專利名稱：具有il－16活性的加工的多肽,其生產(chǎn)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及具有IL-16活性的多肽，其生產(chǎn)方法及其用途。本發(fā)明描述了具有高活性的加工的IL-16。
IL-16(白細胞介素-16)是一種淋巴因子，它也稱為淋巴細胞趨化因子(LCF)或免疫缺陷病毒抑制淋巴因子(ISL)。IL-16及其特性在WO94/28134和WO96/31607中及由Cruikshank,W.W.等，美國科學院學報91(1994)5109-5113和由Baier,M.，等，自然378(1995)563描述。IL-16的重組生產(chǎn)也在這些參考文獻中進行了描述。根據(jù)這些文獻，IL-16是分子量為13,385D的蛋白質(zhì)。Cruikshank還發(fā)現(xiàn)ISL在分子篩層析中以分子量為50-60和55-60KD的多聚體形式洗脫。作為一種同型四聚體(產(chǎn)品信息AMS生物技術(shù)有限公司，歐洲，目錄號11177186)的這種多聚體形式負責趨化活性。分子量為28KD的IL-16的同型二聚體形式由Baier進行了描述。然而，Cruikshank等在免疫學雜志146(1991)2928-2934中描述的趨化活性和Baier描述的重組人IL-16的活性非常小。
本發(fā)明的目的是提高IL-16的活性并提供具有低免疫原性及有優(yōu)勢地適宜于治療應用的IL-16形式。
本發(fā)明的目的以可用于在原核或真核宿主細胞中表達具有白細胞介素-16活性的多肽的核酸來實現(xiàn)，其中所述的核酸a)相應于SEQ ID NO:1的DNA序列或相應于在5’端延長了一個天冬氨酸密碼子(GAC)的DNA，或相應于其互補鏈b)在嚴格條件下與SEQ ID NO:1的DNA或與在5’端延長了一個天冬氨酸密碼子的DNA雜交，c)或是如果沒有遺傳密碼簡并性能在嚴格條件下與a)或b)限定的核酸序列雜交的核酸序列。
d)以及在5’端編碼氨基酸序列SEQ ID NO:7至10之一或編碼在N末端延長一個天冬氨酸的類似序列。
該核酸優(yōu)選編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽或編碼具有與SEQ ID NO:2相比在N末端延長了一個天冬氨酸密碼的序列的多肽。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸編碼在C末端縮短了多達8個氨基酸的具有IL-16活性的多肽。
該核酸編碼具有IL-16活性的加工的多肽，特別是優(yōu)選來自靈長類的天然IL-16，如人IL-16或猿種或諸如小鼠的另一哺乳動物的IL-16。
令人驚奇的是已證明WO94/28134的附圖
2沒有描述正確加工的IL-16。該蛋白質(zhì)前體形式的起始密碼子“ATG”不是從核苷酸783而是從核苷酸54或174開始。當一個A插入到核苷酸156之后，一個C插入到核苷酸398之后且一個G插入到核苷酸780之后時產(chǎn)生該閱讀框。該序列也顯示與WO94/28134的附圖2有其它區(qū)別。例如存在核苷酸取代(313位G變成A,717C變成A)。IL-16在真核細胞表達期間進行加工。以這種方式產(chǎn)生根據(jù)SEQ ID NO:2的多肽和/或具有與SEQ ID NO:2相比在N末端延長了一個天冬氨酸密碼子的序列的多肽。對加工的IL-16的了解使之能夠生產(chǎn)具有高活性和低免疫原性的IL-16及其衍生物。
IL-16的序列可與該DNA序列編碼的蛋白質(zhì)序列具有一定程度的區(qū)別。這種序列改變可以是氨基酸取代，缺失或添加。然而，IL-16的氨基酸序列優(yōu)選與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少75％相同，且特別優(yōu)選至少90％相同。部分氨基酸和核酸序列SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2的變異體在，例如，WO96/31607和國際專利申請PCT/EP96/05662和PCT/EP96/05661中描述。然而，多肽具有正確的N-末端是必需的。因此，優(yōu)選的蛋白質(zhì)其中N末端的前3個至10個氨基酸不變，從而在N末端以氨基酸序列SEQ ID NO:6至8或以在N端延伸一個天冬氨酸殘基的類似序列開始。還優(yōu)選在C末端縮短多達8個氨基酸的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明意義內(nèi)的核酸理解為，例如，DNA,RNA和核酸衍生物及類似物。優(yōu)選的核酸類似物是那些其中糖磷酸骨架被諸如氨基酸的其它單位代替的化合物。這類化合物稱為PNA且在WO92/20702中進行了描述。由于PNA-DNA鍵強于例如，DNA-DNA鍵，因此，下文所述的嚴格條件不能應用于PNA-DNA雜交。然而，合適的雜交條件在WO92/20703中進行了描述。
術(shù)語“IL-16”在本發(fā)明意義內(nèi)理解為具有IL-16活性的多肽。IL-16優(yōu)選在WO96/31607所述的試驗方法中表現(xiàn)出所述作用或根據(jù)WO94/28134刺激細胞分裂。
