專利名稱：真菌表達(dá)的異源基因中隱蔽剪接位點(diǎn)的修飾方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于獲得包含編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的重組真菌宿主細(xì)胞的方法，其中在核酸序列中至少有一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)被修飾。本發(fā)明也涉及具有一個(gè)修飾的隱蔽剪接位點(diǎn)的分離的核酸序列和包含所說的核酸序列的核酸構(gòu)建體，載體，以及重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于重組制備由所說的核酸序列編碼的多肽的方法。
相關(guān)技術(shù)的描述真核基因被間插序列(內(nèi)含子)間斷，所說的內(nèi)含子必須在前體轉(zhuǎn)錄物中經(jīng)過修飾以產(chǎn)生功能mRNA。內(nèi)含子消除過程被稱為前-mRNA剪接。通常，內(nèi)含子的分支點(diǎn)序列對(duì)通過形成套索結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子剪接來說是必要的。剪接信號(hào)直接位于內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的界線處。內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的界線通常分別在5’和3’端有共有內(nèi)含子序列GT和AG。目前沒有報(bào)導(dǎo)除AG之外的3’剪接位點(diǎn)，但報(bào)導(dǎo)了5’GT剪接位點(diǎn)的一些例外情況。例如，有先例其中在5’界線處CT或GC取代了GT。在GT后的極為優(yōu)選的核苷酸堿基是ANGT，其中N是A,C,G，或T(在酵母種類中主要是A或T)，但是在CT剪接位點(diǎn)前面沒有明顯優(yōu)選的任何特殊核苷酸。在3’剪接位點(diǎn)AG前面主要是嘧啶核苷酸堿基(Py)，即C或T。
間斷真菌基因的內(nèi)含子數(shù)量的范圍為一個(gè)至十二個(gè)或更多內(nèi)含子(Rymond和Rosbash,1992,E.W.Jones,J.R.Pringle，以及J.R.Broach，編者，酵母酵母屬的分子和細(xì)胞生物學(xué)，第143-192頁(yè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，Plainview，紐約；Gurr等，1987,Kinghorn,J.R.(編者)，真核微生物中的基因結(jié)構(gòu)，第93-139頁(yè)，LRL出版社，牛津大學(xué))。它們可分布于整個(gè)基因中或位于基因的5’或3’端。在釀酒酵母中內(nèi)含子主要位于基因的5’端。一般地內(nèi)含子長(zhǎng)度不到1kb，并且通常在酵母中長(zhǎng)度不到400bp，在絲狀真菌中長(zhǎng)度不到100bp。
釀酒酵母內(nèi)含子分支點(diǎn)序列5’-TACTAAC-3’很少確切地出現(xiàn)在絲狀真菌內(nèi)含子中(Gurr等，1987，如前)。在絲狀真菌內(nèi)含子的相同位點(diǎn)觀察到密切或松散類似TACTAAC的序列段和一般的共有序列NRCTRAC，其中N是A,C,G，或T，并且R是A或G。例如，第四個(gè)位置T在粗糙脈孢菌和黑曲霉兩者推斷的共有序列中是不變的。此外，核苷酸G,A，和C在第3,6和7位置分別超過80％，雖然黑曲霉的第7位置柔性較大僅僅為65％。然而，第1,2,5，和8位置在粗糙脈孢菌和黑曲霉中嚴(yán)格程度均低得多。其它絲狀真菌在其內(nèi)含子的等同位置有類似的分支點(diǎn)伸展，但是取樣太小不能辯明任何肯定趨向。
在真菌宿主菌株中編碼多肽的基因的異源表達(dá)可能在宿主菌株中導(dǎo)致錯(cuò)誤地將基因編碼序列內(nèi)的區(qū)域當(dāng)作間插序列或內(nèi)含子。例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中絲狀真菌的具內(nèi)含子的基因被錯(cuò)誤地剪接(Gurr等，1987,Kinghorn,J.R.(編者)，真核微生物中的基因結(jié)構(gòu)，第93-139頁(yè)，LRL出版社，牛津大學(xué))。由于親本菌株(從中獲得所說的基因)不把該區(qū)作為內(nèi)含子，所以稱這種內(nèi)含子為隱蔽內(nèi)含子。這種不恰當(dāng)?shù)淖R(shí)別可導(dǎo)致前體mRNA分子的異常剪接，這種異常剪接導(dǎo)致不產(chǎn)生生物活性多肽或產(chǎn)生帶有變異生物活性的幾群多肽產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的是提供用于除去在基因編碼序列內(nèi)的隱蔽剪接位點(diǎn)以阻止真菌宿主細(xì)胞異源表達(dá)的前體mRNA不適宜剪接的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于獲得重組真菌宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將編碼異源多肽的核酸序列導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞內(nèi)，其中在核酸序列中至少有一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)被修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用非-共有序列取代核酸內(nèi)的至少一個(gè)隱蔽共有序列修飾隱蔽剪接位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過用第二區(qū)(其具有在約40％到約70％范圍內(nèi)的G+C百分含量)取代包含至少一個(gè)隱蔽內(nèi)含子或其部分的第一區(qū)來修飾隱蔽剪接位點(diǎn)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過用非-共有序列取代隱蔽共有序列和通過用第二區(qū)(其具有在約40％到約70％范圍內(nèi)的G+C百分含量)取代包含隱蔽內(nèi)含子或其部分的第一區(qū)來修飾隱蔽剪接位點(diǎn)。
本發(fā)明也涉及具有至少一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)的核酸序列和包含所說的核酸序列的核酸構(gòu)建體，載體，以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于重組制備由所說的核酸序列編碼的多肽的方法。
定 義＂內(nèi)含子＂這里定義為非翻譯間插核酸序列，其間隔開基因的編碼序列，并從原初mRNA轉(zhuǎn)錄物中被剪切掉。
＂外顯子＂這里定義為轉(zhuǎn)錄基因的片段，且其被翻譯成多肽。
＂原初mRNA轉(zhuǎn)錄物＂這里定義為通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的基因前體mRNA產(chǎn)物。
＂RNA剪接＂這里定義為由原初mRNA轉(zhuǎn)錄物所轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子序列的切除，并接著連接余下的外顯子以形成mRNA產(chǎn)物。
＂隱蔽內(nèi)含子＂這里定義為編碼序列的區(qū)，其被錯(cuò)誤地識(shí)別為從原初mRNA轉(zhuǎn)錄物中被切除的內(nèi)含子。隱蔽內(nèi)含子優(yōu)選的有10-1500個(gè)核苷酸，較優(yōu)選的20-1000個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的30-300個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的30-100個(gè)核苷酸。
＂共有序列＂這里定義為通常位于5’或3’外顯子-內(nèi)含子界線處含有內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的核酸序列。
＂隱蔽剪接位點(diǎn)＂在這里定義為位于隱蔽內(nèi)含子的5’或3’界線(這里發(fā)生異常剪接)處的位點(diǎn)。
＂隱蔽共有序列＂這里定義為一般地位于隱蔽內(nèi)含子(其含有隱蔽剪接位點(diǎn))的5’或3’界線處的核酸序列。隱蔽共有序列優(yōu)選的不超過10個(gè)核苷酸，較優(yōu)選的不超過6個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的3個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的2個(gè)核苷酸。
＂異常剪接＂這里定義為由原初mRNA轉(zhuǎn)錄物所轉(zhuǎn)錄的序列區(qū)域不適宜的切除，其中所切除的區(qū)段被錯(cuò)誤地當(dāng)作間插核酸序列。
＂氨基酸擺動(dòng)位置＂這里定義為可被另一個(gè)核苷酸取代(其原因是真菌宿主細(xì)胞的遺傳密碼的簡(jiǎn)并性)的核苷酸殘基。
＂重組真菌宿主細(xì)胞＂這里定義為包含異源核酸序列的真菌宿主細(xì)胞。
附 圖 簡(jiǎn) 述

圖1顯示pUCI9-GFP的限制性酶切圖。
圖2顯示pShTh34的構(gòu)建。
圖3顯示具有標(biāo)記為片段A-D的隱蔽內(nèi)含子區(qū)的GFP cDNA序列(SEQ ID NO:20)。
圖4顯示pShTh49的構(gòu)建。
圖5顯示pShTh58.1的構(gòu)建。
圖6顯示由轉(zhuǎn)化體ShTh5 81.1產(chǎn)生的GFP的熒光光譜。
圖7顯示pShTh58.2的限制性酶切圖。
圖8顯示由轉(zhuǎn)化體ShTh582.1產(chǎn)生的GFP的熒光光譜。
發(fā) 明 詳 述本發(fā)明涉及獲得重組真菌宿主細(xì)胞的方法，包括將編碼異源多肽的核酸序列導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞內(nèi)，其中在核酸序列中至少有一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)被修飾。所說的核酸序列可能是基因組序列以及對(duì)應(yīng)的cDNA與RNA序列。核酸序列優(yōu)選為cDNA序列。
通過將編碼重組真菌宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的異源多肽的異源mRNA或由所說mRNA合成的cDNA，與從親本細(xì)胞中獲得的mRNA或由所說mRNA合成的cDNA作比較，可確定隱蔽剪接位點(diǎn)。親本細(xì)胞是異源mRNA的來源。此外，通過與親本細(xì)胞的核酸序列和它推定的氨基酸序列相比較，可從在真菌宿主細(xì)胞中由核酸序列異源編碼的多肽的氨基酸序列中確定隱蔽剪接位點(diǎn)。也可利用界線或可靠的真菌內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的共有內(nèi)含子序列(Rymond和Rosbash,1992，如前述；Gurr等，1987，如前述)來確定隱蔽剪接位點(diǎn)。
隱蔽剪接位點(diǎn)通過用非-共有序列取代隱蔽共有序列和/或用第二區(qū)(其具有在約40％到約70％范圍內(nèi)的G+C百分含量，優(yōu)選為約40％-約60％，更優(yōu)選為約40％-約50％)取代包含隱蔽內(nèi)含子或其部分的第一區(qū)來修飾。
