括非天然的氨基酸。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及降鈣素片段的重組制備方法和該片段在制備降鈣素和相關(guān)類似物中的用途，該相關(guān)類似物包括如Elcatonin的碳類似物(在下文稱作為“降鈣素碳類似物”)。本發(fā)明包括重組形成融合蛋白，該融合蛋白包括通過切割位點(diǎn)連接到碳酸酐酶上的靶序列。該靶序列包括至少大約15個(gè)氨基酸殘基，該殘基對應(yīng)于接近降鈣素C-末端的片段或者對應(yīng)于這種片段的密切相關(guān)類似物。典型地，靶序列包括對應(yīng)于降鈣素或者密切相關(guān)類似物的氨基酸殘基10直至32(在下文共同稱作為“10-32片段”)的氨基酸序列。其后用切割試劑切割重組形成的融合蛋白以產(chǎn)生包括靶序列的多肽。通過使融合蛋白與化學(xué)切割試劑或者酶促切割試劑接觸來實(shí)現(xiàn)切割反應(yīng)。合適切割試劑和摻入融合蛋白中的相應(yīng)切割位點(diǎn)的選擇都將取決于存在于融合蛋白中的具體的靶序列和碳酸酐酶序列。典型地，可這樣選擇切割試劑以及切割位點(diǎn)，其中構(gòu)成切割位點(diǎn)的氨基酸序列并不出現(xiàn)在靶序列或者碳酸酐酶的氨基酸序列之中。例如，不能對包括豬、?；蛘哐蚪碘}素10-32片段的融合蛋白在蛋氨酸上進(jìn)行溴化氰切割。
切割位點(diǎn)典型地存在于連接碳酸酐酶和靶序列的接頭序列中。此外，融合蛋白可以包括一種構(gòu)建體，其中碳酸酐酶的C-末端直接與靶序列的N-末端連接。這可以發(fā)生在碳酸酐酶的C末端殘基和靶序列的N末端殘基構(gòu)成切割位點(diǎn)(其使得可以進(jìn)行上述兩片段之間的肽鍵的切割)的情況下。除存在于接頭序列中的切割位點(diǎn)之外，融合蛋白的碳酸酐酶部分也可以包括不同的切割位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)使得融合蛋白可以被切割從而形成“微型融合蛋白質(zhì)”，即具有仍然與靶序列連接的碳酸酐酶的C末端部分的一種多肽。
本發(fā)明的一種實(shí)施方案包括一種用于多肽的重組制備的方法，該多肽對應(yīng)于降鈣素或者相關(guān)類似物的氨基酸10-32(“10-32個(gè)片段”)。該方法典型地包括下式的多肽片段(“10-32片段-Xxx”)的重組制備A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者M(jìn)et,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala。C-末端-Xxx基團(tuán)典型地是C末端羧酸(“-OH”)，C末端甲酰胺(“-NH2”)，或者能轉(zhuǎn)化成C末端甲酰胺的基團(tuán)，如氨基酸殘基或者多肽基團(tuán)(典型地，具有2至大約10個(gè)氨基酸殘基)。由殘基A10至A32(SEQ IDNO:2)表示的10-32片段相應(yīng)于得自鰻魚(SEQ ID NO:37)，鮭魚Ⅰ(SEQ IDNO:38)、鮭魚Ⅱ(SEQ ID NO:39)、鮭魚Ⅲ(SEQ ID NO:40)，小雞(SEQID NO:41)、人(SEQ ID NO:42)、兔(SEQ ID NO:43)、豬(SEQ IDNO:44)、牛(SEQ ID NO:45)和羊(SEQ ID NO:46)降鈣素或者密切相關(guān)類似物(參見顯示在圖9中的降鈣素序列)的氨基酸序列的殘基10直至32。本方法也用來重組產(chǎn)生與修飾的降鈣素序列相應(yīng)的10-32片段。修飾的降鈣素序列可以包括一個(gè)或多個(gè)在天然氨基酸序列中的保守氨基酸取代。
10-32片段可以用于降鈣素和相關(guān)類似物的制備。這種制備典型地包括下式的N末端片段
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,Aa是Val或者M(jìn)et,R2是(CH2)4或者-CH(NH2)CH2S-S-，以及Y是OH、OR1，其中-R1是低級烷基；與重組形成的具有下式的多肽在非酶促聯(lián)試劑的存在下縮合A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者M(jìn)et,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala,以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸殘基或者多肽基團(tuán)；形成具有下式的降鈣素衍生物
A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:48)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用脫氨九肽縮合重組形成的10-32片段。脫氨九肽是N末端降鈣素片段的碳類似物并且典型地具有式
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,A8是Val或者M(jìn)et，以及Y是OH、OR1，其中-R1是低級烷基(即C1-C6烷基)。利用如在美國專利4,086,221和美國專利5,428,129所描述的那些化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)縮合反應(yīng)，這些專利的公開內(nèi)容并入本文作為參考。化學(xué)偶聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。合適的化學(xué)偶聯(lián)劑包括碳二亞胺和各種其它非酶促試劑，這些非酶促試劑能夠與肽的α-羧酸基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)從而形成活化的羧酸衍生的α-羧酸衍生物，該α-羧酸衍生物與另一個(gè)氨基酸或者多肽的N末端α-氨基反應(yīng)。其中使脫氨九肽的C末端α-羧酸轉(zhuǎn)化成為?；B氮、混合酸酐、咪唑酰胺或者活性酯的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)可以用于本發(fā)明中。在存在碳二亞胺和能夠形成活性酯的試劑的情況下，可以實(shí)現(xiàn)一種特別有效的偶聯(lián)兩個(gè)肽片段的方法，所說試劑例如為二環(huán)己基碳二亞胺(“DCC”)和N-羥基琥珀酰亞胺(“HOSu”)或者1-羥基苯并三唑(“HOBt”)的混合物。
用于縮合的重組形成的10-32片段優(yōu)選地具有下式A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)其中，A10直至A31和-Xxx如本文所定義。
偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物典型地是具有下式的降鈣素碳類似物
A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:4)其中，A10直至A31和-Xxx如本文脫氨九肽(SEQ ID NO:3)或者10-32片段-Xxx(SEQ ID NO:1)下所定義的一樣。典型地，在存在非酶促偶聯(lián)試劑的情況下實(shí)現(xiàn)脫氨九肽和重組形成的肽的偶聯(lián)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種方法，該方法用于具有下式的多肽片段(這里稱作為“ECF2-酰胺”)的重組制備和酰胺化Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(SEQ ID NO:6)以及用于偶聯(lián)ECF2-酰胺到Elcatonin的氨基末端片段(下文稱作為“ECH1”)，該氨基末端片段具有式
本發(fā)明也提供了一個(gè)核酸序列，該核酸序列包括編碼降鈣素或者相關(guān)類似物的氨基酸10-32的序列。該核酸序列典型地編碼融合蛋白，該融合蛋白包括通過切割位點(diǎn)連接到碳酸酐酶上的10-32片段。優(yōu)選利用用于目標(biāo)宿主細(xì)胞(如大腸桿菌、釀酒酵母或者巴斯德畢赤酵母)的最佳密碼子使用，設(shè)計(jì)編碼10-32片段的基因部分。
附圖簡要描述

圖1顯示質(zhì)粒pET31F1mhCAⅡ的圖。該質(zhì)粒包括與pSP65復(fù)制起點(diǎn)的相反方向上引入的來自質(zhì)粒pEMBL8的復(fù)制起點(diǎn)F1。
圖2顯示質(zhì)粒pABN的圖。質(zhì)粒pABN包括編碼接頭肽片段(SEQ IDNO:49)的核酸序列(SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)，該接頭肽片段插入到質(zhì)粒中鄰近人碳酸酐酶Ⅱ(“hCAⅡ”)的基因序列的羧基末端處。
圖3顯示質(zhì)粒pTBN的圖。質(zhì)粒pTBN是四環(huán)素抗性表達(dá)載體，該載體得自pABN的1.5kb片段向質(zhì)粒pBR322中的插入。該1.5kb片段包括pABN的T7啟動(dòng)子、hCAⅡ、接頭和T7終止子序列。
圖4A是用PCR方法制備編碼ECF2-Ala和附加的限制酶切位點(diǎn)(使得將片段克隆進(jìn)入質(zhì)粒得以實(shí)現(xiàn))的核苷酸序列的第一步的示意說明。通過利用Taq DNA聚合酶在PCR MIX 1上實(shí)施PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)這一步驟。
圖4B是編碼ECF2-Ala的DNA序列的制備的第二步的示意性說明。得自在PCR MIX 1中的寡核苷酸2和3的延伸(分別為2Ext(SEQ ID NO:8)和3Ext(SEQ ID NO:50))的PCR產(chǎn)物在它們的3’末端上具有20bp互補(bǔ)序列。利用Taq DNA聚合酶的第二個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)生了雙鏈核苷酸片段，該核苷酸片段包括編碼ECF2-Ala(SEQ ID NO:9)的全長無間斷基因序列。
圖5顯示質(zhì)粒pTBN26的圖。質(zhì)粒pTBN26包括總hCAⅡ-接頭-ECF2-Ala融合蛋白(“hCA-ECF2-Ala”)構(gòu)建體的基因序列。
圖6A顯示hCAⅡ-接頭-ECF2-Ala融合蛋白構(gòu)建體的N末端蛋氨酸和hCAⅡ殘基1-162的核苷酸(SEQ ID NO:11)和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。
圖6B顯示hCAⅡ-接頭-ECF2-Ala融合蛋白構(gòu)建體的hCAⅡ殘基162-257以及接頭和ECF2-Ala片段的核苷酸(SEQ ID NO:11)和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。
圖7顯示Elcatonin和鰻魚降鈣素的23氨基酸C末端片段(“ECF2”)的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)和氨基酸(SEQ ID NO:6)序列。所顯示的核苷酸序列是編碼ECF2的序列，ECF2存在于摻入到質(zhì)粒pTBN26中的hCA-ECF2-Ala融合蛋白的基因中。
圖8顯示包含ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的樣品的代表性制備性HPLC圖(利用聚磺乙基天冬酰胺(polysulfolethylaspartamide)柱)。ECF2-酰胺的峰值出現(xiàn)在14.5和16.3分鐘之間。
圖9A顯示來源于一些物種的降鈣素的殘基1-15的氨基酸序列。
圖9B顯示來源于一些物種的降鈣素的殘基16-32的氨基酸序列。
圖10顯示經(jīng)由PCR方法從5寡核苷酸(描述在實(shí)施例1.1中)合成的雙鏈DNA片段(SEQ ID NO:9)以及由該雙鏈DNA片段(SEQ ID NO:10)編碼的肽序列。
圖11描述在編碼ECF2的基因序列的PCR合成期間產(chǎn)生的寡核苷酸2Ext的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。
圖12描述在編碼ECF2的基因序列的PCR合成期間產(chǎn)生的寡核苷酸3Ext的核苷酸序列(SEQ ID NO:50)。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明的融合蛋白的重組制備包括編碼靶序列的核酸序列(“FP核酸序列”)的構(gòu)建，該靶序列通過切割位點(diǎn)連接到碳酸酐酶上。在圖6中所顯示的FP核酸序列是用于本方法的合適核酸序列的一個(gè)例子。在圖6中所顯示的核酸序列包括編碼人碳酸酐酶Ⅱ(“hCAⅡ”)的殘基1-257的密碼子。
這一氨基酸序列或者碳酸酐酶的其它功能活性片段在融合蛋白中的包含極大地有利于融合蛋白從細(xì)胞碎片中分離出來。如本文所使用的，術(shù)語“碳酸酐酶”包括天然存在的碳酸酐酶(和任一等位變體)、功能活性碳酸酐酶片段或者其修飾體(“突變體”)。這里的“功能活性碳酸酐酶片段和突變體”意指碳酸酐酶的片段或者修飾體，其仍顯示出hCAⅡ的酶抑制劑結(jié)合性質(zhì)。具有這樣性質(zhì)的片段能夠極緊密地結(jié)合碳酸酐酶抑制劑(如磺胺)。具有這樣結(jié)合性質(zhì)的功能活性片段顯示出高度選擇性的與低分子量配體(例如磺胺或者其合成衍生物)的親和結(jié)合。一般來說，這種結(jié)合是如此強(qiáng)烈以致碳酸酐酶/配體綴合物將顯示出不超過大約10-7M的溶液解離常量(結(jié)合常數(shù)的倒數(shù))。一般地，這種配體是碳酸酐酶的可逆抑制劑。合適的碳酸酐酶片段可以缺乏酶的N末端或者C末端部分，只要該片段保持酶的功能性抑制劑結(jié)合活性。同樣地，修飾碳酸酐酶(在本發(fā)明融合蛋白中可以用作為結(jié)合蛋白)可以通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸的加入、缺失或者插入得到修飾，只要修飾酶本質(zhì)上顯示出以上所描述的抑制劑結(jié)合活性。典型地，通過缺失或者改變氨基酸殘基修飾碳酸酐酶，結(jié)果是修飾酶不包含將要在融合蛋白中用作為切割位點(diǎn)的特異氨基酸。例如，當(dāng)溴化氰將要用作為切割試劑時(shí)，可以修飾碳酸酐酶以除去或者取代正常存在的任一蛋氨酸(“Met”)殘基。