IL-16結(jié)合CD4+淋巴細胞且可抑制諸如HIV-1,HIV-2和SIV的病毒復制。IL-16的功能不受其在MHC復合物中的存在的限制。
特別是IL-16表現(xiàn)出一種和幾種下列特性-經(jīng)CD4受體結(jié)合T細胞，-刺激CD4+淋巴細胞上的IL-2受體和/或HLA-DR抗原的表達，-在IL-2存在下刺激T輔助細胞的增生，-抑制用抗-CD3抗體刺激的T輔助細胞的增生，-抑制病毒，優(yōu)選HIV-1,HIV-2或SIV的復制。
優(yōu)選在嚴格條件下與序列SEQ ID NO:1的核酸雜交的核酸。術(shù)語“在嚴格條件下雜交”意思是兩個核酸片斷在例如Sambrook等，“克隆基因在大腸桿菌中的表達”，分子克隆實驗室手冊(1989)，美國紐約冷泉港實驗室出版，所述的標準雜交條件下互相雜交。該條件是例如在大約45℃下6.0×SSC中雜交，隨后在50℃下2×SSC中洗滌。為了選擇嚴格性，洗滌步驟中的鹽濃度例如可選擇為在50℃下2.0×SSC的低等嚴格和50℃下0.2×SSC的高度嚴格之間。另外，洗滌步驟的溫度可在室溫，大約22℃的低等嚴格和65℃的高度嚴格之間變化。
IL-16優(yōu)選在原核或真核宿主細胞中經(jīng)重組產(chǎn)生。該生產(chǎn)方法例如在WO 94/28134和WO 96/31607中進行了描述，它也是本發(fā)明說明書的主體目的。然而，為了以限定的和可重復的方式獲得IL-16的根據(jù)本發(fā)明的形式，必須采取本領域的技術(shù)人員熟悉的重組生產(chǎn)方法以外的其它方法。
以本領域的技術(shù)人員熟悉的方法作為異源表達或作為同源表達(IL-16核酸同源重組進宿主生物基因組后)可生產(chǎn)重組IL-16。為此，首先生產(chǎn)能產(chǎn)生具有IL-16活性的蛋白質(zhì)的DNA。將該DNA克隆進可轉(zhuǎn)移進宿主細胞并能在那里復制的載體中。該載體除IL-16序列外還含有為DNA序列表達所必需的調(diào)節(jié)元件。將這種含有IL-16序列和調(diào)節(jié)元件的載體轉(zhuǎn)移進能表達IL-16 DNA的載體中。在適合于擴增該載體的條件下培養(yǎng)宿主細胞并分離IL-16。在該方法中，合適的方法可保證該蛋白質(zhì)形成表現(xiàn)出IL-16特性的有活性的三級結(jié)構(gòu)。
也可修飾該蛋白質(zhì)的核酸序列。該修飾是例如-修飾核酸以便導入限制性酶的各種識別序列以利于連結(jié)，克隆和誘變步驟-修飾核酸以摻入優(yōu)選的宿主細胞密碼子-在核酸上補充其它的操縱子元件以最優(yōu)化在宿主細胞中的表達。
該蛋白質(zhì)優(yōu)選在微生物中，特別是在原核生物且在本例中是大腸桿菌中表達。在原核生物中的表達產(chǎn)生非糖基化的多肽。
表達載體必需含有允許在宿主生物中表達該蛋白質(zhì)的啟動子。這類啟動子是本領域的技術(shù)人員已知的且是例如，lac啟動子(Chang等，自然198(1977)1056),trp啟動子(Goeddel等，核酸研究8(1980)4057),λPL啟動子(Shimatake等，自然292(1981)128)和T5啟動子(美國專利號4,689,406)。諸如tac啟動子(美國專利號4,551,433)的合成啟動子也是合適的。偶聯(lián)的啟動子系統(tǒng)同樣是合適，例如T7-RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)(Studier等，分子生物學雜志，189(1986)113)。由噬菌體啟動子和微生物操縱子區(qū)組成的雜合啟動子(EP-A 0 267 851)也是合適的。除了啟動子外，有效的核糖體結(jié)合位點也是必需的。在大腸桿菌的例子中，核糖體結(jié)合位點稱為Shine-Dalgarno(SD)序列(Sambrook等，“克隆基因在大腸桿菌中的表達”，分子克隆實驗室手冊(1989)，美國紐約冷泉港實驗室出版)。
為了提高表達，可作為融合蛋白質(zhì)表達該蛋白質(zhì)。在本例中編碼內(nèi)源性細菌蛋白質(zhì)N端部分或另一穩(wěn)定蛋白質(zhì)的DNA序列通常融合到編碼IL-16的序列的5’端。其例子是例如lacZ(Phillips和Silhavy，自然344(1990)882-884),trpE(Yansura，酶學方法185(1990)161-166)。
優(yōu)選是有生物學功能的質(zhì)?；虿《据d體的載體表達后，融合蛋白優(yōu)選用酶(例如，因子Xa)裂解(Nagai等，自然309(1984)810)。裂解位點的其它例子是IgA蛋白酶裂解位點(WO 91/11520,EP-A 0 495 398)，遍在蛋白質(zhì)裂解位點(Miller等，生物/技術(shù)7(1989)698)和腸激酶裂解位點。
以這種方式在細菌中表達的蛋白質(zhì)經(jīng)過破碎細菌并分離該蛋白質(zhì)以常規(guī)方式獲得。
