專利名稱：尋靶至特異性配體的生物檢測器的制作方法
Ⅰ．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用來探測和定量測定液體、氣體或固體基質(zhì)的分子的生物檢測器。更具體地，本發(fā)明涉及含有在與靶物質(zhì)發(fā)生相互作用時以分子開關(guān)機(jī)理以表達(dá)報道基因的生物檢測器。本發(fā)明還包括用這些生物檢測器來高特異性、高靈敏度地探測和定量測定所選物質(zhì)的方法。
Ⅱ．發(fā)明背景在生物樣品、體內(nèi)或環(huán)境內(nèi)檢測低濃度水平的生物和無機(jī)物質(zhì)通常是很困難的。這種類型的檢測測定包括多個步驟，它們包括第一抗體結(jié)合步驟、幾步洗滌、與第二抗體的結(jié)合、再次洗滌，且根據(jù)檢測體系，還可包括附加的酶反應(yīng)和洗滌步驟。這類測定方法還有靈敏度低、準(zhǔn)確性差的缺點。例如，傳統(tǒng)的免疫測定會漏檢30％的傳染病。
分子探針測定法盡管很靈敏，但是需要技術(shù)非常高的操作人員和對生物核酸序列的了解。用核酸探針和基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的測定法只能檢測核酸，它們需要復(fù)雜的抽提步驟，而且核酸可能是或不是疾病狀態(tài)的主要指標(biāo)或只是雜質(zhì)。當(dāng)待檢測實體提供的信息非常少時，這兩類測定方法均有局限性。
目前測定患者的物理參數(shù)如CAT或MRI的非侵染性方法是很昂貴的，且常常是不可及的。因此，許多醫(yī)學(xué)問題的檢測仍然需要緩慢而昂貴的試驗。實際試驗和確認(rèn)病情之間的時間可能是非常重要的。例如，在敗血癥病例中，許多患者在確認(rèn)感染、鑒定出感染的生物之前就已死亡，這樣治療就要依靠經(jīng)驗，從而效果較差。另一個例子是篩選血樣中的病原體。
無病原體血樣的校準(zhǔn)需要大量勞動強(qiáng)度高的測定。在HIV-1(引起AIDS的病毒)例子中，目前的測定方法是篩選抗HIV的抗體而不是病毒本身。人受病毒感染許多周時間內(nèi)檢測不到有抗體，而血液中已經(jīng)含有大量感染性病毒顆粒。Clark等，1994,J.Infect,Dis.170:194-197；Piatak等，1993,Aids Suppl.2:S65-71。
例如，為了確定血樣中不含HIV-1，必須進(jìn)行數(shù)個勞動強(qiáng)度高且昂貴的試驗。而且，目前用來最初的鑒別試驗不會鑒定出以相對較低的濃度存在的病毒本身，而是鑒定在最初感染的數(shù)周后才會存在的HIV抗體。Clark等，1994,J.Infect,Dis.170:194-197；Piatak等，1993,Aids Suppl.2:S65-71。因此，對血樣的鑒別不僅耗時、緩慢，而且還不準(zhǔn)確。
同樣，檢測環(huán)境中的物質(zhì)(如空氣中或水中的雜質(zhì))的能力也是非常重要的。例如，需要用不昂貴的多用途測定方法來實時監(jiān)測地下水來控制工業(yè)加工、食品加工操作。然而，目前的方法不適于這樣的“在線”監(jiān)測。
目前的方法有局限性的原因有幾個。首先，獲得足量的檢測物很困難。例如，檢測生物物質(zhì)很困難，因為感興趣的生物物質(zhì)通常在體內(nèi)，因此對于體外監(jiān)測很難獲得大的量。因此，需要采用只需少量物質(zhì)的靈敏的測定方法。這表明需要有一種放大信號的方法?，F(xiàn)在已經(jīng)建立了用于檢測核酸的信號放大方法，但是它不適用于抗原檢測方法。
第二個問題是實時傳感可能是困難的，因為靶物質(zhì)的存在量很少，檢測它們的存在需要耗時、昂貴和有技術(shù)參與的方法。例如，在血液中感染細(xì)菌的敗血病例中，1-10毫升血樣內(nèi)可能只有1-2個細(xì)菌。目前的方法需要首先使細(xì)菌生長從而才能來檢測。Askin,1995,J.Obstet.Gynecol.Neonatal.Nurs.24:635-643。這種時間滯后是有害的，因為延遲治療或是不治療疾病就可能意味著生和死之間的分別。
其它人試圖通過采用放射性或熒光標(biāo)記與抗體組合使用來避免這些局限性(Harlow等，(1988),Antibodies:A Laborartory Manual(Cold Spring Harbor,NY:ColdSpring Harbor Laborartory Press))。以抗體為基礎(chǔ)的測定方法通常包括使抗體與靶分子結(jié)合，然后用一系列的洗滌步驟除去所有未結(jié)合的抗體?？贵w與其靶分子的結(jié)合通?？捎描b定分子(例如含有可檢測標(biāo)記的特異性識別靶分子特異性抗體的次級抗體)來檢測。步驟后也進(jìn)行多步洗滌?；蛘?，靶特異性抗體可以直接與可檢測標(biāo)記相連。標(biāo)記包括放射性微量元素、熒光標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光檢測體系。Harlow和Lane,1988,Antibodies:A Laborartory Manual(Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laborartory Press))。
所需的用這些以抗體為基礎(chǔ)的測定方法來形成特別信號的一系列步驟是耗時的，且勞動強(qiáng)度大。而且，這些測定方法局限于只能測定固定在某些基質(zhì)上的抗原。這類檢測體系的實例包括Western印跡法、免疫組織化學(xué)法和ELISA。目前用放射性同位素和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記可獲得最高的靈敏度。然而，這些檢測體系的靈敏度(即在背景上的特異性信號)通常有限制因素。
同樣，背景輻射在放射性免疫測定技術(shù)也有靈敏度方面的局限性。此外，這些技術(shù)是耗時且昂貴的。最后，放射性方法對環(huán)境有害，因為它們有大量廢物處理問題。
檢測物質(zhì)的另一種方法是采用光。光的優(yōu)點是它很容易測量、沒有侵染性且是定量的。Von,Bally等，(1982)Optics in Biomedical Sciences:Proceedings of theInternational Conference(Berlin,New York:Springer-Verlag)。
傳統(tǒng)的光譜法包括將光照射入物質(zhì)中，并根據(jù)光的吸收和散射來計算濃度。Von,Bally等，(1982)Optics in Biomedical Sciences:Proceedings of the InternationalConference(Berlin,New York:Springer-Verlag)。光技術(shù)檢測光吸收或光散射物質(zhì)的濃度變化。Von,Bally等，(1982)Optics in Biomedical Sciences:Proceedings ofthe International Conference(Berlin,New York:Springer-Verlag)。近紅外光譜法表明它是非離子化的，相對安全的輻射形式，它能很好地用作醫(yī)用探針，因為它可以穿透組織。而且，甚至在很大劑量下它也能很好地耐受。例如現(xiàn)在用光來計算血液中(Nellcor)或是體內(nèi)(Benaron圖象)氧氣的濃度，或甚至是用來檢測體內(nèi)葡萄糖(Sandia)。Benaron和Stevenson,1993,Science 259:1463-1466；Benaron等，1993,in:Medical Optical Tomography: Functional Imaging and Monitoring,G.Muller,B.Chance,R.Alfano等eds.(Bellingham,WA USA:SPIE Press),pp.3-9；Benaron和Stevenson,1994,Adv.Exp.Med.Biol.361:609-617。然而，由于許多物質(zhì)沒有獨特的光譜信號，不能進(jìn)行方便和定量的光測定，從而限制了當(dāng)前的此項技術(shù)。Von,Bally等，(1982)Optics in Biomedical Sciences: Proceedings of the InternationalConference(Berlin,New York: Springer-Verlag)。而且，尤其是在生物介質(zhì)如組織中。低濃度物質(zhì)的檢測通常受高背景信號的干擾，Von,Bally等，(1982)Optics inBiomedical Sciences:Proceedings of the International Conference(Berlin,New York:Springer-Verlag)。
在過去的幾年里，由于極靈敏的檢測和定量光的方法的發(fā)展，以光發(fā)射為基礎(chǔ)的測定方法，例如化學(xué)發(fā)光法(Tatsu和Yoshikawa,1990,Anal Chem.62:2103-2106)，已經(jīng)受到越來越多的注意。Hooper等，1994,J.Biolumin.Chemilumin.9:113-122。采用化學(xué)發(fā)光的生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)品的一個例子是用于免疫測定和核酸檢測的ECL檢測系統(tǒng)(Amersham)。
