專(zhuān)利名稱(chēng)：新的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶和編碼該酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)，其識(shí)別糖類(lèi)中特異性的糖鏈結(jié)構(gòu)并且向其中導(dǎo)入GlcNAc β1→4分支結(jié)構(gòu)。
背景領(lǐng)域1．糖蛋白自然中大多數(shù)蛋白并非是僅由氨基酸所組成的簡(jiǎn)單蛋白，而是具有糖鏈和其它物質(zhì)如磷酸基和脂類(lèi)附著其上的“成熟”蛋白。因此，由大腸桿菌制備的簡(jiǎn)單蛋白型產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)包括多種問(wèn)題因?yàn)樵摦a(chǎn)物缺乏蛋白的成熟過(guò)程。因?yàn)槌贁?shù)例外，所有分泌型生理活性蛋白(如細(xì)胞因子)均為糖蛋白，故糖鏈的功能和作用在開(kāi)發(fā)生物藥物中受到極高的重視。
糖蛋白中的糖鏈粗略地分為Asn-連接型、粘蛋白(mucin)-型、O-連接的GlcNAc型、GPI錨定型和蛋白聚糖型[makoto Takeuchi，“糖生物學(xué)系列5糖技術(shù)”，Kihata,Hakomori和Nagai(編)，Kodansha科學(xué)公司，(1994),191-208]。這些糖鏈類(lèi)型的每一種具有其自己的生物合成途徑和各自的生理功能。Asn-連接的糖鏈廣泛分布于霉菌、酵母、昆蟲(chóng)、植物和動(dòng)物中。Asn-連接的糖鏈的基本生物合成途徑在不同種間是保守的(

圖1)。代表具體種類(lèi)的糖鏈在核心糖鏈部分的外側(cè)(稱(chēng)為“非還原性末端一側(cè)”)形成，這在Asn-連接的糖鏈的生物合成中是常見(jiàn)的。其中的α1,3-和α1,2-分支甘露糖殘基通過(guò)α1,6鍵延伸而附著到主鏈的甘露聚糖型糖鏈?zhǔn)钦婢缃湍傅奶卣餍蕴擎溄Y(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖版2)[Hiroshi Nakajima，糖鏈技術(shù)，工業(yè)調(diào)查協(xié)會(huì)(Industry Survey Association(1992),384-397]。另一方面，在昆蟲(chóng)、植物和動(dòng)物中，未觀察到甘露糖殘基的延伸；相反，形成了高甘露糖型糖鏈，其為由多萜醇中間體轉(zhuǎn)移而來(lái)且僅修整(trimmed)過(guò)糖鏈(見(jiàn)圖2中c版)。具有特征性木糖等的獨(dú)特結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2中b版)也在昆蟲(chóng)、植物和軟體動(dòng)物中觀察到。在動(dòng)物中，觀察到特征性糖鏈結(jié)構(gòu)如復(fù)合型糖鏈(圖2中e版)和雜合型糖鏈(圖2中d版)；在前者中，GlcNAc分支結(jié)構(gòu)在曾經(jīng)修整過(guò)的糖鏈中形成，并且添加其它種單糖如半乳糖和唾液酸形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；在后者，既存在復(fù)合型糖鏈又存在高甘露糖型糖鏈[Kiyoshi Furukawa，糖鏈技術(shù)，工業(yè)調(diào)查協(xié)會(huì)(1992),64-75]。
如上述的這種糖鏈存在于大多數(shù)細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白中，且認(rèn)為起決定細(xì)胞和蛋白性質(zhì)和特性的重要作用。其中，形成象從常見(jiàn)核心糖鏈延伸出天線一樣的分支的糖鏈結(jié)構(gòu)部分稱(chēng)為糖鏈分支結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)據(jù)信具有產(chǎn)生有機(jī)體識(shí)別配體(即糖鏈末端部分)的功能，由此高度自由地提供多位點(diǎn)識(shí)別機(jī)會(huì)和通過(guò)大大增加空間占據(jù)體積而使保護(hù)蛋白部分的能力最大化的另一功能(Takeuchi等，見(jiàn)上)。因此，通過(guò)控制糖鏈的分支結(jié)構(gòu)，用各種方式修飾生理功能，如糖蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性，體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和器官靶向特性是可能的?？紤]到這些，控制糖鏈分支結(jié)構(gòu)的技術(shù)預(yù)期成為下一代用于開(kāi)發(fā)“對(duì)人類(lèi)靈敏的”糖蛋白型藥物的生物技術(shù)。2．糖蛋白糖鏈的生理意義分泌型糖蛋白的糖鏈在糖蛋白的生物合成、細(xì)胞內(nèi)分組、抗原性的掩蔽、體內(nèi)穩(wěn)定性及器官-靶向特性中顯示出杰出的功能。已知細(xì)胞表面蛋白的糖鏈依細(xì)胞中的變化(如分化、轉(zhuǎn)變?yōu)椴B(tài)、癌變)而變化。特別地，已報(bào)道在腫癌的遷移和糖鏈分支結(jié)構(gòu)之間存在著密切的相關(guān)性。(1)抗原性的掩蔽(Masking of Antigenicity)據(jù)認(rèn)為就空間結(jié)構(gòu)而言糖鏈具有高度的自由度且因此象推進(jìn)器一樣自由地移動(dòng)。因此，蛋白分子如蛋白酶和抗不具對(duì)糖鏈親和性蛋白的抗體被糖鏈所隔開(kāi)且因此不能夠達(dá)到蛋白部分。結(jié)果，即使在靠近糖鏈結(jié)合位點(diǎn)的肽部分具有抗原性，抗體分子仍然不能夠接近肽部分。這樣，抗原-抗體反應(yīng)極難發(fā)生。此外，當(dāng)糖蛋白被巨噬細(xì)胞捕獲且降解產(chǎn)物以抗原形式給出，受體難以接近糖鏈結(jié)合位點(diǎn)附近的肽。因此，抗原性刺激難以發(fā)生。實(shí)際上，據(jù)報(bào)導(dǎo)當(dāng)糖鏈被導(dǎo)入到卵清蛋白溶菌酶抗原性肽中部時(shí)，MHCⅡ類(lèi)分子與該抗原的結(jié)合受到異常抑制[Mouritsen,S.,Meldal,M.,Christiansen-Brams,I.,Elsner,H.和Werdelin,O.，歐洲免疫學(xué)雜志，(1994),24,1066-1072]。隨著糖鏈占據(jù)體積的變大，抗原性的這種掩蔽效應(yīng)變得更大。因此，認(rèn)為開(kāi)發(fā)分支結(jié)構(gòu)大大有助于這種掩蔽的效應(yīng)。(2)體內(nèi)穩(wěn)定性關(guān)于以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞作為宿主而制備的第一種糖蛋白型藥物的紅細(xì)胞生成素，其糖鏈的功能已被徹底研究過(guò)。結(jié)果，顯示紅細(xì)胞生成素的糖鏈抑制其與其受體的結(jié)合但對(duì)維持活性結(jié)構(gòu)和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的改進(jìn)起決定作用；總之，糖鏈顯示出對(duì)紅細(xì)胞生成素藥物學(xué)活性的表達(dá)至關(guān)重要(Takeuchi,M和Kobata,A.，糖生物學(xué)(1991),1,337-346]。特別地，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生成素糖鏈天線數(shù)目和紅細(xì)胞生成素的藥物學(xué)效應(yīng)之間存在著強(qiáng)烈的相關(guān)性，且因此從未引起注意的分支結(jié)構(gòu)(由GlcNAc殘基附著到核心糖鏈而形成的分支結(jié)構(gòu))的重要性首次被弄清[Takeuchi,M.,Inoue,N.,Strickland,T.W.,Kobata,M.,Wada,M.,Shimizu,R.,Hoshi,S.,Kozutsumi,H.,Takasaki,S.和Kobata,A.，美國(guó)自然科學(xué)院院刊(1989),86,7819-22]。上面現(xiàn)象的主要原因解釋如下沒(méi)有發(fā)達(dá)分支結(jié)構(gòu)的紅細(xì)胞生成素在腎臟內(nèi)很快被清除且，結(jié)果，該紅細(xì)胞生成素在體內(nèi)的存留時(shí)間變短[Misaizu,T,Matsuki,S.,Strickland,T.W.,Takeuchi,M.,Kobata,A.和Takasaki,S.，血液，(1995),86,4097-4104]。(3)器官靶向性大多數(shù)生物組織具有凝集素樣受體且然后用于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用或從血液中攝入糖蛋白。肝臟中的脫唾液酸蛋白結(jié)合凝集素是對(duì)老化糖蛋白清除系統(tǒng)的一個(gè)代表性實(shí)例[Toshihiro Kawasaki,Sugar糖鏈技術(shù)，工業(yè)調(diào)查協(xié)會(huì)(1992),125-136]。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞(Kawasaki，見(jiàn)上)中含的選擇蛋白和存在于巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的凝集素受體(Kawasaki，見(jiàn)上)是眾所周知的。此外，已知不僅糖蛋白而且細(xì)胞用糖鏈作為配體而聚集于特異的組織中。骨髓細(xì)胞的歸巢(homing)[Tatsuo Irimura，“糖生物學(xué)系列3細(xì)胞社會(huì)中的糖生物學(xué)”，Katsutaka Nagai,Senichiro Hakomori和AkiraKobata(編)，Kodansha科學(xué)公司，(1993),127-175]和纂集噬中性細(xì)胞至炎癥區(qū)(Irimura，見(jiàn)上)的事例已詳細(xì)研究過(guò)。將所有這些事加起來(lái)，可很好地認(rèn)為糖蛋白和細(xì)胞，通過(guò)其糖鏈結(jié)構(gòu)，對(duì)在血液循環(huán)中呈現(xiàn)出凝集素受體的特異性器官或組織具有靶向性，盡管這種靶向系統(tǒng)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)于所有器官中。這意味著通過(guò)糖鏈的藥物運(yùn)輸是可能的。在該藥物運(yùn)輸中，凝集素對(duì)糖鏈的親和性劇烈地受糖鏈配體自由度和數(shù)目的影響。因此，糖鏈的分支結(jié)構(gòu)將在這種藥物運(yùn)輸中成為最重要的因素。(4)細(xì)胞向病態(tài)的轉(zhuǎn)變和其糖鏈分支結(jié)構(gòu)的相關(guān)性[Junko Kato,Naoko Suzuki，“糖鏈技術(shù)和藥物開(kāi)發(fā)”，藥物副作用所致?lián)p傷的減輕與研究基金會(huì)(編)，Yakugyo-Jiho-Sha,(1994),107-13214]。
一旦稱(chēng)為L(zhǎng)-PHA的植物凝集素開(kāi)發(fā)成探針以檢測(cè)多-分支型糖鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，檢測(cè)各種病態(tài)組織樣品變?yōu)榭赡?。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一種趨勢(shì)，即有些類(lèi)型癌細(xì)胞，特別是具有高度遷移能力的癌細(xì)胞用L-PHA能很好地被染色。這樣，研究人員便注意到糖鏈分支結(jié)構(gòu)與癌細(xì)胞遷移能力的相關(guān)性。人類(lèi)絨毛膜促性腺蛋白(hCG)為在胚胎早期絨毛組織中進(jìn)行活躍生物合成的糖蛋白激素。由于相當(dāng)多的hCG釋放到尿液中，hCG在臨床上被用作妊娠的指標(biāo)。主要通過(guò)單一和雙重天線(biantennary)復(fù)合型鏈而形成的Asn-連接糖鏈?zhǔn)莌CG特征性糖鏈。隨著從絨毛膜上皮癌至侵襲性葡萄胎和從侵襲性葡萄胎至絨毛膜癌而癌逐漸增加其惡性，據(jù)報(bào)道2,4,2型三-天線糖鏈和異常雙天線糖鏈(兩者分別通過(guò)GnT-Ⅳ-對(duì)正常雙天線和單一-天線糖鏈的作用而形成)出現(xiàn)于hCG的糖鏈中[Katsuko Yamashita，蛋白、核酸和酶(1992),37,1880-1888]。由于該現(xiàn)象的原因，已表明隨著絨毛膜癌惡性的進(jìn)展GnT-Ⅳ活性增加。
γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶(γ-GTP)是在肝臟中尤為豐富的糖蛋白。由于當(dāng)有肝病時(shí)血清γ-GTP水平劇烈升高,該水平被用作肝病的診斷指標(biāo)。此外，Yamashita等[Yamashita,K.,Totani,K.,Iwaki,Y.,Takamisawa,I.,Takeishi,N.,Higashi,T.,Sakamoto,Y.和Kobata,A.，生物化學(xué)雜志，(1989),105,728-735]已發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞的癌變，與異常hCG中情況一樣，γ-GTP的糖鏈結(jié)構(gòu)在其分支結(jié)構(gòu)中變化異常；因此，他們報(bào)導(dǎo)了癌變和GnT-Ⅳ激活的相關(guān)性。源自健康人肝細(xì)胞γ-GTP的Asn-連接的糖鏈主要由雙天線復(fù)合型糖鏈所組成，且具有少量三天線和四天線糖鏈混合其中。相反，在源自人肝癌細(xì)胞γ-GTP的Asn-連接的糖鏈中觀察到分支程度的異常增加。同時(shí)，盡管量較少，但出現(xiàn)高甘露糖型糖鏈和異常的雙天線糖鏈(兩者在正常細(xì)胞的γ-GTP中均未觀察到)。由于糖鏈結(jié)構(gòu)的這些變化，故表明有這樣的可能性即N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ(GnT-Ⅳ)和Ⅴ(GnT-Ⅴ)的激活與肝細(xì)胞癌變有關(guān)(Yamashita等，見(jiàn)上)。
另?yè)?jù)報(bào)導(dǎo)細(xì)胞中糖蛋白的糖鏈分支結(jié)構(gòu)受病毒感染而劇烈改變(Yamashita等，見(jiàn)上)。BHK細(xì)胞具有分支成四天線型的糖鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)BHK細(xì)胞以多瘤病毒感染時(shí)，在細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白糖鏈中雙天線型糖鏈減少，而四天線型糖鏈和N-乙酰乳糖胺重復(fù)結(jié)構(gòu)增加；總的來(lái)說(shuō)，分支數(shù)目的異常改變已被認(rèn)識(shí)到[Takasaki S.,Ikehira,H.和Kobata A.,生化、生物物理、研究通訊，(1980),90,(3),735-742]。由于上述的改變，GnT-Ⅳ、GnT-Ⅴ和i-GnT的激活可以考慮。3．與糖蛋白糖鏈分支結(jié)構(gòu)有關(guān)的酶動(dòng)物特征性糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)合型糖鏈具有復(fù)雜的分支結(jié)構(gòu)，其中的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)殘基以各種方式附著到常見(jiàn)的核心結(jié)構(gòu)上(Kiyoshi Furukawa，見(jiàn)上)(圖1)。由于此分支結(jié)構(gòu)與糖蛋白的體內(nèi)及體內(nèi)穩(wěn)定性、定位、生物學(xué)活性和藥物學(xué)特性密切相關(guān)(MakotoTakeuchi，見(jiàn)上)，分支結(jié)構(gòu)的生物合成過(guò)程已被詳細(xì)研究。通過(guò)用發(fā)明底物，H.Schachter等在母雞輸卵管中區(qū)分出多種酶活性繼而預(yù)言GlcNAc分支形成酶GnT-Ⅰ至GnT-Ⅵ的存在(GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶的分組；圖3)[Glesson,P.A.和Schachter,H.，生物化學(xué)雜志，(1983),258,6162-6173]。之后，GnT-Ⅰ[Kumar,R.,Yang,J.,Larsen,R.D.和Stanley P.，美國(guó)自然科學(xué)院院刊，(1990),87,9948-9952；Sarkar,M.,Hull,E.,Nishikawa,Y.,Simpson,R.J.,Moritz,R.L.,Dunn,R,和Schachter,H.，美國(guó)自然科學(xué)院院刊，(1991),88,234-238],GnT-Ⅱ[D′Agostaro,GA.,Zingoni,A.,Moritz,RL.,Simpson,RJ.,Schachter,H.和Bendiak,B.，生物化學(xué)雜志，(1995),270,15211-21],GnT-Ⅲ[Nishikawa,A.,Ihara,Y.,Hatakeyama,M.,Kangawa,K.和Taniguchi,N.,生物化學(xué)雜志，(1992),267,18199-18204]和GnT-Ⅴ[Shorebah,M.G.,Hindsgaul,O.和Pierce,M.,生物化學(xué)雜志，(1992),267,2920-2927；Gu,J,Nishikawa,A.,Turuoka,N.,Ono,M.,Yamaguchi,N.,Kangawa,K.,和Taniguchi,N.，生化雜志，(1993),113,614-619]被相繼純化，且其基因已被克隆。然而，僅具有這些已知的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶，是不可能形成發(fā)現(xiàn)于人血液糖蛋白[Yoshima,K.,Tsuji,T.,Irimura,T.和Osawa,T.生物化學(xué)雜志，(1984),256,10834-10840]和細(xì)胞生成素[Takeuchi,M.,Takasaki S.,Shimada,M.和Kobata,A.，生化化學(xué)雜志，(1990),265,12127-12130]中α1酸性糖蛋白中的主要糖鏈(四天線型；見(jiàn)下面的公式)。因此，已尋找預(yù)期在GnT-Ⅳ中具有該底物特異性和反應(yīng)特異性的N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶作為缺失的環(huán)節(jié)。