在另一實施方案中可從微生物中作為活性蛋白質(zhì)分泌該蛋白質(zhì)。為此，優(yōu)選使用融合產(chǎn)物，它由適合于在所用的宿主生物中分泌蛋白質(zhì)的信號序列和編碼該蛋白質(zhì)的核酸組成。在本例中該蛋白質(zhì)分泌進培養(yǎng)基(在革蘭氏陽性細菌中)或分泌進壁膜間隙(在革蘭氏陰性細菌中)。方便的是在信號序列和編碼IL-16的序列之間插入一個裂解位點，它允許在加工期間或在其它的步驟中裂解該蛋白質(zhì)。該信號序列來自例如ompA(Ghrayeb等，EMBO J.3(1984)2437),phoA(Oka等，美國科學院學報82(1985)7212)。
該載體另外還含有終止子。終止子是提供轉(zhuǎn)錄過程終止信號的DNA序列。它們通常以兩個結(jié)構(gòu)特征來鑒定可形成分子內(nèi)雙螺旋的反向重復的G/C-富集區(qū)以及許多U(或T)殘基。其例子有噬菌體fd(Beck和Zink，基因16(1981)35-38)和rrnB(Brosius等，分子生物學雜志148(1981)107-127)的主要終止子。
另外表達載體通常含有一個選擇標記以便選擇轉(zhuǎn)化的細胞。該選擇標記是例如氨芐青霉素，氯霉素，紅霉素，卡那霉素，新霉素和四環(huán)素的抗性基因(Davies等，微生物學年鑒32(1978)469)。同樣合適的選擇標記是用于細胞所必需的物質(zhì)，例如組氨酸，色氨酸和亮氨酸的生物合成的必需物質(zhì)的基因。
許多合適的細菌載體是已知的。例如已描述了用于下列細菌的載體枯草芽孢桿菌(Palva等，美國科學院學報79(1982)5582)，大腸桿菌(Aman等，基因40(1985)183；Studier等，分子生物學雜志189(1986)113)，奶油色鏈球菌(streptococcus cremoris)(Powell等，應用環(huán)境微生物學54(1988)655)，變青鏈球菌(streptococcuslividans)和變青鏈霉菌(streptomyces lividans)(美國專利號4,747,056)。
生產(chǎn)和表達合適的載體的其它遺傳工程方法在Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(1989)，紐約州紐約冷泉港實驗室出版中描述。
除了原核生物外，也可在真核生物(例如CHO細胞，酵母或昆蟲細胞)中表達重組IL-16。優(yōu)選酵母系統(tǒng)或昆蟲細胞作為真核表達系統(tǒng)?？山柚谌惤湍篙d體整合型YIP(酵母整合質(zhì)粒)載體，復制型YRP(酵母復制子質(zhì)粒)載體和附加型YEP(酵母附加體質(zhì)粒)載體實現(xiàn)在酵母中的表達。其更詳細的情況在例如S.M.Kingsman等，Tibtech 5(1987)53-57中描述。
另外本發(fā)明涉及用編碼根據(jù)本發(fā)明的IL-16多肽的核酸以宿主細胞表達所述多肽的方式轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞。該宿主細胞通常含有一個有生物學功能的核酸載體，優(yōu)選含有該核酸的DNA載體，質(zhì)粒DNA。
另外優(yōu)選不能進一步裂解為亞基的單體IL-16多肽。
令人驚奇的是證明了WO94/28134中所述的IL-16的核酸和蛋白質(zhì)序列并不與天然的人序列相對應。它僅僅是非天然的IL-16類似物。然而，優(yōu)選用于治療應用的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)相同或者與天然蛋白質(zhì)僅有微小的差別且至少表現(xiàn)出相當?shù)幕钚院兔庖咴浴Ｔ摰鞍踪|(zhì)的序列在SEQ ID NO:2中描述(任選在N端延長一個天冬氨酸殘基和/或在C末端縮短多達8個氨基酸)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的IL-16核酸序列可含有缺失，突變和添加。在優(yōu)選的實施方案中IL-16的單體形式可多聚體化。可以這種方式增強IL-16的活性。該多聚體形式優(yōu)選二聚體，四聚體或八聚體形式。
在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽可另外含有限量的金屬離子，每亞基的金屬離子數(shù)優(yōu)選0.5到2個。
許多金屬離子適合于作為本發(fā)明意義內(nèi)的金屬離子。已證明堿土金屬以及副族的元素是合適的。堿土金屬，鈷，鋅，硒，錳，鎳，銅，鐵，鎂，鈣，鉬和銀特別合適。該離子可以是單價，二價，三價或四價的。特別優(yōu)選二價離子。該離子優(yōu)選作為MgCl2,CaCl2,MnCl2,BaCl2,LiCl2,Sr(NO3)2,Na2MoO4,AgCl2的溶液加入。
這種含有金屬離子的IL-16的多聚體形式在國際專利申請PCT/EP96/05661中描述。
經(jīng)過在合適的營養(yǎng)條件下培養(yǎng)用權(quán)利要求1或2所要求的核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞并任選分離所需的多肽可生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多肽。如果試圖在基因治療處理的情況中體內(nèi)生產(chǎn)該多肽，則當然不必從細胞中分離該多肽。