生物源光(生物發(fā)光)在生物測定中的應(yīng)用也隨化學(xué)發(fā)光檢測而同時發(fā)展，因為需要檢測光的裝置是相似的。Kricka,1991,Clin.Chem.37:1472-1481。最常用的生物光源是螢光素酶，一種能由很多生物合成的發(fā)光酶，這些生物包括Phoninuspyralis(美洲螢火蟲)、Renilla reniformis(磷光珊瑚)和Photobacterium(發(fā)光細(xì)菌類)。通常，螢光素酶是低分子量的氧化還原酶，它在氧氣、ATP和鎂離子存在下催化螢光素脫氫。在該步驟中，約96％的能量以可見光釋放。參見Jassim等，1990,J.Biolumin.Chemilumin.5:115-122。
光子檢測的靈敏性和有設(shè)計制造出能表達(dá)生物發(fā)光蛋白質(zhì)細(xì)菌和其它細(xì)胞的能力使人能夠?qū)⑦@些細(xì)胞作為靈敏的生物傳感器用于環(huán)境研究。Guzzo等，1992,Toxicol.Lett.64:687-693；Heitzer等，1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1487-1494；Karube和Nakanishi,1994,Curr.Opin.Biotechnol.5:54-59；Phadke,1992,Biosystems 27:203-206；Selifonova等，1993,Appl.Environ.Microbiol.59:3083-3090。例如，Selifonova等描述了用于檢測環(huán)境中污染物的生物傳感器。更具體的是，通過采用Hg(Ⅱ)可誘導(dǎo)的Tn2l操縱子和來自費希爾氏弧菌Vibriofischeri的無啟動子的luxCDABE的融合，可以構(gòu)建成用來檢測Hg(Ⅱ)的高靈敏度生物傳感器。
除了采用生物發(fā)光法作為特異性條件(如上所述的Hg(Ⅱ)的存在)的檢測方法的系統(tǒng)外，已經(jīng)采用螢光素酶的組成型表達(dá)來作為標(biāo)記以示蹤細(xì)菌細(xì)胞的存活，因為螢光素酶測定法取決于細(xì)胞的存活。例如，最近已經(jīng)將螢光素酶的組成型表達(dá)用來抗細(xì)菌疾病的藥物和疫苗研制中。具體的是，已經(jīng)采用螢光素酶增強(qiáng)表達(dá)的鳥結(jié)合分支桿菌Mycobacterium tuberculosis株系來評價小鼠中的抗微細(xì)菌活性。Hickey等，1996,Antibacterical Agents and Chemotherapy 40:400-407。
然而，依賴于細(xì)菌受體來引發(fā)螢光素酶的生物傳感器局限于只能感受那些有與可融合入螢光素酶基因的已知啟動子區(qū)域相連的相應(yīng)細(xì)菌受體分子。而且，用來測試小鼠中抗微生物活性的螢光素酶表達(dá)菌是非特異性的。
因此，盡管已經(jīng)有用生物發(fā)光，尤其是螢光素酶作為生物發(fā)光傳感器的方法用于非常專一性的應(yīng)用，而本發(fā)明涉及用于廣泛應(yīng)用的高靈敏度、高選擇性的配體特異性生物檢測器。更具體的是，本發(fā)明將配體特異性結(jié)合的選擇性和抗體譜(repertoire)的多能性與生物發(fā)光檢測的靈敏度結(jié)合起來，具有用靠光子發(fā)射特異性來響應(yīng)預(yù)定配體的內(nèi)在本質(zhì)(entity)。因此，本發(fā)明的方法提供了非常靈敏的生物檢測器用于各種測定方法來檢測任何數(shù)量的商業(yè)上重要的分子。
Ⅲ．發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于檢測和監(jiān)控所選物質(zhì)的定向配體特異性生物檢測器。更具體地，本發(fā)明的生物檢測器包括(1)一個信號轉(zhuǎn)換元件，它包括一個胞外配體特異性結(jié)合部分，該結(jié)合部分與能激活(2)轉(zhuǎn)導(dǎo)物組件的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域融合，處于活性狀態(tài)下的轉(zhuǎn)導(dǎo)物組件可以激活(3)效應(yīng)元件，如與編碼有獨特性質(zhì)而易于檢測(如用光來檢測)的多肽的(4)報道基因作用相關(guān)聯(lián)的啟動子。因此，本發(fā)明的生物檢測器將與靶物質(zhì)(即配體)的結(jié)合轉(zhuǎn)變成可檢測信號。在本發(fā)明的一個較佳實例中，生物檢測器產(chǎn)生的信號是光，它可用一個光電探測器來檢測。因此，就可以鑒定感興趣的物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及用這些生物檢測器高靈敏度、高特異性地檢測和監(jiān)控所選物質(zhì)的方法。本發(fā)明生物檢測器的應(yīng)用方法包括檢測食品和農(nóng)業(yè)中的污染物，醫(yī)藥和研究上的診斷和監(jiān)控，和環(huán)境或防御裝置中的毒物或污染物的檢測。
Ⅳ．附圖簡述

圖1示出生物檢測器主要組成的總的模式。生物檢測器由一個實體組成，該實體中有感受組件(Y形結(jié)構(gòu)的表面部分)、轉(zhuǎn)導(dǎo)組件(Y形結(jié)構(gòu)的生物檢測器內(nèi)部部分)和發(fā)光組件(小圓圈)。
圖2更具體地示出了生物檢測器分子水平的示意圖。
圖3示出在固體載體上有序排列的多個生物檢測器，可以同時檢測一個樣品中不同物質(zhì)。
圖4示出實施例1中也指定的細(xì)菌基因組中轉(zhuǎn)座子整合而產(chǎn)生的生物檢測器。螢光素酶操縱子編碼五種能夠一起生物發(fā)光的蛋白質(zhì)(來自基因A、B、C、D和E)。Chl，指抗氯霉素基因；Kan；抗卡那霉素基因；Amp，抗氨芐青霉素基因；PO4，磷酸酯基團(tuán)(作為轉(zhuǎn)導(dǎo)物的激活物)。
圖5示出人體血液對發(fā)光沙門氏菌的光發(fā)射的影響，試驗表明接近于單細(xì)胞檢測。
Ⅴ．定義除非另有所指，這里所用的所有術(shù)語的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的含義相同。
這里所用的術(shù)語“靶分子”是指待檢測和/或待定量化的物質(zhì)。
除非另有所指，這里所用的術(shù)語“螢光素酶”包括原核和真核螢光素酶以及有改變或變化的物理和/或發(fā)光特性的變種。
這里所用的術(shù)語“生物檢測器”是指用光信號來響應(yīng)靶分子的結(jié)合或相互作用的光學(xué)信號。
這里所用的術(shù)語“光信號”是指可用光檢測技術(shù)來區(qū)別的任何生化反應(yīng)或物質(zhì)。它包括光子發(fā)射、熒光和光吸收。
除非另有所指，這里所用的術(shù)語“光”是指波長約在220nm至1100nm的電磁輻射。
這里所用的術(shù)語“啟動子誘導(dǎo)”是指直接或間接激活所選的可誘導(dǎo)的遺傳因子的行為。
Ⅵ．發(fā)明詳述A．發(fā)明綜述本發(fā)明涉及用于檢測和監(jiān)控所選物質(zhì)(包括微生物、分子和離子)的靶配體特異性生物檢測器。通過采用靠光子發(fā)射來特異性響應(yīng)預(yù)定配體結(jié)合的實體，本發(fā)明的生物檢測器將配體特異性結(jié)合的特異性和選擇性與生物發(fā)光檢測結(jié)合起來。因此，本發(fā)明中的方法為針對任一選定物質(zhì)的檢測與監(jiān)控的多種分析法的開發(fā)提供一種高靈敏的生物檢測器。
更具體地，本發(fā)明的生物檢測器通過一個“分子開關(guān)”(即信號轉(zhuǎn)導(dǎo))使配體特異性結(jié)合并與響應(yīng)配體結(jié)合的可檢測的報道分子激活相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的生物檢測器可以由不同的生物實體(如細(xì)菌)或非生物實體(如脂質(zhì)體)組成。作為通用的方案，生物檢測器的特征是它們能夠特異性地識別配體，并將與配體的結(jié)合轉(zhuǎn)變成一個可測定信號(如光發(fā)射)。例如，可用細(xì)菌作為配體特異性生物檢測器，它能用光子發(fā)射來特異性地響應(yīng)預(yù)定配體。