四天線型糖鏈結(jié)構(gòu)除上述那些酶外，下面的N-乙酰-葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶已被純化或其基因已被克隆作用于粘蛋白型糖鏈的轉(zhuǎn)移酶[Bierhuizen,M.F.,Maemura,K.和Fukuda,M.，生物化學(xué)雜志，(1994),269,4473-4479]，作用于糖脂的轉(zhuǎn)移酶，和形成稱(chēng)為I.i抗原結(jié)構(gòu)糖鏈表位的轉(zhuǎn)移酶[Kawashima,H.,Yamamoto,K.,Osawa,T和Irimura,T.，生物化學(xué)雜志，(1993),268,27118-27126；Bierhuizen,M.F.,Mattei,M.G.和Fukuda,M.，基因發(fā)育，(1993),7,468-478]。然而，這些轉(zhuǎn)移酶的底物特異性和由這些轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移的GlcNAc基因的結(jié)合模式不同于GnT-Ⅳ。這些轉(zhuǎn)移酶中任何一個(gè)不產(chǎn)生象GnT-Ⅳ產(chǎn)物的產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
以下是本發(fā)明的目的，包括提供具有β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(以下稱(chēng)為“GnT-Ⅳ”)活性的酶；編碼該酶的基因；包括該基因的重組DNA；含有重組DNA的細(xì)胞；用于制備具有GnT-Ⅳ活性酶蛋白包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法；和其中的糖鏈以GnT-Ⅳ修飾的糖類(lèi)。
為了解決上面的方案，本發(fā)明者進(jìn)行了深入而廣泛的研究。結(jié)果，發(fā)明者在牛小腸中分離純化一種GnT-Ⅳ酶蛋白，并對(duì)該蛋白的生化特性進(jìn)行了特征描述。然后，根據(jù)上面酶蛋白的部分氨基酸序列本發(fā)明者成功地從小腸cDNA文庫(kù)和mRNA中克隆出編碼牛GnT-Ⅳa的基因。此外，根據(jù)牛GnT-Ⅳa基因，本發(fā)明者又從人肝臟和人肺的cDNA文庫(kù)和mRNAs中分別成功地克隆出編碼人GnT-Ⅳa和人GnT-Ⅳb的兩個(gè)基因。通過(guò)證實(shí)這些基因產(chǎn)物顯示出GnT-Ⅳ活性而完成本發(fā)明。
本申請(qǐng)第一個(gè)發(fā)明涉及具有產(chǎn)生具有下面化學(xué)式所代表部分結(jié)構(gòu)糖類(lèi)活性的GnT-Ⅳ

用UDP-GlcNAc作為糖供體且用具有下面化學(xué)式所代表的部分結(jié)構(gòu)的糖類(lèi)作為糖受體

第二個(gè)發(fā)明涉及由顯示于SEQ ID NO:18中的氨基酸序列所組成的GnT-Ⅳ或由顯示于SEQ ID NO:18中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基添加、缺失或替代而仍產(chǎn)生GnT-Ⅳ活性的GnT-Ⅳ；由顯示于SEQ ID NO:24中的氨基酸序列所組成的GnT-Ⅳ或由顯示于SEQ ID NO:24中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍產(chǎn)生GnT-Ⅳ活性的GnT-Ⅳ；和由顯示于SEQ ID NO:37中的氨基酸序列所組成的GnT-Ⅳ或由顯示于SEQ ID NO:37中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍產(chǎn)生GnT-Ⅳ活性的GnT-Ⅳ。
第三個(gè)發(fā)明涉及編碼GnT-Ⅳ的GnT-Ⅳ基因，該GnT-Ⅳ由顯示于SEQ ID NO:18中的氨基酸序列所組成或由顯示于SEQ IDNO:18中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍產(chǎn)生GnT-Ⅳ活性；編碼GnT-Ⅳ的GnT-Ⅳ基因，該GnT-Ⅳ基因由顯示于SEQ ID NO:24中的氨基酸序列所組成或由顯示于SEQ ID NO:24中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍具有GnT-Ⅳ活性；編碼GnT-Ⅳ的GnT-Ⅳ基因，該GnT-Ⅳ基因由顯示于SEQ ID NO:37中的氨基酸序列所組成或由SEQ ID NO:37中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍產(chǎn)生GnT-Ⅳ活性；由顯示于SEQ ID NO:17中的核苷酸序列所組成的GnT-Ⅳ基因；由顯示于SEQ ID NO:23中的核苷酸序列所組成的GnT-Ⅳ基因；和由顯示于SEQ ID NO:36中的核苷酸序列所組成的GnT-Ⅳ基因。
第四個(gè)發(fā)明涉及可通過(guò)將上述GnT-Ⅳ基因中的任何一個(gè)插入到載體DNA中而獲得的重組DNA；和包括上述GnT-Ⅳ基因中任何一個(gè)基因的部分或全長(zhǎng)的染色體片段。
第五個(gè)發(fā)明涉及帶有上述重組DNA的宿主細(xì)胞；和其中人工導(dǎo)入有上述染色體片段的宿主細(xì)胞。
第六個(gè)發(fā)明涉及用于制備GnT-Ⅳ的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞和從得到的培養(yǎng)物中回收GnT-Ⅳ；以及用于制備GnT-Ⅳ的方法，包括從分泌物中、體液或源自上述宿主細(xì)胞的勻漿液回收GnT-Ⅳ酶。
第七個(gè)發(fā)明涉及用于從生物樣品中純化GnT-Ⅳ的方法。
第八個(gè)發(fā)明涉及其糖鏈結(jié)構(gòu)以GnT-Ⅳ修飾的糖。
以下，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明的GnT-Ⅳ基因可按下述方法分離。牛GnT-Ⅳa基因的分離首先，將從去污劑溶解的牛小腸微粒體級(jí)分用陰離子交換層析、銅螯合物層析、用底物類(lèi)似物的兩步親和層析及凝膠過(guò)濾進(jìn)行一系列的純化步驟繼而獲得GnT-Ⅳ酶的純化樣品。將得到的純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE且然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移的蛋白原樣或經(jīng)有限的水解后從氣相氨基酸測(cè)序儀進(jìn)行分析以獲得GnT-Ⅳ酶的部分氨基酸序列。
隨后，用從動(dòng)物細(xì)胞(即，牛小腸)提取的RNA作為模板用根據(jù)上面測(cè)得的部分氨基酸序列而設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR。此外，用通過(guò)RT-PCR獲得的片段作為探針，通過(guò)噬菌斑雜交從上面提到組織的cDNA文庫(kù)中篩選感興趣的GnT-Ⅳ基因。將在得到的陽(yáng)性噬菌斑中含有的cDNA片段切出并亞克隆到載體如pUC19中，然后分析其核苷酸序列。如果編碼感興趣蛋白的基因全長(zhǎng)沒(méi)有含在該片段中，用部分的該亞克隆cDNA片段作為探針再次進(jìn)行噬菌斑雜交?；蛘撸鶕?jù)上面獲得的核苷酸序列信息通過(guò)RACE等而獲得感興趣cDNA的末端部分。將這樣獲得的GnT-Ⅳ基因(后稱(chēng)為GnT-Ⅳa)進(jìn)行其全長(zhǎng)核苷酸序列的分析。將具有上面提到的核苷酸序列的基因翻譯成氨基酸序列。此氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:18中。人類(lèi)GnT-Ⅳa和GnT-Ⅳb基因的分離通過(guò)用從人組織(肝臟或肺)提取的RNA且根據(jù)上面獲得的牛GnT-Ⅳa基因核苷酸序列信息進(jìn)行PCR，然后從上面的組織中篩選cDNA文庫(kù)可獲得人GnT-Ⅳa和GnT-Ⅳb基因。將得到的人GnT-Ⅳa和GnT-Ⅳb基因進(jìn)行它們的全長(zhǎng)核苷酸序列分析。然后，將這些基因翻譯成氨基酸序列。這些氨基酸序列顯示于SEQ ID NOS:24和37。
為了獲得編碼顯示于SEQ ID NO:18、24或37中的氨基酸序列并具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代的DNA，可用多種方法。例如，以誘變劑處理DNA以誘導(dǎo)點(diǎn)突變或缺失突變的方法，包括選擇性切割DNA、去除或添加選擇的核苷酸且然后連接DNA的方法；點(diǎn)特異性誘變；等可被列舉。
本發(fā)明的GnT-Ⅳ蛋白可通過(guò)以下方法制備，包括制備其中的啟動(dòng)子下游插入通過(guò)上述方法而獲得的編碼本發(fā)明GnT-Ⅳ DNA的重組載體，將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并培養(yǎng)得到的細(xì)胞。用于此目的的載體DNA或者可以是質(zhì)粒DNA或者可以是噬菌體DNA。例如，可以使用顯示于后面所述實(shí)施例中的pSVL載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)。作為其中導(dǎo)入有得到的重組DNA的宿主細(xì)胞，可以使用在重組DNA技術(shù)中方便使用的任何細(xì)胞，例如，原核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、酵母、真菌及昆蟲(chóng)細(xì)胞。具體的實(shí)例包括作為原核細(xì)胞的大腸桿菌和作為動(dòng)物細(xì)胞的來(lái)自中國(guó)倉(cāng)鼠的CHO細(xì)胞和來(lái)自猴的COS細(xì)胞。
對(duì)每種宿主用常規(guī)的方法對(duì)上述宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，如果宿主為大腸桿菌，包括重組DNA的載體通過(guò)熱休克方法或電穿孔導(dǎo)入由鈣方法等而制備的感受態(tài)細(xì)胞中。如宿主為酵母，包括重組DNA的載體通過(guò)熱休克方法或電穿孔進(jìn)入由鋰方法等而制備的感受態(tài)細(xì)胞中。如果宿主為動(dòng)物細(xì)胞，包括重組DNA的載體通過(guò)磷酸鈣方法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或電穿孔法導(dǎo)入生長(zhǎng)期的細(xì)胞中。
通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)這樣獲得的轉(zhuǎn)化子，制備GnT-Ⅳ蛋白。
在轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)中，只要宿主能夠在其中存活可使用任何培養(yǎng)基，例如，如果宿主是大腸桿菌可以使用LB培養(yǎng)基等。如果宿主是酵母，可以使用YPD培養(yǎng)基等。如果宿主是動(dòng)物細(xì)胞，可以使用補(bǔ)充以動(dòng)物血清等的Dulbecco′s培養(yǎng)基。培養(yǎng)在常規(guī)用于宿主的條件下進(jìn)行。例如，如果宿主是大腸桿菌，細(xì)胞在約25-37℃，如果必要，通氣和/或振蕩下培養(yǎng)約3-24小時(shí)。如果宿主是酵母，細(xì)胞在約25-37℃，如果必要，通氣和/或振蕩下培養(yǎng)約12小時(shí)至2周。如果宿主是動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)在約32-37℃于5％CO2和100％濕度下，如果必要，改變通氣條件和/或振蕩下進(jìn)行24小時(shí)至2周。
培養(yǎng)后，用勻漿器、弗氏壓碎器、超聲處理、溶菌酶和/或凍融破碎培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞以從該微生物或細(xì)胞中洗脫出GnT-Ⅳ蛋白。然后，蛋白可獲自可溶性部分。如果感興趣的蛋白含在不溶性部分中，破碎微生物或細(xì)胞后通過(guò)離心收集不溶性部分。然后，該蛋白可用含鹽酸胍等的緩沖液溶解而用于回收。或者，將培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞可直接以含有蛋白變性劑和鹽酸胍的緩沖液破碎以從微生物或細(xì)胞中洗脫出感興趣的蛋白。
從上面的上清液中對(duì)GnT-Ⅳ蛋白的純化可通過(guò)實(shí)施例1中描述的方法完成?；蛘撸思兓赏ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合常規(guī)的分離/純化方法而進(jìn)行。這些常規(guī)的分離/純化方法包括，但不限于，離心、鹽析、溶劑沉淀、透析、超濾、分配層析、凝膠過(guò)濾、毛細(xì)管電泳、TLC、離子交換層析、金屬螯合層析、親和層析、反相層析及等電點(diǎn)聚焦。
按上述獲自牛小腸的GnT-Ⅳ酶蛋白的生化特性如下。(1)作用該酶蛋白產(chǎn)生具有下面化學(xué)式所代表的部分結(jié)構(gòu)的糖類(lèi)

用UDP-GlcNAc作為糖供體且用具有下面化學(xué)式所代表的部分結(jié)構(gòu)的糖類(lèi)作為糖受體

作為糖受體的糖類(lèi)意指寡糖、多糖、糖綴合物(糖肽、糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖)或其衍生物。(2)底物特異性當(dāng)糖受體是寡糖(寡糖結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4)時(shí)，酶蛋白對(duì)核心型寡糖顯示出0％的反應(yīng)性，對(duì)GnT-Ⅰ產(chǎn)物型寡糖顯示出54％的反應(yīng)性且對(duì)GnT-Ⅴ產(chǎn)物型寡糖顯示出164％的反應(yīng)性，其中將酶蛋白對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的反應(yīng)性看作100％。
酶蛋白對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出46％的反應(yīng)性，其中的巖藻糖通過(guò)α1→6鏈附著到還原性末端的GlcNAc上。
酶蛋白對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出0％的反應(yīng)性，其中α1→3甘露糖上的GlcNAc缺失。
酶蛋白對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出16％的反應(yīng)性，其中的半乳糖通過(guò)β1→4鍵附著到α1→6甘露糖上的GlcNAc中，且酶蛋白對(duì)下面的GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出0％的反應(yīng)性，該寡糖中的半乳糖通過(guò)β1→4鍵附著到α1→3甘露糖上的GlcNAc上。
酶蛋白對(duì)下面的GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出0％的反應(yīng)性，該寡糖中的GlcNAc通過(guò)β1→4鍵附著到β1→4甘露糖上。(3)分子量由SDS-PAGE(非變性條件下)測(cè)定約為66K。經(jīng)肽N-糖苷酶F處理后約60K。由于當(dāng)使用肽N-糖苷酶時(shí)觀察到帶的遷移，故認(rèn)為此酶蛋白是糖蛋白。
通過(guò)含有Triton Ⅹ-100的凝膠過(guò)濾而測(cè)得的表觀分子量為77K。因此，認(rèn)為GnT-Ⅳ不具有亞單位結(jié)構(gòu)且以單體起作用。
由此核苷酸序列推導(dǎo)的該酶蛋白部分由535個(gè)氨基酸殘基所組成且具有61614的分子量。(4)最適pH反應(yīng)的最適pH約為5.5。在pH6.5至8.0的范圍內(nèi)觀察到多于50％的最大活性。(5)抑制、激活和穩(wěn)定化(ⅰ)抑制該酶活性受添加20mM EDTA而受到抑制。
該酶受UDP衍生物抑制。抑制的強(qiáng)度按下面順序UDP＞＞UDP-Glc＞UDP-GalNAc＞＞2′-脫氧UDP＞UDP-己酸胺(hexanolamine)＞＞UDP-Gal＞UTP＞UDP-葡萄糖醛酸＞UMP。
尿苷、TDP及CDP不具有抑制效應(yīng)。
(ⅱ)激活二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)活性的表達(dá)是至關(guān)重要的。二價(jià)陽(yáng)離子中，Mn2+顯示出最大的效應(yīng)。在7.5mM的濃度時(shí)，Co2+和Mg2+的各自效應(yīng)約為Mn2-的70％，且Ca2+的效應(yīng)約為Mn2+的10％。在5-20mM的范圍中Mn2-的效應(yīng)是最大的。
(ⅲ)穩(wěn)定化在BSA和甘油中認(rèn)識(shí)到有穩(wěn)定效應(yīng)。(6)動(dòng)力學(xué)參數(shù)當(dāng)作為受體的糖為單糖時(shí)(單糖結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4)(ⅰ)其中的酶在50μl 125mM MOPS緩沖液(pH7.3)中于37℃反應(yīng)4小時(shí)的分析條件下，其中的緩沖液含有0.8mM的受體底物，20mM的UDP-GlcNAc,7.5mM的MnCl2,200mM的GlcNAc,0.5％(w/v)Triton X-100,10％的甘油和1％的BSA
對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的Km和Vmax值分別為0.73mM和3.23μM/分鐘。
對(duì)GnT-Ⅴ產(chǎn)物型寡糖的Km和Vmax值分別為0.13mM和1.75μM/分鐘。
當(dāng)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖為受體底物時(shí)，對(duì)UDP-GlcNAc的Km值為0.22mM。
(ⅱ)其中的酶在125mM MOPS緩中液(pH7.3)中于37℃反應(yīng)4小時(shí)的分析條件下，其中的緩沖液含有120mM的UDP-GlcNAc,7.5nM的MnCl2,0.5％(w/v)的Triton X-100,10％的甘油和1％的BSA對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的Km和Vmax值分別為0.59mM和0.74mM/分鐘/mg。
對(duì)GnT-Ⅴ產(chǎn)物型寡糖的Km和Vmax值分別為0.14mM和0.47mM/分鐘/mg。(7)GnT-Ⅳ家族牛GnT-Ⅳa和人GnT-Ⅳa之間同源性在核苷酸水平為91％且在氨基酸水平為96％。
所有從牛小腸中純化的GnT-Ⅳ中含有的部分氨基酸結(jié)構(gòu)均編碼于牛GnT-Ⅳa基因中。
人GnT-Ⅳb和人GnT-Ⅳa在核酸水平有63％的同源性且在氨基酸水平具有62％的同源性。然而，它們?cè)贑-末端和N-末端區(qū)域是完全不同的。
從上述的生化特性看，本發(fā)明的GnT-Ⅳ被認(rèn)為是一種新的酶因?yàn)樵撁改軌蛲瓿上旅娉Ｒ?guī)酶不能夠完成的反應(yīng)