本發(fā)明的另一主體是含有根據(jù)本發(fā)明的多肽以及任選藥用上合適的稀釋劑，佐劑和/或載體的藥用組合物，其中該多肽的量和/或特異性活性足以用于治療應用。
根據(jù)本發(fā)明的多肽特別適合于治療由病毒復制，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒復制所引起的病理狀態(tài)以及適合于免疫調(diào)節(jié)。該治療應用也在WO96/31607中描述。它還描述了診斷試驗方法。
根據(jù)本發(fā)明的多肽也可優(yōu)選用于免疫抑制。優(yōu)選經(jīng)過抑制TH0和/或TH1和/或TH2細胞的輔助功能實現(xiàn)該免疫抑制。因此根據(jù)本發(fā)明的多肽在病理上假定為免疫調(diào)節(jié)異常成分的所有疾病且特別是在超免疫中具有治療價值。在心臟病學/血管學中可用IL-16治療的疾病有例如，諸如心肌炎，心內(nèi)膜炎和心包炎的疾病，在肺臟學中有例如支氣管炎，哮喘，在血液學中有自身免疫神經(jīng)缺乏病和移植排斥，在胃腸病學中有慢性胃炎，在內(nèi)分泌學中有糖尿病I型，在腎病學中有腎小球腎炎，風濕病，在眼科學中的疾病，在神經(jīng)學中例如多發(fā)性硬化和在皮膚病學中的濕疹。根據(jù)本發(fā)明的多肽特別是可用于自身免疫疾病，過敏性并避免移植排斥。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在基因治療上的應用。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或非病毒性載體系統(tǒng)是用于該目的的合適的載體系統(tǒng)。
另外本發(fā)明還涉及多克隆或單克隆抗IL-16抗體或其與SEQ IDNO:2的前3-20個氨基酸或與N端延長一個天冬氨酸殘基的SEQ ID NO:2結(jié)合的免疫活性片斷，還涉及生產(chǎn)該抗體的方法及其在IL-16的測定和在真核細胞且特別是在哺乳動物細胞材料中測定病毒感染的用途。經(jīng)過用根據(jù)本發(fā)明的多肽免疫實現(xiàn)該抗體的生產(chǎn)。根據(jù)本領域的技術(shù)人員熟悉的方法用含有SEQ ID NO:2的前3-20個氨基酸或N端延長一個天冬氨酸殘基的SEQ ID NO:2的免疫原作為半抗原進行免疫接種可實現(xiàn)該抗體的生產(chǎn)。隨后可用常規(guī)方式從免疫動物中分離該抗體并任選可生產(chǎn)單克隆抗體。
下面的實施例和公開以及序列方案進一步解釋本發(fā)明從本專利的權(quán)利要求書產(chǎn)生的保護范圍。所述的方法應作為實施例來理解，即使修改后它仍是描述了本發(fā)明的目的。
實施例1IL-16的克隆，表達和純化1.1 RNA分離5×107PBMC(來自人或猴)用10μg/ml伴刀豆凝集素A和180U/mlIL-2培養(yǎng)48小時。為了制備RNA，細胞用PBS洗滌一次并隨后用5ml變性溶液(RNA分離試劑盒，Stratagene)裂解。加入1ml乙酸鈉，5ml酚和1ml氯仿/異戊醇(24∶1)后將裂解產(chǎn)物在冰上保持15分鐘。隨后將水相與6ml異丙醇混合以沉淀RNA并在-20℃儲存2小時。沉淀最后用純乙醇洗滌一次并溶于150μl H2O中。以分光光度法測定產(chǎn)量為120μg。
1.2 cDNA合成用于cDNA合成的混合物含有10μg RNA,0.2μg寡聚dT,13mM DTT和5μl混合第一鏈混合物(第一鏈cDNA合成試劑盒，Pharmacia)，總量為15μl。混合物在37℃培養(yǎng)1小時隨后儲存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 按WO94/28134或WO96/31607所述并考慮修飾的序列實現(xiàn)IL-16cDNA的擴增，克隆及表達克隆的生產(chǎn)。
1.3 IL-16的大腸桿菌表達克隆的10 l發(fā)酵和高壓破碎從種子培養(yǎng)物(儲存于-20℃的平板涂布物或安瓿)在37℃下?lián)u動培養(yǎng)建立預培養(yǎng)物。接種進下一更高規(guī)模的體積在每例中是1-10體積％。在預培養(yǎng)物和主要培養(yǎng)物中使用氨芐青霉素(50-100mg/l)選擇質(zhì)粒丟失。
作為N和C源的酶消化的蛋白質(zhì)和/或酵母提取物以及作為額外C源的甘油和/或葡萄糖用作營養(yǎng)物。培養(yǎng)基緩沖至pH7并以生理學可耐受的濃度加入金屬鹽以穩(wěn)定發(fā)酵過程。用具有混合的酵母提取物/C源劑量的飼養(yǎng)批次進行發(fā)酵。發(fā)酵溫度是25-37℃。溶氧分壓(pO2)借助于通氧率r.p.m.調(diào)節(jié)和劑量速率保持在大約20％以下。經(jīng)過在528nm下測定光密度(OD)來測定生長。借助于IPTG誘導IL-16的表達。經(jīng)過10-20小時的發(fā)酵時期后，在OD值不變時離心收獲生物量。