FP核酸序列包括編碼10-32片段的序列，即降鈣素或者密切相關(guān)類似物的氨基酸殘基10-32。密切相關(guān)類似物可以得自在降鈣素10-32片段中的保守氨基酸取代?？梢栽O(shè)計(jì)這部分核酸序列以便優(yōu)化融合蛋白在特異宿主細(xì)胞中的表達(dá)。例如，在將要利用腸桿菌(如大腸桿菌)作為宿主有機(jī)體進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)的情況下，典型地基于在目標(biāo)宿主有機(jī)體中的密碼子使用頻率(參見，例如，Gribskov等，核酸研究，12,539-549,1984中的密碼子使用頻率的討論)構(gòu)建編碼10-32片段的核酸序列和切割位點(diǎn)。
切割位點(diǎn)可以是化學(xué)切割位點(diǎn)或者酶促切割位點(diǎn)。在PCT專利申請?zhí)朩O 92/01707中詳盡地描述了化學(xué)和酶促切割位點(diǎn)和用來進(jìn)行與這些位點(diǎn)之一連接的肽鍵切割的相應(yīng)試劑，該專利申請的公開內(nèi)容引入本文作為參考。適合于在本發(fā)明中用作為切割位點(diǎn)的肽序列(以及編碼它的DNA基因序列)和相應(yīng)的切割酶或者化學(xué)切割條件的例子顯示在表1中。所表明的基因序列是編碼相應(yīng)肽序列的一種可能序列?？梢詷?gòu)建編碼相同肽序列的其它DNA序列。優(yōu)選地，基于將要用于融合蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞的每一氨基酸的更通常使用的密碼子，設(shè)計(jì)編碼切割位點(diǎn)的核酸序列。例如，核苷酸序列可以基于在如大腸桿菌的腸桿菌中的最佳密碼子使用(參見，例如Gribskov等，1984，核酸研究，12,539-549)。
切割位點(diǎn)可以存在作為接頭肽的一部分，該接頭肽連接碳酸酐酶和靶序列。例如，在圖6中描述的hCAⅡ-接頭-ECF2-Ala(“hCA-ECF2-Ala”)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)包括一個(gè)七氨基酸接頭序列(-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-；(SEQ ID NO:14))，該接頭序列建立了可由羥胺(“Asn-Gly”)切割的化學(xué)切割位點(diǎn)，該切割位點(diǎn)位于接頭的C末端天冬酰胺殘基和靶序列的N末端甘氨酸殘基之間。
表1用于切割的酶肽序列DNA序列腸激酶 (Asp)4Lys GACGACGACGATAAA(SEQ ID NO:16)(SEQ ID NO:15)因子Xa IleGluGlyArg ATTGAAGGAAGA(SEQ ID NO:18)(SEQ ID NO:17)凝血酶 GlyProArg或者 GGACCAAGA或者GlyAlaArg GGAGCGAGA遍在蛋白切割酶 ArgGlyGly AGAGGAGGA腎素HisProPheHisLeu- CATCCTTTTCATC-LeuValTyr TGCTGGTTTAT(SEQ ID NO:20)(SEQ ID NO:19)胰蛋白酶Lys或者Arg AAA或者CGT胰凝乳蛋白酶Phe或Tyr或Trp TTT或TAT或TGG梭菌蛋白酶 ArgCGTS.aureus V8 GluGAA化學(xué)切割肽序列 DNA序列(在pH3) AspGly或AspPro GATGGA或GATCCA(羥胺) AsnGly AATCCA(CNBr) 蛋氨酸 ATGBNPS-糞臭素 TrpTGG2-硝基-5- CysTGT氰硫基苯甲酸融合蛋白包括至少一個(gè)拷貝，并且可以包括多個(gè)靶序列拷貝。在存在多個(gè)靶序列拷貝的情況下，這些拷貝可以串聯(lián)地連接在一起。此外，靶序列的拷貝可以由內(nèi)部接頭肽連接在一起。上述內(nèi)部接頭肽可以與外部接頭肽相同或者不相同，上述外部接頭肽把碳酸酐酶與靶肽的第一個(gè)拷貝相連接。如果上述內(nèi)部和上述外部接頭肽是相同的或者包括相同的切割位點(diǎn)，那么可以直接切割融合蛋白從而產(chǎn)生一些片段，這些片段的每一個(gè)包含靶肽的單拷貝。然而，如果上述內(nèi)部和上述外部接頭肽包含不同的切割位點(diǎn)，那么就有可能是首先把碳酸酐酶片段切割下來從而形成具有一個(gè)以上靶肽拷貝的中間多肽。
利用本方法可以從多拷貝構(gòu)建體(具有包括蛋氨酸殘基的內(nèi)部連接肽)中產(chǎn)生無蛋氨酸殘基的靶序列。在蛋氨酸殘基與靶序列的C-末端直接連接的情況下，可以用溴化氰切割上述多拷貝構(gòu)建體?？梢岳美缃z氨酸羧肽酶(如羧肽酶Y)的羧肽酶對所產(chǎn)生的片段進(jìn)行轉(zhuǎn)肽基作用從而用α-酰胺化的氨基酸取代C末端高絲氨酸殘基。該片段也可以利用羧肽酶轉(zhuǎn)酰胺化從而用2-硝基芐胺化合物取代C末端高絲氨酸殘基。這一過程產(chǎn)生具有C末端(2-硝基芐基)酰氨基的片段，所說的酰氨基可以以光化學(xué)方式分解從而產(chǎn)生無高絲氨酸殘基的α-酰胺化的肽片段。
在構(gòu)建體中包括多拷貝靶序列的融合蛋白的一個(gè)例子中，所說的構(gòu)建體包括hCA-(MetValAspAspAspAspAspAsn-ECF2)n-Xxx，其中hCA、ECF2和Xxx如本文所定義，n是一個(gè)整數(shù)(典型地是2-20)?？梢岳肅NBr處理這種構(gòu)建體從而形成ValAspAspAspAspAsn-ECF2-Hse(SEQID NO:49)肽片段(其中Hse是由CNBr與Met殘基的反應(yīng)產(chǎn)生的高絲氨酸殘基)。然后當(dāng)如羧肽酶Y的肽酶存在時(shí)可以使該肽片段與如鄰硝基苯基甘氨酸酰胺(“ONPGA”)的親核體進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果導(dǎo)致Hse殘基為ONPGA所取代。利用光解，將轉(zhuǎn)肽基作用產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成為C末端甲酰胺。通過用羥胺處理可以從所述片段上切除N末端尾序列ValAspAspAspAspAsn(SEQ ID NO:50)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及C末端鰻魚降鈣素多肽片段即ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的制備。該制備包括下列蛋白質(zhì)構(gòu)建體的起始遺傳表達(dá)Met-hCAⅡ’-Met240-Va1241-hCAⅡ”-接頭-ECF2-aa(“hCA-ECF2-aa”)其中，aa是氨基酸殘基，Met是任一大腸桿菌蛋白質(zhì)所需要的N末端殘基。將Met殘基加入至hCAⅡ’(人碳酸酐酶Ⅱ的239氨基酸N末端多肽片段)的第一個(gè)殘基的N-末端上，Met240-Va1241是在人碳酸酐酶Ⅱ(“hCAⅡ”)中的唯一的溴化氰不穩(wěn)定的肽鍵，hCAⅡ”是來源于鄰近hCAⅡ(殘基242-257)的C末端的16氨基酸片段(SEQ ID NO:21)。ECF2-aa的C末端氨基酸殘基(SEQ ID NO:22)(即aa)提供了酰胺化信號從而使之能夠轉(zhuǎn)變成為Pro-酰胺，該P(yáng)ro-酰胺構(gòu)成Elcatonin(SEQ IDNO:13)的C-末端。aa殘基典型地是如丙氨酸的氨基酸殘基，該氨基酸殘基能夠經(jīng)由轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)與親核體的交換。
所需要的產(chǎn)物ECF2-aa(SEQ ID NO:22)可以用至少兩種方法得自hCA-ECF2-aa蛋白質(zhì)構(gòu)建體。第一種方法使用利用羥胺在Asn-Gly鍵上對hCA-ECF2-aa的切割，從而直接產(chǎn)生ECF2-aa(SEQ ID NO:22)。此外，利用溴化氰(CNBr)的切割產(chǎn)生微型融合蛋白質(zhì)，該融合蛋白質(zhì)包括連接到ECF2-aa多肽(SEQ ID NO:22)上的hCAⅡ的hCAⅡ”C末端片段(SEQ ID NO:21)。其后可以在微型融合蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的衍生化作用之前或者之后用羥胺切割該微型融合蛋白質(zhì)從而提供ECF2-aa(SEQ IDNO:22)，所說的衍生化作用是指例如，其中ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的Lys殘基已得到衍生而形成具有Z-保護(hù)側(cè)鏈氨基的Lys殘基。在其中衍生化作用試劑修飾Lys的側(cè)鏈氨基功能的情況下，在衍生的微型融合蛋白質(zhì)切割之后，所產(chǎn)生的帶保護(hù)基的ECF2-aa(SEQ ID NO:22)在N末端甘氨酸殘基的α位上將僅僅具有單自由氨基功能團(tuán)。自由N末端α-氨基可以用于爾后的特異性化學(xué)反應(yīng)，例如偶聯(lián)到ECF1(SEQ ID NO:7)的C末端殘基上從而提供Elcatonin(SEQ ID NO:13)。這種類型的偶聯(lián)反應(yīng)可以在ECF2-aa多肽(SEQ ID NO:22)已轉(zhuǎn)化成為具有C末端殘基Pro-酰胺(“ECF2-酰胺”，(SEQ ID NO:6))的ECF2衍生物之后進(jìn)行，或者可以用來產(chǎn)生衍生形式的Elcatonin(例如“Elcatonin-aa”，(SEQ ID NO:30))，該衍生形式的Elcatonin用于爾后的向Elcatonin(SEQ ID NO:13)的轉(zhuǎn)變。
ECF2-aa的優(yōu)選序列是Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(“ECF2-Ala”,SEQ ID NO:23)ECF2-Ala肽片段可以得自hCA-ECF2-Ala蛋白質(zhì)構(gòu)建體的切割，例如通過利用羥胺的處理。hCA-ECF2-Ala蛋白質(zhì)構(gòu)建體可以包括序列hCAⅡ’-Met-Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Gln-Ile-Lys-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(SEQ ID NO:12)此外，可以在不同鍵上切割hCA-ECF2-Ala蛋白質(zhì)構(gòu)建體從而產(chǎn)生前ECF2-Ala肽，即微型融合蛋白質(zhì)。例如，可以切割hCA-ECF2-Ala蛋白質(zhì)構(gòu)建體從而產(chǎn)生前ECF2-Ala肽，這些肽包括hCAⅡ的C末端片段或者其修飾體連接在ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)的N-末端上。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以用溴化氰(CNBr)切割hCA-ECF2-Ala蛋白質(zhì)構(gòu)建體(SEQ ID NO:12)從而產(chǎn)生具有下列氨基酸序列的微型融合蛋白質(zhì)(“MFP”)Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Glu-Ile-Lys-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(SEQ ID NO:24)MFP包括hCAⅡ的C末端的Val241-hCAⅡ”片段Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Glu-Ile-Lys-Ala(SEQ ID NO:25)以及具有下式的接頭序列Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn(SEQ ID NO:14)。
人碳酸酐酶Ⅱ(hCAⅡ)的多肽片段hCAⅡ’-Met240-Val241-hCAⅡ”已在生物化學(xué)，9,2638(1970)中有報(bào)道，并且可以用作為結(jié)合蛋白片段，用來利用如在(WO 92/01707)中所描述的那些方法純化碳酸酐酶-ECF2-aa蛋白質(zhì)構(gòu)建體。按照WO 92/01707，碳酸酐酶片段或者修飾的碳酸酐酶也可以用作為結(jié)合蛋白片段。
用于一些其它碳酸酐酶的氨基酸序列也有報(bào)道(參見，例如Hewett-Emmett等，在碳酸酐酶中，Dodgson等編著，第2章，pp.15-32,1991)。如果特異碳酸酐酶的氨基酸序列是已知的但沒有基因可供使用，那么可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法(參見，例如Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y,1989；以及Tanhauser等，基因，117,113-117,1992)分離編碼碳酸酐酶的cDNA。這些方法典型地包括構(gòu)建編碼所討論的碳酸酐酶片段的核酸探針(例如長為大約20-30個(gè)堿基對)?；谝阎被嵝蛄谢蛘呦嚓P(guān)DNA序列的簡并性核苷酸探針可以用來篩選cDNA文庫(參見，例如Wallace等，核酸研究，6,3543,1979和Wallace等，核酸研究，9,879,1981)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，靶序列可以包括其中10-32片段的至少一個(gè)C末端殘基已為一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(“離去單位”)所取代的氨基酸序列?？梢栽诔ヌ妓狒覆糠值娜诤系鞍浊懈钪盎蛘咧蠼?jīng)由轉(zhuǎn)肽基反應(yīng)修飾靶序列的C末端。轉(zhuǎn)肽基反應(yīng)典型地導(dǎo)致離去單位從靶序列的C末端上除去以及它被“10-32片段”的丟失的C末端殘基(或者多個(gè)殘基)所取代。例如，可以利用S.aureus V8對具有C末端離去單位的重組產(chǎn)生的肽(如鰻魚降鈣素的氨基酸殘基10-30偶聯(lián)到C末端丙氨酸上的鰻魚(10-30)-Ala)進(jìn)行轉(zhuǎn)肽基作用從而在殘基Glu30取代Ala C末端殘基之后引入Thr-Pro-NH2二肽。