本發(fā)明的生物檢測器能高度靈敏地檢測各種物質(zhì)，例如人血液中的微生物，病毒和細(xì)菌，有毒分子，離子，癌細(xì)胞，抗原，小分子(如葡萄糖)，pH，氧和金屬。而且，本發(fā)明提供了這些生物檢測器在各種測定方法中檢測任何所選的物質(zhì)的應(yīng)用。通常，本發(fā)明的生物檢測器包括一個信號轉(zhuǎn)換元件，該元件包括一個胞外配體特異性結(jié)合部分，它與能激活轉(zhuǎn)導(dǎo)物組件的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域相連。活性形式下的轉(zhuǎn)導(dǎo)物組件可以激活效應(yīng)元件，如與那些編碼有獨特性質(zhì)易被檢測的診斷多肽報道基因在作用過程中相互關(guān)聯(lián)的啟動子。或者，報道分子可以通過與信號轉(zhuǎn)換元件的其它胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化區(qū)結(jié)合來直接激活。因此，本發(fā)明的生物檢測器將與靶物質(zhì)(即配體)的結(jié)合轉(zhuǎn)變成可檢測的信號。在本發(fā)明的較佳實施例中，生物檢測器產(chǎn)生的信號是光，它可用光檢測裝置檢測。因此，根據(jù)這種相互作用，就可定量或鑒定靶配體。
B．生物檢測器本發(fā)明的生物檢測器的特征是它們能響應(yīng)體內(nèi)或體外的靶物質(zhì)存在而產(chǎn)生可檢測的信號。
在一個具體的實例中，光是生物檢測器響應(yīng)靶物質(zhì)的存在而產(chǎn)生的可檢測信號。由于沒有來自正常組織和其它有機(jī)或無機(jī)物的背景光，因此體系的靈敏度只受生物檢測器的背景噪聲的限制。更具體地，本發(fā)明的靶配體特異性生物檢測器包含一個配體特異性區(qū)域，它通過一個“分子開關(guān)”連接到編碼可檢測蛋白的報道基因上。然后報道基因響應(yīng)配體與配體特異性區(qū)域的結(jié)合而激活。配體特異性結(jié)合部分可以是任何與感興趣物質(zhì)選擇性結(jié)合的抗體?！胺肿娱_關(guān)”是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組件，它將配體的結(jié)合與效應(yīng)元件的激活相關(guān)聯(lián)。轉(zhuǎn)導(dǎo)分子可以是任意兩個源于細(xì)菌的組份調(diào)控體系。(包括磷酸調(diào)節(jié)子)或任何真核轉(zhuǎn)導(dǎo)物。效應(yīng)元件可以是可誘導(dǎo)的與報道基因作用相關(guān)聯(lián)的啟動子。該報道基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯會產(chǎn)生能產(chǎn)生可檢測信號(如光)的基因產(chǎn)物。信號可用合適的裝置檢測得到；當(dāng)信號是光時，這種裝置是光檢測裝置。
例如，發(fā)光檢測器實體的成像可包括使用能檢測水平非常低的光(通常是單光子行為)的光電探測器。如果需要，通過集成光子發(fā)射直至構(gòu)成圖象，可確定信號的位置。這些光電探測器的實例包括強(qiáng)化單光子行為的裝置(如微通道板增強(qiáng)器和光電倍增管)。增強(qiáng)器可放在照相機(jī)前。另外，也可用能夠在檢測體系固有的背景噪聲中檢測單光子的靈敏相機(jī)(例如用液氮冷卻)。
一旦形成光子發(fā)射圖象，通常將其疊加在“正?！钡奈矬w反射光圖象上，以提供發(fā)射光子源的對照框架。然后對這種“組合”的圖象進(jìn)行分析，確定物體中靶的位置和/或數(shù)量。在大多數(shù)情況下，不需要光源圖象。從樣品發(fā)射出的光子數(shù)量的簡單定量(例如用光亮度計來檢測)表明了光發(fā)射報道物的濃度。因此，光子數(shù)量與特異性檢測器感受的靶配體數(shù)量成正比。檢測器可放在離光發(fā)射生物檢測器非常近，而沒有需要圖象的限制，這樣就可使光檢測和測定的靈敏度最優(yōu)。微通道板增強(qiáng)器就可以這樣的配置使用來檢測單光子。這種裝置目前由HamamatsuCorporation生產(chǎn)。在Hamamatsu系統(tǒng)中，通過將裂解緩沖液、螢光素酶和底物螢光素噴灑在固定化細(xì)胞上，就可測定單細(xì)胞的ATP濃度。
圖1中顯示了配體特異性生物檢測器的一般機(jī)理。圖2更詳細(xì)地顯示了較佳的生物檢測器的分子機(jī)理。在所示的實例中，生物檢測器是表達(dá)靶特異性信號跨膜轉(zhuǎn)換元件的細(xì)菌細(xì)胞，該元件包括胞外配體特異性結(jié)合部分(如抗體)，該組成部分與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域相連。靶特異性信號轉(zhuǎn)換元件被整合入膜(如細(xì)胞膜，它將“胞外”區(qū)室和“胞內(nèi)”區(qū)室分開)中。配體特異性部分能夠與所選物質(zhì)結(jié)合從而激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域。然后激活的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域?qū)o活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)物轉(zhuǎn)變成活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)物。轉(zhuǎn)導(dǎo)物的特征是，當(dāng)它轉(zhuǎn)變成活性形式時，它能與和報道基因在作用過程中相互關(guān)聯(lián)的啟動子元件結(jié)合。報道基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄和翻譯會形成能產(chǎn)生可檢測信號(如光)的基因產(chǎn)物。在本發(fā)明較佳的實例中，報道物是螢光素酶操縱子，它產(chǎn)生可見光并容易被高度靈敏地監(jiān)控、測定和定量。
或者，信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域可以直接作用于修飾過的報道分子。報道分子被修飾成以無活性的形式表達(dá)，然后它可通過與信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域的直接作用而激活。
提供響應(yīng)預(yù)定所選物質(zhì)的“分子開關(guān)”的生物檢測器與目前的方法相比有很多優(yōu)點。首先，開關(guān)使得能夠檢測復(fù)雜混合物中的抗原，并且不需要洗去未結(jié)合的抗體，從而簡化了檢測方法。由于與抗體結(jié)合的配體引發(fā)發(fā)光，且樣品中沒有背景光，因此不需要用洗滌來減少信號噪聲比，減少的噪聲提高了靈敏度，只有特異性相互作用才會引發(fā)發(fā)光。
一旦與配體結(jié)合，就會激活酶級聯(lián)反應(yīng)(cascade)來發(fā)射信號。
而且，如果在例如病原體微生物的表面上表達(dá)出很多靶配體，則很多生物檢測細(xì)菌會與一個靶結(jié)合，從而來放大信號，形成非常靈敏的檢測體系。
另外，由于生物檢測器體系中信號轉(zhuǎn)換元件的配體特異性區(qū)域可以向彈夾那樣交換，因此可形成無限量的生物檢測器來識別任何所需的或所選的物質(zhì)。因此，本發(fā)明的生物檢測器是一種靈活的通用的系統(tǒng)，它可用來識別任何所選的物質(zhì)，選擇的范圍可以很廣泛。很快地就可開發(fā)出一種針對某一物質(zhì)的生物檢測器。
本發(fā)明的生物檢測器是多用性的，因為它們在體內(nèi)、溶液中或固定于傳感器片上是有效的。而且，可以對這些生物檢測器的排列進(jìn)行構(gòu)建，在不同的波長下或“生物傳感器基片(chip)”的不同位置上進(jìn)行操作，從而使得能同時監(jiān)控和篩選多種試劑、基因、基因產(chǎn)物或其它靶的。參見圖3。例如，為了構(gòu)建能在一步中進(jìn)行范圍廣而且有效的分析，生物檢測器可以集成有獨特多檢測器的排列構(gòu)型。例如，生物檢測器可放在正常信號檢測儀器頂部的凝膠上，當(dāng)產(chǎn)生的信號是光時，儀器例如是電荷耦合器件(CCD)基片。由于CCD排列對信號的空間識別，因此生物檢測器排列能用放置在一個傳感器基片上排列中的多個不同的傳感器來提供以光為基礎(chǔ)的分析。這樣，就可同時對例如血型、HIV感染情況、肝炎病情、淋巴細(xì)胞像和CMV陽性進(jìn)行分析。就能迅速同時篩選出多種感染。
如果光是報道物產(chǎn)生的信號，則信號能以非侵入性方式檢測，能通過例如組織來檢測光。參見待審查美國專利申請No.08/270,631，其內(nèi)容結(jié)合入本文作參考。
而且，由于本發(fā)明的生物檢測器是生物相容的，對環(huán)境是無害的，因此它們的生產(chǎn)成本相當(dāng)?shù)?，給使用者帶來的負(fù)擔(dān)較低，尤其與涉及產(chǎn)生毒廢物的方法以放射性為基礎(chǔ)的測定方法相比。
本發(fā)明生物檢測器的一個顯著的優(yōu)點是減少了需要進(jìn)行多個診斷測試的時間和勞動力。在許多測試和診斷領(lǐng)域中常見的限制速度的步驟是需要有適于迅速提供準(zhǔn)確信息的傳感和檢測系統(tǒng)。實例包括篩選血樣中的AIDS病毒和其它血液中的病原體，研究和評價組織培養(yǎng)物或動物模型中的新藥，和監(jiān)控基因治療后的治療蛋白質(zhì)產(chǎn)出。例如，強(qiáng)制性(mandatory)篩選血樣中的HIV和其它病原體目前需要大量試驗。用內(nèi)置(built-in)確認(rèn)試驗來廉價、迅速、特異性傳感檢測血液中的大量病原體能顯著地簡化方法，從而降低使用者的凈成本。同樣，對潛在新藥(制藥公司稱為先導(dǎo)化合物)的評價現(xiàn)在需要精細(xì)、昂貴的組織培養(yǎng)和動物試驗。能對藥物動力學(xué)和效果進(jìn)行體外和體內(nèi)監(jiān)控的廉價傳感器和相關(guān)的硬件對于制藥公司尋找簡化這些先導(dǎo)化合物生產(chǎn)的方法是非常有價值的。