附圖簡(jiǎn)述圖1顯示Asn-連接糖鏈的生物合成途徑。
圖2顯示Asn-連接糖鏈的變異(修改自位于Makoto Takeuchi,Wako Purechemical Newsletter 64,18-19,1996中的圖1)。
a．甘露聚糖型真菌如酵母和霉菌的特征性糖鏈結(jié)構(gòu)。
b．木-高-甘露糖型植物、軟體動(dòng)物和昆蟲(chóng)的特征性結(jié)構(gòu)。
c．高甘露糖型常見(jiàn)于植物、昆蟲(chóng)和動(dòng)物中的結(jié)構(gòu)。
d．雜合型常見(jiàn)于昆蟲(chóng)和動(dòng)物中的結(jié)構(gòu)。
e．復(fù)合型動(dòng)物的特征性結(jié)構(gòu)。
f．原核細(xì)胞沒(méi)有用于Asn-連接糖鏈生物合成的系統(tǒng)。
套于點(diǎn)線中的部分代表常見(jiàn)的核心糖鏈。
圖3顯示由各種GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶)對(duì)GlcNAc轉(zhuǎn)移的位置。
圖4顯示寡糖的命名和結(jié)構(gòu)。
圖5顯示對(duì)GnT-Ⅳ反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜。
圖6顯示由Q-Sepharose FF色譜對(duì)GnT-Ⅳ的分析結(jié)果。
圖7顯示通過(guò)銅螯合物Sepharose FF層析對(duì)GnT-Ⅳ的分析結(jié)果。
圖8顯示通過(guò)UDP-己酸胺(UDP-Hexanolamine)瓊脂糖親和層析(Ⅰ)對(duì)GnT-Ⅳ的分析結(jié)果。
圖9顯示通過(guò)UDP-己酸胺瓊脂糖親和層析(Ⅱ)對(duì)GnT-Ⅳ的分析結(jié)果。
圖10顯示通過(guò)Superdex200凝膠層析對(duì)GnT-Ⅳ的分析結(jié)果。
圖11為顯示純化GnT-Ⅳ SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳)結(jié)果圖。
圖12顯示純化GnT-Ⅳ的天然凝膠電泳及其活性的結(jié)果。
圖13顯示GnT-Ⅳ、-Ⅴ和Ⅵ產(chǎn)物型寡糖的Smith降解圖。
圖14顯示GnT-Ⅳ反應(yīng)產(chǎn)物的1H-NMR(30℃)結(jié)果。
圖15顯示GnT-Ⅳ的最適pH。
圖16顯示GnT-Ⅳ的最適Mn2+濃度。
圖17顯示GnT-Ⅳ反應(yīng)產(chǎn)物糖蛋白的SDS-PAGE和熒光層析分析結(jié)果。
道1和道2:7.6μg脫唾液酸人轉(zhuǎn)鐵蛋白道3:7.6μg唾液酸人轉(zhuǎn)鐵蛋白道4和道5:2.8μg脫唾液酸CHO細(xì)胞來(lái)源的重組人紅細(xì)胞生成素道6和道7:1.3μg脫唾液酸胎球蛋白道1、4和6代表反應(yīng)在無(wú)GnT-Ⅳ進(jìn)行的模擬實(shí)驗(yàn)。M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)(伯樂(lè))。PM代表預(yù)染的分子量標(biāo)記(伯樂(lè)，美國(guó))。
GnT-Ⅳ反應(yīng)條件向10μl含0.702mnol/hr的GnT-Ⅳ、相當(dāng)于1.6nmol的雙天線型糖鏈的底物糖蛋白(對(duì)于僅是胎球蛋白，糖鏈含量為1.6nmol)和450nCi的UDP-[14C]GlcNAc的溶液中，加入等體積的分析混合物(250mM MOPS緩沖液，pH7.3,400mM GlcNAc,20％甘油，1.0％(w/v)Triton X-100,15mM MnCl2,1mM UDP-GlcNAc)以獲得反應(yīng)溶液，將其于37℃孵育20小時(shí)。將得到溶液的十分之一通過(guò)SDS-PAGE和熒光自顯影進(jìn)行分析。
對(duì)于SDS-PAGE，使用10-20％的梯度膠(Daiichi Kagaku)。對(duì)于熒光自顯影，用Amplify(Amersham)將樣品暴露至X射線膠片20小時(shí)。當(dāng)點(diǎn)印跡至PVDF膜上后用ConA-HRP和POD-Immunostain試劑盒(Wako Purechemical)對(duì)糖蛋白中的雙天線糖鏈進(jìn)行觀察。
圖18顯示人GnT-Ⅳa的開(kāi)放閱讀框和含在pCore-His表達(dá)載體中的區(qū)域。
圖19顯示由單個(gè)細(xì)胞克隆產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素的等電點(diǎn)聚焦及Western分析結(jié)果。分別用2種產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素的菌株及其中導(dǎo)入有牛和人GnT-Ⅳa基因的相同菌株，通過(guò)等電點(diǎn)聚焦和用抗紅細(xì)胞生成素抗體的Western印跡對(duì)每種菌株分泌的紅細(xì)胞生成素進(jìn)行分析。在左側(cè)，顯示出PI標(biāo)準(zhǔn)的位置。
完成本發(fā)明的最佳方式下面，將參照下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述。然而，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。[參照實(shí)施例1](1)用于實(shí)施例中的試劑除非特別說(shuō)明，所用的試劑為由Wako Purechemical Industries公司生產(chǎn)的最高級(jí)別的產(chǎn)品。
(ⅰ)吡啶基胺化(Pyridylaminated)的寡糖所用的每種吡啶基胺化的寡糖按下述獲得。首先，根據(jù)Tokugawa等的方法[Biehuizen,M.F.,Mattei,M.G.和Fukuda,M.(1993)基因發(fā)育，7,468-478]從人轉(zhuǎn)鐵蛋白(apo型；Sigma，美國(guó))中制備吡啶胺化的寡糖。以一種或幾種下面的酶處理得到的材料產(chǎn)脲節(jié)桿菌來(lái)源的唾液酸酶(Nacalai Tesque)，曲霉類(lèi)來(lái)源的β-半乳糖苷酶(Toyobo)，刀豆來(lái)源的β-N-乙酰氨基己糖苷酶(Seikagaku公司)，CHO-K1細(xì)胞提取物(通過(guò)超聲處理位于2體積5mM Tris-HCl緩沖液中的CHO-K1細(xì)胞而獲得的上清，緩沖液pH7.5，含有2mMMgCl2和1mM PMSF)中的GnT-Ⅴ活性部分，位于牛小腸勻漿物溶解部分中的GnT-Ⅴ活性部分(對(duì)于制備方法，見(jiàn)實(shí)施例1中的“微粒體級(jí)分的制備”和“溶解”)。通過(guò)以上述的酶處于PA-糖鏈021和022(Takara Shuzo)制備部分的吡啶基胺化寡糖。在兩種情況，使用前通過(guò)用ODS柱(10×250mm；Vydac，美國(guó))的反相層析純化制備的寡糖。
(ⅱ)糖蛋白底物將牛胎球蛋白(Sigma，美國(guó))和CHO細(xì)胞來(lái)源的重組人紅細(xì)胞生成素(Kirim Brewery)進(jìn)行下面的預(yù)處理以將它們純化成相對(duì)一致的糖形式(glycoform)。簡(jiǎn)言之，將40-100mg糖蛋白應(yīng)用于以pH7.4，含有1mM MgCl2,1mM CaCl2和0.15M NaCl的10mM Tris-HCl緩沖液平衡的ConA-Sepharose柱(5ml；發(fā)瑪西亞，瑞典)以獲得具有低雙天線糖鏈含量作為非吸附部分的糖形式。之后，以含有1.0Mα-甲基甘露糖苷(Nacalai Tesque)的上述緩沖液洗脫柱以獲得吸收具有高雙天線糖鏈含量糖形式的部分。這樣，獲得具有低雙天線糖鏈含量的胎球蛋白和具有高雙天線糖鏈含量的紅細(xì)胞生成素。至于人轉(zhuǎn)鐵蛋白，沒(méi)有必要純化此糖蛋白因?yàn)閹缀跗渌械奶擎溇鶠殡p天線型。
將這樣獲得的胎球蛋白和人轉(zhuǎn)鐵蛋白于1ml pH5.0，含有4mMMgCl2的醋酸鈉緩沖液中以1U的唾液酸酶和0或107U的β-半乳糖苷酶于37℃反應(yīng)16小時(shí)以唾液酸(asialo)或脫唾液酸(asialo agalacto)的糖蛋白。具有高度雙天線型糖鏈含量的紅細(xì)胞生成素以與上述同樣的方式與0.5U的唾液酸酶和5U的β-半乳糖苷酶反應(yīng)以獲得脫唾液酸脫乳糖的糖蛋白。
這樣獲得的每種糖蛋白以pH7.3的50mM醋酸銨緩沖液透析。然后，用BSA(牛血清蛋白)作為標(biāo)準(zhǔn)以BCA蛋白分析儀(Pierce，美國(guó))測(cè)定蛋白的量。此外，通過(guò)SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析此蛋白。這樣制備的糖蛋白用于實(shí)施例中。
(ⅲ)RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))對(duì)于RT-PCR，使用Acess RT-PCR系統(tǒng)(Promega，美國(guó))。對(duì)于感興趣基因片段的擴(kuò)增，使用Pfu聚合酶(Stratagene，美國(guó))。(2)用于實(shí)施例中的設(shè)備(ⅰ)基因測(cè)序ABI PLISM 377 DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer，美國(guó))被使用。[參考實(shí)施例2]GnT-Ⅳ活性的特異性分析一般地，有2種用于分析GnT-Ⅳ活性的方法測(cè)定放射性標(biāo)記的GlcNAc向寡糖底物中轉(zhuǎn)移的方法和通過(guò)HPLC等分級(jí)分析GlcNAc向標(biāo)記的寡糖底物中轉(zhuǎn)移的方法。Taniguchi等開(kāi)發(fā)出一種用GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖作為受體同時(shí)測(cè)定GnT-Ⅲ、-Ⅳ和-Ⅴ活性的方法[Nishikawa,A.,Fujii,S.,Sugiyama,T.和Taniguchi,N.(1988)生化年鑒，170,349-354]。然而，此分析方法本身不適于在GnT-Ⅳ純化過(guò)程中的分析因?yàn)镚nT-Ⅳ的相對(duì)活性大大低于GnT-Ⅲ和-Ⅴ的活性。
因此，本發(fā)明者通過(guò)增加受體吡啶基胺化寡糖至10倍于用于前面分析系統(tǒng)中的量而開(kāi)發(fā)出用于定量選擇性地測(cè)定GnT-Ⅳ活性的方法[Tokugawa,K.,Oguri,S.和Takeuchi,M.(1996)糖綴合物雜志，13,53-56]，這種寡糖可容易地制備。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，GnT-Ⅳ活性按下述分析。
該酶在pH7.3的125mM MOPS[3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸]緩沖液中于37℃反應(yīng)4小時(shí)，MOPS緩中液中含有0.8mM吡啶基胺化的寡糖底物(GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖底物)，20mM UDP-GlcNAc,7.5mM MnCl2,200mM GlcNAc,0.5％(w/v)Triton X-100,10％甘油和1％BSA。然后，通過(guò)煮沸該溶液2分鐘而終止反應(yīng)。以0.45nm濾膜去除固體后，以O(shè)DS-80TM柱(4.6×150mm；TOSO)于50℃以pH4.0含有0.15％(w/v)n-丁醇的50mM醋酸銨緩沖液以1.2ml/分鐘的流速分析5μl的濾液。吡啶氨基的熒光用320nm的激發(fā)光和400nm的發(fā)射光加以檢測(cè)。[實(shí)施例1]酶的分離和純化(1)酶源的篩選通過(guò)利用上述的分析方法搜索待純化的GnT-Ⅳ酶的來(lái)源。如表1中所示，已發(fā)現(xiàn)牛小腸中GnT-Ⅳ對(duì)GnT-Ⅲ和GnT-Ⅴ的相對(duì)活性大大高于GnT-Ⅳ在任何其它組織中的相對(duì)活性。因此，選擇牛小腸作為純化的起始原料。
表1GnT-Ⅳ酶源的搜索

N.D.低于檢測(cè)極限1)數(shù)據(jù)來(lái)自Nishikawa,A.等，BBA 1035,313-318(1990)(2)純化除非特別說(shuō)明，否則所有操作均在4℃進(jìn)行。(ⅰ)微粒體級(jí)分的制備將2千克牛小腸(獲自肉類(lèi)加工廠)切碎。然后，向其中加入4體積的提取緩沖液(10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.4，含0.25M蔗糖，1mM苯甲磺酰氟，1mM鹽酸苯脒(benzamidine hydrochloride),1mM二硫蘇糖醇及10mg/ml抗蛋白酶)并從Polytron(Kinematica，瑞典)勻漿。得到的勻漿物以900×g離心10分鐘。然后，進(jìn)一步以105,000×g離心上清60分鐘以得到微粒體沉淀級(jí)分(樣品1)。(ⅱ)溶解以3體積通過(guò)添加Triton-100至提取緩沖液而制備的溶解緩沖液懸浮樣品1以得到1％的終濃度。通過(guò)以105,000×g離心60分鐘而獲得上清。再次懸浮沉淀并收集上清。合并第一及第二次提取物(樣品2)。(ⅲ)Q-Sepharose FF層析將樣品2應(yīng)用于Q-Sepharose FF柱(5×30cm；發(fā)瑪西亞，瑞典)，該柱以20mM Tris-HCl,pH7.4，含有1mM鹽酸苯脒，0.1％Triton X-100和20％甘油的操作緩沖液1預(yù)平衡且然后以0-0.5MKCl的線性梯度洗脫(圖6)(樣品3)。(ⅳ)銅螯合物Sepharose FF層析將樣品3應(yīng)用于以操作緩沖液2(通過(guò)向操作緩沖液1中加入KCl至0.15M而獲得)預(yù)平衡的銅螯合物Sepharose FF層析柱(5×10cm；發(fā)瑪西亞，瑞典)。然后以5體積的操作緩沖液2將沒(méi)有被吸收的部分洗出。之后，以0.01M的甘氨酸線性梯度洗脫吸收的部分(圖7)。合并得到的GnT-Ⅳ活性部分并以YM30超濾膜(Amicon，美國(guó))濃縮(樣品4)。(ⅴ)UDP-己酸胺瓊脂糖親和層析Ⅰ將在加入1mM苯脒鹽酸的操作緩沖液3中透析過(guò)的樣品4的一半應(yīng)用至以操作緩沖液3(20mM Tris-HCl,pH8.0，含有0.15M KCl,10mM MnCl2,0.05％Trion X-100和20％甘油)預(yù)平衡的UDP-己酸胺瓊脂糖親和柱(1.2×4.5cm；Sigma，美國(guó))中。然后，沒(méi)有吸附的部分以操作緩沖液4(20mM Tris-HCl,pH8.0，含有10mMMnCl2,0.05％Triton X-100和20％的甘油)洗出。之后，以其中加入有1M(終濃度)KCl的操作緩沖液4洗脫吸附產(chǎn)物(圖8)。合并GnT-Ⅳ活性部分并在操作緩沖液5(與操作緩沖液4具有相同的級(jí)分但具有7.4的pH)中透析(樣品5)。(ⅵ)UDP-己酸胺瓊脂糖親和層析Ⅱ?qū)悠?應(yīng)用于以操作緩沖液5預(yù)平衡的UDP-己酸胺瓊脂糖親和柱(1.0×6.5cm；Sigma，美國(guó))。然后，以操作緩沖液5將未吸附的部分洗出。之后，以去除MnCl2的操作緩沖液5洗脫吸附產(chǎn)物(圖9)。合并得到的GnT-Ⅳ活性部分(樣品6)。(ⅶ)Superdex 200凝膠層析用小的Q-sepharose FF柱濃縮樣品6并應(yīng)用于以操作緩沖液6(通過(guò)向操作緩沖液5中添加KCl至0.15M的終濃度而獲得)預(yù)平衡的Superdex 200HR5/5柱(1×30cm；發(fā)瑪西亞，瑞典)。操作緩沖液6以0.25ml/分鐘的流速應(yīng)用于柱以獲得GnT-Ⅳ活性部分(樣品7)。(ⅷ)每個(gè)純化步驟中蛋白的量、活性及特異性活性總結(jié)于表2中。最終樣品較小腸勻漿物純化224,000倍。
表2GnT-Ⅳ的純化