除用于降鈣素碳類似物(如Elcatonin)的制備外，本發(fā)明的重組合成的10-32片段可以用于降鈣素的合成。例如，可以利用非酶促偶聯(lián)試劑將鰻魚降鈣素的環(huán)氧化形式的殘基1-9與ECF2酰胺的側(cè)鏈保護(hù)的衍生物偶聯(lián)，例如，其中Ser、Thr和Glu殘基被保護(hù)作為芐基醚或者酯并且Lys殘基為CBZ基團(tuán)所保護(hù)?？梢杂脕韺?shí)現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)的合適的非酶促偶聯(lián)試劑的例子包括DCC、N-乙基-N′-二甲基氨丙基-碳二亞胺(“EDAPC”)、DCC/HOSu、DCC/HOBt以及EDAPC/HOSu(參見，例如美國專利5,429,129，其公開內(nèi)容并入本文作為參考)。Ⅰ．融合蛋白的重組形成a．載體選擇摻入融合蛋白基因的表達(dá)載體以便使之可與宿主細(xì)胞相容。一般地，所利用的載體具有許多共同的特性。這些特性包括可與宿主細(xì)胞相容的復(fù)制起點(diǎn)、用于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(對于可誘導(dǎo)系統(tǒng))的調(diào)節(jié)DNA序列、有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(對于原核宿主)、聚A信號(對于真核宿主)。此外，可以包括表型基因、調(diào)節(jié)區(qū)以及前導(dǎo)序列。
原核載體(如那些用于在大腸桿菌中表達(dá)的載體)的特點(diǎn)在于復(fù)制起點(diǎn)、用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌的選擇的遺傳標(biāo)記(表型)以及將指導(dǎo)感興趣的基因的表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)序列。典型地，所說的調(diào)節(jié)序列將包括驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制轉(zhuǎn)錄(開/關(guān)開關(guān))的操縱基因、起始翻譯的有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止信號。起始和終止密碼子由插入(融合蛋白)的基因提供。
原核載體尤其包含合適的“表達(dá)盒”，該表達(dá)盒基于一些可供使用的啟動(dòng)子/操縱基因系統(tǒng)之任一個(gè)。包含在原核載體中的典型的啟動(dòng)子包括乳糖、色氨酸、T7、脂蛋白、堿性磷酸酶、λ左或右啟動(dòng)子或者它們的混合物(雜合啟動(dòng)子)。乳糖和色氨酸操縱基因以及溫敏的λ啟動(dòng)子是典型的開/關(guān)開關(guān)，這種開關(guān)可以包括在原核載體中。包含在原核載體中的典型的表型標(biāo)記包括用于產(chǎn)生對氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素以及氯霉素的抗性的基因。
真核載體(如那些用于在酵母、釀酒酵母中表達(dá)的載體)典型地是穿梭載體，該穿梭載體包含用于大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)和用于釀酒酵母的復(fù)制起點(diǎn)、兩種細(xì)胞類型的遺傳標(biāo)記以及將指導(dǎo)在酵母中表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)序列。所說的調(diào)節(jié)序列典型地包括啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)序列以及轉(zhuǎn)錄終止信號(包括聚腺苷酸化信號)。用于指導(dǎo)細(xì)胞分泌的可有可無的信號序列也可以插入到真核載體中。將要摻入的典型的標(biāo)記對基因中的突變的互補(bǔ)提供陽性選擇，該基因?qū)τ谀蜞奏?、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤、色氨酸等的產(chǎn)生是必要的?？梢詢?yōu)選地?fù)饺胝婧溯d體中的啟動(dòng)子序列包括醇脫氫酶Ⅰ或者Ⅱ、磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerokinase)、半乳糖、色氨酸、交配因子α等等。
依據(jù)所選擇的載體的性質(zhì)，可以在各種有機(jī)體中表達(dá)ECF2-aa基因片段。具有特異宿主范圍的載體和具有廣泛宿主范圍的載體都適合用于本發(fā)明中。具有特異宿主范圍的載體的例子，例如對于大腸桿菌來說，是pBR322(Bolivar等，基因，2,95-113,1977)、PUC18/19(Yanisch Perron等，基因，23,103-119,1985)、pK18/19(Pridmore，基因，56,309-312,1987)、pRK290X(Alvarez-Morales等，核酸研究，14,4207-4227,1986)和pRA95(可得自Nycomed Pharm a AS,Huidove，丹麥)。
可以使用的其它載體是適合用于革蘭氏陰性細(xì)菌中的“廣泛宿主范圍”載體。這樣的“廣泛宿主范圍”載體的例子是pRK290(Ditta等，Proe.Nat.Acad.Sci.,77,7347-7351,1980)、pKT240(Bagdasarian等，基因，26,273-282,1983)、如pLAFR1(Long等，自然，289,485-488,1982)的pRK290衍生物、如pMMB66EH(Furste等，基因，48,119-131,1986)或者pGSS33(Sharpe，基因，29,93-102,1984)的pKT240衍生物。
b．質(zhì)粒pTBN的構(gòu)建包含hCAⅡ基因的表達(dá)載體pET31F1mhCAⅡ獲自佛羅里達(dá)大學(xué)的P.J Laipis博士。氨芐青霉素抗性的T7表達(dá)載體由在Tanhauser等，基因，117,113-117(1992)中所描述的方法從質(zhì)粒pET-3c(Studier等，Methods EnZymol.,185,60-89,1990)中構(gòu)建。將得自pET-3c載體的T7表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到截短的pSP65質(zhì)粒上。為了使單鏈質(zhì)粒DNA能夠產(chǎn)生，將得自pEMBL8+(Dente等，核酸研究，11,1645-1655,1983)的F1起點(diǎn)連接到陽性克隆的BglⅡ限制酶切位點(diǎn)中。指定所產(chǎn)生的質(zhì)粒為pET31F1m,其中F1m表示F1起點(diǎn)具有pSP65復(fù)制起點(diǎn)的相反方向。最后，將人碳酸酐酶ⅡcDNA(hCAⅡ cDNA)克隆在pET31F1m質(zhì)粒中Nde±和BamHⅠ位點(diǎn)之間，從而給出指定為pET31F1mhCAⅡ(參見圖1)的質(zhì)粒。
通過首先在佛羅里達(dá)大學(xué)的DNA Synthesis Core of theInterdisciplinary Center for Biotechnology合成兩種互補(bǔ)寡核苷酸來建立質(zhì)粒的接頭區(qū)5′A GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAT ATC TT 3′(SEQ ID NO:26)5′AGC TAA GAT ATC GTC GTC GTC AAC GAA 3′(SEQ ID NO:27)將上述寡核苷酸磷酸化、退火并連接到鄰近hCAⅡ基因序列的羧基末端的Hind Ⅲ位點(diǎn)中。包含插入片段的質(zhì)粒具有唯一的EcoR Ⅴ位點(diǎn)，該位點(diǎn)緊隨多肽片段即接頭(SEQ ID NO:14)中的第四個(gè)天冬氨酸殘基。所產(chǎn)生的質(zhì)粒稱作為pABN(參見圖2)。
利用質(zhì)粒pABN和pBR322(Bolivar等，基因，2,95-113,1977)構(gòu)建四環(huán)素抗性的表達(dá)載體，該表達(dá)載體用于ECF2-aa(SEQ ID NO:27)的產(chǎn)生，例如其中aa是Ala。將得自pABN的1.5-kb SspⅠ/BspEⅠ片段插入到pBR322的ScaⅠ位點(diǎn)中，結(jié)果產(chǎn)生pTBN(參見圖3)。
c．宿主菌株和轉(zhuǎn)化用于按照本發(fā)明進(jìn)行限制性切割、連接、轉(zhuǎn)化、選擇、培養(yǎng)和裂解的方法中的過程一般采用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)方法。提供這些方法的細(xì)節(jié)的文獻(xiàn)包括Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，N.Y.(1989)，其公開內(nèi)容并入本文作為參考。
為了制備用于發(fā)酵的生產(chǎn)菌株，把編碼hCA-ECF2-aa的DNA片段引入適合于hCA-ECF2融合蛋白表達(dá)的宿主菌株。適合于表達(dá)這一基因的微生物(典型地包括具有底物和原材料的高耐受性的菌株)的例子是腸桿菌，如埃希氏菌屬。大腸桿菌種的微生物是特別優(yōu)選的。該微生物可以包含在載體分子上的或者在整合到它們的染色體中的hCA-ECF2-aaDNA片段。用包含hCA-ECF2-aa DNA片段的載體利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法(參見，例如Sambrook等，上述引用的)轉(zhuǎn)化所選擇的微生物。合適的生產(chǎn)菌株的例子是大腸桿菌JM 109(DE3)和大腸桿菌BL21(DE3)，在所說的每一種生產(chǎn)菌株的情況下都包含編碼融合蛋白的質(zhì)粒，例如pTBN26。
真核細(xì)胞可以包括單細(xì)胞生物(如酵母細(xì)胞)以及得自高等生物的無限增殖細(xì)胞(如植物、昆蟲或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。合適的真核宿主細(xì)胞包括釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、黑曲霉、草地夜蛾以及玉米、煙草或者大豆植物細(xì)胞?？勺鳛樗拗鞯母叩壬锇ň哂锌蛇M(jìn)行轉(zhuǎn)化的生殖細(xì)胞的高等植物和動(dòng)物。包括在其中的是如煙草、玉米、大豆和有果植物的植物和魚、鳥的無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物以及如綿羊、山羊、母牛，馬和豬的哺乳動(dòng)物。
典型地，將所轉(zhuǎn)化的宿主菌株從加有抗生素的選擇性營養(yǎng)培養(yǎng)基分離出來，其中由于標(biāo)記基因定位在載體上面因而宿主菌株具有對抗生素的抗性。
d．發(fā)酵利用微生物實(shí)現(xiàn)hCA-ECF2-aa融合蛋白的重組制備，該微生物包含hCA-ECF2-aa DNA片段和/或載體質(zhì)粒(包含hCA-ECF2-aa片段)。利用本質(zhì)上已知的方法可以實(shí)現(xiàn)上述過程，例如利用在WO 92/01707中所描述的方法。據(jù)此，可以利用市售的生長培養(yǎng)基，如Luria肉湯。分批向發(fā)酵液中補(bǔ)加氧和氨基酸補(bǔ)料以提供高細(xì)胞密度。在發(fā)酵完成之后，可以如同在WO 92/01707中所描述的一樣破壞微生物，并且純化hCA-ECF2-aa融合蛋白，例如利用如WO 92/01707中所描述的磺胺親和層析。Ⅱ．產(chǎn)生ECF2-Ala的融合蛋白的切割可以在氨基酸Asn 7(接頭序列的氨基酸7)和Gly A10(ECF2-Ala的氨基酸1)之間(由下列的“*”指出)切割具有以下所顯示的序列的融合蛋白hCAⅡ’-Met-Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Gln-Ile-Lys-Ala-Ser-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn*-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala(SEQ ID NO:12)通過用羥胺處理可以實(shí)現(xiàn)在該位點(diǎn)的特異性切割。所產(chǎn)生的ECF2-Ala片段(SEQ ID NO:23)可以由常規(guī)方法純化。Ⅲ．形成ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的酰胺化通過在有羧肽酶Y(參見下述的方案1)的情況下利用親核氨基化合物轉(zhuǎn)酰胺化如ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)的ECF2-aa肽，按照WO 92/05271可以實(shí)現(xiàn)ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的酰胺化，從而形成能夠被反應(yīng)或者分解而形成ECF2-NH2(SEQ ID NO:6)的肽中間體。合適的親核體的例子包括鄰硝基芐胺，如鄰硝基苯基甘氨酸酰胺(“ONPGA”)。轉(zhuǎn)酰胺化導(dǎo)致ECF2-aa(SEQ ID NO:22)的C末端-aa殘基為親核胺所取代。所產(chǎn)生的光不穩(wěn)定中間體(例如ECF2-ONPGA(SEQ ID NO:28))的光解導(dǎo)致親核體的切割和在羧基末端具有酰胺化的脯氨酸的ECF2片段(“ECF2-酰胺”，SEQ ID NO:6)的產(chǎn)生。ECF2-酰胺可以由常規(guī)方法純化。方案1
Ⅳ.Elcatonin片段1(ECF1)和ECF2-酰胺的縮合利用如本文所描述的標(biāo)準(zhǔn)的肽偶聯(lián)反應(yīng)，例如在有DCC/HOSu、EDAPC/HOSu或者DCC/HOBt的情況下，可以偶聯(lián)N末端Elcatonin片段ECF1(SEQ ID NO:7)和Elcatonin相關(guān)片段ECF2-Xxx(SEQ IDNO:1)。如果利用無保護(hù)形式的ECF1和ECF2-酰胺進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，那么ECF1片段的C末端α-羧酸在ECF2片段加入之前就典型地轉(zhuǎn)化成為活化酯。通過偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的Elcatonin(SEQ ID NO:13)可以由常規(guī)技術(shù)(如制備性HPLC方法)純化。
利用ECF1(SEQ ID NO:7)和其它10-32片段，例如鮭魚Ⅰ降鈣素10-32片段(SEQ ID NO:29)，用類似的方法可以制備其它降鈣素的Carba類似物(例如鮭魚Ⅰ降鈣素，(SEQ ID NO:38))和相關(guān)降鈣素碳類似物。通過得自一物種的降鈣素的C末端片段和與得自另一不同物種的降鈣素相應(yīng)的N末端碳片段的結(jié)合，本發(fā)明也可以制備碳類似物。方案2C(O)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHC(O)-Val-Leu-OH(CH2)5(SEQ ID NO:7)Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-
