專利名稱：多肽的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在基因改造酵母細(xì)胞中生產(chǎn)短鏈多肽的一種新方法，這些多肽鏈包括具有多達(dá)三個(gè)二硫鍵并且/或者具有富含堿性氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)的多肽，以及具有開(kāi)放結(jié)構(gòu)的短鏈多肽，例如胰高血糖素、胰高血糖素樣肽和它們的功能類似物，所述基因改造酵母細(xì)胞，和制備所說(shuō)酵母細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
對(duì)于許多種類的多肽，例如胰高血糖素、胰高血糖素樣肽和它們的功能類似物來(lái)說(shuō)，用包含編碼所說(shuō)蛋白質(zhì)之DNA序列的合適表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，已在酵母中成功地對(duì)這些異源蛋白質(zhì)進(jìn)行了表達(dá)。由于其穩(wěn)定的產(chǎn)量和安全性，優(yōu)選酵母特別是釀酒酵母作為生產(chǎn)具有藥用價(jià)值之多肽的宿主微生物。
但是，人們常發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物是具有不同氨基酸鏈長(zhǎng)的各種目的多肽前體的異源混合物。許多可被pep4基因產(chǎn)物激活的蛋白酶導(dǎo)致了酵母蛋白質(zhì)的降解。常利用諸如pep4-3突變之類在PEP4基因上的突變減少細(xì)胞的蛋白酶解作用以使我們感興趣的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量都可得到提高。EP341215描述了將缺少羧肽酶yscα活性的酵母菌株用于異源蛋白水蛭素的表達(dá)中。由于內(nèi)源性酵母蛋白酶對(duì)初始表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后作用，野生型酵母菌株產(chǎn)生了在C末端序列各不相同的各種脫硫水蛭素(desulphatohirudin)的混合物。而缺乏羧肽酶yscα活性的酵母突變菌株不能從異源蛋白質(zhì)的C末端除去氨基酸，因此產(chǎn)生的是完整蛋白質(zhì)。
利用缺乏蛋白酶A、B、Y和/或S活性的酵母菌株只能部分地降低外源基因產(chǎn)物的隨機(jī)蛋白酶解。
在酵母中表達(dá)異源蛋白質(zhì)所遇到的另一問(wèn)題是產(chǎn)率低，這可能是由于在蛋白質(zhì)內(nèi)部位點(diǎn)的異常加工引起了胞內(nèi)區(qū)室內(nèi)和質(zhì)膜上的蛋白酶解加工，例如，人甲狀旁腺素的分泌(Gabrielsen等，基因，90:255-262,1990；Rokkones等，生物技術(shù)雜志，33:293-306,1994)，以及釀酒酵母中β-內(nèi)啡肽的分泌(Bitter等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，81:5330-5334,1984)。有的多肽，如具有大約10-55個(gè)氨基酸或更短鏈，并且沒(méi)有二硫鍵或有一些二硫鍵，而且/或者富含堿性氨基酸的多肽，如β-內(nèi)啡肽、胰高血糖素和胰高血糖素樣肽，當(dāng)在異源宿主中表達(dá)時(shí)，由于它們具有短鏈開(kāi)放并且不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因而可能對(duì)胞內(nèi)、胞外的蛋白酶解降解特別敏感，從而產(chǎn)生不均一的產(chǎn)物。
WO95/23857公開(kāi)了重組型人白蛋白(rHA)在酵母細(xì)胞中的生產(chǎn)，該蛋白質(zhì)是一種非常大的載體型蛋白質(zhì)，通過(guò)17個(gè)二硫鍵交聯(lián)，分子量約66KD，所述酵母細(xì)胞中酵母天冬氨酰蛋白酶(Yap3p)的蛋白酶解活性水平有所降低，而使不需要的45kD rHA片段的水平有所降低，并且與相應(yīng)的單倍體YAP3野生型酵母株中產(chǎn)生的rHA相比，單倍體Δyap3酵母株產(chǎn)生的回收rHA的產(chǎn)率提高了30-50％。
在此之前，Bourbonnais等人(Biochimie 76:226-233,1994)已指出盡管YAP3蛋白酶基因產(chǎn)物與Kex2p的底物專一性有重疊，但其在體外有獨(dú)特的底物專一性，他們還指出Yap3p專一地切割促生長(zhǎng)素抑制素原(prosomatostatin)中潛在加工位點(diǎn)處存在的精氨酸C-末端。此外，Cawley等人(生物化學(xué)雜志，271:4168-4176,1996)已測(cè)定了Yap3p在許多激素原底物如牛胰島素原中切割單一或成對(duì)堿性殘基加工位點(diǎn)的體外專一性及相對(duì)效率。
本發(fā)明的目的是提供一種在酵母表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)分泌多肽的改進(jìn)方法，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)約55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0到3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。優(yōu)選的多肽例子是胰高血糖素和胰高血糖素樣肽、CRF以及截短的和/或C末端或N末端截短的和/或N末端延伸形式的可卡因苯異丙胺調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄物(cocaine amphetamine regulated transcript,CART)。更可取的是，本發(fā)明多肽的產(chǎn)量有相當(dāng)大的提高，例如與常規(guī)酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，所說(shuō)多肽的產(chǎn)量高兩倍以上。