將生物量置于50mM磷酸鈉，5mM EDTA,100mM NaCl,pH7中并借助于連續(xù)高壓擠壓在1000巴下破碎。再次離心以這種方式獲得的懸液并進一步處理含有溶解的IL-16的上清。
1.4重組人IL-16的純化在50mM磷酸鈉，5mM EDTA,100mM NaCl,pH7.2中的550ml裂解上清與55ml 5M NaCl,60mM MgCl2,pH8.0混合，攪拌30分鐘并隨后在20,000g下離心30分鐘。將400ml上清上樣到預先裝有30μMolNiCl2/ml凝膠并用50mM磷酸鈉，0.2M NaCl,pH8.0平衡的鎳螯合的瓊脂糖柱(V=60ml；Pharmacia)上。隨后用300ml 50mM磷酸鈉，0.5MNaCl,pH7.0洗滌柱，然后用在50mM磷酸鈉，0.1M NaCl,pH7.0中的OM至300mM咪唑梯度(2×0.5 l梯度體積)洗脫IL-16融合蛋白質(zhì)。含有IL-16的餾份借助于SDS-PAGE鑒定，合并且在20mM磷酸鈉，pH7.0中透析。
以這種方式獲得的300mg融合蛋白質(zhì)在4℃下用20 l 20mM咪唑，pH5.5透析，隨后在20,000g下離心30分鐘以去掉渾濁物。接著用NaOH將離心上清調(diào)至pH8.5，與0.3mg凝血酶(Boehringer Mannheim GmbH)混合并在37℃培養(yǎng)4小時。隨后用HCl將裂解混合物調(diào)至pH6.5，經(jīng)過用水稀釋將導電性調(diào)至1.7mS。將樣品上樣到預先用20mM咪唑平衡的Q-瓊脂糖FF柱(45ml；Pharmacia)上。使用在20mM咪唑，pH6.5中的0至0.3M NaCl梯度洗脫IL-16。含有IL-16的餾份借助于SDS-PAGE鑒定并合并。借助于分子量分析(分子量13,566+3D)和自動N端序列分析證實IL-16的相同性。IL-16在280nm下的紫外吸收率和在此波長下計算的摩爾消光系數(shù)5540M-1cm-1(Mack等(1992)分析化學200,74-80)用于測定濃度。
為了獲得所需N末端，任選用氨基肽酶(例如，α氨酰基肽水解酶)或二肽基肽酶(例如，組織蛋白酶CCATH)再裂解。
以這種方式獲得的IL-16在還原條件下在SDS-PAGE中純度超過95％。
Vydac，蛋白質(zhì)和肽C18,4×180mm柱用于借助于RP-HPLC分析純度。用0％至80％B(溶劑B在0.1％TFA中的90％乙晴；溶劑A在H2O中的0.1％TFA)的線性梯度在30分鐘內(nèi)以1ml/分鐘的流速洗脫。在220nm下檢測。
實施例2使用腸激酶裂解位點生產(chǎn)縮短的IL-162.1表達克隆按WO94/28134或WO96/31607所述并考慮修飾的序列實現(xiàn)IL-16cDNA的擴增和克隆及表達克隆的制備。
具有序列SEQ ID NO:3的寡聚核苷酸用作正向引物，它含有EcoRⅠ位點，6個組氨酸和腸激酶裂解位點(D4K)cccgaattc tatg cat cac cac cac cac cac gatgacgacgacaaa-tctgcagcctcagcctctgcEcoRⅠ H6D4K具有序列SEQ ID NO:6的也含有EcoRⅠ位點，6個組氨酸和腸激酶裂解位點(D4K)的寡聚核苷酸用作正向引物用于在5’端延長一個天冬氨酸密碼子的序列cccgaattc tatg cat cac cac cac cac cac gatgacgacgacaaa-gactctgcagcctcagcctcEcoRⅠ H6 D4K寡聚核苷酸IL-16-R1(SEQ ID NO:4):IL-16-R1:gcg gat cca agctta gga gtc tcc agc agc tgt g或寡聚核苷酸IL-16-R2(SEQ IDNO:5):IL-16-R2:gcg gat cca agc tta ttc ctt gga ctg gag gct ttttc用作反向引物。
兩個反向引物含有用于克隆的BamHⅠ和HindⅢ裂解位點。
用IL-16-R1獲得了編碼根據(jù)SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)的一個序列。
用IL-16-R2獲得了編碼C末端縮短8個氨基酸的IL-16的一個序列。該C末端IL-16也具有活性。
根據(jù)標準條件進行PCR反應，克隆和表達克隆(具有用于純化的N端poly-His部分的融合蛋白質(zhì))的制備0.2mM dNTP混合物，正向和反向引物各1pmol/μl,1x高保真緩沖液(Boehringer Mannheim,D),1.5mM MgCl2,2.6U高保真酶混合物(Boehringer Mannheim,D)。
20μl終體積。
儀器Perkin Elmer GeneAmp 9600反應過程94℃3分鐘，56℃1分鐘，72℃2分鐘，然后25個循環(huán)(94℃20秒，56℃20秒，72℃1分鐘)。
2.2發(fā)酵與實施例1.3類似地進行發(fā)酵。