Ⅴ．給出微型融合蛋白質(zhì)(MFP)的融合蛋白hCA-ECF2-aa的切割在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案(其在Elcatonin(SEQ ID NO:13)的形成中使用化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng))中，經(jīng)由CNBr處理可以在Met240和Va1241殘基之間切割Met-hCAⅡ’-Met240-Val241-hCATⅠ”-接頭-ECF2-Ala融合蛋白(SEQ ID NO:12)，從而產(chǎn)生48氨基酸微型融合蛋白質(zhì)(Val241-hCAⅡ”-接頭-ECF2-Ala，下文的“MFP”(SEQ ID NO:24))。MFP由3種組分片段組成。微型融合蛋白質(zhì)的氨基末端部分基本上由在ECF2-Ala片段(SEQID NO:23)的N-末端上的24殘基“生物保護(hù)基團(tuán)”組成?？梢杂沙Ｒ?guī)方法純化MFP(SEQ ID NO:24)，其后使之衍生從而保護(hù)氨基酸側(cè)鏈殘基。Ⅵ．向微型融合蛋白質(zhì)引入保護(hù)基團(tuán)當(dāng)要以化學(xué)保護(hù)形式分離ECF3-aa(SEQ ID NO:22)時(shí)，可以從切割之后的融合蛋白中分離出微型融合蛋白質(zhì)，然后使之接受化學(xué)衍生化作用從而用各種保護(hù)基團(tuán)(“R”)封阻活性側(cè)鏈基團(tuán)，如賴氨酸殘基的ε氨基功能團(tuán)。N末端肽片段起保護(hù)基團(tuán)的作用，保護(hù)ECF2-aa的N末端Gly的α-氨基不受化學(xué)保護(hù)試劑衍生化。
在多肽化學(xué)中常用的氨基保護(hù)基團(tuán)R，例如那些在Houben-Weyl(Methoden der organischen Chemie 15/1和15/2,Thieme VerlagStuttgart,1974)中描述的保護(hù)基團(tuán)，都適合于用作為保護(hù)基團(tuán)。優(yōu)選的氨基保護(hù)基團(tuán)包括芐氧基羰基-(“Z”)、叔丁氧基羰基-(“BOC”)、芴基甲氧基羰基(“FMOC”)或者金剛烷氧基羰基-(“ADOC”)。其它活性側(cè)鏈基團(tuán)也可以由保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，例如可以保護(hù)羥基和羧基分別作為芐基醚和芐基酯。Ⅶ．保護(hù)的ECF2-Ala片段的制備通過首先用適當(dāng)?shù)难苌噭?“R”試劑)處理微型融合蛋白質(zhì)可以形成保護(hù)的10-32片段，其中R是氨基保護(hù)基團(tuán)(其中n與微型融合蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基的數(shù)量相對應(yīng))。然后切割所產(chǎn)生的保護(hù)的微型融合蛋白質(zhì)(“Rn-MFP”(SEQ ID NO:24))從而形成保護(hù)的10-32片段(“Rn-ECF2-Ala”(SEQ ID NO:23))，其中只有Lys殘基的自由ε-氨基為“R”基團(tuán)所保護(hù)而α-氨基沒有得到保護(hù)(參見以下的方案3)?？梢砸曰瘜W(xué)方式或者酶促方式進(jìn)行切割。對于化學(xué)切割，羥胺可以用來切割A(yù)sn-Gly鍵(用箭頭指出)，例如按照由Bomstein，生物化學(xué)，12,2408-2421,1979所描述的方法，從而產(chǎn)生Rn-ECF2-Ala的片段(SEQ ID NO:23)。其后可以由常規(guī)化學(xué)方法(如果需要的話)純化所產(chǎn)生的Rn-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)。在本發(fā)明的這一實(shí)施方案的一個(gè)例子中，通過使MFP與BOC-酸酐進(jìn)行反應(yīng)可以形成BOC保護(hù)的Val241-hCAⅡ”-接頭-ECF2-Ala(“BOC4-MFP”(SEQ ID NO:24))?？梢杂昧u胺在Asn和Gly氨基酸殘基之間切割所產(chǎn)生的BOC4-MFP(SEQ ID NO:24)從而產(chǎn)生BOC2-ECF2-Ala(SEQ IDNO:23)。方案3MFP Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-(SEQ ID NO:24) Pro-Leu-Lys(R)-Asn-Arg-Glu-Ile-+
Lys(R)-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-“R試劑”Asn-Gly-Lys(R)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(R)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala“R4-MFP” (SEQ ID NO:24)NH2OHGly-Lys(R)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-
His-Lys(R)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala“R2-ECF2-Ala”(SEQ ID NO:23)Ⅷ．產(chǎn)生非酰胺化的Elcatonin的保護(hù)性Rn-ECF2-aa與ECF1片段的偶聯(lián)本發(fā)明還涉及ECF2-aa(SEQ ID NO:22)或者其修飾形式(如Rn-ECF2-aa)在如Elcatonin(SEQ ID NO:13)的降鈣素類似物的制備中的用途。在這一實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法，利用非酶促偶聯(lián)試劑可以首先使RnECF2-aa(SEQ ID NO:22)的自由α-氨基與肽片段(如ECF1(SEQ ID NO:7))或者保護(hù)的ECF1的自由羧基縮合，從而產(chǎn)生Elcatonin前體，如Elcatonin-Ala。
Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala“Elcatonin-Ala”(SEQ ID NO:31)例如，用其中Ser和Thr殘基的羥基和Lys殘基的側(cè)鏈氨基如同以上所描述的一樣得到保護(hù)的起始物可以實(shí)現(xiàn)用來產(chǎn)生Elcatonin前體的縮合。該縮合導(dǎo)致形成側(cè)鏈保護(hù)的、氨基酸延伸的、非酰胺化形式的Elcatonin(“Rn-Elcatonin-Ala(SEQ ID NO:31))。
由碳二亞胺或者疊氮化物方法，利用已知的方式可以實(shí)現(xiàn)縮合。在兩個(gè)片段已經(jīng)以化學(xué)方式縮合之后，例如通過如(Houben Weyl,Meth.derOrg.Chemie,15,1-2 Thieme Verlag,Stuttgart,1974)所描述的氫解、水解、酸化、還原或者肼解，利用適合于具體保護(hù)基的常規(guī)技術(shù)可以使產(chǎn)物脫保護(hù)。Ⅸ．Elcatonin-Ala向Elcatonin的轉(zhuǎn)化按照WO 92/05271，通過在有羧肽酶的情況下使前體多肽Elcatonin-aa(SEQ ID NO:30)與親核化合物(例如ONPGA)進(jìn)行反應(yīng)以給出可切割的中間體，然后該中間體可以由光解切割從而給出Elcatonin(其作為C末端α-甲酰胺存在)，如此可以實(shí)現(xiàn)氨基酸延伸的Elcatonin前體向具有下式的Elcatonin的轉(zhuǎn)化
Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(SEQ ID NO:13)本文用于氨基酸的縮寫是Gly，甘氨酸；Lys,L-賴氨酸；Leu,L-亮氨酸；Ser,L-絲氨酸；Gln,L-谷氨酰胺；Glu,L-谷氨酸；His,L-組氨酸；Thr,L-蘇氨酸；Tyr,L-酪氨酸；Pro,L-脯氨酸；Arg,L-精氨酸；Asp,L-天門冬氨酸；Val,L-纈氨酸；Ala,L-丙氨酸；Met,L-蛋氨酸；Asn,L-天冬酰胺；Trp,L-色氨酸；Ile,L-異亮氨酸；以及Phe,L-苯丙氨酸。
實(shí)施例1.1包含編碼hCA-ECF2-Ala融合蛋白的DNA的質(zhì)粒pTBN26的制備利用PCR方法構(gòu)建編碼ECF2的氨基酸10-32的基因。在佛羅里達(dá)大學(xué)合成下列五種寡核苷酸1．5′ GGA TCC AAG CTT GTT A 3′ (SEQ ID NO:32)2．5′ GTC GAC GAA TTC GAT A 3′ (SEQ ID NO:33)3．5′ GGA TCC AAG CTT GTT AAC GGT AAA CTG TCT CAGGAG CTC CAT AAA CTG 3′(SEQ ID NO:34)4．5′ CTG ACG TTG GTG CTG GTA CCC CGG CTT AAG ATATCG AAT TCG TCG AC 3′ (SEQ ID NO:35)5．5′ GGT ACC AGC ACC AAC GTC AGT ACG CGG GTA AGTCTG CAG TTT ATG GAG CTC CTG AGA 3′(SEQ iD NO:36)將寡核苷酸2-5混合在PCR反應(yīng)混合物PCR MIX 1中。寡核苷酸3的3’末端互補(bǔ)于寡核苷酸5的3’末端，而寡核苷酸2互補(bǔ)于寡核苷酸4的3’末端。將上述四種核苷酸一起退火，如圖4A中所示。如圖A的虛線所指出的一樣，在PCR期間，Taq DNA聚合酶用來伸展寡核苷酸3到寡核苷酸5的5’末端，寡核苷酸5則伸展到寡核苷酸3的5’末端，寡核苷酸2則伸展到寡核苷酸4的5’末端。
第二個(gè)PCR反應(yīng)用來連接得自PCR MIX 1中的PCR產(chǎn)物，結(jié)果產(chǎn)生雙鏈核苷酸片段(SEQ ID NO:9)，該片段包含完全的、無間斷的Asn-ECF2-Ala基因序列以及有利于克隆的限制酶切位點(diǎn)。分別得自寡核苷酸2(2Ext(SEQ ID NO:8))和3(3Ext(SEQ ID NO:50))的PCR延伸產(chǎn)物在它們的3’末端(參見圖4B中的示意說明)都具有20bp的互補(bǔ)序列。在與PCRMIX 2的最初幾個(gè)循環(huán)的反應(yīng)期間，寡核苷酸2Ext(SEQ ID NO:8)和3Ext(SEQ ID NO:50)(其中它們的序列是互補(bǔ)的)得到退火并延伸從而建立雙鏈片段，該雙鏈片段包括ECF2(SEQ ID NO:10)的全長無間斷基因序列。最后，寡核苷酸1和2用來擴(kuò)增上述全長基因序列。圖11和12顯示完全的、無間斷的ECF2基因序列(SEQ ID NO:10)的核酸序列以及分別為寡核苷酸2Ext(SEQ ID NO:8)和3Ext(SEQ ID NO:50)的核酸序列。
用HpaⅠ和EcoRⅤ消化所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。在唯一的EcoRⅤ位點(diǎn)上將這一平端DNA片段(編碼多肽片段接頭的C末端氨基酸(Asn)以及整個(gè)多肽片段ECF2)插入到pABN質(zhì)粒中。篩查該質(zhì)粒以確保Asn-ECF2基因以正確的取向插入。所產(chǎn)生的質(zhì)粒指定為pABN26。最后，用XbaⅠ和BspEⅠ消化pABN26，并將整個(gè)Met-hCAⅡ’-Met240-Val241-hCAⅡ”-接頭-ECF2-aa序列轉(zhuǎn)移到pTBN質(zhì)粒(已用相同的酶消化過)中從而產(chǎn)生質(zhì)粒pTBN26(圖5)。
最后構(gòu)建體的DNA序列顯示在圖6中，該構(gòu)建體具有加下劃線的Met溴化氰切割位點(diǎn)和Asn-Gly(SEQ ID NO:11)以及用箭頭指出的相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)切割位點(diǎn)。
1.2質(zhì)粒pTBN26(包含hCA-ECF2-aa DNA片段的載體)的轉(zhuǎn)化按照在WO 92/01707中所描述的方法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。所利用的宿主微生物是大腸桿菌HB101和大腸桿菌BL21(DE3)，兩者都描述在van Heeke等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，4,265-275,1993中。
1.3包含hCA-ECF2-AlaDNA的載體的選擇利用如那些在WO 92/01707中所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)選擇。選擇基于四環(huán)素抗性向宿主生物中的引入。2．包含質(zhì)粒pTBN26的大腸桿菌的發(fā)酵2.1用于接種發(fā)酵罐的預(yù)培養(yǎng)物的生長在37℃下在搖瓶中使包含質(zhì)粒pTBN26的大腸桿菌菌株BL21(DE3)生長在Luria肉湯(LB)培養(yǎng)基(包含四環(huán)素(15mg/L)和葡萄糖溶液(50mg/L))中直到在550nm(OD550)達(dá)到大約4的光密度，該過程歷時(shí)大約14小時(shí)。Luria肉湯培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)的組合物是1.0g/L胰蛋白胨、1.0g/L NaCl和0.5g/L酵母提取物。
2.2發(fā)酵在New Brunswick MPP-80發(fā)酵罐中完成發(fā)酵。在發(fā)酵罐中加入包含300g酵母提取物、30g NaCl和溶于15L H2O的1200g酪蛋白氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，其后加入30L蒸餾水。在121℃下將發(fā)酵罐滅菌25分鐘。在發(fā)酵罐的內(nèi)含物已冷卻至37℃之后，依次加入下列無菌溶液在800mL H2O中的480g葡萄糖、在250mL H2O中的120gMgSO4·H2O、在3.0L H2O中的495g K2PO4和465g KH2PO4、以及在30mL95％EtOH和20mL H2O的混合物中的0.9g鹽酸四環(huán)素。此外，還加入無菌無機(jī)混合物，該無菌無機(jī)混合物包含3.6g FeSO4·7H2O,3.6gCaCl2·2H2O,0.90g MnSO4,0.90g AlCl3·6H2O,0.09gCuCl2·2H2O,0.18g鉬酸，以及溶于490.0mL H2O和10.0mL濃HCl的0.36g CoCl2·6H2O。