通過本領(lǐng)域所熟知的方法可用非-共有序列取代5’和3’端隱蔽共有序列，這些方法包括但不限于，寡核苷酸定向誘變，同源再重組，定點(diǎn)誘變，PCR誘變，以及化學(xué)合成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，5’隱蔽共有序列是GT,GC，或CT,3’隱蔽共有序列是AG。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，5’隱蔽共有序列是GTANGT,GCANGT，或CTANGT，其中N是A,C,G，或T。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，3’隱蔽共有序列是CAG,TAG，或AAG。若某處超過一個(gè)合成片段，利用本領(lǐng)域所熟知的方法可將這些片段共同退火成一個(gè)片段。然后通過用對(duì)該基因特異的寡核苷酸引物擴(kuò)增合成片段周圍的核酸序列剩下的5’和3’部分，可重建整個(gè)編碼序列。
哪種核苷酸取代隱蔽共有序列的核苷酸優(yōu)選取決于密碼子使用表，如下頁(yè)所顯示的曲霉屬真菌宿主細(xì)胞的密碼子使用表Ⅰ。隱蔽共有序列優(yōu)選被非-共有序列取代，其中對(duì)應(yīng)于氨基酸擺動(dòng)位置的核苷酸已被不同的核苷酸所取代以產(chǎn)生相同的氨基酸。
表1
<p>利用上述的用于非-共有序列取代隱蔽共有序列的相同方法可完成用第二區(qū)取代隱蔽內(nèi)含子或其部分的第一區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二區(qū)與第一區(qū)具有相同數(shù)量的寡核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在隱蔽內(nèi)含子界線的5’和/或3’兩側(cè)，第一和第二區(qū)優(yōu)選為10-500個(gè)核苷酸，更優(yōu)選10-200個(gè)核苷酸，最優(yōu)選10-100個(gè)核苷酸。在隱蔽內(nèi)含子中，分支點(diǎn)序列可有可無。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，隱蔽內(nèi)含子序列包含至少七個(gè)核苷酸a-b-c-d-e-f-g的分支點(diǎn)序列，其中a是A,C,G，或T；b是A或G,c是C,d是T；e是A或T；f是A；g是C。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，分支點(diǎn)序列含有至少七個(gè)核苷酸，其中a是A,C,G，或T；b是A；c是C,d是T；e是A；f是A；g是C。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生的異源多肽的氨基酸序列與野生型多肽的氨基酸序列相同。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生的異源多肽中的氨基酸殘基的數(shù)量與野生型多肽中的氨基酸殘基數(shù)量相同。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非-共有序列與隱蔽共有序列具有相同數(shù)量的核苷酸。
重組真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生的異源多肽的氨基酸序列不同于野生型多肽的氨基酸序列，前者具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基的取代。優(yōu)選地，氨基酸變化是屬于次要的性質(zhì)，它是不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊或活性的保守氨基酸取代；典型為1至約30個(gè)氨基酸的小缺失；氨基-或羧基-端的小延伸，如氨基-端的甲硫氨酸殘基；至多約20-25個(gè)殘基的小連接肽；或利于純化的小延伸，如聚-組氨酸段，抗原表位或結(jié)合域。保守取代的例子在堿性氨基酸(如精氨酸，賴氨酸，組氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(如谷酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸)，芳香族氨基酸(如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)及小氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸)組內(nèi)。
因此，術(shù)語＂異源多肽＂這里不是指所編碼的產(chǎn)物的具體長(zhǎng)度，因此包括肽，寡肽，以及蛋白質(zhì)。此外，術(shù)語＂異源多肽＂可包括結(jié)合形成產(chǎn)物的兩個(gè)或多個(gè)多肽。異源多肽可從下列來源中獲得原核來源(例如，芽孢桿菌種的水解酶，即，α-淀粉酶，蛋白酶，脂酶，等等)，真核來源(例如，人胰島素，人生長(zhǎng)激素，牛凝乳酶，因子Ⅷ，綠色熒光蛋白質(zhì)，等等)，以及不同于真菌宿主的真菌來源(例如，毀絲霉屬漆酶，多孔菌屬漆酶，鬼傘屬過氧化物酶，腐質(zhì)霉屬脂酶，曲霉屬淀粉酶，等等)。異源多肽也可能包括雜交多肽，其包含從至少兩個(gè)不同的多肽中獲得的部分或完全多肽序列的組合，其中至少一個(gè)多肽對(duì)真菌宿主是異源的(例如，被融合到編碼黑曲霉葡糖淀粉酶的信號(hào)肽與前肽的核酸序列中的編碼毀絲霉屬漆酶的核酸序列)。異源多肽可進(jìn)一步包括上述多肽的天然存在的等位基因變體和人工變體。
優(yōu)選地，異源多肽是激素，酶，受體，或報(bào)道分子。在較為優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源多肽是氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶，或連接酶。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源多肽是氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶；過氧化氫酶，纖維素酶，幾丁質(zhì)酶，角質(zhì)酶，DNA酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，鹵過氧化物酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，鹵斑葡聚糖酶，氧化酶，果膠分解酶，過氧化物酶，肌醇六磷酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，及木聚糖酶。
在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源多肽是Aequorea victoria綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)。在許多生物(包括大腸桿菌，酵母，植物細(xì)胞，蠕蟲，蒼蠅，以及哺乳動(dòng)物)中，GFP作為通用報(bào)道分子具有許多合乎需要的特點(diǎn)其能使體內(nèi)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位被觀測(cè)到(Chalfie等，1994，科學(xué)263:802-805；Delagrave等，1995，生物/技術(shù)13:151-154；Heim等，1995，自然373:663-664；Sheen等，1995，植物雜志8:777-784；Prasher,1995,TIG 8:320-323；Haseloff和Amos,1995,TIG 8:328-329)。尚未有GFP作為在絲狀真菌中基因表達(dá)報(bào)道分子的應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的具有修飾隱蔽剪接位點(diǎn)的分離核酸序列。具有修飾隱蔽剪接位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)一步包括基因組序列及對(duì)應(yīng)的cDNA與RNA序列，并且應(yīng)該理解這里所使用的＂核酸序列＂詞組涉及所有這樣的變體包括合成的DNA。
本發(fā)明也涉及包含所說的核酸序列的核酸構(gòu)建體。＂核酸構(gòu)建體＂一般地認(rèn)為是核酸分子(或?yàn)閱捂?或?yàn)殡p鏈)，它是從天然存在的基因中分離出的或者它被修飾成含有核酸節(jié)段(其通過用自然界中不另外存在的方式相結(jié)合和相并列)。在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，核酸序列可以是基因組，cDNA，半合成起源，或合成起源。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體可以是任何能便利地進(jìn)行重組DNA操作過程，并能引起核酸序列(其具有至少一個(gè)修飾的隱蔽剪接位點(diǎn))表達(dá)的載體。載體的選擇主要取決于載體與該載體導(dǎo)入至的真菌宿主細(xì)胞的親和性。載體可以是線型或閉環(huán)質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可能是共同含有要被導(dǎo)入至真菌宿主基因組內(nèi)的整個(gè)DNA的單個(gè)載體或質(zhì)?；蛘邇蓚€(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒。
所說的載體是自主復(fù)制的載體，即，以染色體外實(shí)體形式存在且其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如，質(zhì)粒，染色體外元件，微染色體，或人工染色體。載體含有用于保證自主復(fù)制的任何工具。另外，所說的載體可以是當(dāng)其被導(dǎo)入進(jìn)真菌細(xì)胞內(nèi)時(shí)能整合到基因組中并且與它整合的染色體一起復(fù)制的載體。對(duì)于整合，載體可依賴于至少具一個(gè)修飾隱蔽剪接位點(diǎn)的核酸序列或載體的任何其它元件來通過同源或非同源重組方法使載體穩(wěn)定整合到基因組內(nèi)。另一可取的，載體可以含有用于指導(dǎo)通過同源重組方法使其整合到真菌宿主的基因組內(nèi)整合過程的附加核酸序列。附加核酸序列能使載體在染色體精確的位置處整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)。為了增加在精確位置整合的可能性，這里應(yīng)優(yōu)選兩個(gè)核酸序列以提高同源重組的概率，這兩個(gè)序列分別含有足夠數(shù)量的核酸，優(yōu)選為400bp-1500bp，更優(yōu)選為800bp-1000bp，并與對(duì)應(yīng)的靶序列高度同源。這些核酸序列是與真菌宿主細(xì)胞基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列，且可以是非編碼序列或編碼序列。
對(duì)于自主復(fù)制，載體還可包含能使載體在正被談?wù)摰乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的例子是2u復(fù)制起點(diǎn)和CEN3和ARS1的組合。任何與選擇的真菌宿主細(xì)胞相容的復(fù)制起點(diǎn)均可加以利用。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有使被轉(zhuǎn)化細(xì)胞容易篩選的一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性，重金屬抗性，原養(yǎng)型至營(yíng)養(yǎng)缺陷型，及類似抗性的基因。選擇性標(biāo)記可從下組標(biāo)記中選擇但不限于這些，該組包括amdS(乙酰胺酶)，argB(鳥氨酸甲氨酰轉(zhuǎn)移酶)，bar(膦蘇菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，niaD(硝酸鹽還原酶)，pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸-脫羧酶)，以及sC(硫酸鹽腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)，和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)。在曲霉細(xì)胞中優(yōu)選利用構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標(biāo)記和吸水鏈霉菌的bar標(biāo)記。此外，可通過共-轉(zhuǎn)染(如WO91/17243中所描述的)完成選擇，這里選擇性標(biāo)記在一個(gè)單獨(dú)載體上。