2.3純化和裂解在50mM磷酸鈉，5mM EDTA,100mM NaCl,pH7.2中的700ml裂解上清與70ml 5M NaCl,60mM MgCl2,pH8.0混合，攪拌30分鐘，隨后在20,000g下離心30分鐘。將離心上清上樣到預先裝有NiSO4溶液(c=10mg/ml)并用50mM磷酸鈉，0.5M NaCl,pH8.0平衡的鎳螯合柱(V=200ml；Pharmacia)上。隨后用平衡緩沖液洗滌柱直至幾乎達到基線(在280nm下紫外檢測)。之后用1l 50mM磷酸鈉，0.5M NaCl,pH7.0和用1l 50mM磷酸鈉，0.1M NaCl,pH7.0洗滌柱。用在50mM磷酸鈉，0.1M NaCl,pH7.0中的0-300mM咪唑，pH 7.0梯度(2×1.6l)洗脫融合蛋白質(zhì)。含有IL-16的餾份借助于SDS-PAGE鑒定并合并。將該IL-16合并物在Provario(Filtron，膜ω5K)中濃縮至5mg蛋白質(zhì)/ml的濃度并在50mM Tris,pH8.0中透析。
相當于含有100mg融合蛋白質(zhì)的合并物用50mM Tris,pH8.0稀釋至蛋白質(zhì)濃度為c=1mg/ml用于腸激酶裂解。加入33μg腸激酶(Boehringer Mannheim；1:3000w/w)后，裂解混合物在37℃培養(yǎng)過夜(14小時)。隨后用HCl將pH值調(diào)至pH6.5。
經(jīng)過在20ml鎳螯合瓊脂糖(其制備見上文)中攪拌并隨后離心(10,000g)或經(jīng)過在玻璃濾器上抽吸過濾上清去掉未裂解的IL-16。經(jīng)過N端測序和分子量分析證實上清中所含的裂解的IL-16的相同性。經(jīng)過SDS-PAGE和RP-HPLC(Vydac，二肽基，4.6×150mm，在45分鐘內(nèi)20％至95％B的線性梯度；溶劑A在H2O中的20mM磷酸鉀，pH7.5；溶劑B:100％乙腈)檢測純度。
實施例3用細胞裂解物(Zellysat)裂解重組IL-163.1經(jīng)MACS分離CD8+和CD4+淋巴細胞借助于Ficoll梯度從淡黃色覆蓋層分離的淋巴細胞重懸于500μlPBS-疊氮化物/1×108個細胞(無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽水，0.01％疊氮化鈉，5mM EDTA,pH7.2)。加入20ml CD8微珠/1×107個預期細胞(與磁顆粒連結(jié)的小鼠抗人CD8抗體，Miltenyi Biotec GmbH)后，將它們在4℃培養(yǎng)15分鐘。加入2mg DTAF/1×107個預期細胞(FITC連結(jié)的抗小鼠IgG,Dianova公司)在4℃下再處理5分鐘。用25ml BPS-疊氮化物/1％BSA稀釋后，再次離心(10分鐘，1200rpm,4℃)。棄去上清，細胞重懸于2ml PBS/1％BSA中，將細胞懸液上樣到位于磁分離器(Miltenyi Biotec GmbH)中的柱上。偶聯(lián)CD8微珠的CD8+細胞留在柱中，因此流過的部分含有除CD8+細胞外的所有淋巴細胞(大約80％CD4+細胞)。從支架上取出洗滌柱后，用PBS-疊氮化物/1％BSA洗脫CD8+細胞部分。離心流出部分和CD8+細胞部分，重懸于細胞培養(yǎng)基(RPMI 1640,20％FCS,2mM谷氨酰胺，180U/ml IL-2)中，調(diào)節(jié)細胞數(shù)至3×106個細胞/ml并用PHA(9mg/ml)刺激細胞。借助于FACS檢查淋巴細胞亞群體分離的質(zhì)量。
3.2制備細胞裂解物并消化IL-16已用PHA刺激3天的1×108CD8+淋巴細胞在與1％Triton X100混合的2mlPBS中在冰上裂解10分鐘。然后經(jīng)離心取出細胞碎片和細胞核。以這種方式獲得的45μl細胞裂解物在室溫下與10μg以在氨基末端或羧基末端與組氨酸標記(HIS標記，例如，具有裂解位點的6個組氨酸，參見WO 94/28134)融合的形式表達的重組IL-16保溫16小時。然后借助于鎳瓊脂糖基質(zhì)純化攜帶該HIS標記的片段。進一步純化在HPLC中形成的片段后，以質(zhì)譜法測定該片段的質(zhì)量，從而測定N末端片段的大小。以這種方式鑒定了天然加工的IL-16片段，它以SEQID NO:1/2所述的N末端或以延長了一個天冬氨酸密碼子的N末端開始。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱由衛(wèi)生部代表的聯(lián)邦德國(B)街道-(C)城市Bonn(E)國家德國(F)郵政編碼(郵編)D-53108(A)名稱BOEHRINGER MANNHEIM GMBH(B)街道Sandhofer Str.116(C)城市Mannheim(E)國家德國(F)由政編碼(由編)D-68305(G)電話08856/60-3446(H)電傳08856/60-3451(ⅱ)發(fā)明名稱具有IL-16活性的加工的多肽，其生產(chǎn)方法及其用途(ⅲ)序列數(shù)10個(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30B(EPO)(ⅵ)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朌E 196 17 202.0