將試劑級別的NH4OH(28％)加入到發(fā)酵罐的自動(dòng)pH進(jìn)料泵中并將pH調(diào)整至6.8。利用校準(zhǔn)電極連續(xù)地監(jiān)控發(fā)酵液，并且通過間歇地加入NH4OH使pH保持在6.8。另外，連續(xù)地監(jiān)控溶氧，利用校準(zhǔn)氧探測器。通過調(diào)整攪拌速率保持氧濃度。通氣速率保持在40L/min。當(dāng)所有系統(tǒng)都正常運(yùn)行時(shí)，通過無菌方法加入600mL接種物進(jìn)行接種。
在整個(gè)發(fā)酵過程中監(jiān)控濁度、溶氧以及葡萄糖水平。當(dāng)濁度達(dá)到15-20 OD(550)時(shí)，向培養(yǎng)基補(bǔ)加300g酵母提取物和1,200g酪蛋白氨基酸。當(dāng)攪拌速率達(dá)到500rpm時(shí)，向以5L/min速率進(jìn)給的空氣中補(bǔ)加純氧并使通氣速率減少至20L/min以保持40％的溶氧。
當(dāng)濁度達(dá)到30 OD550單位時(shí)，向發(fā)酵培養(yǎng)基提供異丙基硫代半乳糖苷至2mM以誘導(dǎo)質(zhì)粒的表達(dá)。此外，加入足夠的ZnCl2以提供100μM終濃度，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入無菌氨基酸溶液，該氨基酸溶液包含225gL-Ser和各為75g的L-Tyr、L-Trp、L-Phe、L-Pro和L-His。在誘導(dǎo)之后第2小時(shí)，取細(xì)胞樣品用于分析。對樣品進(jìn)行干重和SDS-PAGE蛋白質(zhì)分析，其中樣品在誘導(dǎo)時(shí)采集并且其后每30分鐘采集一次。
在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，在無菌條件下將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無菌存貯槽中并冷卻至8℃。利用裝備有200 kD分子量截?cái)嗄さ腗illipore Pro Stack通過錯(cuò)流過濾從廢培養(yǎng)基中分離出細(xì)胞。將細(xì)胞濃縮至5L，然后立即處理或者以1L等分試樣包裝在塑料冷藏袋中并存儲在-20℃下用于以后處理。
用32L裂解緩沖液(50mM Tris,1,mM EDTA,0.5％Triton-X100,pH7.8，包含0.05 mM基甲磺酰氟)稀釋濃縮的細(xì)胞(5L)，然后使之兩次通過在4-15℃下以12,000 psi運(yùn)行的Gaulin APV中試規(guī)模勻漿器。然后制備溶菌酶的1.3μM溶液，培養(yǎng)15分鐘(在4-15℃下)，然后使之迅速通過勻漿器。
可溶性大腸桿菌蛋白質(zhì)的大約50％為hCA-ECF2-aa，通過按照Verpoorte等，生物學(xué)化學(xué)雜志，242,4221-4229,1967測量融合蛋白的人碳酸酐酶部分的酶促活性來評估。
2.3 hCA-ECF2-Ala融合蛋白的純化用裂解緩沖液(沒有加入甲苯磺酰氟)以1∶1稀釋獲自實(shí)施例2.2的裂解液(32L)，并加入聚乙烯亞胺至0.35％的終濃度。將上述整個(gè)溶液攪拌20分鐘，然后以10,000xg離心以除去沉淀的DNA、RNA、非必需的蛋白質(zhì)以及膜泡，然后利用Pall Profile Filter(1.0μm)過濾。
其后由親和層析純化可溶性融合蛋白。通過加入Tris堿將所過濾的蛋白質(zhì)溶液的pH調(diào)整至8.7，并以200ml/min流速將該溶液裝載在1L的對氨甲基苯磺酰胺親和樹脂(van Heeke等，Methods.Molec.Biol.,36,245-260,1994)柱上。在裝載之后，用5倍柱量的0.1M pH9.0 Tris-硫酸鹽緩沖液(包含0.2M K2SO4和0.5mM EDTA)洗滌上述柱。然后用5倍柱量的0.1M pH7.0 Tris-硫酸鹽緩沖液(包含1M NaCl)洗滌上述樹脂。用5倍柱量的0.1M pH6.8 Tris-硫酸鹽緩沖液(包含0.4mM硫氰酸鉀和0.5mM EDTA)從親和材料上洗脫重組產(chǎn)生的hCA-ECF2-Ala融合蛋白?；旌习琱CA-ECF2-Ala融合蛋白的級分，并用乙酸處理該混合物至pH4.0以沉淀產(chǎn)物，其后離心收集該產(chǎn)物。凍結(jié)并冷凍干燥所產(chǎn)生的糊狀物。這一步驟的產(chǎn)率是85％。3．給出ECF2-Gla的hCA-ECF2-Gla融合蛋白的切割3.1利用羥胺對hCA-ECF2-Ala融合蛋白的切割用羥胺在Asn和Gly之間切割融合蛋白而成為包含hCAⅡ的片段以及多肽片段ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)。通過將溶解于羥胺緩沖液(2M鹽酸羥胺，5M鹽酸胍，50mM 3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙烷磺酸，用氫氧化鋰調(diào)整pH至10)中的40g hCA-ECF2-Ala培養(yǎng)4小時(shí)來實(shí)現(xiàn)切割。每小時(shí)取出一等分試樣，融合蛋白切割成為ECF2-Ala的程度則由HPLC分析(C18 Vydac,4.6×300mM，緩沖液A:0.1％三氟乙酸，5％體積的乙腈，95％體積水；緩沖液B:0.1％三氟乙酸，5％體積水，95％體積乙腈；5％緩沖液A至68％緩沖液B的線性梯度；流速1ml/min)測定。然后用15％乙酸將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至4L，所沉淀的包含hCAⅡ的片段由10000×G的離心除去。
離心所產(chǎn)生上清液包含ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，然后通過將其以50ml/min流速裝載到用在5％乙腈中的10mM乙酸平衡的制備性C8柱(5×5.1cm)上來除去上清液的鹽分。在裝載之后，用在10％乙腈中的10mM乙酸洗滌上述柱，并用在45％乙腈中的10mM乙酸洗脫ECF2-Ala。包含ECF2-Ala的級分由如上所述的分析型HPLC確定，集中并凍干這些級分。獲得總計(jì)1.14g的ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，相應(yīng)的產(chǎn)率為82％。
3.2 ECF2-Ala的純化為了進(jìn)一步純化ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，利用了如5.3部分所詳盡描述的半制備性聚磺乙基天冬酰胺HPLC，其產(chǎn)率為85％。4．ECF2-Ala向ECF2-酰胺的轉(zhuǎn)化按照在WO 92/05271中所描述的方法實(shí)現(xiàn)ECF2-Ala(SEQ IDNO:23)的酰胺化。將ECF2-Ala(12.8mg)溶解在1mL的5mM EDTA、25mM嗎啉代乙烷-磺酸、pH7.0中，并在其中加入72mg鄰硝基苯基甘氨酸酰胺(ONPGA)。用5M NaOH將pH調(diào)整至6.0并加入羧肽酶-Y(120μg)。在暗處攪拌大約48小時(shí)之后，加入乙腈(1mL)，并由如5.2部分的C18反相HPLC純化ECF2-ONPGA(SEQ ID NO:28)產(chǎn)物，凍干所得產(chǎn)物。接著酰胺化反應(yīng)過程的步驟是在10、60、120和180分鐘之后提取樣品，提取的樣品用于分析型C18 HPLC(如WO 92/05271中所描述的)的分析。
為了進(jìn)行爾后的光解，將凍干的ECF2-ONPGA(12mg)溶解在5mL的50％乙醇中。在該溶液中加入NaHSO3(26mg)和苯甲酸鈉(7.2mg)并用5M NaOH將pH調(diào)整至9.5。然后使氮?dú)馔ㄟ^反應(yīng)混合物15分鐘。按照在WO 92/05271中所描述的方法進(jìn)行爾后的光解、反應(yīng)過程的分析以及所產(chǎn)生的ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的鑒定。5．產(chǎn)生微型融合蛋白質(zhì)的hCA～ECF2-Ala融合蛋白的切割5.1利用溴化氰的hCA～ECF2-Ala融合蛋白的化學(xué)切割當(dāng)使用化學(xué)而非酶促片段偶聯(lián)時(shí)，MFP(SEQ ID NO:24)首先從融合蛋白(SEQ ID NO:12)上切割下來。為了切割Met240-Val241鍵(在ECF2-Ala的開始之前的24個(gè)氨基酸)，在暗處在氬氣環(huán)境下在室溫下利用0.02M溴化氰(在70％甲酸中)處理40mg/mL的hCA-ECF2-Ala融合蛋白(SEQ ID NO:12)6小時(shí)。加入蛋氨酸(0.03M)至0.03M的終濃度以終止切割反應(yīng)，并且攪拌所產(chǎn)生的溶液30分鐘。在反應(yīng)混合物中兩次加入反應(yīng)量的包含10％乙酸和112g/L硫酸鈉的溶液以沉淀包含hCAⅡ”的片段，同時(shí)攪拌混合物20分鐘。離心(10分鐘，10,000×G)除去所沉淀的材料。微型融合蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:24)仍然溶解在上清液中。獲得相對于所使用的hCA-ECF2-Ala融合蛋白(SEQ ID NO:12)的58％MFP(SEQID NO:24)回收率。
5.2使微型融合蛋白質(zhì)脫鹽將得自酸沉淀的上清液(4.5g微型融合蛋白質(zhì))裝載在C8 Vydac半制備柱(22×250mM)上，該柱已用0.1％三氟乙酸和5％乙腈平衡。利用0.1％三氟乙酸(在25％乙腈中)洗脫上述蛋白質(zhì)，爾后凍干。獲得總計(jì)4.05g的85％純微型融合蛋白質(zhì)，相應(yīng)的產(chǎn)率為90％。
5.3利用聚磺乙基天冬酰胺HPLC的微型融合蛋白質(zhì)的純化將聚磺乙基天冬酰胺層析用于純化微型融合蛋白質(zhì)(SEQ IDNO:24)、ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)和ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)。將肽溶解在緩沖液A(25mM乙酸，35％乙腈)中從而使終濃度為5mg/mL，然后以20ml/min流速將其裝載在聚磺乙基天冬酰胺HPLC柱(2.2×25cm)上。其后就可能利用10％緩沖液B(25mM乙酸，400mM乙酸鈉，35％乙腈)至47％緩沖液B的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)，該過程歷時(shí)30分鐘。產(chǎn)率典型地是50％或者更大。圖8顯示包含ECF2-酰胺(SEQ ID NO:6)的樣品的代表性HLPC圖。ECF2-酰胺的峰值出現(xiàn)在14.5和16.3分鐘之間。
5.4聚磺乙基天冬酰胺HPLC后的脫鹽凍干之后，在C8柱(5×20cm，用95％乙醇平衡)上裝載蛋白質(zhì)用于脫鹽。然后用4倍柱量的水和用4倍柱量的5％乙醇(包含1％乙酸)洗滌該柱。然后用2倍柱量的90％乙醇洗脫肽。由HPLC分析各組分。產(chǎn)率典型地是80％或者更大。6．保護(hù)基團(tuán)向微型融合蛋白質(zhì)中的摻入一般方法在重組MFP(SEQ ID NO:24)之內(nèi)的ECF2片段(SEQ ID NO:6)的α-氨基是被生物保護(hù)的，即通過N末端hCAⅡ”片段的存在得到保護(hù)。MFP中的Lys基團(tuán)的ε-氨基被酰基供體(如Z、BOC、ADOC或者FMOC)所保護(hù)。精氨酸-胍基功能團(tuán)與Z-OSU的反應(yīng)通過加入如N-羥基琥珀酰亞胺的試劑被封阻。
實(shí)驗(yàn)方法將MFP(SEQ ID NO:24)(270mg)溶解在水(20mL)中，同時(shí)加入二噁烷(4mL)和680μL的O.1N HCl(以確保兩個(gè)精氨酸-胍基功能團(tuán)上形成鹽)。在反應(yīng)之前，加入78mg N-羥基琥珀酰亞胺和104.7μL三乙胺以保護(hù)His氮，然后在整個(gè)溶液中加入169mg Z-OSU、146mg BOC-OSU、135mg ADOC氟化物或者229mg FMOC-OSU，并伴隨冷卻。
然后在室溫下攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)，其后在真空中干燥。用二氯甲烷(兩次)然后用乙腈(兩次)細(xì)心地研磨所產(chǎn)生的殘?jiān)?。通過過濾收集產(chǎn)物并在真空中干燥。Z保護(hù)的微型融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)量是300mg,BOC保護(hù)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量是295mg,ADOC保護(hù)的和FMOC保護(hù)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量是310mg。
利用保護(hù)的和無保護(hù)的肽由薄層層析對具有各自保護(hù)基團(tuán)的微型融合蛋白質(zhì)的完全反應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)。在薄層二氧化硅平板(洗脫液∶苯酚∶H2O=775∶225)上檢驗(yàn)完全反應(yīng)。當(dāng)利用540mg MFP(SEQ ID NO:24)時(shí)Z-OSU反應(yīng)的產(chǎn)率是75％，并且該產(chǎn)率相對于利用其它封阻劑所發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)率來說是典型的。7．產(chǎn)生保護(hù)性ECF2-Ala片段的保護(hù)性微型融合蛋白質(zhì)的切割7.1利用羥胺的切割為了釋放為氨基酸序列所生物保護(hù)的α-氨基，用羥胺在Asn和Gly之間切割微型融合蛋白質(zhì)成為Z-保護(hù)的ECF2-Ala片段(SEQ ID NO:23)和24個(gè)氨基酸長的包含Trp的片段。羥胺緩沖液的組成與3.1部分所描述的相同。
在260mg Z-保護(hù)的微型融合蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:24)中加入羥胺緩沖液(26mL)，然后超聲處理(20秒)全部溶液并用4M氫氧化鋰調(diào)整pH至pH10.0。在30℃和pH10.0下培養(yǎng)所產(chǎn)生的混合液多達(dá)5小時(shí)。然后利用濃乙酸調(diào)整pH至6.0。