總之，與目前能獲得的診斷檢測體系相比，本發(fā)明的生物傳感器提供很多優(yōu)點。
1．實體遮蔽(sheltering)生物傳感器生物傳感器的生物組件可以包含在有生命或無生命實體或是與其相連而必要相互反應(yīng)。這些組件的結(jié)構(gòu)形成了能夠高度專一而靈敏地檢測少量配體微型傳感系統(tǒng)。
有生命的實體。更典型的，生物檢測器的實體是活細(xì)胞，它被基因工程制成包含所有需要的組件。活實體包括但不局限于，原核生物、真核生物、病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、載體、質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，建立的細(xì)胞系。更具體地，實體包括基因工程細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌。基因工程修飾的細(xì)菌能以低成本迅速生長，因此用活細(xì)胞作為生物檢測器實體的優(yōu)點是，一旦構(gòu)建出原始的生物檢測器，就可大量復(fù)制和生長這些生物檢測器。
采用“活”生物檢測器實體有幾個優(yōu)點。首先，一旦制成傳感器就可使生物檢測器低成本生長。第二，它使得檢測器可在組織內(nèi)生長并繼續(xù)發(fā)育，而不是象傳統(tǒng)的無機(jī)傳感器那樣被消耗掉。第三，活的生物檢測器可放大檢測信號。例如，一個抗原與細(xì)菌表面的結(jié)合會引發(fā)一系列的發(fā)光物的形成，它們每一個均可以重復(fù)的方式產(chǎn)生光。因此，適當(dāng)刺激體系的單抗原結(jié)合會導(dǎo)致一個活生物檢測器中產(chǎn)生大量光子。第四，由于這些生物檢測器可大量地與靶結(jié)合，結(jié)果每個均能放大結(jié)合行為的許多生物檢測器(即細(xì)菌)會導(dǎo)致信號高度的放大。因此，就可獲得非常高的靈敏度。
無生命的實體。然而也可制成非生物生物檢測器。生物檢測器系統(tǒng)可放入非生物凝膠、非生物膠囊和脂質(zhì)體中，以及注射入體內(nèi)或固定在板上。另外可以采用能夠維持載體新陳代謝的任何其它實體如脂雙層。
2．信號轉(zhuǎn)換元件信號轉(zhuǎn)換元件由選擇性結(jié)合特異性物質(zhì)的“胞外”部分和能激活轉(zhuǎn)導(dǎo)物的“胞內(nèi)”部分組成。典型的，信號轉(zhuǎn)換元件是跨膜融合蛋白，該蛋白有胞外配體結(jié)合部分(如抗體)和在胞外部分與所選靶結(jié)合時被激活的胞內(nèi)酶部分。因此，信號轉(zhuǎn)換元件的目的是將對特異性物質(zhì)(即配體)的識別和結(jié)合轉(zhuǎn)變成胞內(nèi)信號，從而激活轉(zhuǎn)導(dǎo)物組件，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)物組件激活啟動報道蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動子。
配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？杀槐景l(fā)明鑒定的物質(zhì)包括，但不局限于，蛋白質(zhì)、肽、糖類、脂肪酸、離子、微生物(包括細(xì)菌、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)。因此，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是抗體、抗體片段、細(xì)胞受體或其它任何與配體結(jié)合的蛋白(如葡萄球菌屬蛋白A和G、巨噬細(xì)胞Fc受體)、碳水化合物或與離子結(jié)合的物質(zhì)(如鈉或鉀通道的區(qū)域)。
在具體的實例中，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其衍生物，其包括但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab＇)2片段、Fab表達(dá)文庫生產(chǎn)的片段、抗獨特型(anti-Id)抗體、和上述任一種的表位結(jié)合片段。尤其是，單克隆技術(shù)和最近在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)功能性抗體的技術(shù)發(fā)展使得鑒定合適的用于所需靶的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域更容易，適應(yīng)能力更高。關(guān)于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)抗體的詳細(xì)情況參見Collet等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10026-10030，和Huse等，1989,Science 246:1275-1281。
而且，抗體編碼區(qū)的來源不局限于從已知抗體特異性且抗體本身是單克隆的雜交瘤細(xì)胞系克隆得到的那些。但是，可用大的抗體文庫來形成融合蛋白，這樣就可制成大量用于檢測無限范圍的抗原的生物檢測器。
信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域。信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域可以由有任何數(shù)量的蛋白質(zhì)修飾功能的酶或酶的活性區(qū)域組成，這些功能包括磷酸化、去磷酸化、甲基化、乙?；偷鞍酌富钚浴＿@些酶包括蛋白激酶、磷酸化酶、蛋白甲基化酶、乙?；?、蛋白酶、蛋白酶K、絲氨酸蛋白酶。在本專利申請的一個具體實例中，細(xì)菌磷酸化酶PhoQ的活性區(qū)域?qū)⑷诤先肱c抗體cDNA重鏈區(qū)域的基因融合物中。因此，表達(dá)的融合蛋白與靶抗原(配體)的相互作用會導(dǎo)致抗體-磷酸化酶融合物中發(fā)生構(gòu)象改變，這會激活特異性磷酸化酶的活性，從而通過磷酸化/去磷酸化行為激活轉(zhuǎn)導(dǎo)物PhoP?；钚缘腜hoP激活用來啟動報道基因操縱子lux表達(dá)的Pho啟動子。信號轉(zhuǎn)換元件的轉(zhuǎn)導(dǎo)物激活區(qū)的特征是，當(dāng)與特異性分子結(jié)合時，它的構(gòu)象或電荷發(fā)生改變，從而激活了轉(zhuǎn)導(dǎo)物。轉(zhuǎn)導(dǎo)物可通過磷酸化、糖基化、甲基化電子轉(zhuǎn)運、氫轉(zhuǎn)運、羧基化、脫氫化、氧化/還原或其它任何化學(xué)修飾。
3．轉(zhuǎn)導(dǎo)物轉(zhuǎn)導(dǎo)物在配體結(jié)合時被信號轉(zhuǎn)換元件激活。轉(zhuǎn)導(dǎo)物可以是任何能夠識別和響應(yīng)構(gòu)象或電荷的變化、任何化學(xué)亞基團(tuán)的增減(如磷酸化、糖基化)的分子，然后它能引發(fā)可檢測的響應(yīng)。
在本發(fā)明的具體實例中，轉(zhuǎn)導(dǎo)物的激活直接或間接地引發(fā)了轉(zhuǎn)錄激活元件(如啟動子)來實現(xiàn)報道基因或報道基因操縱子的激活。隨后，報道基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄和翻譯形成了能產(chǎn)生可檢測信號(如光)的基因產(chǎn)物。然而，在另一個實例中，轉(zhuǎn)導(dǎo)物的激活可以直接形成可見的和可測定的信號。