(B)申請日1996年4月30日(ⅵ)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朌E 196 17 203.9(B)申請日1996年4月30日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度366個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..366(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述TCT GCA GCC TCA GCC TCT GCA GCC AGT GAT GTT TCT GTA GAA TCT ACA48Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr1 5 10 15GCA GAG GCC ACA GTC TGC ACG GTG ACA CTG GAG AAG ATG TCG GCA GGG96Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly20 25 30CTG GGC TTC AGC CTG GAA GGA GGG AAG GGC TCC CTA CAC GGA GAC AAG 144Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys35 40 45CCT CTC ACC ATT AAC AGG ATT TTC AAA GGA GCA GCC TCA GAA CAA AGT 192Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser50 55 60GAG ACA GTC CAG CCT GGA GAT GAA ATC TTG CAG CTG GGT GGC ACT GCC 240Glu Thr Val Gln Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala65 70 75 80ATG CAG GGC CTC ACA CGG TTT GAA GCC TGG AAC ATC ATC AAG GCA CTG 288Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu85 90 95CCT GAT GGA CCT GTC ACG ATT GTC ATC AGG AGA AAA AGC CTC CAG TCC 336Pro Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser100 105 110AAG GAA ACC ACA GCT GCT GGA GAC TCC TAG 366Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser*115 120(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度122個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述:Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr1 5 10 15Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly20 25 30Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys35 40 45Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser50 55 60Glu Thr Val Gln Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala65 70 75 80Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Ash Ile Ile Lys Ala Leu85 90 95Pro Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser100 105 110Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser *115 120(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度66個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“正向引物’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAATCTG CAGCCTCAGC 