每小時(shí)取出一等分試樣，Z-保護(hù)性微型融合蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:24)切割成為Z-保護(hù)性ECF2-Ala片段(SEQ ID NO:23)的程度則由HPLC分析(C18 Vydac,5×300mM，緩沖液A:0.1％三氟乙酸；緩沖液B:0.1％三氟乙酸，5％體積水，95％乙腈；5％緩沖液A至68％緩沖液B的線性梯度；1ml/min)測定。羥胺切割的終止如在3.1部分中所描述的一樣。
利用Vydac C18柱由HPLC分析得自C8柱的級分。用于HPLC的緩沖液是那些以前所描述的緩沖液。流速是1mL/min。用41％緩沖液A至71％緩沖液B的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。檢測在210nm進(jìn)行。獲得總計(jì)156mg的Z-保護(hù)性ECF2-Ala(“Z-ECF2-Ala”(SEQ ID NO:23))，相應(yīng)的產(chǎn)率為60％。
7.2 Z-ECF2-Ala的純化利用半制備C8 HPLC純化Z-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)。將Z-ECF2-Ala(160mg)溶解在5M乙酸(5mL)中，其后加入緩沖液A(100mM乙酸，5％乙腈)(5mL)。然后將樣品裝載在半制備HPLC C8柱上(細(xì)節(jié)如3.2部分一樣)。在羥胺切割和純化之后，獲得120mg Z-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，對于C8純化步驟來說相應(yīng)的產(chǎn)率為75％。
為了進(jìn)一步純化Z-ECF2-Ala(SEQ ID NO:23)，如以上5.3部分所描述的一樣利用半制備聚磺乙基天冬酰胺HPLC。利用這一方法，可獲得59mg 95-98％的純Z-ECF2-Ala，相應(yīng)的產(chǎn)率為85.5％。8．ECF2-酰胺和ECF1-OMe的縮合在有非酶促偶聯(lián)試劑的情況下，可以偶聯(lián)按照實(shí)施例4產(chǎn)生的酰胺化的ECF2(SEQ ID NO:6)和環(huán)狀Elcatonin片段ECF1(SEQ ID NO:7)。例如，在ECF1(SEQ ID NO:3)(Thr和Ser的側(cè)鏈羥基作為芐醚被保護(hù))和ECF2-酰胺(SEQ ID NO:2)(具有Lys、Ser、Thr和/或Glu殘基的活性側(cè)鏈基團(tuán)被保護(hù))的溶液中，可以加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)。在大約0℃下攪拌反應(yīng)8小時(shí)。在這一期間的片段縮合之后的是HPLC分析。在反應(yīng)終止之后，可以通過加入1％三氟乙酸來稀釋上述混合物。產(chǎn)物Elcatonin(SEQ ID NO:13)可以由制備HPLC純化?？梢杂蒆PLC分離和純化未反應(yīng)的ECF2-酰胺(SEQ ID NO:2)，并使之再循環(huán)。9．Z-ECF2與ECF1的化學(xué)偶聯(lián)利用碳二亞胺或者疊氮化物方法(參見，例如Greenstein等，氨基酸的化學(xué)，卷2,John Wiley，紐約，pp 804ff,1016ff,1961)，可以實(shí)現(xiàn)Z-ECF2-Ala片段(即具有為芐氧羰基所保護(hù)的側(cè)鏈氨基的EFC2-Ala)的自由α-氨基與肽片段ECF1的自由C末端α-羧基基團(tuán)的偶聯(lián)。典型地，通過加入Z-ECF2-Ala片段至活化的酯(從ECF1片段的C末端α-羧酸形成)中實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)由氫解可以實(shí)現(xiàn)從偶聯(lián)產(chǎn)物中除去Cbz保護(hù)基團(tuán)，所產(chǎn)生的產(chǎn)物則由制備性HPLC純化從而產(chǎn)生Elcatonin-Ala(即“ECF1-ECF2-Ala”；SEQ ID NO:31)。10．Elcatonin-Ala向Elcatonin-酰胺的轉(zhuǎn)變利用在第4部分中所描述的方法，可以使按照第9部分產(chǎn)生的Elcatonin-Ala(SEQ ID NO:31)肽酰胺化?？梢约兓０坊腅lcatonin(SEQ ID NO:13)，其后利用在5.3和5.4部分中所描述的方法可以使之脫鹽。
雖然已按照各種具體的和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)描述了本發(fā)明。然而，應(yīng)該明白的是可以進(jìn)行許多變化和修飾而保持在本發(fā)明的精神與范圍之內(nèi)。
本說明書中所涉及的出版物表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)水平，并且這些出版物相同程度地引入本文作為參考，如同每一種出版物被具體地和單獨(dú)地引述。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱BioNebraska,Inc.
(B)街道西北第46街3820號(C)城市Lincoln(D)州Nebraska(E)郵政編碼(ZIP)68524(F)國家美國(ⅱ)發(fā)明名稱降鈣素的重組制備方法和其在制備降鈣素和相關(guān)類似物中的用途(ⅲ)序列數(shù)50(ⅳ)通訊地址(A)地址Merchant&Gould(B)街道3100 Norwest Center,90 S.7th Street(C)城市Minneaplis(D)州明尼蘇達(dá)(E)國家美國(F)ZIP:55402(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ版本1.5(ⅵ)當(dāng)前的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)栁粗?B)申請日期1997年2月4日(C)分類號(ⅶ)在先中請的數(shù)據(jù)
(A)申請?zhí)?8/595,868(B)申請日06-FEB-1996(ⅷ)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)名稱CARTER,Charles G./BRUESS,Steven C.
(B)注冊號35,093/34,130(C)證書號8648.59WO01(ⅸ)電訊信息(A)電話612/371-5278/612/336-4711(B)傳真612/336-4751(C)電傳(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置24(D)其它信息/注=具有-OH、-NH2、氨基酸或者多肽的α-羧基(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro Xaa20(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro20(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置1...6(D)其它信息注=在位置1和6之間的L-氨基辛二酸鍵(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Xaa Xaa Leu Ser Thr Xaa Xaa Leu1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置1...6(D)其它信息注=在1和6位置之間的L-氨基辛二酸鍵(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置31...31(D)其它信息注=具有-OH、-NH2、氨基酸或者多肽的α-羧基(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Xaa Xaa Leu Ser Thr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:5的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度69個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...69(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT AAA CTG CAG ACT TAC CCG CGT ACT 48Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1 5 10 15GAC GTT GGT GCT GGT ACC CCG 69Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅱ)序列特征(A)長度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ))假設(shè)否(ⅳ)反義否
(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg1 5 10 15Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20(2)SEQ ID的NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置1...6(D)其它信息注=在1和6位置之間的L-氨基辛二酸鍵(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu1 5(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度47個(gè)堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GACGACGAAT TCGATATCTT AAGCCGGGGT ACCAGCACCA ACGTCAG 47(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度111個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅲ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置16...90(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GGATCCAAGC TTGTT AAC GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT AAA CTG CAG 51Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln1 5 10ACT TAC CCG CGT ACT GAC GTT GGT GCT GGT ACC CCG GCT TAAGATATCG AAT 103Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala15 20 25TCGTCGAC 111(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg1 5 10 15Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala20 25(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度864個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型
(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...864(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:ATG TCC CAT CAC TGG GGG TAC GGC AAA CAC AAC GGA CCT GAG CAC TGG48Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp1 5 10 15CAT AAG GAC TTC CCC ATT GCC AAG GGA GAG CGC CAG TCC CCT GTT GAC96His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp20 25 30ATC GAC ACT CAT ACA GCC AAG TAT GAC CCT TCC CTG AAG CCC CTG TCT 144Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser35 40 45GTT TCC TAT GAT CAA GCA ACT TCC CTG AGG ATC CTC AAC AAT GGT CAT 192Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His50 55 60GCT TTC AAC GTG GAG TTT GAT GAC TCT CAG GAC AAA GCA GTG CTC AAG 240Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys65 70 75 80GGA GGA CCC CTG GAT GGC ACT TAC AGA TTG ATT CAG TTT CAC TTT CAC 288Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His85 90 95TGG GGT TCA CTT GAT GGA CAA GGT TCA GAG CAT ACT GTG GAT AAA AAG 336Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys100 105 110AAA TAT GCT GCA GAA CTT CAC TTG GTT CAC TGG AAC ACC AAA TAT GGG 384Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly115 120 125GAT TTT GGG AAA GCT GTG CAG CAA CCT GAT GGA CTG GCC GTT CTA GGT 432Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly130 