4．報道基因和操縱子可采用各種報道基因或報道基因操縱子，包括會形成生物熒光、比色反應(yīng)或熒光的那些。例如，報道基因可以編碼顏料(Bonhoeffer,1995,Arzneimittelforschung45:351-356)如細(xì)菌視紫素(Ng等，1995,Biochemistry 34:879-890)、黑色素(Vitkin等，1994,Photochemisrty and Photobiology 59:455-462)、aquorins(分子探針，Seattle)、綠色熒光蛋白(GFP,Clonetech,Palo Alto；Chalfie等，1994,Science263:802-805；Cubitt等，1995,TIBS 20:448-455)、黃色熒光蛋白(Daubner等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:8912-8916)、黃素、bioflavinoid、血紅蛋白(Chance等，1995,Analytical Biochemistry 227:351-362；Shen等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.908108-8122)、血紅素(Pieulle等，1996,Biochem.Biophys.Acta 1273:51-61)、靛藍(lán)染料(Murdock等，1993,Biotechnology 11:381-386)、多甲藻黃素葉綠素-a蛋白(PCP)(Ogata等，1994,FEBS Letters,356:367-371)或綠膿素(al-ShibibKandela,1993,Acta Microbiologica Polonica 42:275-280)?；蛘?，報道基因可以編碼切割顏色吸收底物的酶如β-內(nèi)酰胺酶、使熒光蛋白發(fā)光的酶、有熒光底物的酶、或其它任何編碼有光活性化學(xué)物質(zhì)或?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)變成有光活性化合物的基因。在還有一個實例中，報道基因可編碼光蛋白(photoprotein)。在每一例中，報道基因與被活性形式轉(zhuǎn)導(dǎo)組件激活的可誘導(dǎo)啟動子在作用過程中相互關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明的一個具體實例中，采用了生物發(fā)光報道基因。
以生物發(fā)光為基礎(chǔ)的報道基因和操縱子。幾種生物發(fā)光報道基因是已知的，有機(jī)體包括螢光素酶族(如Wood等，1989,Science 244:700-702)。在各種原核和真核中已經(jīng)鑒定出螢光素酶族的成員。原核生物發(fā)光(lux)體系中和相應(yīng)的lux基因中包括的螢光素酶和其它酶已經(jīng)從海生細(xì)菌(弧菌屬和發(fā)光細(xì)菌屬)和陸生細(xì)菌(Xenorhabdus屬，也稱為photorhalodus屬)中分離獲得。
含有螢光素酶(luc)的典型的真核生物是北美火螢Photinus pyralis。已經(jīng)對火螢的螢光素酶進(jìn)行了廣泛的研究，并將其廣泛地用于ATP測定。從另一類叩頭蟲Pyrophorus plagiophthalamus獲得的cDNA編碼的螢光素酶已經(jīng)被克隆和表達(dá)(如Wood等，1989,Science 244:700-702)。這種蟲是不尋常的，種類的不同成員發(fā)出不同顏色的生物發(fā)光。分離得到了四類克隆，每類間有95-99％的同源性。它們發(fā)生的光在546納米(綠色)、560納米(黃綠色)、578納米(黃色)和593納米(桔黃色)。
螢光素酶需要能量來源(如ATP、NAD(P)H等)，底物(如螢光素、decanal(細(xì)菌酶)或coelentrizine)和氧。
為了使其發(fā)光，必須將底物螢光素提供給螢光素酶。這樣提供螢光素的便利的方法是表達(dá)螢光素酶和合成底物decanal的生物合成酶。然后氧是在細(xì)菌中從Lux操縱子表達(dá)這些蛋白質(zhì)來生物發(fā)光的唯一的外部需求。
例如，從土壤細(xì)菌Xenorhabdus luminescence獲得的lux操縱子(Frackman等，1990,J.Bact.172:5767-5773)可用作報道基因操縱子，因為它通過表達(dá)異源二聚體螢光素酶的兩個亞單位和三種輔助蛋白質(zhì)使轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌具有發(fā)射光子的能力(Frachman等，同上)。
發(fā)現(xiàn)在37℃下表達(dá)X.luminescence的lux基因的大腸桿菌有最優(yōu)的生物發(fā)光(Szittner和Meighen,1990,J.Biol.Chem.265:16581-16587；Xi等，1991,J.Bact.173:1399-1405)，這與來自真核生物和其它原核發(fā)光生物的螢光素酶在低溫下最優(yōu)的情況相反(Campbell,1988,Chemiluminescence,Principles and Applications inBiology and Medicine(Chichester,England:Ellis Horwood Ltd.和VCHVerlagsgesellschaft mbH))。因此，可根據(jù)具體應(yīng)用的特點和要求來選擇報道基因操縱子。例如來自X.luminescence的螢光素酶非常適于用作在動物中的研究用標(biāo)記。
螢光素酶載體構(gòu)建物適用于轉(zhuǎn)化入各種宿主細(xì)胞中，包括大多數(shù)細(xì)菌和許多真核細(xì)胞。另外，某些病毒(如皰疹病毒和牛痘病毒)可用基因工程的方法來表達(dá)螢光素酶。例如，Kovacs和Mettenlieter,1991,J.Gen.Virol.72:2999-3008描述了編碼皰疹病毒的火螢的基因的穩(wěn)定表達(dá)。Brasier和Ron,1992,Meth.in Enzymol.216:386-396描述了在哺乳動物細(xì)胞中使用螢光素酶基因構(gòu)建物。已經(jīng)用CCD圖象對培育中的哺乳動物細(xì)胞的螢光素酶表達(dá)進(jìn)行了宏觀研究(Israel和Honigman,1991,Gene 104:139-145)和微觀研究(Hooper等，1990,J.Biolum.and Chemilum.5:123-130)。
C．發(fā)光生物檢測器的成像發(fā)光生物檢測器可以多種方式成像。下面描述了這些成像的思路和具體的實施例。
1．光電探測器裝置在本發(fā)明的一個實施例(在該例中，生物檢測器產(chǎn)生的信號是光)中，一個重要的方面是選擇靈敏度足夠高的光電探測器裝置，以對暗淡的光成像。而且，當(dāng)生物檢測器用于活物體時，成像必須在適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)，最好在小于約30分鐘內(nèi)，并用來自該裝置的信號構(gòu)成圖象。
在可以采用非常亮的發(fā)光物和/或檢測位于待成像物體或動物表面附近的發(fā)光共軛物(conjugate)的情況中，可采用一對“夜視”護(hù)目鏡或標(biāo)準(zhǔn)的高靈敏度電視攝像機(jī)，如硅增強(qiáng)管(SIT)相機(jī)(如Hamamatsu Photonic Systems,Bridgewater,NJ)。然而，更一般地，需要用更靈敏的光檢測方法。
在非常低的光強(qiáng)下，如本發(fā)明實踐中遇到的那些情況，每單位面積的光子通量低得使成像景象不再表現(xiàn)出連續(xù)性。相反，它由時間和空間上互不相同的單個光子表示。從監(jiān)視器上看，這種圖象作為閃爍的光點出現(xiàn)，每個光點表示單個檢測得的光子。
通過經(jīng)歷時間在數(shù)字圖象處理器中積累這些檢測到的光子，就可獲得并構(gòu)成圖象。或者，可以對閃爍點計數(shù)，用數(shù)字方式記錄，避免了圖象的重建步驟，從而加速了分析。對每一圖象點的信號指定一個強(qiáng)度數(shù)值的與常規(guī)相機(jī)相反，在光子計數(shù)成像中信號的幅度沒有顯著性。目的只是檢測信號(光子)的存在和相對于信號發(fā)生的位置經(jīng)歷一段時間對信號的發(fā)生計數(shù)。
下述至少兩類光電探測器裝置可檢測個別的光子并產(chǎn)生可被圖象處理器分析的信號。
噪聲較低的光電探測器裝置。與放大光子信號相反，第一類裝置是通過減少光子檢測器中的背景噪聲來獲得靈敏度。主要通過冷卻檢測器陣列可以減少噪聲。裝置包括電荷耦合器件(CCD)相機(jī)，它稱為“背薄式(backthinned)”冷卻的CCD相機(jī)。在更靈敏的儀器中，冷卻通過用例如液氮來實現(xiàn)，它使CCD陣列的溫度降低至約-120℃。“背薄式”指超薄的背板，它減少了光子被檢測的通道長度，從而提高了量子效率。特別靈敏的背薄式低溫CCD相機(jī)是“TECH 512”，它是一種購自Photometrics,Ltd.的200系列相機(jī)。(Tucson,AZ)。
光子放大裝置。第二類靈敏的光電探測器包括在光子撞擊檢測器屏幕前將光子放大的裝置。這類裝置包括帶有增強(qiáng)器(如微通道增強(qiáng)器)的CCD相機(jī)。微通道增強(qiáng)器一般含有垂直于相機(jī)的檢測屏幕并與其共同伸展的金屬通道陣列。微通道陣列放在待成像的樣品、對象或動物和相機(jī)之間。進(jìn)入通道陣列的大多數(shù)光子在離開前與通道的側(cè)面接觸。跨過陣列施加之電壓，使得每次光子碰撞釋放許多電子。由這樣的碰撞產(chǎn)生的電子以“獵槍(shotgun)”方式離開它們的原始通道并被相機(jī)檢測。
通過串聯(lián)放置增強(qiáng)式通道陣列，就可獲得更高的靈敏度，這樣在第一級產(chǎn)生的電子會在第二級處產(chǎn)生放大的電子信號。然而，靈敏度增加的實現(xiàn)是以空間分辨率為代價的，空間分辨率隨著每個添加的放大級而降低。
適用于本發(fā)明實踐的一個典型的基于微通道增強(qiáng)器的單光子檢測裝置是購自Hamamatsu的C2400系列。