以2kg牛小腸開(kāi)始。(3)酶化學(xué)及蛋白化學(xué)特性(ⅰ)純度在SDS-PAGE中樣品7在分子量為60K處出現(xiàn)單一條帶(圖11)。當(dāng)將樣品7進(jìn)行非變性-PAGE(native-PAGE)并將得到的帶從凝膠中切除以測(cè)定GnT-Ⅳ活性時(shí)，此蛋白帶的位置與活性位置相一致(圖12)。此外，樣品7中沒(méi)有檢測(cè)到任何GnT-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ或-Ⅴ活性。從這些結(jié)果，得出樣品7為純的GnT-Ⅳ?？紤]到通過(guò)含Triton X-100凝膠過(guò)濾而測(cè)得該蛋白的表觀分子為77K(圖10)，認(rèn)為GnT-Ⅳ不具有亞單位結(jié)構(gòu)且以單體形式表達(dá)其活性。當(dāng)樣品7以肽N-糖苷酶F(寶靈曼，德國(guó))處理時(shí)，在SDS-PAGE中觀察到流動(dòng)性的增加。因此，認(rèn)為牛小腸的GnT-Ⅳ為具有至少Asn-連接酶鏈的糖蛋白。(ⅱ)反應(yīng)特異性當(dāng)該酶與由下面化學(xué)式所代表的GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖作為底物反應(yīng)時(shí)

在由HPLC分析的標(biāo)準(zhǔn)條件下，該酶產(chǎn)生單一的產(chǎn)物(比啶基胺化的寡糖1)。
收集此產(chǎn)物，然后通過(guò)下面的方法測(cè)定其結(jié)構(gòu)，包括(ⅰ)Smith降解加激光TOF-MS(時(shí)相質(zhì)譜儀(time-of-flight massspectrometer)和(ⅱ)1H-NMR。因此，該酶的反應(yīng)特異性得以檢測(cè)。當(dāng)根據(jù)Kobata和Takasaki方法[Kobata,A.和Takasaki,S.(1993)于《糖生物學(xué)》中“實(shí)踐方法”(Fukuda,M.和Kobata,A.，編)165-185,IRL出版社，牛津，英國(guó)]將吡啶基胺化的寡糖1進(jìn)行Smith降解時(shí)，由于第一次降解時(shí)其質(zhì)量數(shù)由1599.0變?yōu)?95.30且由于第二次降解進(jìn)一步變?yōu)?34.68。這與圖13中所示的反應(yīng)途徑相一致。因此，得出此酶的反應(yīng)產(chǎn)物具有下面的結(jié)構(gòu)

此外，當(dāng)將吡啶基胺化的寡糖1進(jìn)行1H-NMR時(shí)，檢到4.53ppm的峰值，其相應(yīng)于顯示下面通式中GlcNAc7的無(wú)頭質(zhì)子；其偶聯(lián)常數(shù)J1,2為7.9Hz(圖14)。這些結(jié)果顯示GlcNAc7，如下面化學(xué)式中所示，GlcNAc7通過(guò)β-型鍵附著到Man4的位置4上，完全支持了上述結(jié)構(gòu)。

(ⅲ)最適pH如圖15所示，該酶的最適pH約為7.5。(ⅳ)二價(jià)陽(yáng)離子的需求如表3中所示，該酶可由加入EDTA(乙二胺四乙酸)而失活。二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)其活性是至關(guān)重要的。二價(jià)陽(yáng)離子中，Mn2+顯示出最大的效應(yīng)，其次是Co2+和Mg2+。Ca2+和Fe2+有微弱的效應(yīng)。如圖16所示Mn2+的最適濃度約為10mM。
表3GnT-Ⅳ的二價(jià)陽(yáng)離子需求

通過(guò)加入每種金屬離子(10mM)至去除金屬離子的GnT-Ⅳ樣品中而測(cè)定GnT-Ⅳ的活性。GnT-Ⅳ活性由表中的百分比表示，其中加入10mM MnCl2的活性被看作是100％。(ⅴ)糖核苷酸類(lèi)的抑制如表4中所示，UDP最為強(qiáng)烈地抑制該酶的活性。UDP-葡萄糖，UDP-GalNAc,2′-脫氧-UDP和UDP-己酸胺(Sigma，美國(guó))的抑制效應(yīng)以此順序列于UDP的抑制效應(yīng)之后。尿苷、UMP、TDP和CDP幾乎沒(méi)有顯示出抑制效應(yīng)。
表4核苷酸對(duì)GnT-Ⅳ的抑制

當(dāng)在0.5mM UDP-GlcNAc存在時(shí)加入每種核苷酸(2mM)時(shí)的GnT-Ⅳ活性在表中以百分?jǐn)?shù)表示，其中沒(méi)有加入任何物質(zhì)時(shí)的活性看作是100％。(ⅵ)底物特異性如表5中所示，該酶最優(yōu)選以GnT-Ⅴ產(chǎn)物型寡糖(表中E)作為受體。其次，該酶優(yōu)選GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖(表5中D)。
當(dāng)該酶對(duì)GnT-Ⅱ型寡糖的反應(yīng)性看作為100％時(shí)，它對(duì)核心型寡糖(表5中A)和GnT-Ⅰ底物型寡糖(表5中C)分別表現(xiàn)出0％和54％的反應(yīng)性。
該酶對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出46％的反應(yīng)性，其中的巖藻糖通過(guò)α1→6鍵附著到GlcNAc的還原性末端(G有5中F)。
該酶對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖顯示出0％的反應(yīng)性，其中的GlcNAcα1→3甘露糖缺失(表5中B)。
該酶對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出16％的反應(yīng)性，其中的半乳糖以β1→4鍵附著到GlcNAc的α1→6甘露糖上(表5中的G)，且對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出0％的反應(yīng)性，其中的半乳糖通過(guò)β1→4鍵附著到GlcNAc的α1→3甘露糖上(表5中的H和I)。
該酶對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的結(jié)構(gòu)顯示出0％的反應(yīng)性，其中的GlcNAc以β1→4鍵附著到β1→4甘露糖上(表5中J)。
上述該酶的底物特異性與Schachter等所預(yù)言的GnT-Ⅳ底物特異性[Glesson,P.A.和Schachter,H.(1983)生物化學(xué)雜志，258,6162-6173]幾乎一致。因此，很明顯本發(fā)明的酶正是復(fù)合型糖鏈生物合成中長(zhǎng)期缺失的環(huán)節(jié)(link)中的GnT-Ⅳ。表5

(ⅶ)動(dòng)力學(xué)參數(shù)在參照實(shí)施例2中所述分析條件下，該酶對(duì)GnT-Ⅱ產(chǎn)物型寡糖的Km和Vmax值分別為0.73mM和3.23μm/分鐘，對(duì)GnT-Ⅴ產(chǎn)物型寡糖的這些值分別為0.13mM和1.75μM/分鐘。對(duì)UDP-GlcNAc的Km值為0.22mM。
在獲得的吡啶基胺化寡糖中，發(fā)現(xiàn)由下面化學(xué)式所代表的寡糖為新的寡糖

和

(ⅷ)對(duì)糖蛋白的作用為了證明GnT-Ⅳ不僅能對(duì)寡糖底物而且能對(duì)糖蛋白中的寡糖鏈起作用，用UDP[14C]GlcNAc作為糖供體GnT-Ⅳ對(duì)脫唾液酸糖起反應(yīng)。然后，通過(guò)SDS-PAGE和熒光自顯影分析反應(yīng)產(chǎn)物(圖17中A版和B版)。如圖17B版中的2道和5道所示，[14C]GlcNAc向脫唾液酸人轉(zhuǎn)鐵蛋白和脫唾液酸、CHO細(xì)胞來(lái)源的重組人紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)移。
通過(guò)此GnT-Ⅳ反應(yīng)而獲得的具有GnT-Ⅳ產(chǎn)物型糖鏈的人轉(zhuǎn)鐵蛋白(具有下面的化學(xué)式)為自然界中沒(méi)有的新物質(zhì)。

GnT-Ⅳ產(chǎn)物型糖鏈結(jié)構(gòu)[實(shí)施例2]肽作圖分析約1mg最終純化的本發(fā)明酶根據(jù)Laemmli方法[Laemmli，英國(guó)，自然(1970)313,756-762]于0.1％SDS-10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將分離的蛋白電印跡至PVDF膜上。將固定于膜上的蛋白進(jìn)行S-羧甲基化然后以賴(lài)氨酰內(nèi)肽酶無(wú)色桿菌蛋白酶Ⅰ(AP-I)(Wako純化學(xué)工業(yè)公司)消化以獲得AP-I-消化的片段混合物。AP-I-消化的PVDF膜進(jìn)一步以Asp-N(Takara Shuzo)消化以獲得Asp-N-消化的片段混合物。通過(guò)高液相層析分離肽段混合物中的每一片段并進(jìn)行氨基酸序列分析。結(jié)果，獲得顯示于SEQ ID NOS:1-14中的序列。[實(shí)施例3]牛GnT-Ⅳa cDNA的分離和鑒定(1)RT-PCR根據(jù)在實(shí)施例2中獲得的顯示于SEQ ID NOS:7和11中的氨基酸序列，分別合成顯示于SEQ ID NO:15中的寡聚體AP-5F和顯示于SEQ ID NO:16中的寡聚體DN-9R。用從牛小腸組織中通過(guò)異硫氰酸胍方法提取的總RNA作為模板且用上述引物進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果，獲得似乎特異性的約170bp的擴(kuò)增片段。將該片段亞克隆。(2)文庫(kù)的篩選用上述RT-PCR產(chǎn)物篩選牛小腸cDNA文庫(kù)(Clontech，美國(guó))以獲得4個(gè)陽(yáng)性噬菌斑。測(cè)定這些克隆的核苷酸序列。得到的序列含有許多編碼一些實(shí)施例2中獲得的部分氨基酸序列(SEQ ID NOS:1-14)的核苷酸序列，且也含有似乎為終止密碼子的序列。用代表得到核苷酸序列最上游區(qū)域的150bp的片段，再次篩選該文庫(kù)以獲得兩個(gè)陽(yáng)性噬菌斑。測(cè)定這些克隆的核苷酸序列。然后，以150bp的最上游區(qū)域的探針進(jìn)一步同樣地篩選該文庫(kù)，然而，沒(méi)有獲得新的克隆。(3)5′RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)隨后，為了獲得全長(zhǎng)cDNA而進(jìn)行5′RACE。用噬菌體篩選獲得的最上游區(qū)域序列，進(jìn)行第1次5′RACE。然而，沒(méi)有能夠發(fā)現(xiàn)起始密碼子。然后，根據(jù)第一次5′RACE獲得的序列，進(jìn)行第二次5′RACE以獲得含有起始密碼子的序列。將該序列連接到以前獲得的噬菌體克隆的部分基因序列上以獲得含有完整開(kāi)放閱讀框的基因片段(基因1)。這樣獲得基因片段的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:17中，且由其推測(cè)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:18中。已證實(shí)此DNA片段含有所有編碼在實(shí)施例2中獲得的部分氨基酸序列(SEQ ID NOS:1-14)的核苷酸序列。[實(shí)施例4]用克隆的牛GnT-Ⅳa基因?qū)Ρ磉_(dá)載體的構(gòu)建和用于制備GnT-Ⅳa酶的方法(1)載體的構(gòu)建合成將XhoⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入基因1起始密碼子上游區(qū)域的引物(SEQ IDNO:19)和將XbaⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入該基因終止密碼子下游區(qū)域的另一種引物(SEQ ID NO:20)。然后，用此引物用PCR擴(kuò)增編碼GnT-Ⅳ酶的整個(gè)基因。以XhoⅠ和XbaⅠ消化獲得的擴(kuò)增片段，并插入pSVL載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的XhoⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)之間以制備質(zhì)粒pBGT4。(2)導(dǎo)入COS7細(xì)胞質(zhì)粒pBGT4通過(guò)電穿孔導(dǎo)入COS7細(xì)胞(RIKEN細(xì)胞庫(kù))。簡(jiǎn)言之，將10μg質(zhì)粒加入到約含5×106個(gè)細(xì)胞的0.8mlPBS(-)(Nissui藥物公司)中。在室溫下用基因脈沖儀(伯樂(lè)，美國(guó))以25μF的容量應(yīng)用1600伏以將該基因?qū)爰?xì)胞。將得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至90mm實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)皿中并于5％CO2,37℃下培養(yǎng)于含10％胎牛血清的10ml Dulbecco′s修飾的Eagle′s培養(yǎng)基中(基本目錄號(hào).12430，美國(guó)生物技術(shù)公司)72小時(shí)。之后，回收細(xì)胞并懸浮于100μl緩沖液(5mM Tris-HCl,pH7.5,2mM MgCl2,1mM苯甲磺酰氟)中，然后超聲處理并以2000×g離心5分鐘。因此，獲得細(xì)胞提取物。(3)GnT-Ⅳ活性的分析細(xì)胞提取物中GnT-Ⅳ的活性通過(guò)參照實(shí)施例2中所述的方法測(cè)定。結(jié)果顯示于表6中。與其中導(dǎo)入pSVL載體作為對(duì)照的細(xì)胞提取物相比，其中導(dǎo)入質(zhì)粒pBGT4的提取物每個(gè)細(xì)胞顯示出44-78倍更高的GnT-Ⅳ活性。從這些結(jié)果，證實(shí)基因1編碼GnT-Ⅳ酶。這樣，GnT-Ⅳ酶可根據(jù)此方法通過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞制備。
表6

反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)活性比率是相對(duì)于把pSVL的總活性看作1來(lái)表示的。[實(shí)施例5]人類(lèi)GnT-Ⅳa cDNA的分離和鑒定(1)RT-PCR根據(jù)在實(shí)施例3中獲得的牛GnT-Ⅳa核苷酸序列，合成顯示于SEQID NO:21中的引物h1-2F和顯示于SEQ ID NO:22中的引物h1-1R。用人肝臟的總RNA(Clontech，美國(guó))作為模板，以上述引物進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果，獲得似乎為特異性的約650bp的擴(kuò)增片段。將此片段亞克隆，并測(cè)定其核苷酸序列。(2)文庫(kù)的篩選用上面RT-PCR獲得的685 bp DNA片段作為探針篩選人肝臟cDNA文庫(kù)(Clontech，美國(guó))。獲得2個(gè)陽(yáng)性噬菌斑h(yuǎn)GT4/λgt10-1和hGT4/λgt10-2。測(cè)定這些噬菌體克隆中插入子的核苷酸序列。結(jié)果，hGT4/λgt10-1含有804bp的DNA區(qū)域且hGT4/λgt10-2含有2115bp的DNA區(qū)域。前者區(qū)域完全包括在后者區(qū)域內(nèi)。如SEQ ID NO:23中所示，hGT4/λgt10-2中含有的DNA片段具有與牛GnT-Ⅳa氨基酸序列高度同源的開(kāi)放閱讀框(ORF)(96％一致)。從實(shí)施例6中獲得的結(jié)果，證實(shí)此ORF為人GnT-Ⅳa基因。該ORF的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:24中。[實(shí)施例6]人GnT-Ⅳa基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及制備人GnT-Ⅳa酶的方法(1)人GnT-Ⅳa基因表達(dá)質(zhì)粒pHGT4-1的構(gòu)建合成將XhoⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入人GnT-Ⅳa基因起始密碼子上游區(qū)域的引物(h1-7F；SEQ ID NO:25)和與該基因終止密碼子下游區(qū)域互補(bǔ)的另一種引物(h1-7R；SEQ ID NO:26)。用人肝臟RNA(Clontech，美國(guó))作為模板，用上述引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增編碼人GnT-Ⅳa酶的整個(gè)基因。將得到的擴(kuò)增片段以與lacz基因轉(zhuǎn)錄相反的方向插入質(zhì)粒pCRScnpt Amp SK(+)(Stratagene,DNA)的SrfⅠ位點(diǎn)。用得到的質(zhì)粒，通過(guò)核苷酸序列分析證實(shí)擴(kuò)增的片段編碼顯示于SEQ IDNO:24中的氨基酸序列。此外，以XhoⅠ和SacⅠ消化此質(zhì)粒以獲得XhoⅠ-Sacl 1.7kb的片段。將此片段插入到pSVL載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的XhoⅠ和SacⅠ位點(diǎn)之間以從人GnT-Ⅳa基因制備表達(dá)質(zhì)粒pHGT4-1。(2)人GnT-Ⅳa基因向COS7細(xì)胞的導(dǎo)入通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pHGT4-1導(dǎo)入COS7細(xì)胞。將得到的細(xì)胞于10％CO2,37℃下培養(yǎng)72小時(shí)。然后，收獲細(xì)胞，懸浮于100μl緩沖液(5mMTris-HCl,pH7.5,2mM氯化鎂，1mM苯甲磺酰氟)中，超聲處理破碎，2000×g離心5分鐘并收集上清以獲得細(xì)胞提取物。(3)人GnT-Ⅳa基因在COS7細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)參照實(shí)施例2中描述的方法測(cè)定細(xì)胞提取物中的GnT-Ⅳ活性。結(jié)果顯示于表7中。與其中導(dǎo)入pSVL載體作為對(duì)照的細(xì)胞提取物相比，其中導(dǎo)入質(zhì)粒pHGT4-1的細(xì)胞提取物每個(gè)細(xì)胞顯示出21-28倍更高的GnT-Ⅳ活性。從這些結(jié)果，證實(shí)顯示于SEQ ID NO:23中的GnT-Ⅳa基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶GnT-Ⅳ。也證實(shí)人GnT-Ⅳa酶可根據(jù)此方法通過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞制備。
表7