在載體中，將包含至少一個(gè)修飾剪接位點(diǎn)的核酸序列有效連接到調(diào)控序列上，該調(diào)控序列對(duì)其所結(jié)合的核酸序列的編碼序列表達(dá)是必須的。術(shù)語＂調(diào)控序列＂這里是指包括所有其存在對(duì)核酸序列的編碼序列表達(dá)必要或有利的組分。調(diào)控序列對(duì)編碼異源多肽的核酸序列來說可以是天然的或由外源而獲得的。這樣的調(diào)控序列包括但不限于下列序列，前導(dǎo)序列，聚腺苷酸化序列，原肽序列，啟動(dòng)子，信號(hào)序列，和轉(zhuǎn)錄終止子。最少，調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄與翻譯停止信號(hào)。對(duì)于在調(diào)控序列指導(dǎo)下的表達(dá)，以這種使編碼序列在與調(diào)控序列相容的條件下完成表達(dá)的方式，將按照本發(fā)明要利用的基因有效連接到調(diào)控序列上。術(shù)語＂編碼序列＂這里定義為當(dāng)置于上述調(diào)控序列的控制下時(shí)被轉(zhuǎn)錄成mRNA，并且被翻譯成異源多肽的序列。編碼序列的界線取決于5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子。編碼序列包括但不限于，DNA,cDNA，以及重組核酸序列。
如上所述，本發(fā)明的核酸序列可以與合適的啟動(dòng)子序列有效連接。啟動(dòng)子序列是可被用于該核酸序列表達(dá)的真菌宿主細(xì)胞所識(shí)別的核酸序列。啟動(dòng)子序列含有轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列，它們介導(dǎo)異源多肽的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是任何在所選擇的真菌宿主細(xì)胞中能顯示轉(zhuǎn)錄活性，并且能從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的多肽的基因中獲得的任何核酸序列。用于指導(dǎo)絲狀真菌中本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的例子是從編碼下列蛋白質(zhì)的基因中獲得的啟動(dòng)子，這些蛋白質(zhì)為米曲霉TAKA淀粉酶，米黑根霉菌天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)，米黑根霉菌脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶，構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶，以及其雜合體。在酵母宿主中，一個(gè)有用的啟動(dòng)子是釀酒酵母烯醇化酶(eno-I)啟動(dòng)子。更為優(yōu)選的啟動(dòng)子是TAKA淀粉酶，NA2-tpi(來源于編碼黑曲霉中性α-淀粉酶和編碼米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的雜合啟動(dòng)子)，以及glaA啟動(dòng)子。
本發(fā)明的核酸序列也可有效連接在終止子序列的3’端。終止子序列對(duì)編碼異源多肽的核酸序列來說可以是天然的或由外源而獲得的。任何在所選擇的真菌宿主細(xì)胞中有功能的終止子均可用于本發(fā)明，但是特別優(yōu)選從編碼下列蛋白質(zhì)的基因中獲得的終止子，如米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡萄糖苷酶和釀酒酵母烯醇化酶。
本發(fā)明的核酸序列也可與合適的前導(dǎo)序列有效連接。前導(dǎo)序列是對(duì)真菌宿主翻譯很重要的mRNA非翻譯區(qū)?？蓪⑶皩?dǎo)序列有效連接到編碼異源多肽的核酸序列的5’端。前導(dǎo)序列對(duì)編碼異源多肽的核酸序列來說可以是天然的或由外源而獲得的。任何在所選擇的真菌宿主細(xì)胞中有功能的前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明，但是特別優(yōu)選從編碼下列蛋白質(zhì)的基因中獲得的前導(dǎo)序列，如米曲霉TAKA淀粉酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。
聚腺苷酸化序列也能有效連接到本發(fā)明核酸序列的3’末端。聚腺苷酸化序列是當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)被真菌宿主識(shí)別并將多聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄mRNA上的序列。聚腺苷酸化序列對(duì)編碼異源多肽的核酸序列來說可以是天然的或由外源而獲得的。任何在所選擇的真菌宿主細(xì)胞中有功能的聚腺苷酸化序列均可用于本發(fā)明，但是特別優(yōu)選從編碼下列蛋白質(zhì)的基因中獲得的聚腺苷酸化序列，如米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡萄糖苷酶。
為了避免為獲得異源表達(dá)多肽而破壞細(xì)胞的必要性并且最大限度地減少在細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)的多肽可能降解的量，優(yōu)選所生成的產(chǎn)物分泌在細(xì)胞外部的多肽基因的表達(dá)。對(duì)于這一點(diǎn)而言，本發(fā)明的異源多肽可與連接在多肽氨基末端的信號(hào)肽相連接。信號(hào)肽是使異源多肽從真菌宿主內(nèi)分泌到培養(yǎng)基中的氨基酸序列。信號(hào)肽對(duì)編碼異源多肽的核酸序列來說可以是天然的或由外源而獲得的。本發(fā)明核酸序列編碼序列的5’端固定地含有信號(hào)肽編碼區(qū)，其在翻譯讀框中與編碼分泌的異源多肽的編碼區(qū)的這一節(jié)段天然地相連接。此外，編碼序列的5’端含有對(duì)編碼分泌的異源多肽的編碼區(qū)的那一部分來說是外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。在編碼序列通常不含有信號(hào)肽編碼區(qū)的地方可能要求有外源信號(hào)肽。此外，外源信號(hào)肽可簡(jiǎn)單取代天然信號(hào)肽以獲得所要求異源多肽的加強(qiáng)分泌。外源信號(hào)肽編碼區(qū)可從下列基因中獲得，如來源于曲霉物種的淀粉酶或葡糖淀粉酶基因，來源于米黑根霉菌的脂肪酶或蛋白酶基因，及來源于釀酒酵母的α-因子基因，或小牛前凝乳酶原基因。真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽是米曲霉TAKA淀粉酶信號(hào)肽，黑曲霉中性淀粉酶信號(hào)肽，米黑根霉菌天冬氨酸蛋白酶信號(hào)肽，Humicola lanuginosus纖維素酶信號(hào)肽，或米黑根霉菌脂肪酶信號(hào)肽。然而，任何能使所選擇的真菌宿主中異源多肽分泌的信號(hào)肽均可用于本發(fā)明。
可將本發(fā)明的核酸序列連接到一種前肽編碼區(qū)。前肽是位于多肽原或酶原的氨基端的氨基酸序列。從多肽原上切割前肽則產(chǎn)生成熟的具生化活性的多肽。所形成的多肽稱為多肽原或酶原。多肽原一般是無活性的，但通過催化或自身催化從多肽原或酶原上切割前肽則能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓挠谢钚缘亩嚯摹Ｔ撉半木幋a區(qū)對(duì)異源多肽可以是天然的或由外源而獲得的。外源前肽編碼區(qū)可從釀酒酵母α-因子基因或Myceliophthora thermophila漆酶基因(WO95/33836)中獲得。
本領(lǐng)域技術(shù)人員均知道用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法(參見，例如，Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港，紐約，1989)。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重組真菌宿主細(xì)胞，在利用本發(fā)明的重組載體時(shí)優(yōu)選這些真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選利用包含本發(fā)明的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，接著載體整合到宿主染色體上。＂轉(zhuǎn)化作用＂指將包含至少有一個(gè)修飾隱蔽剪接位點(diǎn)的核酸序列的載體導(dǎo)入真菌宿主細(xì)胞中，使得載體以染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式存在。通常認(rèn)為整合有利于該核酸序列在細(xì)胞中更穩(wěn)定地保持。通過上述的同源或非同源重組可使載體整合到宿主染色體上。
真菌宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于編碼異源多肽的基因和它的來源。真菌宿主細(xì)胞可能是酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞。
本文中的＂酵母＂包括產(chǎn)子囊酵母(酵母目)，產(chǎn)擔(dān)孢子酵母，以及屬于半知菌綱(芽酵母屬)的酵母。產(chǎn)子囊酵母分為蝕精霉科和酵母科。后者包括四個(gè)亞科，即裂殖酵母亞科(例如，裂殖酵母屬)，拿遜酵母亞科，油脂酵母亞科，以及酵母亞科(例如畢赤酵母屬，克魯維酵母屬和酵母屬)。產(chǎn)擔(dān)孢子酵母包括白冬孢酵母屬，紅冬孢酵母屬，鎖擲酵母屬，線黑粉菌屬，和線黑粉菌類。屬于半知菌綱的酵母劃分成兩科。擲孢酵母科(例如，Sorobolomyces和布勒擲孢酵母屬)和隱球酵母科(例如，假絲酵母屬)。由于酵母分類在將來可能有變化，對(duì)于本發(fā)明目的，酵母定義按照酵母生物學(xué)和酵母活性中所描述的(Skinner.F.A.Passmore.S.M.和Davenport.R.R，編輯，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué)會(huì)專題研討系列第9期，1980)。在本領(lǐng)域大家熟知酵母生物學(xué)和酵母遺傳學(xué)操縱(參見，例如，酵母生化和遺傳學(xué)，Bacil.M.,Horecker.B.J.和Stopani,A.O.M.編輯，第2版，1987；酵母，Rose.A.H.和Harrison.J.S.編輯，第二版，1987；酵母分子生物學(xué)，Strathern等，編輯，1981)。
本文中的＂真菌＂包括phyla子囊菌亞門，擔(dān)子菌亞門，壺菌亞門和接合菌亞門(如Hawksworth等定義的，真菌的Ainsworth和Bisby’s字典，第8版，1995,CAB International，大學(xué)出版社，劍橋，英國(guó))及卵菌亞門(其引用于Hawksworth等，1995，如前，第171頁(yè))和所有的有絲分裂孢子的真菌(Hawksworth等，1995，如前)。子囊菌亞門代表組包括，例如，脈孢菌屬，正青霉屬(=薄膜革菌屬)，裸胞殼(=曲霉屬)，散囊菌屬(=曲霉屬)和上面列出的確切的酵母。擔(dān)子菌亞門的例子包括蘑菇，銹斑病菌，及黑穗病菌。壺菌亞門代表組包括，例如，異水霉屬，小芽枝霉屬，雕蝕菌屬，及水生真菌。卵菌亞門代表組包括，例如，水霉屬水生真菌(水霉菌)如綿霉屬。有絲分裂孢子真菌的例子包括曲霉屬，正青霉屬，假絲酵母屬和鏈格孢屬。接合菌亞門代表組包括，例如，根霉屬和毛霉屬。