圖象處理器。對光子進(jìn)行計數(shù)的光電探測器裝置產(chǎn)生的信號需要用圖象處理器來處理，從而構(gòu)造例如能夠顯示在監(jiān)視器上或打印在圖象印刷機(jī)上的圖象。這樣的圖象處理器通常是作為系統(tǒng)的一部分出售的，該系統(tǒng)包括上述靈敏的光子計數(shù)相機(jī)，因此其可從相同來源(例如Photometrics,Ltd.,和Hamamatsu)處購得。也可用購自其它廠家的圖象處理器，但是實現(xiàn)功能性系統(tǒng)一般需要花更大的精力。
圖象處理器通常與個人計算機(jī)相連，如IBM兼容型PC或Apple Macintosh(Apple Computer,Cupertino,CA)，它們可以作為或不作為購得的圖象系統(tǒng)的一部分。一旦圖象是數(shù)字文件形式，它們就可用各種圖象處理程序(如“ADOBEPHOTOSHOP”,Adobe Systems,Mountain View,CA)來處理并打印。
2．光子發(fā)射圖象的構(gòu)建當(dāng)由于非常亮的發(fā)光物和/或位于對象的表面附近的發(fā)光共軛物而采用一對“夜視”護(hù)目鏡或高靈敏度的電視攝像機(jī)來獲得圖象時，圖象可以簡單地觀看或在電視監(jiān)視器上顯示。如果需要，來自電視攝像機(jī)的信號可通過圖象處理器轉(zhuǎn)移，該圖象處理器可將各別的電視圖象幀存儲在存儲器中以進(jìn)行分析或打印，和/或?qū)D象數(shù)字化以便在計算機(jī)上進(jìn)行分析和打印。
或者，如果采用光子計數(shù)方法，光子發(fā)射的測量結(jié)果在圖象處理器中產(chǎn)生了表示在每一像素位置測得的光子數(shù)目的數(shù)目陣列，一般通過將光子計數(shù)歸一化(對固定的預(yù)定值歸一或?qū)υ谌魏蜗袼刂袦y得的最大數(shù)目歸一)，并將歸一化數(shù)目轉(zhuǎn)化成顯示在監(jiān)視器上的亮度(灰度標(biāo))或顏色(偽彩色)，來將這些數(shù)目形成圖象。在偽彩色表示中，典型的顏色分源如下。零光子計數(shù)的像素定為黑色，計數(shù)低的為藍(lán)色，隨計數(shù)的增加顏色的波長增加，光子計數(shù)最高的定為紅色。監(jiān)視器上顏色的位置表示光子發(fā)射的分布，因此代表了發(fā)光共軛物的位置。
為了給共軛物提供參照框架，通常對進(jìn)行光子發(fā)射測量的物體(仍是固定化的)構(gòu)造灰度標(biāo)圖象。該圖象例如可這樣構(gòu)造，在暗淡的室內(nèi)光下打開成像室(chamber)或盒子的門，并測定反射的光子(一般為測量光子發(fā)射所需時間的一部分)。可在測定光子發(fā)射前后構(gòu)造灰度標(biāo)圖象。
光子發(fā)射的圖象通常重疊在灰度標(biāo)圖象上以形成關(guān)于該物體的光子發(fā)射組合圖象。
如果需要經(jīng)歷一段時間跟蹤定位和/或來自發(fā)光共軛物的信號，例如記錄處理對所選生物相容物質(zhì)的分布和/或定位的影響，則光子發(fā)射的測定或成像可以在選定的時間間隔處重復(fù)，從而形成一系列的圖象。間隔可以短至皮秒(在快門式(fastgated)相機(jī)中)或秒，至天或周(用積分式(integrating)相機(jī))。
D．應(yīng)用生物檢測器的具體應(yīng)用包括疾病診斷、臨床相關(guān)物質(zhì)的檢測、環(huán)境污染物的檢測、食品污染物的檢測。另外本發(fā)明的生物檢測器在基礎(chǔ)研究和開發(fā)方面應(yīng)用廣泛。
傳染性疾病的診斷。生物檢測器可用來檢測體液(包括血液或尿液)或組織和其它流體中的抗原。合適的靶抗原包括但不局限于，細(xì)菌抗原、病毒病原體、真菌病原體、血清蛋白、淋巴因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞毒素、干擾素、β-2微球蛋白、免疫球蛋白、肽和多肽。
具體的以細(xì)菌抗原為目標(biāo)的診斷測試可以包括，但不局限于，淋巴疾病、鏈球菌屬、沙門氏菌屬、結(jié)核病、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、螺旋細(xì)菌屬(helicobactor)、李斯特氏菌屬、志賀氏菌屬、變形桿菌屬、腸道球菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、博德特氏菌屬、巴爾同氏體屬、立克次氏體屬、衣原體屬、螺旋體屬的診斷。以病毒病原體為目標(biāo)的診斷測試可以包括，但不局限于，對逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV-1、HTLV-1)、肝炎病毒(HBV、HCV、HAV)、皰疹病毒(包括EBV、CMV、Ⅰ型單純性皰疹(herpes simplex Ⅰ)、Ⅱ型單純瘡疹(herpes simplex Ⅱ)和HHV-6)、腦炎(包括日本腦炎病毒、Eastern和Western腦炎病毒)、輪狀病毒、所有已知但是待鑒定的人和動物病毒病原體和非常規(guī)因素(如與阿爾茨海默病和Crutzfeld-Jacob瘋羊病(Prions)有關(guān)的因素)的檢測。真菌病原體靶可以包括，但不局限于，隱球菌屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、念珠菌屬、賈第蟲病(giardia)。
其它臨床相關(guān)物質(zhì)的檢測。生物檢測器的應(yīng)用可以包括臨床相關(guān)物質(zhì)(如體液如血液或尿液或組織中的糖分子、脂肪酸、蛋白質(zhì)或微生物)的檢測。靶抗原可以包括指示正常器官功能的酶(包括乳酸脫氫酶)、脲、葡萄糖和其它小分子和細(xì)胞因子。α胎蛋白可用來作為spinobifida診斷的靶。將某些種類細(xì)菌或其它微生物作為靶可測定它們在混合種群如胃腸和陰道菌叢中的分布。一個重要的診斷靶是診斷和預(yù)測一些方面的疾病的淋巴因子。用目前的方法不容易測得淋巴因子像，然而，可以預(yù)計其測定結(jié)果可以說明大量有關(guān)疾病和病情關(guān)系的未知的方面。而且，醫(yī)學(xué)上的重要應(yīng)用是遺傳疾病(包括膀胱纖維變形、鐮刀型貧血癥、唐氏綜合征、苯丙酮尿癥、ADA缺陷、thallassemias、生長激素缺陷、癌癥素因)的早期、圍產(chǎn)期診斷。最后，生物檢測器可用于實時監(jiān)控例如葡萄糖水平和藥物水平。
農(nóng)業(yè)和獸醫(yī)上的應(yīng)用。所有上述醫(yī)學(xué)應(yīng)用適用于獸醫(yī)學(xué)。
環(huán)境污染物的檢測。例如，生物檢測器可用來檢測供水中的污染物。所選的靶可以包括，但不局限于，賈第蟲屬、隱球菌屬、軍團(tuán)桿菌屬、梭菌毒素、腸桿菌屬、大腸桿菌、原生動物、重金屬。而且，用生物檢測器可以測得某些土壤種群中的細(xì)菌的存在；可篩選土壤來示蹤釋放入環(huán)境中的基因工程生物。
食品污染物的檢測。生物檢測器可用來鑒定食品中的污染物，其包括(但不局限于)細(xì)菌，如沙門氏菌屬、大腸桿菌類、葡萄球菌屬、梭狀桿菌屬和真菌。
基礎(chǔ)研究和開發(fā)。生物檢測器可用于許多基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用。實例包括標(biāo)準(zhǔn)免疫測定法(如Western印跡法、ELISA、淋巴細(xì)胞曲線的測定、細(xì)胞培養(yǎng)物污染(包括支原體)的檢測)中的檢測系統(tǒng)。另外，生物檢測器可用作表達(dá)測定中的檢測系統(tǒng)，來檢測細(xì)胞表面標(biāo)記如CD4、CD8、粘附物(adhereins)。
非生物的生物檢測器。在某些應(yīng)用中，當(dāng)抗原性(即體內(nèi)使用)是所注意的問題時，需要非生物的生物檢測器。實例包括體內(nèi)檢測和定位感染、組織損傷和其它病理。將生物檢測器結(jié)構(gòu)包裹在通常惰性的泡囊雙層或膜或其它任何無生命且可維持載體新陳代謝的實體(如脂質(zhì)體)中，使得與配體的接觸會產(chǎn)生光，這種系統(tǒng)就可用作體內(nèi)使用。
下列實施例更詳細(xì)地解釋了本發(fā)明。給出下列制備方法和實施例，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更清楚地理解和實時本發(fā)明。然而，本發(fā)明并不局限于列舉實例的范圍，這些實例只能被認(rèn)為用來描述本發(fā)明的一個方面，而在功能上等價的方法也應(yīng)在本發(fā)明范圍內(nèi)。實際上，除了本文描述的那些外，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易根據(jù)前述描述和附圖來作各種改動。這些改動均應(yīng)認(rèn)為在附加權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實施例首先三個實施例是用來使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與特異性基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的三種方法。