在二倍體酵母培養(yǎng)物中生產(chǎn)異源多肽常常是有利的，這是因?yàn)樵趩伪扼w酵母培養(yǎng)物例如生產(chǎn)規(guī)模的連續(xù)發(fā)酵物中某些遺傳缺損可能會(huì)在表型上表現(xiàn)出來(lái)，另一個(gè)原因是二倍體中多肽產(chǎn)量可能比單倍體中要高一些(Fu等人，生物技術(shù)進(jìn)展，12:145-148,1996；Mead等人，生物技術(shù)信件(Biotechnol.Letters),8:391-396,1986)。
使用本發(fā)明方法生產(chǎn)符合上述標(biāo)準(zhǔn)的其它多肽對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，這些多肽包括諸如胰島素和胰島素類似物、促腎上腺皮質(zhì)激素、血管緊張肽原、心房肽、強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽、galanin、胃泌素、胃泌素釋放肽、神經(jīng)肽Y片段、胰抑制素、胰多肽、促胰液素、血管活性腸肽、生長(zhǎng)激素釋放因子、促黑素細(xì)胞激素、神經(jīng)降壓素、腎上腺肽、甲狀旁腺激素和相關(guān)肽、促生長(zhǎng)素抑制素及相關(guān)肽、腦鈉尿肽、降鈣素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)(參看本文SEQ ID NO:3)、胸腺素和硬骨魚(yú)緊張肽；還有這些肽和其它多肽的同源或其它方面的相關(guān)肽以及片段(如EEID-CART55-102，參看本文SEQ ID NO:2)，只要符合一定的標(biāo)準(zhǔn)，即該多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。
發(fā)明概述可利用本發(fā)明的方案達(dá)到上述確定的目的，該方法包括培養(yǎng)酵母，所述酵母中Yap3蛋白酶(Yap3p)或其同系物的活性有所降低，該酵母已被含有與編碼一種多肽之DNA序列可操作性地相連的酵母啟動(dòng)子的雜合載體所轉(zhuǎn)化，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵，例如胰高血糖素或胰高血糖素樣肽；以及分離所述多肽。更可取的是，該酵母細(xì)胞通過(guò)YAP3基因的破壞而缺乏Yap3p活性。
利用已破壞YAP3的酵母株生產(chǎn)多肽可導(dǎo)致其產(chǎn)率比相應(yīng)的YAP3野生型酵母株明顯提高約達(dá)2倍，甚至可達(dá)10倍，所述多肽在多肽鏈中具有1-70個(gè)氨基酸，優(yōu)選1-40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選10-30個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有不超過(guò)一個(gè)二硫鍵，例如由胰高血糖素前體基因編碼的多肽，包括胰高血糖素、GRPP、GLP-1、GLP-2和它們的功能類似物。已發(fā)現(xiàn)用已破壞YAP3的酵母株生產(chǎn)異源多肽可使該異源多肽產(chǎn)率比利用相應(yīng)的YAP3野生型酵母株獲得的產(chǎn)率明顯提高約達(dá)2倍，甚至可達(dá)10倍，所述異源多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。這種多肽的例子有由胰高血糖素前體基因編碼的多肽，包括胰高血糖素、GRPP、GLP-1、GLP-2和它們的功能類似物，或CRF，如本文中SEQ ID NO:3所示，或CART截短的和/或N-末端延伸的形式，優(yōu)選本文SEQ ID NO:2所示的EEID-CART55- 102。利用本發(fā)明方法生產(chǎn)異源多肽的另一有利之處是，由于降低了蛋白酶解的降解水平，因而分泌產(chǎn)物的均一性得到了提高。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明方法中利用已破壞YAP3的二倍體酵母可大大提高分泌型異源多肽產(chǎn)量水平，與相應(yīng)的野生型單倍體酵母的產(chǎn)率水平相比提高約2倍，甚至可達(dá)9倍。
適宜地，此酵母是缺乏功能性YAP3基因的釀酒酵母。然而，其它酵母屬也可能含有等效的蛋白酶，即Yap3p同系物，如WO95/23857和Clerc等(色譜學(xué)雜志，B.662:245-259,1994)中所示的畢赤酵母屬和克魯維酵母屬。通常說(shuō)來(lái)，如果一個(gè)基因的翻譯產(chǎn)物序列與Yap3p有50％以上相同，則該基因就被認(rèn)為是Yap3p的同系物。Komano和Fuller(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，92:10752-10756,1995)已從釀酒酵母中鑒定出了Mkc7天冬氨酰蛋白酶，該蛋白酶與Yap3p比較相近(53％相同)。酵母的其它天冬氨酰蛋白酶包括PEP4、BAR1的基因產(chǎn)物，序列與YAP3開(kāi)放閱讀框架部分同源的開(kāi)放閱讀框架的基因產(chǎn)物，例如YAP3-link(由GenBank acc.NO.X89514位置25352-26878所編碼)、YIV9(Swiss Prot acc.NO.P40583)和天冬氨酰蛋白酶(Ⅳ)(由GenBank acc.NO.U28372位置326-2116所編碼)。按照最近接受的酵母基因組命名，在此提到的酵母基因名稱YAP3、YAP3 link、YIV9、NO4和MKC7分別對(duì)應(yīng)于酵母的開(kāi)放閱讀框架YLR120C、YLR121C、YIR039C、YDR349C和YDR144C。此外，開(kāi)放閱讀框架YGL259W的基因產(chǎn)物也包括在酵母天冬氨酰蛋白酶內(nèi)。