＂絲狀真菌＂包括真菌亞門和卵菌亞門的所有的絲狀菌形式(如Hawkswarth等定義的，1995，如前)。所說的絲狀真菌的特點(diǎn)是其營(yíng)養(yǎng)菌絲體由下列物質(zhì)組成幾丁質(zhì)，纖維素，葡聚糖，脫乙酰殼多糖，甘露聚糖，和其它復(fù)合多糖。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲伸長(zhǎng)，碳分解代謝是專性好氧代謝。相反地，酵母(如釀酒酵母)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過萌發(fā)單細(xì)胞的菌體，碳分解代謝是發(fā)酵代謝。
在一個(gè)實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是，假絲酵母屬，克魯維酵母屬，酵母屬，裂殖酵母屬，畢赤酵母屬和Yarrowia物種的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞，卡爾酵母細(xì)胞，糖化酵母細(xì)胞，克魯弗酵母細(xì)胞，諾地酵母細(xì)胞，saccharamyces oviformis細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是下列物種的細(xì)胞(但不限于這些)頂孢霉屬，曲霉屬，鐮孢屬，腐質(zhì)霉屬，毀絲霉屬，毛霉屬，脈孢菌屬，正青霉屬，梭孢殼屬，中國(guó)彎勁霉屬，木霉屬。在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是曲霉屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是頂孢霉屬細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是鐮孢屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是腐質(zhì)霉屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是毀絲霉屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是毛霉屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是脈孢菌屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是正青霉屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是梭孢殼屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是中國(guó)彎勁霉屬細(xì)胞。在另一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。在最為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是米曲霉細(xì)胞，黑曲霉細(xì)胞，臭曲霉細(xì)胞或日本曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是尖鐮孢細(xì)胞或禾谷鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicola insolens細(xì)胞或Humicolalanuginosus細(xì)胞。在另一個(gè)最為優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Myceliophthora thermophila細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是米黑毛霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是粗糙脈孢菌細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是產(chǎn)紫青霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是青地梭孢殼霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，木霉屬細(xì)胞是綠色木霉細(xì)胞，Trichoderma longibrachiatum細(xì)胞，Trichodermaharzianum細(xì)胞，或康寧木霉細(xì)胞。
本發(fā)明的重組真菌宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含一段或多段編碼一種或多種因子的序列，這些因子利于異源多肽的表達(dá)，例如，激活劑(如反式作用因子)，伴性分子，和加工蛋白酶。將編碼一個(gè)或多個(gè)這些因子的核酸優(yōu)選地不有效地連接到編碼異源多肽的核酸上。激活劑是一種激活編碼多肽的核酸序列轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)(Kudla等，1990,EMBO雜志第9期1355-1364；Jarai和Buxton,1994，當(dāng)前遺傳學(xué)26:2238-244；Verdier,1990，酵母6:271-297)。編碼激活劑的核酸序列可由下列基因中獲得編碼釀酒酵母的血紅素激活蛋白1(hapl)的基因，編碼釀酒酵母的半乳糖代謝蛋白4(ga14)的基因，及編碼構(gòu)巢曲霉的氨調(diào)節(jié)蛋白(are4)的基因。另一些實(shí)施例，參見前面所說的Verdier,1990，和MacKenzie等，1993，普通微生物雜志139:2295-2307。伴性分子是一種輔助另一種多肽正確折疊的蛋白質(zhì)(Hartl等，1994,TIBS 19:20-25；Bergeron等，1994,TIBS 19:124-128；Demolder等，1994，生物技術(shù)雜志32:179-189；Craig,1993，科學(xué)260:1902-1903；Gething和Sambrook,1992，自然355:33-45；Puig和Gilbert,1994，生物化學(xué)雜志269:7764-7771；Wang和Tsou,1993,FASEB雜志7:1515-11157；Robinson等，1994，生物/技術(shù)1:381-384)。編碼伴性分子的核酸序列可從編碼下列物質(zhì)的基因中獲得，如米曲霉蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶，釀酒酵母鈣連接蛋白，釀酒酵母BiP/GRP78，和釀酒酵母Hsp70。另外的例子，參見Gething和Sambrook,1992，如前所述，和Hartl等，1994，如前所述。加工蛋白酶是一種能切割前肽以產(chǎn)生成熟具生化活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak,1994，酵母10:67-79；Fuller等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86:1434-1438；Julius等，1984，細(xì)胞37:1075-1089；Julius等，1983，細(xì)胞32:839-852)。編碼加工蛋白酶的核酸序列可從編碼下列物質(zhì)的基因中獲得黑曲霉Kex2，釀酒酵母二肽氨基肽酶，釀酒酵母Kex2，和Yarrowia lipolytica二堿基加工內(nèi)蛋白酶(xpr6)。任何在選用的真菌宿主細(xì)胞中有功能的因子都可用于本發(fā)明中。
真菌細(xì)胞可通過一種包括原生質(zhì)體形成，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法，用大家熟知的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。適于轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的方法在EP238023和Yelton等，1980，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)81:1470-1474中得以描述。適于轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的方法如Malardier等，基因78:117-156,1989，或共同未決的美國(guó)系列號(hào)08/269,449中所述。酵母轉(zhuǎn)化可利用下列刊物中所描述的方法Becker和Guarente,Abelson,J.N.和Simon,M.I.(編輯)，酵母遺傳學(xué)指南和分子生物學(xué)，酶學(xué)方法，第194卷，pp182-187，學(xué)院出版公司，紐約；Ito等，1983，細(xì)菌學(xué)雜志153:163；和Hinnen等，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)75:1920。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生異源多肽的方法，該方法包括在利于異源多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組真菌宿主細(xì)胞。利用本領(lǐng)域所熟知的方法，將本發(fā)明的真菌細(xì)胞培養(yǎng)在適于異源多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如，細(xì)胞可在合適的培養(yǎng)基中和適于異源多肽表達(dá)和/或分離條件下，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中通過搖瓶培養(yǎng)法，小規(guī)?；虼笠?guī)模的發(fā)酵法(包括連續(xù)，批量，分批加料或固態(tài)發(fā)酵)進(jìn)行培養(yǎng)。利用本領(lǐng)域所熟知的方法(參見，例如，Bennett,J.W.及LaSure,L.，編輯，真菌中的多基因操縱，學(xué)院出版社，CA,1991)，在含碳和氮源及無機(jī)鹽的合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由銷售商提供或按照公開的組成(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心的目錄)而制備。如果異源多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，可從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果異源多肽不被分泌，則從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中回收。
所表達(dá)的異源多肽可通過本領(lǐng)域所熟知的方法進(jìn)行檢測(cè)，該方法對(duì)特殊多肽是特異的。這些檢測(cè)方法可能包括特異性抗體的利用，酶產(chǎn)物的形成，或酶底物的消失。例如，如果異源多肽有酶促活性，可利用酶測(cè)定法。此外，如果對(duì)異源多肽有特異性的多克隆或單克隆抗體是可得到的，則利用多肽的抗體進(jìn)行免疫測(cè)定法。酶檢測(cè)和免疫檢測(cè)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
可以用本領(lǐng)域所熟知的方法回收所形成的異源多肽。例如，多肽可通過常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，這些方法包括(但不限于)離心，過濾，抽提，噴霧干燥，蒸發(fā)，或沉淀。然后所回收的多肽可通過多種層析法(例如，離子交換層析法，凝膠過濾層析法，親和柱層析法，或類似的層析法)進(jìn)行進(jìn)一步純化。