反應(yīng)時(shí)間1.3小時(shí)活性比率以相對(duì)于把pSVL的總活性看成為1而表示的。[實(shí)施例7]人GnT-Ⅳb cDNA的分離和鑒定(1)通過(guò)PCR、RT-PCR和5′RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)獲得人GnT-Ⅳa-樣基因在基因數(shù)據(jù)庫(kù)GerBank中通過(guò)BLASTN搜索與實(shí)施例3中獲得的人GnT-Ⅳa基因核苷酸序列具有類(lèi)似性的核苷酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了許可號(hào)R12057,H10557和W16571。然后，合成顯示于SEQ ID NO:27中的引物h2-45F和顯示于SEQ ID NO:28中的引物h2-43R，從而用人類(lèi)cDNA文庫(kù)中心的快速篩選(Quick Screen Human cDNALibrary Panel)(Clontech，美國(guó))的人腦cDNA文庫(kù)作為模板進(jìn)行PCR。將擴(kuò)增的片段亞克隆入pCRScript Amp SK(+)(Stratagene，美國(guó))的SrfⅠ位點(diǎn)并進(jìn)行核苷酸序列分析。同時(shí)，合成顯示于SEQ ID NO:29中的引物h2-2F和顯示于SEQ ID NO:30中的引物h2-1R從而用人肺總RNA(Clontech，美國(guó))作為模板進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果，得到約500bp預(yù)期大小的擴(kuò)增片段。然后，將此片段亞克隆入pCRScriptAmp SK(+)(Stratagene，美國(guó))的SrfⅠ位點(diǎn)并進(jìn)行核苷酸序列分析。
這樣獲得的2個(gè)DNA片段的核苷酸序列相互間形成1006bp區(qū)域的重疊。在該區(qū)域內(nèi)，編碼與牛和人GnT-Ⅳa同源的氨基酸序列的開(kāi)放閱讀框被發(fā)現(xiàn)。因此，提示與GnT-Ⅳa蛋白有關(guān)的蛋白的存在。
然后，在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中通過(guò)BLASTN搜索可能是R12057上游序列或W16571下游序列的可能核苷酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)R15554為R12057的上游序列，且W16466為W16571的下游序列。然而，在從這些核苷酸序列推導(dǎo)的ORFs中含有顯然不適當(dāng)?shù)慕K止密碼子。因此，為了證實(shí)該核苷酸序列，通過(guò)RT-PCR獲得DNA片段。作為引物，合成顯示于SEQ ID NO:31中的h2-1F，顯示于SEQ ID NO:32中的h2-3F和顯示于SEQ ID NO:33中的h2-8R。用實(shí)施例5中所述的h2-1F和h1-1R組合，或h2-3F和h2-8R組合，用人肝臟的總RNA(Clontech，美國(guó))作為模板進(jìn)行RT-PCR。檢測(cè)到均與預(yù)期大小相一致的約550bp和約300bp的擴(kuò)增片段。將這些片段中的每一個(gè)亞克隆入pCRScript Amp SK(+)中的SrfⅠ位點(diǎn)中以分析其核苷酸序列。結(jié)果，證實(shí)這些片段分別與上述h2-45F和h2-1R之間1006bp的上游區(qū)域和下游區(qū)域重疊。在1361bp的連接區(qū)域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)編碼與牛和人GnT-Ⅳa蛋白氨基酸序列具有高度同源性的433個(gè)氨基酸蛋白的ORF。
然而，當(dāng)此ORF與GnT-Ⅳa蛋白的氨基酸序列比較時(shí)，認(rèn)為起始的甲硫氨酸應(yīng)存在于該ORF上游的區(qū)域。因此，上游區(qū)域用人肺5＇-RACE-即用(Ready)cDNA(Clortech，美國(guó))通過(guò)5＇-RACE獲得。在第一次PCR中，錨定引物和顯示于SEQ ID NO:34中的h2-5R用作引物。在第二次PCR中，錨定引物和顯示于SEQ ID NO:35中的h2-3R用作引物。純化由5′-RACE獲得的片段，用EcoRⅠ和PstⅠ消化，且然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。從凝膠中回收約450bp的片段。將該片段插入pUC18載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的EcoRⅠ和PstⅠ位點(diǎn)之間以分析其核苷酸序列。結(jié)果，證實(shí)此片段與h2-1F和h2-8R之間區(qū)域的上游區(qū)重疊。在1758bp的連接區(qū)域內(nèi)，證實(shí)了一個(gè)編碼與牛和人GnT-Ⅳa蛋白氨基酸序列具有高度類(lèi)似性的548個(gè)氨基酸蛋白的ORF。該ORF的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:36中，且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:37中。從下面實(shí)施例8中描述的結(jié)果，證實(shí)該基因?yàn)槿薌nT-Ⅳb基因。[實(shí)施例8]人GnT-Ⅳb基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和制備人GnT-Ⅳb酶的方法(1)人GnT-Ⅳb基因表達(dá)質(zhì)粒pHGT4-2的構(gòu)建合成將XhoⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入人GnT-Ⅳb基因起始密碼子上游區(qū)域的引物(h2-4:SEQ ID NO:38)，和將XbaⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入上述基因終止密碼子下游區(qū)域的另一種引物(h2-10R:SEQ ID NO:39)。用這些引物，以人肺RNA(Clontech，美國(guó))作為模板通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增編碼人GnT-Ⅳb酶的整個(gè)ORF。將擴(kuò)增的片段插入質(zhì)粒pCRScript AmpSK(+)的SrfⅠ位點(diǎn)中，然后測(cè)定其核苷酸序列。結(jié)果，證實(shí)擴(kuò)增的片段編碼SEQ ID NO:37的氨基酸序列。此外，將該質(zhì)粒以XhoⅠ和XbaⅠ消化以獲得XhoⅠ-XbaⅠ1.7kb的片段。將該片段插入pSVL載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的XhoⅠ與XbaⅠ之間的位點(diǎn)以構(gòu)建用于人GnT-Ⅳb基因的表達(dá)質(zhì)粒。(2)人GnT-Ⅳb基因向COS7細(xì)胞中的導(dǎo)入通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pHGT4-2導(dǎo)入COS7細(xì)胞。得到的細(xì)胞于10％CO2,37℃下培養(yǎng)72小時(shí)。然后，回收細(xì)胞，懸浮于100μl緩沖液(5mMTris-HCl,pH7.5,2mM氯化鎂，1mM苯甲磺酰氟)，超聲處理破碎，2000×g離心5分鐘且收集上清以獲得細(xì)胞提取物。(3)人GnT-Ⅳb基因在COS7細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)參照實(shí)施例2中所述的方法測(cè)定細(xì)胞提取物中的GnT-Ⅳ活性。結(jié)果顯示于上面的表7中。與其中導(dǎo)入pSVL載體作為對(duì)照的細(xì)胞提取物相比，其中導(dǎo)入質(zhì)粒pHGT4-2的細(xì)胞提取物每個(gè)細(xì)胞顯示出8-11倍更高的GnT-Ⅳ活性。從這些結(jié)果，證實(shí)顯示于SEQ ID NO:36中的GnT-Ⅳb基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶GnT-Ⅳ。同時(shí)也證實(shí)人GnT-Ⅳb酶可根據(jù)此方法由培養(yǎng)的細(xì)胞制備。[實(shí)施例9]牛GnT-ⅣaN-末端缺失突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)(1)牛GnT-Ⅳa表達(dá)質(zhì)粒pSigIle93、pSigPro113和pSigPro142表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建合成將XhoⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入人紅細(xì)胞生成素信號(hào)序列(GenBank登記號(hào)X02157)上游區(qū)域的引物(XhoEsig:SEQ ID NO:40)和將上述信號(hào)序列的C-末端連接至?？缭轿恢?3(Ile)至末端GnT-Ⅳa氨基酸序列的部分的反義引物(E4-1R:SEQ ID NO:41)，從而通過(guò)PCR擴(kuò)增人紅細(xì)胞生成素的信號(hào)序列。同時(shí)，合成相應(yīng)于上述反義引物的有義引物(E4-1F:SEQ ID NO:42)和將XbaⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入牛GnT-Ⅳa終止密碼子下游區(qū)域的XbaⅠ位點(diǎn)的引物(4EXPR:SEQ IDNO:20)以通過(guò)PCR擴(kuò)增牛GnT-Ⅳa基因的部分序列。用得到的2種PCR產(chǎn)物的部分作為混合模板，以引物XhoEsig和4EXPR進(jìn)行PCR。擴(kuò)增的片段以XhoⅠ和XbaⅠ消化并插入到pSVL載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的XhoⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)之間以構(gòu)建質(zhì)粒psigIle93，其表達(dá)其中的人紅細(xì)胞生成素信號(hào)序列連接到牛跨越位置93至末端GnT-Ⅳa氨基酸序列部分的氨基酸序列。用E4-2R引物(SEQ ID NO:43)或E4-3R引物(SEQ ID NO:44)代替E4-1R引物；且以E4-2F引物(SEQ IDNO:45)或E4-3F引物(SEQ ID NO:46)代替E4-1F引物，用與上述相同的方式分別構(gòu)建表達(dá)其中的人紅細(xì)胞生成素信號(hào)序列連接到牛跨越位置113(Pro)至末端GnT-Ⅳa氨基酸序列部分的氨基酸序列的質(zhì)粒pSigPro113；或其中的人紅細(xì)胞生成素信號(hào)序列連接到?？缭轿恢?42(Pro)至末端GnT-Ⅳa氨基酸序列部分的氨基酸序列的質(zhì)粒pSigPro142。(2)表達(dá)牛GnT-Ⅳa N-末端缺失突變體的質(zhì)粒向COS7細(xì)胞中的導(dǎo)入通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pSigIle93、pSigPro113或pSigPro142導(dǎo)入COS7細(xì)胞。得到的細(xì)胞于10％CO2,37℃下培養(yǎng)72小時(shí)。然后，分別回收細(xì)胞和培養(yǎng)上清。將細(xì)胞懸浮于100μl緩沖液(5mM Tris-HCl,pH7.5,2mM氯化鎂，1mM苯甲磺酰氟)，超聲處理打碎且2000×g離心5分鐘以獲得細(xì)胞提取物。以Centriplus30(Amicon)將培養(yǎng)上清濃縮至約100μl。(3)牛GnT-Ⅳa N-末端缺失突變體在COS7細(xì)胞中的表達(dá)培養(yǎng)上清與細(xì)胞提取物中GnT-Ⅳ活性通過(guò)參照實(shí)施例2中所述方法加以測(cè)定。結(jié)果顯示于表8中。與其中導(dǎo)入有pBGT4載體作為陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞總活性(即，細(xì)胞中活性+上清中活性)相比，其中導(dǎo)入有pSigIle93的細(xì)胞總活性大于30％。此外，三分之一的活性分泌至培養(yǎng)上清中。從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)牛GnT-Ⅳa N-末端至位置92的氨基酸序列可被缺失而維持酶活性。同時(shí)也顯示GnT-Ⅳa酶可用適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)分泌表達(dá)。
表8

反應(yīng)時(shí)間2.5小時(shí)活性比率以相對(duì)于pBGT4總活性的百分?jǐn)?shù)表示，pBGT4總活性看成為100％。[實(shí)施例10]牛GnT-Ⅳa C-末端缺失突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)(1)牛GnT-Ⅳa表達(dá)質(zhì)粒pCGly499、pCPro465、pCLys432和pCPro383的構(gòu)建合成將XhoⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入牛GnT-Ⅳa基因起始密碼子上游區(qū)域的引物(SEQ ID NO:19)和連接位置499Gly密碼子之后終止密碼子并將XbaⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入上述終止密碼子下游區(qū)域的引物(CGly 499:SEQ IDNO:47)以通過(guò)PCR擴(kuò)增牛GnT-Ⅳa基因的部分序列。擴(kuò)增的片段以XhoⅠ和XbaⅠ消化，并插入到pSVL載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的XhoⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)之間。這樣，構(gòu)建出表達(dá)牛GnT-Ⅳa氨基酸序列至位置499(甘氨酸)的質(zhì)粒pCGly499。用CPro465引物(SEQ ID NO:48),CLys432引物(SEQ ID NO:49)或CPro383引物(SEQ ID NO:50)代替CGly499引物，以相同的方式構(gòu)建三個(gè)其它的質(zhì)粒。它們分別命名為pCPro465(表達(dá)牛GnT-Ⅳa氨基酸序列至位置465(脯氨酸)的質(zhì)粒)；pCLys432(表達(dá)牛GnT-Ⅳa氨基酸序列至位置432(賴(lài)氨酸)的質(zhì)粒)；和pCPro383(表達(dá)牛GnT-Ⅳa氨基酸序列至位置383(脯氨酸)的質(zhì)粒)。(2)表達(dá)牛GnT-Ⅳa C-末端缺失突變體的質(zhì)粒向COS7細(xì)胞中的導(dǎo)入通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pCGly499,pCPro465,pCLys432p或pCPro383導(dǎo)入COS7細(xì)胞。得到的細(xì)胞于10％CO2,37℃下培養(yǎng)72小時(shí)。然后，回收細(xì)胞并懸浮于100μl緩沖液(5mM Tris-HCl,pH7.5,2mM氯化鎂，1mM苯甲磺酰氟)中，超聲處理破碎且以2000×g離心5分鐘以獲得細(xì)胞提取物。(3)牛GnT-Ⅳa C-末端缺失突變體在COS7細(xì)胞中的表達(dá)細(xì)胞提取物中GnT-Ⅳ的活性用參照實(shí)施例2中所述的方法測(cè)定。結(jié)果顯示于表9中。與其中導(dǎo)入有pBGT4載體作為陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞提取物的GnT-Ⅳ活性相比，其中導(dǎo)入有pCGly499、pCPro465、pCLys432或pCPro383的細(xì)胞提取物活性分別為每個(gè)細(xì)胞15.2％、12.1％、2.8％或104.2％。從這些結(jié)果，顯示即使牛GnT-Ⅳa氨基酸序列的位置384至C-末端的氨基酸被缺失，GnT-Ⅳ活性仍被維持。
表9