60CTCTGC66(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“反向引物IL-16-R1’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述GCGGATCCAA GCTTAGGAGT CTCCAGCAGC TGTG 34(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“反向引物IL-16-R2”(ⅹⅰ)SEQED NO:5的序列描述GCGGATCCAA GCTTATTCCT TGGACTGGAG GCTTTTTC 38(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度66個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“正向引物”(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAAGACT CTGCAGCCTC60AGCCTC 66(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala1 5(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述Ser Ala Ala Ser Ala Ser1 5(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述Ser Ala Ala Ser Ala1 5(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述Ser A1a Ala Ser權(quán)利要求
1．可用于在原核或真核宿主細胞中表達具有白細胞介素-16活性的多肽的核酸，其中所述的核酸a)相應于DNA序列SEQ ID NO:1或相應于在其5’端延長了一個天冬氨酸密碼子的DNA，或相應于其互補鏈b)在嚴格條件下與序列SEQ ID NO:1的DNA或與其在5’端延長了一個天冬氨酸密碼子的DNA雜交，c)或是能在嚴格條件下與無遺傳密碼簡并性的a)或b)限定的核酸序列雜交的核酸序列d)以及在5’端編碼氨基酸序列SEQ ID NO:7至10之一或編碼在其N末端延長一個天冬氨酸的類似序列。
2．權(quán)利要求1所要求的核酸，它編碼來自靈長類的白細胞介素-16。
3．用權(quán)利要求1或2所要求的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞，宿主細胞表達所述多肽。
4．具有生物學功能的核酸載體，它含有權(quán)利要求1或2所要求的核酸。
5．可作為權(quán)利要求1或2所要求的核酸的真核表達產(chǎn)物獲得的來自靈長類的白細胞介素-16，它基本上不含其它人類蛋白質(zhì)。
6．可作為權(quán)利要求1或2所要求的核酸的真核表達產(chǎn)物加工后獲得的人類白細胞介素-16，它基本上不含其它人類蛋白質(zhì)。
7．由權(quán)利要求1或2所要求的核酸編碼的具有白細胞介素-16活性的多肽。
8．權(quán)利要求7所要求的具有白細胞介素-16活性的多肽，其特征在于，它是由一定數(shù)目的亞基組成的多聚體，而權(quán)利要求7的多肽是其一個亞基。
9．權(quán)利要求8所要求的多肽，其特征在于，它由4至32個亞基組成。
10．權(quán)利要求7-9所要求的多肽，其特征在于，它含有一定數(shù)目的金屬離子，每亞基的金屬離子數(shù)是0.5-2個。
11．生產(chǎn)權(quán)利要求7-10所要求的多肽的方法，其特征在于，在合適的營養(yǎng)條件下培養(yǎng)用權(quán)利要求1或2所要求的核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞并任選分離所需的多肽。
12．含有權(quán)利要求5-10所要求的多肽以及藥用的稀釋劑，佐劑和/或載體的藥用組合物。
13．含有用于治療應用足夠量的權(quán)利要求5-10所要求的多肽的藥用組合物。
14．生產(chǎn)抗具有白細胞介素-16活性的多肽的抗體的方法，其中用含有SEQ ID NO:2的前3-20個氨基酸或N端延長一個天冬氨酸殘基的SEQ ID NO:2的免疫原作為半抗原免疫接種一種哺乳動物并隨后從該哺乳動物中分離該抗體。
全文摘要
一種核酸,它可用于在原核或真核宿主細胞中表達具有白細胞介素－16活性的多肽,其中所述的核酸編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或在N末端延長了一個天冬氨酸殘基的SEQ ID NO:2或在C末端縮短了多達8個氨基酸的形式的多肽,該核酸適合于生產(chǎn)具有活性的IL－16多肽。
文檔編號C12P21/02GK1217025SQ97194250
公開日1999年5月19日 申請日期1997年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月30日
發(fā)明者R·庫爾斯, M·拜爾, N·班納特, S·維爾納, K·朗 申請人:聯(lián)邦德國衛(wèi)生部, 曼海姆泊靈格股份公司