下列實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1寡核苷酸引物按照制造廠商的說明，利用應(yīng)用生物系統(tǒng)394型DNA/RNA合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)oster City,CA)合成下列寡核苷酸引物95-48 TGTCACTACTTTCTCTTATGG(SEQ ID NO:1)95-89 GTAATGGTTGTCTGGTAAAAG(SEQ ID NO:2)95-448TATCGGCCGCACCGGCCAAGATGAGTAAAGGAGAAGAACTT(SEQ ID NO:3)95-449ATACATGCATTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGT(SEQ ID NO:4)95-656 TGTTACAAACTCAAGAAGGAT(SEQ ID NO:5)95-1202 ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC(SEQ ID NO:6)95-1411AAGACTCGAGCCGAGGTCAAGTTCGAGGGCGATACCCTTTGTTAACCGCATCGAGCTCAAGGGCATTGACTTCAAGGAGGACGGC(SEQ ID NO:7)95-1412GCTTGTCGGCCATGATGTAGACGTTATGTGAGTTATAGTTGTACTCCATCTGTGGCCAAGAATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGT(SEQ ID NO:8)951413 CATCATGGCCGACAAGCCAAAGAACGGCATCAAGGTTAACTTCAAGATCCGCCACAACATTAAGGACGGCAGCGTTCAGCTCGC(SEQ ID NO:9)95-1414CGCCGATCGGAGTGTTCTGCTGATAATGGTCGGCGAGCTGAACGCTGCCG(SEQ ID NO:10)95-1415 AAGACTCGAGCCGAGGTCAAG(SEQ ID NO:11)95-1422 TCAAGCTTTATGTCCAAGGGCGAGGAGCTCTTCACTGGAGTTGTC(SEQ ID NO:12)95-1457 GATGCTCGAGTCTTGTAGTTCCCGTCATCTTTGTAAAA(SEQ IDNO:13)95-1458 GATGCGATCGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAA(SEQ IDNO:14)95-1464 TGAGAATTCGGATCCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC(SEQ IDNO:15)96-67TCCATTTAAATATGAGCAAGGGCGAGGAGCTCTTCACTGGAGTTGTC(SEQ ID NO:16)96-68 TTCCTTAATTAATTATTTGTATAGTTCATCCATGCC(SEQ ID NO:17)GFP2: TGGAATAAGCTTTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT(SEQ ID NO:18)GFP1: AAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCT(SEQ ID NO:19)
實(shí)施例2:DNA測(cè)序利用應(yīng)用生物系統(tǒng)373A型自動(dòng)DNA測(cè)序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)osterCity,CA)，在每條鏈上均使用Taq聚合酶循環(huán)-測(cè)序法，并采用熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(Giesecke等，1992，病毒學(xué)方法雜志38:47-60)和M13反向引物(-48)和M13(-20)正向引物(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)實(shí)，Beverly,MA)和被測(cè)序DNA所獨(dú)有的引物，從而測(cè)定核苷酸序列。
實(shí)施例3:Aequoren virtoria綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)分析利用Perkin-Elmer Cetus LS50B熒光計(jì)(Perkin-Elmer Corp.,Norwalk,CT)檢測(cè)GFP的產(chǎn)生。具體地說，將100微升的蛋白質(zhì)抽提物放置到位于Perkin-Eimer Cetus LS50B平板閱讀器中的96孔的微量滴定平板中。將提取物置于395nm的光下，讀取從400到600nm的發(fā)射光譜值。
利用Zeiss Axioplan顯微鏡(Carl Zeiss,Inc.,Thornwood,NY)和GFP過濾器裝置(色度技術(shù)公司，Brattleboro,VT)觀察菌絲體的GFP熒光。
實(shí)施例4表達(dá)載體pShTh34的構(gòu)建構(gòu)建絲狀真菌表達(dá)載體pShTh34以將GFP結(jié)構(gòu)基因置于TAKA淀粉酶啟動(dòng)子，信號(hào)序列和終止子的控制之下。
利用制造廠商推薦的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega,Madison,WI)，將總RNA(其是通過標(biāo)準(zhǔn)方法從Aequoria victoria中分離出的(Sambrook等，1989，如前))轉(zhuǎn)化成cDNA。然后利用根據(jù)以前發(fā)表的GFP序列(Prasher等，1992，基因111:229-233；基因庫(kù)登記入冊(cè)號(hào)M62653)所設(shè)計(jì)的PCR引物，和UITmaTM聚合酶(Perkin Elmer,Foster City,CA)通過PCR擴(kuò)增cDNA。引物的序列如前面SEQ IDNOS:18和19所示。
將限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)插入到引物的5’(HindⅢ位點(diǎn))和3’(EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn))，這有利于PCR擴(kuò)增的GFP cDNA克隆到微修飾的pUC19載體中。構(gòu)建詳情是LacZ Shine-Dalgarno AGGA，其后緊接著5’HindⅢ位點(diǎn)加上額外T和GFP ATG密碼子，在LacZ啟動(dòng)子GFP的融合點(diǎn)產(chǎn)生下列DAN序列PLacZ-AGGAAAGCTTTATG-GFP。在GFP cDNA的3’端，對(duì)應(yīng)于發(fā)表的GFP序列中的770核苷酸的堿基對(duì)通過PCR產(chǎn)生的BamHⅠ,EcoRⅠ連接區(qū)(如圖1所示)融合到pUC19多克隆位點(diǎn)(MCS)中的EcoRⅠ位點(diǎn)上。
利用pUC19-GFP作為模板，用實(shí)施例1中所描述的寡核苷酸引物95-448和95-449通過PCR擴(kuò)增GFP結(jié)構(gòu)基因。擴(kuò)增反應(yīng)包含下列組分各200微摩爾的dATP,dCTP,dGTP，及dTTP,50ng模板，各30皮摩爾引物，1×Taq聚合酶緩沖液，和0.5單位Taq聚合酶(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla,CA)。將反應(yīng)物按如下方案在Ericomp熱循環(huán)儀中溫育94℃下5分鐘循環(huán)一次；每次循環(huán)94℃1分鐘，60℃1分鐘，74℃1分鐘共30次循環(huán)；74℃下15分鐘循環(huán)一次。利用這些引物可將SfiⅠ限制性酶切位點(diǎn)添加在緊接ATG起始密碼子的上游，且將NsiⅠ位點(diǎn)添加在緊接GFP終止密碼子的下游。利用瓊脂糖電泳標(biāo)準(zhǔn)方法分離出該片段。將所形成的片段亞克隆到pMWR1以產(chǎn)生如圖2所示的pShTh34。
實(shí)施例5:pShTh34的絲狀真菌轉(zhuǎn)化將pShTh34與pPyrG(真菌遺傳儲(chǔ)藏中心，堪薩斯城，KS)共轉(zhuǎn)化進(jìn)米曲霉HoWB104pyrG原生質(zhì)體內(nèi)。以每ml2×107濃度的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將100μl的原生質(zhì)體與10μg的DNA置于冰上30分鐘。添加1ml的SPTC(40％PEG4000,0.8M山梨醇，0.05M Tris pH8.0,0.05MCaCl2)并將原生質(zhì)體在34℃下溫育20分鐘。將原生質(zhì)體直接鋪板在包含基本培養(yǎng)基的平板上(每升6g NaNO3,0.52g KCl,1.52g KH2PO4,1ml微量金屬溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4-7H2O,342.3g蔗糖和20g純凈瓊脂，pH為6.5)。微量金屬溶液(1000X)包括每升22gZnSO4-7H2O,11g H3BO3,5g MnCl2-4H2O,5g FeSO4-7H2O,1.6gCoCl2-5H2O,1.6g(NH4)6Mo7O24，及50g Na4EDTA。將平板在37℃下溫育5-7天。將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到含相同培養(yǎng)基但無蔗糖的平板上并在37℃下溫育3-5天。在相同的條件下，用同樣的平板通過劃線孢子與挑取分離的菌落來純化轉(zhuǎn)化體。所形成的轉(zhuǎn)化體被命名為米曲霉ShTh340。
實(shí)施例6:GFP抽提用實(shí)施例3所述的熒光分析法篩選出實(shí)施例5中所述米曲霉ShTh340轉(zhuǎn)化體中的能表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)化體。將10個(gè)米曲霉ShTh340-19轉(zhuǎn)化體在37℃下，12孔微量滴定平板中，在4ml MY51培養(yǎng)基中靜態(tài)培養(yǎng)1-5天，所說的培育基每升包含下列組分50g麥芽糖，2g MgSO4-7H2O,10g KH2PO4,2gK2SO4,2g枸櫞酸，10g酵母抽提物，0.5ml如實(shí)施例5中所述的微量金屬溶液，1g尿素，及2g(NH4)2SO4。收集菌絲團(tuán)，轉(zhuǎn)移到1.5ml微量離心管中，并置于干冰上5分鐘。然后將微量離心管放置在真空離心蒸發(fā)濃縮器(Savant儀器公司，F(xiàn)armingdale,NY)中，并在真空下室溫干燥過夜。利用無菌的柳葉刀在管中壓碎干燥的培養(yǎng)物。將壓碎的培養(yǎng)物懸浮在400微升pH為5.5的50mM磷酸鈉-0.5M NaCl中，其包含1mM PMSF和0.1mM的抑肽素。菌絲體碎片以MC12V型Sorvall微離心機(jī)(DuPont儀器公司，Newtown,CT)，在20分鐘全速下形成小球。將200微升的上清液轉(zhuǎn)移到一根新微量離心管中，并按照實(shí)施例3中所述的方法進(jìn)行測(cè)定。
沒有任何米曲霉ShTh340-19轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光。
實(shí)施例7:mRNA分析用Timberlake和Barnard方法(1981，細(xì)胞26:29-37)從實(shí)施例6所描述的米曲霉ShTh340-19轉(zhuǎn)化體中分離出總RNA。