反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)活性比率以相對(duì)于pBGT4總活性的百分?jǐn)?shù)表示，pBGT4的總活性看成為100％。[實(shí)施例11]大腸桿菌中表達(dá)各種GnT-Ⅳ基因質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)(1)牛GnT-Ⅳa大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建合成將BspHⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入牛GnT-Ⅳa基因起始密碼子上游區(qū)域的引物(BSP-N:SEQ ID NO:51)和將HindⅢ位點(diǎn)導(dǎo)入終止密碼子下游區(qū)域的另一種引物(C-Hd:SEQ ID NO:52)以通過(guò)PCR擴(kuò)增牛GnT-Ⅳa基因的整個(gè)開(kāi)放閱讀框。擴(kuò)增的片段以BspHⅠ和HindⅢ消化，并導(dǎo)入pTrc99A載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的NcoⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間以構(gòu)建質(zhì)粒pEBGT4。用BSP-sN引物(SEQ ID NO:53)替代BSP-N引物及C-Hd引物，以類(lèi)似的方式構(gòu)建質(zhì)粒pEIle93。此外，用BSP-N引物，可將His-Tag、終止密碼子和HindⅢ位點(diǎn)導(dǎo)入牛GnT-Ⅳa基因C-末端下游區(qū)域的引物(CH-Hd:SEQ ID NO:54)和具有His-Tag、終止密碼子和HindⅢ位點(diǎn)的引物(H-Hd:SEQ ID NO:55)擴(kuò)增編碼其中的His-Tag被添加至C末端開(kāi)放閱讀框的基因，從而以同類(lèi)似的方式構(gòu)建質(zhì)粒pEBGT4+His。(2)人GnT-Ⅳa基因和人GnT-Ⅳb基因大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建合成可在人GnT-Ⅳa氨基酸序列位置94(Leu)上游區(qū)導(dǎo)入起始密碼子和Ile密碼子并在其進(jìn)一步上游區(qū)也可導(dǎo)入BspHⅠ位點(diǎn)的引物(4aBSPIL94:SEQ ID NO:56)；在C-末端氨基酸下游區(qū)導(dǎo)入His-Tag、終止密碼子和HindⅢ位點(diǎn)的引物(4aCH-Hd:SEQ ID NO:57)；和H-Hd引物以擴(kuò)增部分的人GnT-Ⅳa氨基酸序列的基因片段，其中被添加上編碼His-Tag的序列。擴(kuò)增的片段以BspHⅠ和HindⅢ消化，并插入到pTrc99A載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的NcoⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間以構(gòu)建質(zhì)粒pMA4a+His。此外，用CP383H-Hd引物(SEQ IDNO:58)代替4aCH-Hd引物，以類(lèi)似的方式構(gòu)建質(zhì)粒pCore+His。用將BspHⅠ位點(diǎn)導(dǎo)入人GnT-Ⅳb基因起始密碼子上游區(qū)的引物(4bBSP-N:SEQ ID NO:59)和4bSACR引物(SEQ ID NO:60)擴(kuò)增人GnT-Ⅳb基因片段，以BspHⅠ和SacⅠ消化，且然后插入到pTrc99A載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的NcoⅠ和SacⅠ位點(diǎn)之間。得到質(zhì)粒的SacⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間，用4bSACF引物(SEQ ID NO:61)、在人GnT-Ⅳb氨基酸序列的C-末端導(dǎo)入His-Tag的引物(4bCH-Hd:SEQ ID NO:62)和H-Hd引物，擴(kuò)增部分長(zhǎng)度的人GnT-Ⅳb基因，并以SacⅠ和HindⅢ消化，然后插入以得到質(zhì)粒pEHGT4-2+His。此外，用將NcoⅠ位點(diǎn)和起始密碼子導(dǎo)入人GnT-Ⅳb氨基酸序列位置91(Gly)上游區(qū)的引物(4bNCOG91:SEQ ID NO:63)、4bCH-Hd引物和H-Hd引物擴(kuò)增人GnT-Ⅳb基因的部分序列，以NcoⅠ和HindⅢ消化，且然后插入到pTrc99A載體(發(fā)瑪西亞，瑞典)的NcoⅠ和HindⅢ位點(diǎn)之間以構(gòu)建質(zhì)粒pMA4b+His。(3)每種表達(dá)質(zhì)粒向大腸桿菌BL21菌株中的導(dǎo)入將每種質(zhì)粒導(dǎo)入到通過(guò)鈣方法而制備的大腸桿菌BL21菌株感受態(tài)細(xì)胞中。將得到的細(xì)胞培養(yǎng)于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上。得到的以每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落接種至LB液體培養(yǎng)基并于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。然后，將培養(yǎng)物接種至新鮮LB液體培養(yǎng)基以得到2％的濃度。當(dāng)培養(yǎng)液混濁度(OD595nm)約為0.1至0.2時(shí)向其中加入IPTG(異丙基b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至1mm的終濃度。細(xì)胞于37℃培養(yǎng)2小時(shí)或于25℃培養(yǎng)4小時(shí)。然后，收獲500μl的細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物懸浮于50μl緩沖液(5mM Tris-HCl,pH7.5,2mM MgCl2,1mM苯甲磺酰氟)，超聲處理打碎且以2000×g離心5分鐘以獲得作為上清的細(xì)胞提取物。(4)大腸桿菌BL21菌株中每種表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)細(xì)胞提取物中GnT-Ⅳ活性通過(guò)參照實(shí)施例2中所述的方法測(cè)定。表10顯示了?；虻谋磉_(dá)結(jié)果。雖然其中導(dǎo)入有pTrc99A載體作為對(duì)照的大腸桿菌細(xì)胞提取物幾乎沒(méi)有GnT-Ⅳ活性，但其中導(dǎo)入有pEBGT4的大腸桿菌細(xì)胞提取物具有一定的GnT-Ⅳ活性。從這些結(jié)果，證明GnT-Ⅳ酶可通過(guò)大腸桿菌制備。添加到牛GnT-Ⅳa C-末端的His-Tag序列沒(méi)有強(qiáng)烈地影響GnT-Ⅳ活性。因此，顯示適當(dāng)?shù)膖ag序列可添加至GnT-Ⅳ酶上。其中的N-末端92個(gè)氨基酸被缺失的突變體顯示出更強(qiáng)的GnT-Ⅳ活性。也顯示在動(dòng)物細(xì)胞中證實(shí)的GnT-Ⅳ酶變異體的表達(dá)在大腸桿菌中是可能的。
表10

反應(yīng)時(shí)間3.0小時(shí)添加IPTG后，細(xì)胞于37℃培養(yǎng)2小時(shí)。
活性比率以相對(duì)于pEBGT4總活性的百分?jǐn)?shù)表示，pEBGT4總活性看成為100％。
表11顯示了人基因的表達(dá)結(jié)果。與其中導(dǎo)入有pTrc99A載體作為對(duì)照的大腸桿菌細(xì)胞提取物相比，其中導(dǎo)入有任何一種表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞提取物具有顯著的GnT-Ⅳ活性。如在牛GnT-Ⅳa酶中所示，在人GnT-Ⅳa和GnT-Ⅳb酶中缺失N-末端序列而維持活性也是可能的。此外，既具有N-末端缺失又具有C-末端缺失的人GnT-Ⅳa酶顯示出高的GnT-Ⅳ活性(pCore+His)。這顯示在這個(gè)突變體中的這些部分對(duì)GnT-Ⅳ活性不是必需的。
表11