135 140ATT TTT TTG AAG GTT GGC AGC GCT AAA CCG GGC CTT CAG AAA GTT GTT 480Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val145 150 155 160GAT GTG CTG GAT TCC ATT AAA ACA AAG GGC AAG AGT GCT GAC TTC ACT 528Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr165 170 175AAC TTC GAT CCT CGT GGC CTC CTT CCT GAA TCC TTG GAT TAC TGG ACC 576Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr180 185 190TAC CCA GGC TCA CTG ACC ACC CCT CCT CTT CTG GAA TGT GTG ACC TGG 624Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp195 200 205ATT GTG CTC AAG GAA CCC ATC AGC GTC AGC AGC GAG CAG GTG TT3 AAA 672Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys210 215 220TTC CGT AAA CTT AAC TTC AAT GGG GAG GGT GAA CCC GAA GAA CTG ATG 720Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met225 230 235 240GTG GAC AAC TGG CGC CCA GCT CAG CCA CTG AAG AAC AGG CAA ATC AAA 768Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys245 250 255GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAC AAC GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT 816Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His260 265 270AAA CTG CAG ACT TAC CCG CGT ACT GAC GTT GGT GCT GGT ACC CCG GCT 864Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala275 280 285(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度288個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp1 5 10 15His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp20 25 30Ile Asp Thr His Thr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser35 40 45Val Ser Tyr Asp Gln Ala Thr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His50 55 60Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys65 70 75 80Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Ile Gln Phe His Phe His85 90 95Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Lys Lys100 105 110Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly115 120 125Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly130 135 140Ile Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val145 150 155 160Asp Val Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr165 170 175Asn Phe Asp Pro Arg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr180 185 190Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp195 200 205Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys210 215 220Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly Glu Pro Glu Glu Leu Met225 230 235 240Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Ile Lys245 250 255Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His260 265 270Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala275 280 285(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否
(ⅴ)片段類型C末端(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置1...6(D)其它信息注=在1和6位置之間的L-氨基辛二酸鍵(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His1 5 10 15Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn15(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個(gè)堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...15(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GAC GAC GAC GAT AAA 15Asp Asp Asp Asp Lys 151 5(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅵ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Asp Asp Asp Asp Lys1 5(2)SEQ ID NO:17的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度12個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...12(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:ATT GAA GGA AGA 12Ile Glu Gly Arg1(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Ile Glu Gly Arg1(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...24(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CAT CCT TTT CAT CTG CTG GTT TAT 24His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 5(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否
(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr1 5(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Glu Ile Lys Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅱ)序列特征(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C末端
(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1 5 10 15Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Xaa20(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1 5 10 15Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala20(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度48個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Glu Ile Lys1 5 10 15Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Asn Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His20 25 30Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala35 40 45(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Glu Ile Lys1 5 10 15Ala(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:AGCTTTCGTT GACGACGACG ATATCTT27(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅸ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:AGCTAAGATA TCGTCGTCGT CAACGAA27(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否
(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置24...24(D)其它信息/注=鄰-NO2-苯基甘氨酸酰胺(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1 5 10 15Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Xaa20(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型C末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr1 5 10 15Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro20(2)SEQ ID NO:30的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置1...6(D)其它信息/注=在1和6位置之間的L-氨基辛二酸鍵(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His1 5 10 15Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Xaa20 25 30(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端
(ⅵ)原始來源(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞其它(B)位置1...6(D)其它信息/注=在1和6位置之間的L-氨基辛二酸鍵(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His1 5 10 15Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro Ala20 25 30(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:GGATCCAAGC TTGTTA16(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:GTCGACGAAT TCGATA16(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)長度48個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:GGATCCAAGC TTGTTAACGG TAAACTGTCT CAGGAGCTCC ATAAACTG 48(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長度47個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否
(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:CTGACGTTGG TGCTGGTACC CCGGCTTAAG ATATCGAATT CGTCGAC 47(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)長度57個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:GGTACCAGCA CCAACGTCAG TACGCGGGTA AGTCTGCAGT TTATGGAGCT CCTGAGA57(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否