利用3’Race試劑盒(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室，Gaithersburg,MD)，按照廠家說明書合成特異性GFP cDNA。用1微克來自所說轉(zhuǎn)化體的總RNA與3’UAP寡核苷酸引物和實(shí)施例1中所描述的特異性5’寡核苷酸引物95-1202一起反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)物含有下列組分各200微摩爾的dATP,dCTP,dGTP，和dTTP，每種引物各1皮摩爾，50ng模板，1×Taq聚合酶緩沖液，和0.5單位的Taq聚合酶。按如下程序?qū)⒎磻?yīng)物在Ericomp熱循環(huán)儀中溫育94℃5分鐘循環(huán)1次；94℃1分鐘，50℃1分鐘，和72℃1分鐘循環(huán)30次；74℃5分鐘循環(huán)1次。利用有義寡核苷酸引物95-1202或95-88與實(shí)施例1所描述的任何反義引物95-89或95-656，將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行嵌套式PCR擴(kuò)增。PCR條件如上述。利用TA克隆試劑盒，按照廠商說明將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pCRⅡ。然后通過利用QIAwell-8質(zhì)粒試劑盒(Quiagen,Chatsworth,CA)按照廠商說明從轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA，并按照實(shí)施例2所描述的方法測(cè)序質(zhì)粒插入片段篩選轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例8隱蔽內(nèi)含子的鑒定實(shí)施例7中所述的測(cè)序了的亞克隆分成三組，列在如下所示的表1中(圖3,SEQ ID NO.20)。第一組含有在GFP編碼序列內(nèi)的稱為片段A和片段D的兩個(gè)缺失。片段A以序列GTG始于核苷酸347(ATG核苷酸等于GFP編碼序列中的1,2,3)，并以序列AAG終止于核苷酸397；片段D以序列GTA始于核苷酸448，并以序列TAG終止于核苷酸503。第二組含有稱為片段B的單個(gè)缺失。片段B以序列GTA始于核苷酸380，并以序列CAG終止于核苷酸463。第三組含有稱為片段C的單個(gè)缺失。片段C以序列GTA始于核苷酸380，并以序列TAG終止于核苷酸503。這些缺失片段序列兩側(cè)是上面所列出的核苷酸，符合作為絲狀真菌內(nèi)含子(其具有所期望的共有5’和3’剪接位點(diǎn))被識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)，并且可能是由米曲霉中的GFP mRNA的錯(cuò)誤剪接下來的隱蔽內(nèi)含子。
表2隱蔽內(nèi)含子的分布內(nèi)含子 數(shù)量A和D 15B1C5D3實(shí)施例9:pShTh49表達(dá)載體的構(gòu)建為了在曲霉宿主中表達(dá)GFP基因，對(duì)所確定的推斷隱蔽剪接位點(diǎn)進(jìn)行修飾。構(gòu)建pShTh49(一種大腸桿菌表達(dá)載體)以包含正確的GFP基因。具體地說，利用實(shí)施例4所描述相同的條件及實(shí)施例1所描述的寡核苷酸引物95-1422和95-1457，擴(kuò)增來自pUC19-GFP的GFP基因的5’端。利用這些引物將XhoⅠ位點(diǎn)323bp導(dǎo)入在ATG起始密碼子下游。利用瓊脂糖電泳標(biāo)準(zhǔn)方法分離出該片段，然后利用TA克隆試劑盒(InvitrogenCorp.,La Jolla,CA)按照廠商的說明將其亞克隆進(jìn)pCRⅡ以產(chǎn)生pShTh46。利用與實(shí)施例4相同的條件及實(shí)施例1所描述的寡核苷酸引物95-1464和95-1458，擴(kuò)增來自pUC19-GFP的GFP基因的3’端以將PvuⅠ位點(diǎn)191bp導(dǎo)入在終止密碼子的上游。然后利用TA克隆試劑盒按照廠商的說明將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pCRⅡ以產(chǎn)生pShTh47。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)394型DNA/RNA合成儀，按照制造廠商的說明(應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster City,CA)，并利用曲霉的密碼子用法圖表(參見表Ⅰ，如前)合成GFP余下的內(nèi)部編碼序列(用于構(gòu)建需要的堿基323至565)。合成出三段84個(gè)堿基的寡核苷酸片段和一段50個(gè)堿基的寡核苷酸片段(95-1411,95-1412,95-1413,95-1414)，并使其共同退火，用T4 DNA聚合酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)形成雙鏈。利用與實(shí)施例4所述的相同條件及實(shí)施例1所描述的寡核苷酸引物95-1414和95-1415，通過PCR擴(kuò)增所形成的片段。利用瓊脂糖電泳標(biāo)準(zhǔn)方法分離出所擴(kuò)增的片段，然后利用TA克隆試劑盒且按照廠商的說明將其克隆進(jìn)pCRⅡ以產(chǎn)生pShTh45。裝配來自pShTh45,pShTh46和pShTh47的GFP片段，并將合成的GFP等位基因(gfp49)導(dǎo)入進(jìn)pUC19衍生物(其包含LacZShine-Delgarno序列，接著為HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn))以產(chǎn)生pShTh49(圖4)。
因而，在所確定的隱蔽內(nèi)含子中所觀察的5’和3’剪接位點(diǎn)每一個(gè)均發(fā)生了變化。此外，在設(shè)計(jì)的片段的全長(zhǎng)中，只要可能位于密碼子擺動(dòng)位置G+C含量就增加?？偟膩碚f，基因的G+C含量從38.5％增至44.5％(在合成性設(shè)計(jì)的片段中，由33.3％增至51％)。
實(shí)施例10:pShTh49的轉(zhuǎn)化按照廠商的說明將pShTh49轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α(Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室，Gaithersburg,MD)，并在如實(shí)施例3所描述的熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化體。將轉(zhuǎn)化體于37℃在5ml Luria-Bertani培養(yǎng)基中(補(bǔ)充了異丙基-β-D-巰基吡喃半乳糖苷(IPTG))搖動(dòng)培養(yǎng)。14小時(shí)后，用IPTG誘導(dǎo)gfp49，如實(shí)施例5所述用Zeiss熒光顯微鏡觀察到熒光大腸桿菌，這表明gfp49是一種功能性蛋白，其在與真正GFP相同的條件下能發(fā)熒光。
實(shí)施例11表達(dá)載體pShTh58.1的構(gòu)建首先，通過利用實(shí)施例4所描述相同的條件及實(shí)施例1所描述的寡核苷酸引物96-67和96-68擴(kuò)增來自pShTh49的片段從而構(gòu)建pShTh58.1(一種絲狀真菌表達(dá)載體)。該片段是利用瓊脂糖電泳標(biāo)準(zhǔn)方法而分離的。所形成的GFP編碼片段分別在5’和3’端含有單一SwaⅠ和PacⅠ限制性酶切位點(diǎn)。然后用SwaⅠ和PacⅠ消化這一片段，用瓊脂糖電泳標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離，并連接到pBANe13載體DNA中以產(chǎn)生pShTh58.1(圖5)。
實(shí)施例12:pShTh58.1的轉(zhuǎn)化利用與實(shí)施例5相同的方案，將pShTh58.1轉(zhuǎn)化到米曲霉HowB425中。所形成的轉(zhuǎn)化體被命名為ShTh581菌株。
實(shí)施例13:gfp49的表達(dá)如實(shí)施例6所述，將五個(gè)ShTh581轉(zhuǎn)化體在含MY51培養(yǎng)基的微量滴定板中進(jìn)行培育，以誘導(dǎo)出用于GFP生產(chǎn)的TATA啟動(dòng)子。在3天和4天時(shí)收集菌絲體。然后如實(shí)施例4所述分離來自這些菌絲體的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，并如實(shí)施例3所述分析GFP的存在情況。其中5個(gè)檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中的4個(gè)在以395nm的光激發(fā)時(shí)發(fā)光值出現(xiàn)高峰，其對(duì)應(yīng)于在509nm時(shí)GFP的發(fā)光峰值(圖6)。這些結(jié)果表明gfp49的mRNA的校正導(dǎo)致在米曲霉(其可產(chǎn)生發(fā)熒光的GFP)中GFP的正確表達(dá)。
實(shí)施例14表達(dá)載體pShTh58.2的構(gòu)建通過用Morph誘變?cè)噭┖?5-引物3-引物，Boulder,CO)處理pShTh58.1從而構(gòu)建真菌表達(dá)載體pShTh58.2。按照廠商的說明，將引物96-83與14ng的pShTh58.1相混合以產(chǎn)生pShTh58.2(其產(chǎn)生W57C突變(圖7))。
實(shí)施例15:gfp58.2的表達(dá)如實(shí)施例4所述，將一個(gè)ShTh582轉(zhuǎn)化體在含MY51培養(yǎng)基的微量滴定板中進(jìn)行培育。在3天和4天時(shí)收集菌絲體。然后如實(shí)施例4所述分離來自這些菌絲體的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，并如實(shí)施例6所述分析GFP的存在情況。發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化體能產(chǎn)生一種物質(zhì)，該物質(zhì)在以395nm的光激發(fā)時(shí)在509nm處發(fā)出高峰熒光，其對(duì)應(yīng)于GFP的發(fā)光峰值(圖8)。這些結(jié)果表明gfp49的mRNA的校正導(dǎo)致在米曲霉(其可產(chǎn)生發(fā)熒光的GFP)中GFP的正確表達(dá)。
實(shí)施例16:GFP轉(zhuǎn)化體的Southern分析將轉(zhuǎn)化體ShTh582.1的孢子(GFP具有隱蔽內(nèi)含子和GC含量變化)和ShTh581.1(GFP具有隱蔽內(nèi)含子和GC含量變化及W57C突變)以及作為對(duì)照的ShTh590.1(野生型GFP)和BANe130.1(pBANe13無GFP)在YEG培養(yǎng)基中37℃下過夜培養(yǎng)。用MiFacloth過濾菌絲體，并用蒸餾水漂洗三次。排掉多余的水。用液氮凍結(jié)菌絲體并利用研缽與研杵研磨成粉末。用Purgene DNA分離試劑盒(Gentra系統(tǒng)公司。研究TrianglePark,NC)分離基因組DNA。