反應(yīng)時(shí)間4.0小時(shí)加入IPTG后，細(xì)胞于25℃培養(yǎng)4小時(shí)。
活性比率以相對(duì)于pMA4a+His總活性的百分?jǐn)?shù)表示，pMA4a+His總活性看成為100％。[實(shí)施例12]通過(guò)將?；蛉薌nT-Ⅳa基因?qū)氘a(chǎn)生-EPO的CHO細(xì)胞中而使重組人紅細(xì)胞生成素(EPO)向糖鏈分支結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換(1)GnT-Ⅳ表達(dá)質(zhì)粒向產(chǎn)生-EPO CHO細(xì)胞中的導(dǎo)入根據(jù)日本審查的專(zhuān)利公開(kāi)No.2-17156中所述的方法構(gòu)建產(chǎn)生-EPO的CHO細(xì)胞克隆。通過(guò)電穿孔將GnT-Ⅳa表達(dá)質(zhì)粒pBGT4或pHGT4-1導(dǎo)入得到的細(xì)胞克隆MO1和H-5。導(dǎo)入過(guò)程中，15μg表達(dá)質(zhì)粒和1.5μg抗藥標(biāo)記質(zhì)粒(來(lái)自Kaken Pharmaceutical的pSV2bsr或來(lái)自Clontech的pMAMneo)用于混合物中。電穿孔的細(xì)胞于10％CO2,37℃下培養(yǎng)約60小時(shí)。然后，向培養(yǎng)基中加入殺稻瘟素S(KakenPharmaceuticals)(終濃度10μg/ml)或遺傳霉素(生物技術(shù)公司)(終濃度500μg/ml)，細(xì)胞再培養(yǎng)10天至2周。這樣，分離出抗這兩種藥物中任何一種的克隆。(2)導(dǎo)入的GnT-Ⅳ基因在產(chǎn)生-EPO的CHO細(xì)胞克隆中表達(dá)的驗(yàn)證將產(chǎn)生-EPO的CHO細(xì)胞克隆(起始克隆)和單個(gè)藥物抗性克隆培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)囊?guī)模。純化每個(gè)克隆的總RNA。然后，用GnT-Ⅳa基因的部分作為探針進(jìn)行RNA點(diǎn)印跡分析以檢測(cè)GnT-Ⅳa mRNA的量。此外，在起始克隆中表達(dá)的GnT-Ⅳ活性和抗藥克隆通過(guò)參照實(shí)施例2中所述的分析方法加以測(cè)定。篩選那些在RNA點(diǎn)印跡分析中產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)且較起始克隆顯示出更高GnT-Ⅳ活性的克隆并用于EPO生產(chǎn)。篩選出的克隆具有增加的GnT-Ⅳ活性；例如，MO1(牛GnT-Ⅳ)#36較MO1克隆顯示出約104倍的增加，且H-5(人GnT-Ⅳ)#23較H-5克隆顯示出約125倍的增加。(3)用導(dǎo)入GnT-Ⅳ基因的產(chǎn)生-EPO的CHO細(xì)胞克隆生產(chǎn)EPOEPO分泌表達(dá)至培養(yǎng)液中。然后，將產(chǎn)生-EPO的CHO細(xì)胞克隆MO1和H-5，和上述的克隆MO1(牛GnT-Ⅳ)#36和H-5(人GnT-Ⅳ)#23培養(yǎng)于滾瓶中。首先，將每種克隆貼壁培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，且然后將1.5×107個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入含200ml培養(yǎng)基的滾瓶中。細(xì)胞于10％CO2,37℃下培養(yǎng)3天從而使它們一致地附著到瓶上。之后，倒去培養(yǎng)基，并以PBS緩沖液洗細(xì)胞。然后，將200ml無(wú)血清培養(yǎng)基加入到瓶中，其中的細(xì)胞于10％CO2,37℃下培養(yǎng)7天。之后，回收培養(yǎng)上清。作為培養(yǎng)基，使用了D-MEM/F12混合培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充以5％胎牛血清，290mg/升L-谷氨酸，1×MEM非必需氨基酸溶液和100nM的氨甲蝶呤。作為無(wú)血清的培養(yǎng)基，使用了沒(méi)有胎牛血清的上述培養(yǎng)基。每種無(wú)血清培養(yǎng)上清中含有的EPO用抗-人EPO抗體通過(guò)ELISA加以定量。(4)根據(jù)其糖鏈結(jié)構(gòu)對(duì)導(dǎo)入GnT-Ⅳ基因或沒(méi)有導(dǎo)入該基因的克隆產(chǎn)生EPOs的分析在等電聚焦凝膠中重組EPO沒(méi)有作為單個(gè)分子存在；它是帶各種電荷分子的混合物。由于蛋白的部分沒(méi)有變化，故顯示這些分子中的電荷差異是基于糖鏈結(jié)構(gòu)的不同；這種分子混合物稱(chēng)為糖形式(glycoforms)[Watson,E和Yao,F.，生化年鑒(1993),210,389-93]。EPO具有3個(gè)Asn-連接的糖鏈；單個(gè)糖鏈的分支結(jié)構(gòu)從雙天線型至四天線型而變化。Gal(半乳糖)進(jìn)一步附著到每種分支GlcNAc的末端，且唾液酸進(jìn)一步附著到此Gal上。因此，如果糖鏈分支程度通過(guò)導(dǎo)入GnT-Ⅳ基因而增加。附著到Gal上的唾液酸分子數(shù)目增加，且因此，具有低等電點(diǎn)的糖形式含量將增加。然后，本發(fā)明者通過(guò)等電點(diǎn)聚焦分析以檢測(cè)導(dǎo)入GnT-Ⅳ基因的產(chǎn)生-EPO的細(xì)胞產(chǎn)生的EPO糖鏈結(jié)構(gòu)的變化。
對(duì)于等電聚焦，使用了發(fā)瑪西亞生產(chǎn)的MultiphorⅡ設(shè)備。凝膠由5％丙烯酰胺(30∶0.8)和1.5％Pharmelyte 2.5-5(發(fā)瑪西亞)所組成。作為(+)極溶液，使用了0.1M的硫酸。作為(-)極溶液，使用了0.2M的L-組氨酸。等電點(diǎn)聚焦后，將樣品電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用抗-EPO小鼠單克隆抗體的Western印跡以檢測(cè)單個(gè)EPOs糖形式的條帶。簡(jiǎn)言之，如果必要，每種細(xì)胞克隆的無(wú)血清培養(yǎng)上清以Centriplus30和Microcon 30(均由Amicon生產(chǎn))濃縮至約7-100倍。開(kāi)始時(shí)，約50-100IU的EPO用作樣品，但適當(dāng)?shù)卣{(diào)整此樣品量從而使由Western印跡分析檢測(cè)到的條帶密度在樣品間幾乎相等。
當(dāng)來(lái)自MO1克隆的EPO與來(lái)自MO1(牛GnT-Ⅳ)#36克隆的EPO比較時(shí)，證實(shí)了后者主要糖形式的位置表現(xiàn)出向至少一個(gè)糖形式低pI一側(cè)(+電極溶液一側(cè))的遷移(圖19)。從這些結(jié)果，認(rèn)為由于基因?qū)攵磉_(dá)的GnT-Ⅳ酶增加了附著到EPO Asn-連接糖鏈中GlcNAc分支的數(shù)目，因而增加了附著唾液酸分子的數(shù)目從而增加了具有低等電點(diǎn)糖形式的含量。對(duì)H-5克隆和H-5(人GnT-Ⅳ)#23克隆進(jìn)行了類(lèi)似的分析。結(jié)果，也發(fā)現(xiàn)在后者中主要EPO糖形式的位置遷移至低pI一側(cè)(圖19)。
從上述，證實(shí)修飾通過(guò)導(dǎo)入GnT-Ⅳ基因至任何細(xì)胞而制備蛋白的Asn-連接糖鏈結(jié)構(gòu)是可能的。工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了新的β1→4N-乙酰-葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(GnT-Ⅳ)、用于制備GnT-Ⅳ酶的方法和編碼GnT-Ⅳ的基因。有了本發(fā)明的GnT-Ⅳ，制備用傳統(tǒng)的糖基轉(zhuǎn)移酶不能形成的具有分支結(jié)構(gòu)的糖綴合物變?yōu)榭赡?。因此，本發(fā)明的GnT-Ⅳ不僅對(duì)制備或改善糖綴合物型藥物、試劑和食物是有用的，而且對(duì)修飾任何生物高分子的糖鏈結(jié)構(gòu)也是有用的。
本發(fā)明的GnT-Ⅳ基因?qū)τ谠\斷或治療疾病如癌癥和修飾微生物產(chǎn)生的糖綴合物產(chǎn)物糖鏈結(jié)構(gòu)也是有用的。
此外，產(chǎn)生的抗作為抗原的本發(fā)明GnT-Ⅳ蛋白的抗體或抗血清，或作為探針的本發(fā)明GnT-Ⅳ基因的部分或全長(zhǎng)對(duì)微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、各種動(dòng)物組織、血細(xì)胞及血液的特征描述或診斷患病細(xì)胞或組織如癌癥是有用的。
序列表SEQ ID NO:1序列長(zhǎng)度8序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp Asn Leu Tyr Pro Glu Glu Lys5SEQ ID NO:2序列長(zhǎng)度11序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp Tyr Val Asn Gly Val Val Ala Asn Glu Lys5 10SEQ ID NO:3序列長(zhǎng)度21序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Glu Ile Ser Ser Gly Leu Val Glu Ile Ile Ser Pro Pro Glu Ser Tyr5 10 15Tyr Pro Asp Leu Thr20SEQ ID NO:4序列長(zhǎng)度8序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Glu Arg Val Arg Trp Arg Thr Lys5SEQ ID NO:5序列長(zhǎng)度15序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Lys Gln Asn Leu Asp Tyr Cys Phe Leu Met Met Tyr Ala Gln Glu5 10 15SEQ ID NO:6序列長(zhǎng)度6序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp His Ile Leu Trp Val5SEQ ID NO:7序列長(zhǎng)度14序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Lys Ile His Val Asn Pro Pro Ala Glu Val Ser Thr Ser Leu5 10SEQ ID NO:8序列長(zhǎng)度10序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Lys Val Tyr Gln Gly His Thr Leu Glu Lys5 10SEQ ID NO:9序列長(zhǎng)度10序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp Phe Phe Trp Ala Ile Thr Pro Val Ala5 10SEQ ID NO:10序列長(zhǎng)度6序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp Tyr Ile Leu Phe Lys5SEQ ID NO:11序列長(zhǎng)度15序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp Lys Pro Val Asn Val Glu Ser Tyr Leu Phe His Ser Gly Asn5 10SEQ ID NO:12序列長(zhǎng)度10序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp Ile Leu Leu X Thr Thr Val Glu Val5 10SEQ ID NO:13序列長(zhǎng)度9序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Lys Ser Glu Gly Leu Asp Ile Ser Lys5SEQ ID NO:14序列長(zhǎng)度8序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Asp Gly Tyr Phe Arg Ile Gly Lys5SEQ ID NO:15序列長(zhǎng)度29序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述AAR ATY CAY GTB AAY CCH CCH GCN GAR GT29Lys Ile His Val Asn Pro Pro Ala Glu ValSEQ ID NO:16序列長(zhǎng)度35序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述TG RAA VAR RTA RSW YTC VAC RTT VAC DGG YTT RTC 35His Phe Leu Tyr Ser Glu Val Asn Val Pro Lys AspSEQ ID NO:17序列長(zhǎng)度2246序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型cDNA序列描述GGCGGCTGCT CGGTGGCGGC TCGTCGGCGG CCGCGGCAGG ACTGGCAGCG CCGGCGGCGG 60GGAGAAAGAA GCATCCACCT ATGAAGACCG TGCAGACAGT CCTGAATAAT AATTGTGAAT 120GGTGTGGCTG CCAGACTAGT TCTGCTGAGC ATCTGAAATG AACCTCTCCT ATTGATTGTT 180TCAGTTGGCC CCGAGCCAGG AGTACTGGGT TTGCTTGACT TCAGGATAAA AAGAAACGGA 240CTTGGTTATC ATCGTAAACA TATGAACCAG TGTGATGGTG AAATGAG ATG AGG CTC 296Met Arg Leu1CGA AAT GGA ACT GTA GCC ACT GTT TTA GCA TTT ATC ACC TCG TTC CTC 344Arg Asn Gly Thr Val Ala Thr Val Leu Ala Phe Ile Thr Ser Phe Leu5 10 15ACT TTA TCT TGG TAT ACA ACA TGG CAA AAT GGG AAA GAA AAA GTG ATT 392Thr Leu Ser Trp Tyr Thr Thr Trp Gln Asn Gly Lys Glu Lys Val Ile20 25 30 35GCT TAT CAA CGA GAA TTT CTT GCT CTG AAA GAA CGT CTC CGA ATA GCT 440Ala Tyr Gln Arg Glu Phe Leu Ala Leu Lys Glu Arg Leu Arg Ile Ala40 45 50GAA CAT CGA ATC TCT CAG CGC TCT TCT GAG CTC AGT GCC ATT GTA CAG 488Glu His Arg Ile Ser Gln Arg Ser Ser Glu Leu Ser Ala Ile Val Gln55 6065CAA TTC AAG CGT GTA GAA GCA GAA ACA AAC AGG AGT AAG GAT CCA GTG 536Gln Phe Lys Arg Val Glu Ala Glu Thr Asn Arg Ser Lys Asp Pro Val70 75 80AAT AAA TTT TCA GAT GAT ACC CTA AAG ATA CTA AAG GAG TTA ACA AGC 584Asn Lys Phe Ser Asp Asp Thr Leu Lys Ile Leu Lys Glu Leu Thr Ser85 90 95AAA AAG TCT CTT CAA GTG CCA AGT ATT TAT TAT CAT TTG CCT CAT TTA 632Lys Lys Ser Leu Gln Val Pro Ser Ile Tyr Tyr His Leu Pro His Leu100 105 110 115TTG CAA AAT GAA GGA AGC CTT CAA CCT GCC GTG CAG ATC GGA AAT GGA 680Leu Gln Asn Glu Gly Ser Leu Gln Pro Ala Val Gln Ile Gly Asn Gly120 125 130CGA ACA GGA GTT TCA ATA GTA ATG GGA ATT CCT ACA GTG AAG AGA GAA 728Arg Thr Gly Val Ser Ile Val Met Gly Ile Pro Thr Val Lys Arg Glu135 140 145GTT AAA TCT TAC CTC ATA GAA ACT CTT CAT TCC CTT ATT GAT AAT CTG 776Val Lys Ser Tyr Leu Ile Glu Thr Leu His Ser Leu Ile Asp Asn Leu150 155 160TAT CCT GAA GAG AAG TTG GAC TGT GTT ATA GTA GTC TTC ATA GGA GAG 824Tyr Pro Glu Glu Lys Leu Asp Cys Val Ile Val Val Phe Ile Gly Glu165 170 175ACA GAT ACT GAT TAT GTA AAT GGT GTT GTA GCC AAC CTG GAG AAA GAA 872Thr Asp Thr Asp Tyr Val Asn Gly Val Val Ala Asn Leu Glu Lys Glu180 185 190 195TTT TCT AAA GAA ATC AGT TCT GGC TTG GTG GAA ATA ATA TCA CCT CCT 920Phe Ser Lys Glu Ile Ser Ser Gly Leu Val Glu Ile Ile Ser Pro Pro200 205 210GAA AGC TAT TAT CCT GAC CTG ACG AAC TTA AAG GAG ACA TTT GGA GAT 968Glu Ser Tyr Tyr Pro Asp Leu Thr Asn Leu Lys Glu Thr Phe Gly Asp215 220 225TCT AAA GAA AGA GTA AGA TGG AGA ACA AAG CAA AAC CTA GAT TAT TGT 1016Ser Lys Glu Arg Val Arg Trp Arg Thr Lys Gln Asn Leu Asp Tyr Cys230 235 240TTT CTA ATG ATG TAT GCT CAG GAA AAA GGC ACA TAC TAC ATC CAG CTT 1064Phe Leu Met Met Tyr Ala Gln Glu Lys Gly Thr Tyr Tyr Ile Gln Leu245 250 255GAA GAT GAT ATT ATT GTC AAA CAG AAT TAC TTT AAC ACC ATA AAG AAT 1112Glu Asp Asp Ile Ile Val Lys Gln Asn Tyr Phe Asn Thr Ile Lys Asn260 265 270 275TTT GCA CTT CAA CTT TCT TCT GAG GAA TGG ATG ATA CTT GAG TTC TCC 1160Phe Ala Leu Gln Leu Ser Ser Glu Glu Trp Met Ile Leu Glu Phe Ser280 285 290CAG CTG GGA TTC ATT GGT AAA ATG TTT CAA GCA CCT GAC CCA CTC CTG 1208Gln Leu Gly Phe Ile Gly Lys Met Phe Gln Ala Pro Asp Leu Thr Leu295 300 305ATT GTG GAA TTC ATA TTT ATG TTC TAT AAG GAG AAG CCC ATC GAC TGG 1256Ile Val Glu Phe Ile Phe Met Phe Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Asp Trp310 315 320CTC TTG GAC CAT ATT CTG TGG GTC AAA GTC TGC AAC CCG GAA AAA GAT 1304Leu Leu Asp His Ile Leu Trp Val Lys Val Cys Asn Pro Glu Lys Asp325 330 335GCA AAA CAC TGT GAT CGA CAG AAG GCA AAT CTG CGA ATT CGT TTC AGA 1352Ala Lys His Cys Asp Arg Gln Lys Ala Asn Leu Arg Ile Arg Phe Arg340 345 350 355CCG TCC CTT TTC CAA CAC GTT GGT CTG CAT TCT TCA CTC ACA GGA AAA 1400Pro Ser Leu Phe Gln His Val Gly Leu His Ser Ser Leu Thr Gly Lys360 365 370ATT CAG AAA CTC ACG GAT AAA GAT TAC ATG AAA CCA TTA CTG CTC AAA 1448Ile Gln Lys Leu Thr Asp Lys Asp Tyr Met Lys Pro Leu Leu Leu Lys375 380 385ATC CAT GTA AAC CCC CCT GCA GAG GTA TCT ACT TCT TTG AAG GTC TAC 1496Ile His Val Asn Pro Pro Ala Glu Val Ser Thr Ser Leu Lys Val Tyr390 395 400CAA GGT CAT ACA CTG GAG AAA ACT TAC ATG GGT GAG GAC TTC TTC TGG 1544Gln Gly His Thr Leu Glu Lys Thr Tyr Met Gly Glu Asp Phe Phe Trp405 410 415GCT ATA ACC CCA GTA GCT GGA GAC TAC ATC CTA TTT AAA TTC GAC AAG 1592Ala Ile Thr Pro Val Ala Gly Asp Tyr Ile Leu Phe Lys Phe Asp Lys420 425 430 435CCA GTC AAT GTG GAA AGT TAT TTG TTC CAT AGT GGC AAC CAG GAT CAT 1640Pro Val Asn Val Glu Ser Tyr Leu Phe His Ser Gly Asn Gln Asp His440 445 450CCA GGG GAT ATT CTG CTC AAC ACA ACG GTG GAA GTT CTG CCT TTG AAG 1688Pro Gly Asp Ile Leu Leu Asn Thr Thr Val Glu Val Leu Pro Leu Lys455 460 465AGT GAA GGT TTG GAC ATC AGC AAA GAA ACC AAA GAC AAA CGA TTA GAA 1736Ser Glu Gly Leu Asp Ile Ser Lys Glu Thr Lys Asp Lys Arg Leu Glu470 475 480GAT GGC TAT TTC AGA ATA GGG AAA TTT GAA AAC GGT GTT GCG GAA GGG 1784Asp Gly Tyr Phe Arg Ile Gly Lys Phe Glu Asn Gly Val Ala Glu Gly485 490 495ATG GTG GAT CCC AGC CTA AAC CCC ATT TCG GCC TTC CGA CTT TCA GTT 1832Met Val Asp Pro Ser Leu Asn Pro Ile Ser Ala Phe Arg Leu Ser Val 500500 505 510 515ATT CAG AAT TCT GCT GTT TGG GCC ATT CTT AAT GAG ATC CAT ATT AAA 1880Ile Gln Asn Ser Ala Val Trp Ala Ile Leu Asn Glu Ile His Ile Lys520 525 530AAA GTC ACA AAC TGACCATC1900Lys Val Thr Asn535TCTACTAAGA AACCAACACA TTTTTTCCCT GTGAATTTGT TGATTAAAGA CAGCTGAGCA 1960CGTACCTTTT TTTGGTAACT TGAATTCTAC CTCTCGCGAA ATCTACTGTA GATAAAATGA 2020TTGTCATATT TCCACTTGGA AAATGAATCT CCCACGGATA ATTGTATTCA TTTGAATCTA 2080AGCTGTCCTC CAGTTTTAAC TCAACTCAAA CGTTTTACAG TTATGACAGC CTGTTAATAT 2140GACTTGTACT ATTTTGGTAT TATACTAATA CATAAGAGTT GTACATATTG TTACATTCAT 2200TAAATTTGAG AAAAATTAAT GTTAAATACA TTTTATGAAC GGGCCG 2246SEQ ID NO:18序列長(zhǎng)度535序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Met Arg Leu Arg Asn Gly Thr Val Ala Thr Val Leu Ala Phe Ile Thr1 5 10 15Ser Phe Leu Thr Leu Ser Trp Tyr Thr Thr Trp Gln Asn Gly Lys Glu20 25 30Lys Val Ile Ala Tyr Gln Arg Glu Phe Leu Ala Leu Lys Glu Arg Leu35 40 45Arg Ile Ala Glu His Arg Ile Ser Gln Arg Ser Ser Glu Leu Ser Ala50 55 60Ile Val Gln Gln Phe Lys Arg Val Glu Ala Glu Thr Asn Arg Ser Lys65 70 75 80Asp Pro Val Asn Lys Phe Ser Asp Asp Thr Leu Lys Ile Leu Lys Glu85 90 95Leu Thr Ser Lys Lys Ser Leu Gln Val Pro Ser Ile Tyr Tyr His Leu100 105 110Pro His Leu Leu Gln Asn Glu Gly Ser Leu Gln Pro Ala Val Gln Ile115 120 125Gly Asn Gly Arg Thr Gly Val Ser Ile Val Met Gly Ile Pro Thr Val130 135 140Lys Arg Glu Val Lys Ser Tyr Leu Ile Glu Thr Leu His Ser Leu Ile145 150 155 160Asp Asn Leu Tyr Pro Glu Glu Lys Leu Asp Cys Val Ile Val Val Phe165 170 175Ile Gly Glu Thr Asp Thr Asp Tyr Val Asn Gly Val Val Ala Asn Leu180 185 190Glu Lys Glu Phe Ser Lys Glu Ile Ser Ser Gly Leu Val Glu Ile Ile195 200 205Ser Pro Pro Glu Ser Tyr Tyr Pro Asp Leu Thr Asn Leu Lys Glu Thr210 215 220Phe Gly Asp Ser Lys Glu Arg Val Arg Trp Arg Thr Lys Gln Asn Leu225 230 235 240Asp Tyr Cys Phe Leu Met Met Tyr Ala Gln Glu Lys Gly Thr Tyr Tyr245 250 255Ile Gln Leu Glu Asp Asp Ile Ile Val Lys Gln Asn Tyr Phe Asn Thr260 265 270Ile Lys Asn Phe Ala Leu Gln Leu Ser Ser Glu Glu Trp Met Ile Leu275 280 285Glu Phe Ser Gln Leu Gly Phe Ile Gly Lys Met Phe Gln Ala Pro Asp290 295 300Leu Thr Leu Ile Val Glu Phe Ile Phe Met Phe Tyr Lys Glu Lys Pro305 310 315 320Ile Asp Trp Leu Leu Asp His Ile Leu Trp Val Lys Val Cys Asn Pro325 330 335Glu Lys Asp Ala Lys His Cys Asp Arg Gln Lys Ala Asn Leu Arg Ile340 345 350Arg Phe Arg Pro Ser Leu Phe Gln His Val Gly Leu His Ser Ser Leu355 360 365Thr Gly Lys Ile Gln Lys Leu Thr Asp Lys Asp Tyr Met Lys Pro Leu370 375 380Leu Leu Lys Ile His Val Asn Pro Pro Ala Glu Val Ser Thr Ser Leu385 390 395 400Lys Val Tyr Gln Gly His Thr Leu Glu Lys Thr Tyr Met Gly Glu Asp405 410 415Phe Phe Trp Ala Ile Thr Pro Val Ala Gly Asp Tyr Ile Leu Phe Lys420 425 430Phe Asp Lys Pro Val Asn Val Glu Ser Tyr Leu Phe His Ser Gly Asn435 440 445Gln Asp His Pro Gly Asp Ile Leu Leu Asn Thr Thr Val Glu Val Leu450 455 460Pro Leu Lys Ser Glu Gly Leu Asp Ile Ser Lys Glu Thr Lys Asp Lys465 470 475 480Arg Leu Glu Asp Gly Tyr Phe Arg Ile Gly Lys Phe Glu Asn Gly Val485 490 495Ala Glu Gly Met Val Asp Pro Ser Leu Asn Pro Ile Ser Ala Phe Arg500 505 510Leu Ser Val Ile Gln Asn Ser Ala Val Trp Ala Ile Leu Asn Glu Ile515 520 525His Ile Lys Lys Val Thr Asn530 535SEQ ID NO:19序列長(zhǎng)度31序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述CCCTCGAG ATG AGG CTC CGA AAT GGA ACT GT31Met Arg Leu Arg Asn Gly Thr ValSEQ ID NO:20序列長(zhǎng)度31序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述TTTCTAGA TCA GTT TGT GAC TTT TTT AAT AT31TRM Asn Thr Val Lys