A．實施例1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性基因調(diào)節(jié)的關(guān)聯(lián)(方法1)下列實施例描述了已知可用來關(guān)聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性基因調(diào)節(jié)的方法。
構(gòu)建一個轉(zhuǎn)座子來鑒定被配體與表面表達(dá)的配體結(jié)合分子(如抗原)的結(jié)合激活的啟動子。采用無啟動子的報道系統(tǒng)來鑒定細(xì)菌中各種調(diào)節(jié)序列。Ronald等，1990,Gene 90:145-148。轉(zhuǎn)座子包括(ⅰ)(1)含有生物發(fā)光蛋白的基因的無啟動子的操縱子，(2)選擇性標(biāo)記(卡那霉素抗性基因；Kan)，和(3)負(fù)調(diào)節(jié)蛋白(λ阻遏物)；(ⅱ)λ操縱子表達(dá)的附加選擇標(biāo)記物(氯霉素抗性基因；Chl)；和(ⅲ)第三個組成型表達(dá)的選擇標(biāo)記(氨芐青霉素抗性基因；Amp)。將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化入表達(dá)感興趣抗體的細(xì)菌細(xì)胞中?？缒と诤系鞍字械臉?gòu)象改變?yōu)檗D(zhuǎn)導(dǎo)物的激活或化學(xué)修飾發(fā)出信號，而轉(zhuǎn)導(dǎo)物用來將該信息傳遞到lux構(gòu)建物的啟動子區(qū)域。通過測定Amp抗性來選出陽性轉(zhuǎn)化子。含有在抗原存在下為活性(包括組成型表達(dá))的啟動子后的轉(zhuǎn)座子的細(xì)胞在抗原存在下有Kan抗性，而含有在沒有抗原下無活性的啟動子后的轉(zhuǎn)座子的細(xì)胞在沒有抗原下有Chl抗性。因此，通過一系列生長條件傳代，就可鑒定出能響應(yīng)抗原合適表達(dá)的所需轉(zhuǎn)化子。然后可確定啟動子并用來構(gòu)建附加的生物檢測器。
圖4顯示了如實施例1所述產(chǎn)生的生物檢測器。如圖4A所示，在抗原不存在時，融合蛋白不會將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給能啟動克隆入的整合轉(zhuǎn)座子編碼的基因表達(dá)的啟動子。因此，在沒有抗原時，設(shè)計的大腸桿菌的表型是有氨芐青霉素抗性、有氯霉素抗性、對卡那霉素敏感且沒有生物發(fā)光。使氨芐青霉素抗性組成性表達(dá)，以維持對整合入的轉(zhuǎn)座子的選擇。
然而，當(dāng)啟動子與激活的轉(zhuǎn)導(dǎo)物(轉(zhuǎn)導(dǎo)物被配體與融合蛋白的結(jié)合激活)結(jié)合而啟動后，就表達(dá)出螢光素酶操縱子、卡那霉素抗性基因和λ阻遏物。λ阻遏物作用于λ操縱子上，從而阻抑了氯霉素抗性基因的表達(dá)。因此，在抗原存在下，細(xì)胞的表型特點是有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、對氯霉素敏感和生物發(fā)光。
因此，上述的基因誘導(dǎo)和激活允許能對所需的抗原響應(yīng)進(jìn)行正選擇。更具體地只有那些在基因組中合適位點上整合入所述轉(zhuǎn)座子的細(xì)菌細(xì)胞才能在選擇步驟中存活，而不響應(yīng)的細(xì)菌則死亡。
B．實施例2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性基因調(diào)控的關(guān)聯(lián)(方法2)下列實施例描述了第二種用來關(guān)聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性基因調(diào)控的方法。
融合蛋白由抗體重鏈、已知用來轉(zhuǎn)導(dǎo)基因調(diào)控信號的表面蛋白(surfaceprotein)、和受該信號作用的啟動子組成，將該融合蛋白放在標(biāo)記基因前。使抗體輕鏈在生物檢測器中共表達(dá)，以提供附加的配體特異性(Borrebaeck等，1992,Biotechnology 10:697-698)。鑒于細(xì)菌磷酸酶目前在鑒定細(xì)菌表面表達(dá)的融合蛋白中的應(yīng)用(Kohl等，1990,Nucleic Acids Res.18:1069；Weiss和Orfanoudakis,1994；J.Biotechnol.33:43-53)以及能用比色底物來測定磷酸酶活性，選擇細(xì)菌磷酸酶作為基因融合物的最初跨膜和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組件。獲得的抗體片段-磷酸酶融合物既保留了配體結(jié)合特異性和又保留了磷酸酶活性(Kohl等，1991,Acad.Sci.646:106-114；Wels等，1992,Biotechnology 10:1128-1132)。已經(jīng)用磷酸酶-抗體融合物來制成有標(biāo)記的抗體用于免疫測定(Carrier等，1995,J.Immunol.Mehtods 181:177-186；Ducancel等，1993,Biotechnology 11:601-605；Weiss等，1994,J.Biotechnol.33:43-53；Weiss和Orfanoudakis,1994,J.Biotechnol.33:43-53；Wels等，1992,Biotechnology 10:1128-1132)。此外，抗體對于修飾的細(xì)菌磷酸酶表現(xiàn)出能改變磷酸酶的功能(Brennan等，1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:5783-5787)，這表明蛋白-蛋白之間的相互作用能調(diào)節(jié)磷酸酶的活性，這很可能是通過磷酸酶分子中的構(gòu)象改變來實現(xiàn)的。磷酸酶融合蛋白在細(xì)菌細(xì)胞表面上的表達(dá)將磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞從而誘導(dǎo)特異性基因的表達(dá)?？蓪w系進(jìn)行修飾，以使標(biāo)記蛋白、螢光素酶和及其輔助蛋白的表達(dá)與配體和抗體磷酸酶融合蛋白(即配體依賴型分子開關(guān))的結(jié)合緊密相關(guān)。
C．實施例3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性基因調(diào)控的關(guān)聯(lián)(方法3)下列實施例描述第三種用來關(guān)聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性基因調(diào)控的方法。
通過在表達(dá)磷酸酶-抗體融合物的細(xì)胞中采用上述轉(zhuǎn)座子，可將實施例1和2的方法結(jié)合起來。
建立一個細(xì)菌菌株，該菌株中的報道基因與可誘導(dǎo)的啟動子相連，該啟動子能特異性地響應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)物分子的激活，例如pho操縱子的啟動子。然后可將克隆入載體(載體會使抗體與pho膜蛋白融合)的所有抗體文庫放入上述細(xì)菌菌株中。然后用該生物檢測器文庫對待檢測特異性分子進(jìn)行測試，并選出合適的生物檢測器。然后就可大量繁殖獲得的生物檢測器。
D．實施例4溶液中物質(zhì)的檢測下面是檢測溶液中(如全血和血漿中)配體(包括病毒和細(xì)菌抗原)的描述性測定方法。
將含有待檢測和定量的配體的樣品和對照標(biāo)準(zhǔn)品一同稀釋入(連續(xù)稀釋兩倍)96孔板中。將特異性生物檢測器以活細(xì)胞形式加入每個孔中，并立即分析。用電荷耦合裝置(CCD相機(jī))或96孔格式的光亮度計檢測板上的生物發(fā)光信號。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上繪制未知樣品相應(yīng)的生物發(fā)光，以進(jìn)行定量。
E．實施例5固體載體上的底物的檢測下面是檢測固體載體(如硝酸纖維素膜或尼龍膜)上的底物的描述性測定方法，例如在Western印跡法分析中采用特異性生物檢測器。
在用標(biāo)準(zhǔn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體載體(PVDF Immobilon膜，Millipore)上后，將膜干燥并轉(zhuǎn)移至含有生物活性細(xì)胞形式的特異性生物檢測器的盤中，置于含有細(xì)菌新陳代謝所需營養(yǎng)的基本培養(yǎng)基或其它透明的緩沖液中。在室溫下培育30分鐘后，將膜取出，在濕的狀態(tài)下密封在拉鏈鎖或熱封合塑料袋中。用X射線、CCD檢測器或其它光敏檢測方法檢測粘在膜上的生物檢測器發(fā)出的生物發(fā)光信號。用標(biāo)準(zhǔn)的圖象分析軟件可對信號進(jìn)行定量。