用PmeⅠ消化兩微克取自每個(gè)樣品的基因組DNA，并在1％瓊脂糖上通過長(zhǎng)度進(jìn)行分級(jí)分離。在每一個(gè)步驟，使凝膠變性，中和，浸泡在20X SSC中10分鐘。利用Schleicher和Schuell TurboBlotter將消化的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上3小時(shí)，UV層聯(lián)DNA。利用BoehringerMannheim特征系統(tǒng)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)探測(cè)膜。在42℃下，用Easy Hyb(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)與膜進(jìn)行預(yù)雜交1小時(shí)。利用pShTh58.2DNA，寡核苷酸96-67和96-68，及Boehringer Mannheim Dig DNA標(biāo)記混合物(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)使GFP探針進(jìn)行DIG標(biāo)記。在它變性后，定量探針并加入1ng/ml。然后探測(cè)膜過夜。倒掉探針，室溫下用2XSSC-0.1％SDS洗脫膜兩次(每次5分鐘)，并在65℃下用0.1XSSC-0.1％SDS洗脫膜兩次(每次15分鐘)。通過下列Boehringer Mannheim提供的方案，并利用Lumi-Phos 530(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)檢測(cè)Dig-標(biāo)記的核苷酸。將這些膜置于膠片下20分鐘。
這些結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化體ShTh582.1,ShTh581.1，和ShTh590.1中觀察到了GFP帶，而在BANe130.1轉(zhuǎn)化體中沒有觀察到GFP帶。
微生物的保藏按照布達(dá)佩斯條約，以下菌株已經(jīng)保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)，北方區(qū)域研究實(shí)驗(yàn)室，1815學(xué)院街，Peoria，伊利諾州61604，美國(guó)。
菌株 保藏號(hào) 保藏日期大腸桿菌DH5αpShTh58.2NRRL B-215841996年6月6日該菌株已在以下前提下保藏，即在本專利申請(qǐng)的未決期間，該培養(yǎng)物對(duì)于由專利商標(biāo)委員會(huì)按照37C.F.R§1.14和35U.S.C.§122確定的有資格的人來說是可以獲得的。該保藏物代表每一種所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在主題申請(qǐng)的相應(yīng)申請(qǐng)或其后續(xù)申請(qǐng)?jiān)谕鈬?guó)提出，外國(guó)專利法要求保藏時(shí)，該保藏物也是可獲得的。然而，應(yīng)該清楚保藏物的可獲得性并不構(gòu)成對(duì)破壞政府授予的專利權(quán)的主題發(fā)明的實(shí)施許可。
由于這些實(shí)施方案旨在說明本發(fā)明的幾個(gè)方面，因而本文所描述和要求的本發(fā)明其范圍并不受本文所揭示的具體實(shí)施方案限制。本發(fā)明的范圍包括任何等同的實(shí)施方案。確實(shí)，通過先前的描述，除了本文所描述和顯示的那些實(shí)施例之外，本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這樣的修改也包括在附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本文引用了各種參考文獻(xiàn)，它們公開的內(nèi)容本文以其整體一并參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱Novo Nordisk Biotech公司(B)街道1445 Drew路(C)城市Davis(D)州加利福尼亞(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵區(qū)代碼95616-4880(G)電話(916)757-8100(H)傳真(916)758-0317(ⅱ)發(fā)明名稱真菌表達(dá)的異源基因中隱蔽剪接位點(diǎn)的修飾方法(ⅲ)序列數(shù)20(ⅳ)通訊地址(A)收信人北美Novo Nordisk公司(B)街道405 Lexington街，第64層(C)城市紐約(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵區(qū)代碼10174-6401(Ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(Ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)的資料(A)申請(qǐng)?zhí)柎付?B)申請(qǐng)日1997年6月20日(C)分類號(hào)
(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名Agris Dr.,Cheryl H.
(B)登記號(hào)34,086(C)參考/證書號(hào)4855.204-WO(ⅸ)電訊信息(A)電話212-867-0123(B)傳真212-878-9655(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.1:TGTCACTACT TTCTCTTATG G 21(2)SEQ ID NO.2信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.2:GTAATGGTTG TCTGGTAAAA G 21(2)SEQ ID NO.3信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TATCGGCCGC ACCGGCCAAG ATGAGTAAAG GAGAAGAACT T 41(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:ATACATGCAT TTATTTGTAT AGTTCATCCA TGCCATGTGT 40(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TGTTACAAAC TCAAGAAGGA T 21(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTC24(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度85個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:AAGACTCGAG CCGAGGTCAA GTTCGAGGGC GATACCCTTT GTTAACCGCA TCGAGCTCAA60GGGCATTGAC TTCAAGGAGG ACGGC 85(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度83個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GCTTGTCGGC CATGATGTAG ACGTTATGTG AGTTATAGTT GTACTCCATC TGTGGCCAAG60AATGTTGCCG TCCTCCTTGA AGT83(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度84個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:CATCATGGCC GACAAGCCAA AGAACGGCAT CAAGGTTAAC TTCAAGATCC GCCACAACAT 60TAAGGACGGC AGCGTTCAGC TCGC84(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(4)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅲ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:CGCCGATCGG AGTGTTCTGC TGATAATGGT CGGCGAGCTG AACGCTGCCG50(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:AAGACTCGAG CCGAGGTCAA G 21(2)SEQ ID NO:12信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:TCAAGCTTTA TGTCCAAGGG CGAGGAGCTC TTCACTGGAG TTGTC 45(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GATGCTCGAG TCTTGTAGTT CCCGTCATCT TTGTAAAA38(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅲ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GATGCGATCG GCGATGGCCC TGTCCTTTTA CCAGACAA 38(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:TGAGAATTCG GATCCTTATT TGTATAGTTC ATCCATGCC 39(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度47個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:TCCATTTAAA TATGAGCAAG GGCGAGGAGC TCTTCACTGG AGTTGTC 47AGTTGTC 47(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:TTCCTTAATT AATTATTTGT ATAGTTCATC CATGCC 36(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:TGGAATAAGC TTTATGAGTA AAGGAGAAGA ACTTTT 36(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:AAGAATTCGG ATCCCTTTAG TGTCAATTGG AAGTCT 36(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度751個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCACTGGA GTTGTCCCAA TTCTTGTTGA ATTAGATGGC 60GATGTTAATG GGCAAAAATT CTCTGTTAGT GGAGAGGGTG AAGGTGATGC AACATACGGA120AAACTTACCC TTAAATTTAT TTGCACTACT GGGAAGCTAC CTGTTCCATG GCCAACGCTT180GTCACTACTT TCTCTTATGG TGTTCAATGC TTTTCAAGAT ACCCAGATCA TATGAAACAG240CATGACTTTT TCAAGAGTGC CATGCCCGAA GGTTATGTAC AGGAAAGAAC TATATTTTAC300AAAGATGACG GGAACTACAA GACACGTGCT GAAGTCAAGT TTGAAGGTGA TACCCTTGTT360AATAGAATCG AGTTAAAAGG TATTGATTTT AAAGAAGATG GAAACATTCT TGGACACAAA420ATGGAATACA ACTATAACTC ACATAATGTA TACATCATGG CAGACAAACC AAAGAATGGC480ATCAAAGTTA ACTTCAAAAT TAGACACAAC ATTAAAGATG GAAGCGTTCA ATTAGCAGAC540CATTATCAAC AAAATACTCC AATTGGCGAT GGCCCTGTCC TTTTACCAGA CAACCATTAC600CTGTCCACGC AATCTGCCCT TTCCAAAGAT CCCAACGAAA AGAGAGATCA CATGATCCTT660CTTGAGTTTG TAACAGCTGC TGGGATTACA CATGGCATGG ATGAACTATA CAAATAAATG720TCCAGACTTC CAATTGACAC TAAAGGGATC C 75權(quán)利要求