Lys Ile HisSEQ ID NO:21序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述ACGATTGTGC AACAGTTCAA GCGT24SEQ ID NO:22序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述GGGAGAACTC CAGGATCATC CAGT24SEQ ID NO:23序列長(zhǎng)度2115序列類(lèi)型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型cDNA序列描述GAAATGAACC TCTCTTATTG ATTTTTATTG GCCTAGAGCC AGGAGTACTG CATTCAGTTG 60ACTTTCAGGG TAAAAAGAAA ACAGTCCTGG TTGTTGTCAT CATAAACATA TGGACCAGTG 120TGATGGTGAA ATGAG ATG AGG CTC CGC AAT GGA ACT GTA GCC ACT GCT TTA 171Met Arg Leu Arg Asn Gly Thr Val Ala Thr Ala Leu1 5 10GCA TTT ATC ACT TCC TTC CTT ACT TTG TCT TGG TAT ACT ACA TGG CAA 219Ala Phe Ile Thr Ser Phe Leu Thr Leu Ser Trp Tyr Thr Thr Trp Gln15 20 25AAT GGG AAA GAA AAA CTG ATT GCT TAT CAA CGA GAA TTC CTT GCT TTG 267Asn Gly Lys Glu Lys Leu Ile Ala Tyr Gln Arg Glu Phe Leu Ala Leu30 35 40AAA GAA CGT CTT CGA ATA GCT GAA CAC AGA ATC TCA CAG CGC TCT TCT 315Lys Glu Arg Leu Arg Ile Ala Glu His Arg Ile Ser Gln Arg Ser Ser45 50 55 60GAA TTA AAT ACG ATT GTG CAA CAG TTC AAG CGT GTA GGA GCA GAA ACA 363Glu Leu Asn Thr Ile Val Gln Gln Phe Lys Arg Val Gly Ala Glu Thr65 70 75AAT GGA AGT AAG GAT GCG TTG AAT AAG TTT TCA GAT AAT ACC CTA AAG 411Asn Gly Ser Lys Asp Ala Leu Asn Lys Phe Ser Asp Asn Thr Leu Lys80 85 90CTG TTA AAG GAG TTA ACA AGC AAA AAA TCT CTT CAA GTG CCA AGT ATT 459Leu Leu Lys Glu Leu Thr Ser Lys Lys Ser Leu Gln Val Pro Ser Ile95 100 105TAT TAT CAT TTG CCT CAT TTA TTG AAA AAT GAA GGA AGT CTT CAA CCT 507Tyr Tyr His Leu Pro His Leu Leu Lys Asn Glu Gly Ser Leu Gln Pro110 115 120GCT GTA CAG ATT GGC AAC GGA AGA ACA GGA GTT TCA ATA GTC ATG GGC 555Ala Val Gln Ile Gly Asn Gly Arg Thr Gly Val Ser Ile Val Met Gly125 130 135 140ATT CCC ACA GTG AAG AGA GAA GTT AAA TCT TAC CTC ATA GAA ACT CTT 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370TCC TCG CTG GCT GGC AAG ATC CAG AAA CTG AAG GAC AAA GAC TTT GGA 1206Ser Ser Leu Ala Gly Lys Ile Gln Lys Leu Lys Asp Lys Asp Phe Gly375 380 385AAG CAG GCG CTG CGG AAG GAG CAT GTG AAC CCG CCA GCA GAG GTG AGC 1254Lys Gln Ala Leu Arg Lys Glu His Val Asn Pro Pro Ala Glu Val Ser390 395 400ACG AGC CTG AAG ACA TAC CAG CAC TTC ACC CTG GAG AAA GCC TAC CTG 1302Thr Ser Leu Lys Thr Tyr Gln His Phe Thr Leu Glu Lys Ala Tyr Leu405 410 415 420CGC GAG GAC TTC TTC TGG GCC TTC ACC CCT GCC GCG GGG GAC TTC ATC 1350Arg Glu Asp Phe Phe Trp>Ala Phe Thr Pro Ala Ala Gly Asp Phe Ile425 430 435CGC TTC CGC TTC TTC CAA CCT CTA AGA CTG GAG CGG TTC TTC TTC CGC 1398Arg Phe Arg Phe Phe Gln Pro Leu Arg Leu Glu Arg Phe Phe Phe Arg440 445 450AGT GGG AAC ATC GAG CAC CCG GAG GAC AAG CTC TTC AAC ACG TCT GTG 1446Ser Gly Asn Ile Glu His Pro Glu Asp Lys Leu Phe Asn Thr Ser Val
455 460 465GAG GTG CTG CCC TTC GAC AAC CCT CAG TCA GAC AAG GAG GCC CTG CAG 1494Glu Val Leu Pro Phe Asp Asn Pro Gln Ser Asp Lys Glu Ala Leu Gln470 475 480GAG GGC CGC ACC GCC ACC CTC CGG TAC CCT CGG AGC CCC GAC GGC TAC 1542Glu Gly>Arg Thr Ala Thr Leu Arg Tyr Pro Arg Ser Pro Asp Gly Tyr485 490 495 500CTC CAG ATC GGC TCC TTC TAC AAG GGA GTG GCA GAG GGA GAG GTG GAC 1590Leu Gln Ile Gly Ser Phe Tyr Lys Gly Val Ala Glu Gly Glu Val Asp505 510 515CCA GCC TTC GGC CCT CTG GAA GCA CTG CGC CTC TCG ATC CAG ACG GAC 1638Pro Ala Phe Gly Pro Leu Glu Ala Leu Arg Leu Ser Ile Gln Thr Asp520 525 530TCC CCT GTG TGG GTG ATT CTG AGC GAG ATC TTC CTG AAA AAG GCC GAC 1686Ser Pro Val Trp Val Ile Leu Ser Glu Ile Phe Leu Lys Lys Ala Asp535 540 545 548TAAGCTGCGG GCTTCTGAGG GTACCCTGTG GCCAGCCC 1724SEQ ID NQ:37序列長(zhǎng)度548序列類(lèi)型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型肽序列描述Met Arg Leu Arg Asn Gly Thr Phe Leu Thr Leu Leu Leu Phe Cys Leu1 5 10 15Cys Ala Phe Leu Ser Leu Ser Trp Tyr Ala Ala Leu Ser Gly Gln Lys20 25 30Gly Asp Val Val Asp Val Tyr Gln Arg Glu Phe Leu Ala Leu Arg Asp35 40 45Arg Leu His Ala Ala Glu Gln Glu Ser Leu Lys Arg Ser Lys Glu Leu50 55 60Asn Leu Val Leu Asp Glu Ile Lys Arg Ala Val Ser Glu Arg Gln Ala65 70 75 80Leu Arg Asp Gly Asp Gly Asn Arg Thr Trp Gly Arg Leu Thr Glu Asp85 90 95Pro Arg Leu Lys Pro Trp Asn Gly Ser His Arg His Val Leu His Leu100 105 110Pro Thr Val Phe His His Leu Pro His Leu Leu Ala Lys Glu Ser Ser115 120 125Leu Gln Pro Ala Val Arg Val Gly Gln Gly Arg Thr Gly Val Ser Val130 135 140Val Met Gly Ile Pro Ser Val Arg Arg Glu Val His Ser Tyr Leu Thr145 150 155 160Asp Thr Leu His Ser Leu Ile Ser Glu Leu Ser Pro Gln Glu Lys Glu165 170 175Asp Ser Val Ile Val Val Leu Ile Ala Glu Thr Asp Ser Gln Tyr Thr180 185 190Ser Ala Val Thr Glu Asn Ile Lys Ala Leu Phe Pro Thr Glu Ile His195 200 205Ser Gly Leu Leu Glu Val Ile Ser Pro Ser Pro His Phe Tyr Pro Asp210 215 220Phe Ser Arg Leu Arg Glu Ser Phe Gly Asp Pro Lys Glu Arg Val Arg225 230 235 240Trp Arg Thr Lys Gln Asn Leu Asp Tyr Cys Phe Leu Met Met Tyr Ala245 250 255Gln Ser Lys Gly Ile Tyr Tyr Val Gln Leu Glu Asp Asp Ile Val Ala
260 265 270Lys Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Met Lys Asn Phe Ala Leu Gln Gln Pro275 280 285Ser Glu Asp Trp Met Ile Leu Glu Phe Ser Gln Leu Gly Phe Ile Gly290 295 300Lys Met Phe Lys Ser Leu Asp Leu Ser Leu Ile Val Glu Phe Ile Leu305 310 315 320Met Phe Tyr Arg Asp Lys Pro Ile Asp Trp Leu Leu Asp His Ile Leu325 330 335Trp Val Lys Val Cys Asn Pro Glu Lys Asp Ala Lys His Cys Asp Arg340 345 350Gln Lys Ala Asn Leu Arg Ile Arg Phe Lys Pro Ser Leu Phe Gln His355 360 365Val Gly Thr His Ser Ser Leu Ala Gly Lys Ile Gln Lys Leu Lys Asp370 375 380Lys Asp Phe Gly Lys Gln Ala Leu Arg Lys Glu His Val Asn Pro Pro385 390 395 400Ala Glu Val Ser Thr Ser Leu Lys Thr Tyr Gln His Phe Thr Leu Glu405 410 415Lys Ala Tyr Leu Arg Glu Asp Phe Phe Trp Ala Phe Thr Pro Ala Ala420 425 430Gly Asp Phe Ile Arg Phe Arg Phe Phe Gln Pro Leu Arg Leu Glu Arg435 440 445Phe Phe Phe Arg Ser Gly Asn Ile Glu His Pro Glu Asp Lys Leu Phe450 455 460Asn Thr Ser Val Glu Val Leu Pro Phe Asp Asn Pro Gln Ser Asp Lys465 470 475 480Glu Ala Leu Gln Glu Gly Arg Thr Ala Thr Leu Arg Tyr Pro Arg Ser485 490 495Pro Asp Gly Tyr Leu Gln Ile Gly Ser Phe Tyr Lys Gly Val Ala Glu500 505 510Gly Glu Val Asp Pro Ala Phe Gly Pro Leu Glu Ala Leu Arg Leu Ser515 520 525Ile Gln Thr Asp Ser Pro Val Trp Val Ile Leu Ser Glu Ile Phe Leu530 535 540Lys Lys Ala Asp545 548SEQ ID NO:38序列長(zhǎng)度29序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述TTCTCGAGGA GATGAGGCTC CGCAATGGC29SEQ ID NO:39序列長(zhǎng)度30序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述AATCTAGAAA TGTGGGCTTC AGGGCTGGC30SEQ ID NO40序列長(zhǎng)度28序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述CCCTCGAG ATG GGG GTG CAC GAA TGT CC28Met Gly Val His Glu Cys ProSEQ ID NO:41序列長(zhǎng)度48序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CTTTTTGCTT GTTAACTCCT TTAGTATTGG GGCGCCCAGG ACTGGGAG48SEQ ID NO:42序列長(zhǎng)度48序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述CTCCCAGTCC TGGGCGCCCC AATACTAAAG GAGTTAACAA GCAAAAAG48SEQ ID NO:43序列長(zhǎng)度44序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CTTCCTTCAT TTTGCAATAA ATGAGGGGCG CCCAGGACTG GGAG 44SEQ ID NO:44序列長(zhǎng)度43序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述ATTTAACTTC TCTCTTCACT GTAGGGGCGC CCAGGACTGG GAG 43SEQ ID NO:45序列長(zhǎng)度44序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述CTCCCAGTCC TGGGCGCCCC TCATTTATTG CAAAATGAAG GAAG 44SEQ ID NO:46序列長(zhǎng)度43序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述CTCCCAGTCC TGGGCGCCCC TACAGTGAAG AGAGAAGTTA AAT 43SEQ ID NO:47序列長(zhǎng)度26序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述TTCTAGAA TCA CCC TTC CGC AAC ACC 26TRM Gly Glu Ala Val GlySEQ ID NO:48序列長(zhǎng)度28序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述TTCTAGAA TCA AGG CAG AAC TTC CAC CG 28TRM Pro Leu Val G1u Val ThrSEQ ID NO:49序列長(zhǎng)度38序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述TTCTAGAA TCA TTT AAA TAG GAT GTA GTC TCC AGC TAC 38TRM Lys Phe Leu Ile Tyr Asp Gly Ala ValSEQ ID NO:50序列長(zhǎng)度34序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述TTCTAGAA TCA TGG TTT CAT GTA ATC TTT ATC CG 34TRM Pro Lys Met Tyr Asp Lys Asp ThrSEQ ID NO:51序列長(zhǎng)度19序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述TTC ATG AGG CTC CGA AAT G 19Met Arg Leu Arg Asn GlySEQ ID NO:52序列長(zhǎng)度29序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CAAGCT TCA GTT TGT GAC TTT TTT AAT AT 29TRM Asn Thr Val Lys Lys Ile HisSEQ ID NO:53序列長(zhǎng)度27序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述TC ATG ATA CTA AAG GAG TTA ACA AGC A 27Met Ile Leu Lys Glu Leu Thr Ser LysSEQ ID NO:54序列長(zhǎng)度51序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CAAGCT TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTT TGT GAC TTT 39TRM His His His His His His Asn Thr Val LysTTT AAT ATG GAT 51Lys Ile His IleSEQ ID NO:55序列長(zhǎng)度18序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CAAGCT TCA GTG GTG GTG 18TRM His His HisSEQ ID NO:56序列長(zhǎng)度32序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述TC ATG ATA TTA AAG GAG TTA ACA AGC AAA AAA 32Met Ile Leu Lys Glu Leu Thr Ser Lys LysSEQ ID NO:57序列長(zhǎng)度51序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CAAGCT TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTT GGT GGC TTT 39TRM His His His His His His Asn Thr Ala LysTTT AAT ATG AAT 51Lys Ile His IleSEQ ID NO:58序列長(zhǎng)度49序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CAAGCT TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TGG TTT CAT ATA 39TRM His His His His His His Pro Lys Met TyrATC TTT ATC C 49Asp Lys AspSEQ ID NO:59序列長(zhǎng)度19序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述TTC ATG AGG CTC CGC AAT G 19Met Arg Leu Arg Asn GlySEQ ID NO:60序列長(zhǎng)度18序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CAGGTTGAGC TCCTTGGA 18SEQ ID NO:61序列長(zhǎng)度18序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述TCCAAGGAGC TCAACCTG 18SEQ ID NO:62序列長(zhǎng)度44序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA反義是序列描述CAAGCT TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTC GGC CTT TTT CAG GA 44TRM His His His His His His Asp Als Lys Lys Leu PheSEQ ID NO:63序列長(zhǎng)度23序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類(lèi)型合成DNA序列描述CCC ATG GGC CGC CTA ACA GAG GA 23Met Gly Arg Leu Thr Glu Asp
權(quán)利要求
1．具有產(chǎn)生含有由下面化學(xué)式所代表的部分結(jié)構(gòu)的糖類(lèi)活性的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶
該酶用UDP-GlcNAc作為糖供體和具有由下面化學(xué)式所代表的部分結(jié)構(gòu)的糖類(lèi)作為糖受體
2．權(quán)利要求1的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其中的作為糖受體的糖類(lèi)為寡糖、多糖、糖綴合物(糖肽、糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖)或其衍生物。
3．權(quán)利要求1的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其中的糖受體為具有由下面化學(xué)式所代表的部分結(jié)構(gòu)的糖類(lèi)
其中的R1:H-,Manα1→6或GlcNAcβ1→6R2:H-,Manα1→3或GlcNAcβ1→2R3:-OH或β1→4 GlcNAc→R4R4:-OH,-H，-吡啶基胺或-肽鏈。
4．β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，包括顯示于SEQ ID NOS:1-14中氨基酸序列作為部分序列。
5．β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其由顯示于SEQ ID NO:18中氨基酸序列所組成或由顯示于SEQ ID NO:18中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍具有β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。
6．由顯示于SEQ ID NO:18中部分氨基酸序列所組成的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其中包括至少?gòu)奈恢?3至位置383的殘基，或者所述的部分序列具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍具有β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。
7．β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其由顯示于SEQ ID NO:24中的氨基酸序列所組成，或由顯示于SEQ ID NO:24中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍具有β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。
8．由顯示于SEQ ID NO:24中部分氨基酸序列所組成的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，包括至少?gòu)奈恢?4至位置383的殘基，或所述的部分序列具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍具有β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。
9．β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其由顯示于SEQ ID NO:37中氨基酸序列所組成，或由顯示于SEQ ID NO:37中的氨基酸序列所組成但具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍具有β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。
10．由顯示于SEQ ID NO:37中部分氨基酸序列所組成的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其中包括至少?gòu)奈恢?1至位置390的殘基，或所述的部分序列具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失或替代而仍具有β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。
11．編碼權(quán)利要求5或6的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基團(tuán)。
12．編碼權(quán)利要求7或8的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因。
13．編碼權(quán)利要求9或10的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因。
14．由SEQ ID NO:17中顯示的核苷酸序列所組成的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因。
15．由SEQ ID NO:23中顯示的核苷酸序列所組成的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因。
16．由顯示于SEQ ID NO:36中核苷酸序列所組成的β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因。
17．通過(guò)將權(quán)利要求11至16中的任何一種β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因插入載體DNA而獲得的重組DNA。
18．包括權(quán)利要求11至16中任何一種β1→4N乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因部分或全長(zhǎng)的染色體片段。
19．帶有權(quán)利要求17重組DNA的宿主細(xì)胞。
20．向其中人工導(dǎo)入有權(quán)利要求18染色體片段的宿主細(xì)胞。
21．用于從生物樣品中純化權(quán)利要求1至3中任何一種β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的方法。
22．用于制備β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞和從得到的培養(yǎng)物中回收β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶。
23．用于制備β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞和從得到的培養(yǎng)物中回收β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶。
24．用于制備β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括從分泌物、體液或從權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞勻漿中回收β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶。
25．用于制備β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括從分泌物、體液或從權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞勻漿中回收β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶。
26．其糖鏈結(jié)構(gòu)被權(quán)利要求1-3中任何一種β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶修飾的糖類(lèi)。
27．權(quán)利要求26的糖類(lèi)，其為寡糖、糖肽、糖蛋白或其衍生物。
28．用于修飾由宿主細(xì)胞產(chǎn)生糖蛋白糖鏈分支結(jié)構(gòu)的方法，包括將權(quán)利要求11至16中的任何一種β1→4N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞。
29．其中糖鏈的分支結(jié)構(gòu)由權(quán)利要求28的方法修飾的糖蛋白。
30．權(quán)利要求29的糖蛋白，其為紅細(xì)胞生成素。
全文摘要
一種新的具有β1→4N－乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(GnT－Ⅳ)活性的酶;編碼該酶的基團(tuán);含有該基因的重組DNA;含有該重組DNA的宿主細(xì)胞;用于通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞而制備具有Gn－T－Ⅳ活性酶蛋白的方法;和具有由GnT－Ⅳ所修飾糖鏈的糖類(lèi)。本發(fā)明提供新的GnT－Ⅳ,用于制備該酶的方法,和編碼該酶的基因。該新的GnT－Ⅳ使制備不能由現(xiàn)存糖基轉(zhuǎn)移酶而形成的分枝糖類(lèi)成為可能。因此,它有助于藥物、試劑和復(fù)合糖型食物的制備和改善且在修飾任何生物高分子的糖鏈結(jié)構(gòu)中是有用的。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1214732SQ97193477
公開(kāi)日1999年4月21日 申請(qǐng)日期1997年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月12日
發(fā)明者小栗秀, 箕輪真理, 吉田有人, 竹內(nèi)誠(chéng), 谷口直之 申請(qǐng)人:麒麟麥酒株式會(huì)社 被以下專(zhuān)利引用 (1),