(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu1 5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu1 5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Asp Leu1 5 10 15His Lys Leu Gln Thr Phe Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ala Gly Val Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Lys Leu Ser Gln Asp Leu1 5 10 15His Lys Leu Gln Thr Phe Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ala Gly Val Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:Cys Ala Ser Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu1 5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe1 5 10 15Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Leu1 5 10 15Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Asp Ile Gly Val Val Ala Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:44的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44:Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Ser Ala Tyr Trp Arg Asn Leu1 5 10 15Asn Asn Phe His Arg Phe Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Ser Ala Tyr Trp Lys Asp Leu1 5 10 15Asn Asn Tyr His Arg Phe Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:46的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否
(ⅴ)片段類型N末端(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46:Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Ser Ala Tyr Trp Lys Asp Leu1 5 10 15Asn Asn Tyr His Arg Tyr Ser Gly Met Gly Phe Gly Pro Glu Thr Pro20 25 30(2)SEQ ID NO:47的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47:AGCTTTCGTT GACGACGACG ATATCTTA 28(2)SEQ ID NO:48的信息(ⅰ)序列特征(a)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否
(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48:AAGCAACTGC TGCTGCTATA GAATCGA27(2)SEQ ID NO:49的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49:Lys Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Ile Leu15 10(2)SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)序列特征(A)長度84個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否
(ⅴ)片段類型(ⅵ)原始來源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50:GGCTCCAAGC TTGTTAACGG TAAACTGTCT CAGGAGCTCC ATAAACTGCA GACTTACCCG60CGTACTGACG TTGGTGCTGG TACC 8權(quán)利要求
1．一種合成降鈣素片段的重組方法，該方法包括(a)重組形成一種融合蛋白，該融合蛋白包括通過一個(gè)切割位點(diǎn)連接到碳酸酐酶上的靶序列；以及(b)用一種切割試劑切割上述融合蛋白以產(chǎn)生包括靶序列的第一多肽，其中所說的靶序列包括具有下式的氨基酸序列A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者M(jìn)et,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala，以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸殘基或者多肽基團(tuán)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中-Xxx是具有α-C(O)NH2基團(tuán)的氨基酸殘基。
3．權(quán)利要求1的方法，其中A10是Gly；切割位點(diǎn)包括Asn-A10；切割步驟包括使融合蛋白與羥胺相接觸。
4．權(quán)利要求1的方法，其中-Xxx是-OH；該方法還包括使第一多肽與一種酰胺化劑進(jìn)行反應(yīng)以形成第二肽，其中-Xxx是-NH2。
5．權(quán)利要求1的方法，其中-Xxx包括氨基酸殘基；該方法還包括把Pro-XXX序列轉(zhuǎn)化成為C末端Pro-NH2殘基。
6．權(quán)利要求5的方法，其中轉(zhuǎn)化步驟包括用鄰硝基芐胺使-Xxx轉(zhuǎn)酰胺化以形成第三肽；以及光解第三肽以形成包括具有下式的氨基酸序列的第二肽A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-NH2(SEQ ID NO:2)
7．權(quán)利要求1的方法，其中A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ IDNO:1)序列是Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Xxx(SEQ ID NO:6)
8．權(quán)利要求1的方法，該方法包括使所述融合蛋白與一種保護(hù)試劑進(jìn)行反應(yīng)以形成一種保護(hù)的融合蛋白，所說的保護(hù)的融合蛋白包括具有被保護(hù)的氨基、羥基或者羧基活性側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基。
9．權(quán)利要求8的方法，該方法包括使所述融合蛋白與一種保護(hù)試劑進(jìn)行反應(yīng)以形成一種保護(hù)的融合蛋白，所說的保護(hù)的融合蛋白包括具有被保護(hù)側(cè)鏈氨基的Lys殘基。
10．權(quán)利要求1的方法，其中切割步驟包括使所述融合蛋白與切割試劑相接觸以形成一種微型融合蛋白質(zhì)，所說的微型融合蛋白質(zhì)包括具有下式的氨基酸序列接頭肽-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx
11．權(quán)利要求10的方法，其中微型融合蛋白質(zhì)具有下式Val-Asp-Asn-Trp-Arg-Pro-Ala-Gln-Pro-Leu-Lys-Asn-Arg-Glu-Ile-Lys-Ala-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Asn-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ala(SEQ ID NO:24)。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所說的碳酸酐酶是人碳酸酐酶Ⅱ，所說的切割試劑包括溴化氰。
13．權(quán)利要求11的方法，該方法還包括用羥胺切割上述微型融合蛋白質(zhì)以形成一種肽，該肽包括具有下式的氨基酸序列Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-Xxx(SEQ ID NO:6)
14．權(quán)利要求10的方法，該方法還包括使所述微型融合蛋白質(zhì)與一種保護(hù)試劑進(jìn)行反應(yīng)以形成一種保護(hù)的微型融合蛋白質(zhì)，所說的保護(hù)性微型融合蛋白質(zhì)包括具有被保護(hù)的氨基、羥基或者羧基活性側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基。
15．權(quán)利要求1的方法，其中所說的碳酸酐酶是人碳酸酐酶Ⅱ；所說的靶序列包括具有下式的氨基酸序列Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-AlaC(SEQ ID NO:23)，其中AlaC是C末端殘基；并且該方法還包括用鄰硝基苯基甘氨酰胺對-AlaC進(jìn)行轉(zhuǎn)肽基作用以形成一種第三肽；以及光解所說的第三肽以形成一種第二肽，所說的第二肽包括具有下式的氨基酸序列Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(SEQ ID NO:6)。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所說的切割位點(diǎn)包括Asn-A10；以及切割步驟包括使上述融合蛋白與羥胺相接觸。
17．一種核酸序列，該核酸序列包含一個(gè)具有下式的序列GGT AAA CTG TCT CAG GAG CTC CAT AAA CTG CAG ACT TACCCG CGT ACT GAC GTT GGT ACC CCG(SEQ ID NO:5)
18．一種用于產(chǎn)生降鈣素碳類似物的方法，該方法包括將下式的N末端片段
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,A8是Val或者M(jìn)et,R2是(CH2)4或者-CH(NH2)CH2S-S-，以及Y是OH、OR1,其中-R1是低級烷基；在非酶促偶聯(lián)試劑存在下與重組形成的具有下式的多肽縮合A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者M(jìn)et,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala，以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸殘基或者多肽基團(tuán)；形成具有下式的降鈣素衍生物
A16-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:48)。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所說的非酶促偶聯(lián)試劑包括N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑或者碳二亞胺。
20．權(quán)利要求18的方法，其中所說的非酶促偶聯(lián)試劑包括(ⅰ)N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺；(ⅱ)N-羥基琥珀酰亞胺和N-乙基-N’-二甲基氨丙基碳二亞胺或者(ⅲ)N-羥基苯并三唑和二環(huán)己基碳二亞胺。
21．一種用于產(chǎn)生降鈣素或者相關(guān)類似物的方法，該方法包括將一種具有下式的脫氨九肽
其中A2是Gly、Ser或者Ala,A3是Asn或者Ser,A8是Val或者M(jìn)et,以及Y是OH、OR1，其中-R1是低級烷基；在非酶促偶聯(lián)劑存在下與重組形成的具有下式的多肽縮合A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:1)其中A10是Gly或者Ser,A11是Lys、Thr或者Ala,A12是Leu或者Tyr,A13是Ser、Thr或者Trp,A14是Gln、Lys或者Arg,A15是Glu、Asp或者Asn,A16是Leu或者Phe,A17是His或者Asn,A18是Lys或者Asn,A19是Leu、Tyr或者Phe,A20是Gln或者His,A21是Thr或者Arg,A22是Tyr或者Phe,A23是Pro或者Ser,A24是Arg、Gly或者Gln,A25是Thr或者M(jìn)et,A26是Asp、Ala、Gly或者Asn,A27是Val、Leu、Ile、Phe或者Thr,A29是Ala、Val、Pro或者Ser,A30是Gly、Val或者Glu,A31是Thr、Val或者Ala，以及-Xxx是-OH、-NH2、氨基酸殘基或者多肽基團(tuán)；形成具有下式的降鈣素衍生物
A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-Gly-A29-A30-A31-Pro-Xxx(SEQ ID NO:4)
全文摘要
本發(fā)明提供了一種降鈣素片段的重組制備方法和該片段在制備降鈣素和相關(guān)類似物中的用途。該方法包括重組形成融合蛋白,該融合蛋白包括連接到碳酸酐酶上的降鈣素片段。其后切割重組形成的融合蛋白以產(chǎn)生包括降鈣素片段的多肽。本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生降鈣素碳類似物的方法,該方法包括使重組形成的降鈣素片段與脫氨九肽縮合。
文檔編號C12N15/16GK1217724SQ97193123
公開日1999年5月26日 申請日期1997年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月6日
發(fā)明者F·W·瓦格內(nèi), J·S·斯多特, D·B·亨里克森, B·E·帕特里德格, B·霍姆斯特, J·A·弗蘭克 申請人:柏內(nèi)布拉斯加公司