F．實施例6人血對生物發(fā)光的沙門氏菌屬發(fā)出的光的影響下面的實施例表明，用增輝的CCD檢測器可以檢測到少于10個細(xì)菌細(xì)胞。
將連續(xù)稀釋2倍的沙門氏菌屬菌株LB5000一式兩份放在96孔板中，菌株中已經(jīng)轉(zhuǎn)化有提供螢光素酶操縱子組成型表達(dá)的質(zhì)粒。單用30μl生長培養(yǎng)基(稱為LB5000)和30μl用血液來進(jìn)行稀釋，以測定血液作為散射和吸收介質(zhì)對于檢測極限的影響。圖5中顯示了板樣品從濃的孔眼起每一稀釋度和菌落形成單位(CFU)的數(shù)目。圖(圖5)中顯示了通過CCD檢測器對產(chǎn)生圖象分析測得的每個孔相應(yīng)的生物發(fā)光數(shù)。在濃度最大的孔中信號在范圍外，因此數(shù)目在較高的濃度下并不呈線性。
所有對比文獻(xiàn)均結(jié)合入本文作參考。
權(quán)利要求
1．一種用于檢測所選物質(zhì)的生物檢測器，其包括(a)信號轉(zhuǎn)換元件，它包括胞外配體特異性部分和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外配體特異性部分選擇性識別所述所選物質(zhì)，該識別激活所述胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域；(b)轉(zhuǎn)導(dǎo)物，這里所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物有互不相同的無活性和有活性的形式，且這里所述激活的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域?qū)⑺鲛D(zhuǎn)導(dǎo)物的所述無活性形式轉(zhuǎn)變成所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的所述活性形式；和(c)效應(yīng)元件，其中所述效應(yīng)元件被所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的所述活性形式激活，從而產(chǎn)生一個可檢測信號。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物檢測器，其中所述效應(yīng)元件包含一個被所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的所述活性形式激活的轉(zhuǎn)錄激活元件。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物檢測器，其中所述效應(yīng)元件還包括編碼一個或多個能產(chǎn)生所述可檢測信號的基因產(chǎn)物的核酸，其中所述核酸與所述轉(zhuǎn)錄激活元件在作用過程中相互關(guān)聯(lián)。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物檢測器，其中所述可檢測信號是光。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物檢測器，其中所述基因產(chǎn)物能以選自生物發(fā)光、比色反應(yīng)或熒光的方式被檢測。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物檢測器，其中所述核酸包含一個螢光素酶操縱子。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物檢測器，其中所述胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化元件是膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物檢測器，其中所述膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物選自細(xì)菌的兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、真核受體-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物、原核受體-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物。
9．根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物檢測器，其中所述物質(zhì)選自微生物、病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、蛋白質(zhì)、糖和離子。
10．一種檢測所選物質(zhì)的方法，方法包括(a)制成生物檢測器，它包括(ⅰ)信號轉(zhuǎn)換元件，它包括胞外配體特異性部分和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外配體特異性部分選擇性識別所述所選物質(zhì)，該識別激活所述胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域；(ⅱ)轉(zhuǎn)導(dǎo)物，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物有互不相同的無活性和活性形式，且這里所述激活的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域?qū)⑺鲛D(zhuǎn)導(dǎo)物的所述無活性形式轉(zhuǎn)變成所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的所述活性形式；和(ⅲ)效應(yīng)元件，其中所述效應(yīng)元件被所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的所述活性形式激活，從而產(chǎn)生一個可檢測信號；(b)將所述生物檢測器加入樣品中；(c)測定并定量所述可檢測信號；和(d)將所述可檢測信號的水平與所述物質(zhì)的存在及其數(shù)量進(jìn)行相關(guān)。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述生物檢測器的所述效應(yīng)元件包含被所述轉(zhuǎn)導(dǎo)物的所述活性形式激活的轉(zhuǎn)錄激活元件。
12．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述效應(yīng)元件還包括編碼一個或多個產(chǎn)生所述可檢測信號的基因產(chǎn)物的核酸，其中所述核酸與所述轉(zhuǎn)錄激活元件在作用過程中相互關(guān)聯(lián)。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述可檢測信號是光。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物能以選自生物發(fā)光、比色反應(yīng)或熒光的方式被檢測。
15．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸包含一個螢光素酶操縱子。
16．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述物質(zhì)選自微生物、病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、蛋白質(zhì)、糖和離子。
17．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述可檢測信號用光檢測系統(tǒng)來檢測。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述光檢測系統(tǒng)選自光亮度計、分光光度計、熒光光度計、CCD檢測器。
19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中生物檢測器或樣品固定在固體載體上。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中還包括將一系列生物檢測器以有序的排列固定在固定載體，這樣就可測定樣品內(nèi)的各類物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用來探測和定量測定液體、氣體或基質(zhì)中的分子的生物檢測器。更具體地,本發(fā)明涉及包括在與靶物質(zhì)相互作用時以分子開關(guān)機(jī)理表達(dá)報道基因的生物檢測器。本發(fā)明還涉及用這種生物檢測器高特異性、高靈敏度地檢測和定量測定所選物質(zhì)的方法。
文檔編號C12N1/21GK1219239SQ97193894
公開日1999年6月9日 申請日期1997年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月19日
發(fā)明者P·R·孔塔格, D·A·貝納隆, C·H·孔塔格 申請人:齊諾根公司