1．一種用于獲得重組真菌宿主細(xì)胞的方法，所說的方法包括將編碼異源多肽的核酸序列導(dǎo)入到真菌宿主細(xì)胞內(nèi)，其中在核酸序列中至少有一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)被修飾。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)通過非-共有序列取代至少一個(gè)隱蔽共有序列來修飾。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中隱蔽共有序列是5’隱蔽共有序列。
4．按照權(quán)利要求3的方法，其中5’隱蔽共有序列是GT,GC，或CT。
5．按照權(quán)利要求4的方法，其中5’隱蔽共有序列是GTANGT,GCANGT，或CTANGT，其中N是A,C,G，或T。
6．按照權(quán)利要求2的方法，其中隱蔽共有序列是3’隱蔽共有序列。
7．按照權(quán)利要求6的方法，其中3’隱蔽共有序列是AG。
8．按照權(quán)利要求6的方法，其中3’隱蔽共有序列是CAG,TAG，或AAG。
9．按照權(quán)利要求1的方法，其中由真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生的異源多肽的氨基酸序列是野生型多肽。
10．按照權(quán)利要求1的方法，其中通過用具有在約40％到約70％范圍內(nèi)的G+C百分含量的第二區(qū)取代包含至少一個(gè)隱蔽內(nèi)含子或其部分的第一區(qū)來修飾至少一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)。
11．按照權(quán)利要求10的方法，其中G+C百分含量為約40％到約60％之間。
12．按照權(quán)利要求11的方法，其中G+C百分含量為約40％到約50％之間。
13．按照權(quán)利要求10的方法，其中至少兩個(gè)隱蔽內(nèi)含子或其部分被取代。
14．按照權(quán)利要求1的方法，其中通過用非-共有序列取代核酸序列中的至少一個(gè)隱蔽共有序列和通過用具有在約40％到約70％范圍內(nèi)的G+C百分含量的第二區(qū)取代包含至少一個(gè)隱蔽內(nèi)含子或其部分的第一區(qū)來修飾至少一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)。
15．按照權(quán)利要求1的方法，其中至少兩個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)被修飾。
16．按照權(quán)利要求1的方法，其中由真菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生的異源多肽與對(duì)應(yīng)的野生型多肽含有相同數(shù)量的氨基酸殘基。
17．按照權(quán)利要求1的方法，其中非-共有序列與共有序列具有相同數(shù)量的核苷酸。
18．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的核酸序列編碼激素，酶，受體，或報(bào)道分子。
19．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的核酸序列編碼酶。
20．按照權(quán)利要求18的方法，其中所說的酶是氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶，或連接酶。
21．按照權(quán)利要求19的方法，其中酶選自氨肽酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶；過氧化氫酶，纖維素酶，幾丁質(zhì)酶，角質(zhì)酶，DNA酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷，鹵過氧化物酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，鹵斑葡聚糖酶酶，氧化酶，果膠分解酶，過氧化物酶，肌醇六磷酸酶，多酚氧化酶，蛋白水解酶，核糖核酸酶，及木聚糖酶。
22．按照權(quán)利要求18的方法，其中核酸序列編碼報(bào)道分子。
23．按照權(quán)利要求22的方法，其中報(bào)道分子是Aequorea victoria綠色熒光蛋白質(zhì)。
24．按照權(quán)利要求1的方法，其中真菌細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。
25．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是頂孢霉屬，曲霉屬，鐮孢屬，腐質(zhì)霉屬，毀絲霉屬，脈孢菌屬，青霉屬，梭孢殼屬，中國(guó)彎勁霉，或木霉屬的某個(gè)種的細(xì)胞。
26．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是曲霉屬細(xì)胞。
27．按照權(quán)利要求26的方法，其中曲霉屬細(xì)胞是米曲霉細(xì)胞，黑曲霉細(xì)胞，臭曲霉細(xì)胞，或日本曲霉細(xì)胞。
28．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是鐮孢屬細(xì)胞。
29．按照權(quán)利要求28的方法，其中鐮孢屬細(xì)胞是尖鐮孢細(xì)胞或禾谷鐮孢細(xì)胞。
30．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是腐質(zhì)霉屬細(xì)胞。
31．按照權(quán)利要求30的方法，其中腐質(zhì)霉屬細(xì)胞是Humicolainsolens細(xì)胞或Humicola lanuginosus細(xì)胞。
32．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是毀絲霉屬細(xì)胞。
33．按照權(quán)利要求32的方法，其中毀絲霉屬細(xì)胞是Myceliophthorathermophila細(xì)胞。
34．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是毛霉屬細(xì)胞。
35．按照權(quán)利要求34的方法，其中毛霉屬細(xì)胞是米黑毛霉細(xì)胞。
36．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是鏈孢霉屬細(xì)胞。
37．按照權(quán)利要求36的方法，其中鏈孢霉屬細(xì)胞是粗糙脈孢菌細(xì)胞。
38．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是青霉屬細(xì)胞。
39．按照權(quán)利要求38的方法，其中青霉屬細(xì)胞是產(chǎn)紫青霉細(xì)胞。
40．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是梭孢殼屬細(xì)胞。
41．按照權(quán)利要求40的方法，其中梭孢殼屬細(xì)胞是Thielaviaterrestris細(xì)胞。
42．按照權(quán)利要求24的方法，其中絲狀真菌細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞。
43．按照權(quán)利要求42的方法，其中木霉屬細(xì)胞是Trichoderma reesei細(xì)胞，綠色木霉細(xì)胞，Trichoderma longibrachiatum細(xì)胞，Trichoderma harzianum細(xì)胞，或康寧木霉細(xì)胞。
44．按照權(quán)利要求1的方法，其中真菌細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
45．按照權(quán)利要求44的方法，其中酵母細(xì)胞是念珠菌屬，克魯維酵母屬，酵母屬，裂殖酵母屬，畢赤酵母屬，或Yarrowia中某個(gè)種的細(xì)胞。
46．按照權(quán)利要求45的方法，其中酵母細(xì)胞是酵母屬細(xì)胞。
47．按照權(quán)利要求46的方法，其中酵母屬細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞，卡爾酵母細(xì)胞，糖化酵母細(xì)胞，Saccharomyces douglasii細(xì)胞，克魯弗酵母細(xì)胞，諾地酵母細(xì)胞，或Saccharomyces oviformis細(xì)胞。
48．按照權(quán)利要求45的方法，其中酵母細(xì)胞是克魯維酵母細(xì)胞。
49．按照權(quán)利要求48的方法，其中克魯維酵母細(xì)胞是乳酸克魯維酵母細(xì)胞。
50．按照權(quán)利要求45的方法，其中酵母細(xì)胞是Yarrowia細(xì)胞。
51．按照權(quán)利要求50的方法，其中Yarrowia細(xì)胞是Yarrowialipolytica細(xì)胞。
52．一種用于修飾來源于在真菌宿主細(xì)胞中異源表達(dá)的分離的核酸序列的至少一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)的方法，所說的方法包括用非-共有序列取代核酸序列中的隱蔽共有序列和/或通過用具有在約40％到約70％范圍內(nèi)的G+C百分含量的第二區(qū)取代包含至少一個(gè)隱蔽內(nèi)含子或其部分的第一區(qū)來修飾至少一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)。
53．一種按照權(quán)利要求53的方法獲得的分離的核酸序列。
54．一種包含權(quán)利要求53的核酸序列的核酸構(gòu)建體。
55．一種包含權(quán)利要求54的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
56．按照權(quán)利要求55的載體，其中核酸序列有效地與啟動(dòng)子序列相連接。
57．按照權(quán)利要求55的載體，其中核酸序列有效地與轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)相連接。
58．按照權(quán)利要求55的載體，其還包括選擇性標(biāo)記。
59．一種包含權(quán)利要求54的核酸構(gòu)建體的重組真菌宿主細(xì)胞。
60．一種按照權(quán)利要求1的方法獲得的重組真菌宿主細(xì)胞。
61．一種用于在真菌宿主細(xì)胞內(nèi)異源產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求59的真菌細(xì)胞，并且從培養(yǎng)基中回收多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于獲得包含編碼異源多肽的核酸序列的真菌宿主細(xì)胞的方法,其中在核酸序列中至少有一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)被修飾。本發(fā)明也涉及具有一個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)的核酸序列和包含所說的核酸序列的核酸構(gòu)建體,載體,以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于重組制備所說的核酸序列編碼的多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1223691SQ97195895
公開日1999年7月21日 申請(qǐng)日期1997年6月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月20日
發(fā)明者S·A·索姆普森 申請(qǐng)人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司