酵母的例子有釀酒酵母，克魯弗酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克魯維酵母，多形漢遜酵母，巴斯德畢赤酵母，Pichia methanolica，克魯弗畢赤酵母，Yarrowia lipolytica，假絲酵母，產(chǎn)朊假絲酵母，可可假絲酵母，地霉和Geotrichum fermentans。
去除蛋白酶活性的一個(gè)合適途徑是破壞編碼該蛋白酶的宿主基因，從而產(chǎn)生不可回復(fù)地丟失了編碼該蛋白酶之基因的全部或部分(包括調(diào)節(jié)和/或編碼區(qū))的菌株，或者另一種方法是，可通過(guò)傳統(tǒng)的誘變方法或引入特異點(diǎn)突變來(lái)降低或去除蛋白酶活性。其它可適于降低蛋白酶活性的辦法包括在酵母中引入反義和/或核酶構(gòu)建體，如Atkins等(反義和發(fā)育，5:295-305,1995)和Nasr等(分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.),249:51-57,1995)。破壞本發(fā)明方法中所用酵母株內(nèi)YAP3基因的一個(gè)可取方法已由Rothstein作了描述(酶學(xué)方法，194:281-301,1991)。
本文所用詞語(yǔ)“胰高血糖素或胰高血糖素樣肽”可以是來(lái)源于人類或其它動(dòng)物，以及重組體或半合成來(lái)源，它們包括胰高血糖素家族所有成員，如GRPP(胰高血糖素樣肽相關(guān)多肽)、胰高血糖素、GLP-1(胰高血糖素樣肽1)和GLP-2(胰高血糖素樣肽2)，其中包括截短和/或N-末端延伸的形式，如GLP-1(7-36)；還包括類似物，如GLP-1(7-35)R36A GLP-2 F22Y,GLP-2 A19T+34Y.GLP-2 A2G和GLP-2 A19T，及具有1-3個(gè)氨基酸改變、添加或/和缺失的其它類似物。用于本發(fā)明多肽表達(dá)的cDNA包括優(yōu)化了密碼子的形式以在酵母中表達(dá)。
整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中用單字母或三字母表示氨基酸均符合IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)所通過(guò)的規(guī)則(1974)，該規(guī)則收集于IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)暫定規(guī)則和建議合編本(第二版，馬里蘭，1975)。
本發(fā)明另一方面是經(jīng)一種雜合載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞的培養(yǎng)物，所述雜合載體中含有編碼一種多肽的多核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，該多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或20-30個(gè)氨基酸，最優(yōu)選25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵，所述多核苷酸序列或DNA序列可操作性地連接了編碼酵母啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列(原序列或前原序列)的多核苷酸序列或DNA序列和/或?qū)τ诮湍钢斜磉_(dá)所述多肽并將其分泌出來(lái)所必需的其它多核苷酸序列或DNA序列，所述酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的特征在于該細(xì)胞內(nèi)Yap3p活性有所降低(優(yōu)選通過(guò)破壞YAP3基因)，該酵母細(xì)胞培養(yǎng)物是單倍體或二倍體(優(yōu)選二倍體)酵母細(xì)胞的培養(yǎng)物。
另一方面，本發(fā)明提供了一種酵母細(xì)胞培養(yǎng)物，該酵母細(xì)胞含有編碼一種多肽的多核苷酸序列以及編碼分泌信號(hào)的第二種多核苷酸序列，從而使所述多肽可在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并從中分泌出來(lái)，該多肽具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或20-30個(gè)氨基酸，最優(yōu)選25-35個(gè)氨基酸，并且在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選有一個(gè)或沒(méi)有二硫鍵，所述酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的特征在于所述酵母細(xì)胞內(nèi)Yap3蛋白酶的活性有所降低。優(yōu)選該酵母細(xì)胞是已被包含所述多核苷酸序列的雜合載體轉(zhuǎn)化的二倍體酵母細(xì)胞，且優(yōu)選該酵母細(xì)胞缺乏Yap3p活性，這可通過(guò)破壞YAP3基因而方便地達(dá)到。
可將編碼多肽的DNA與多種其它的DNA序列連接以引入一合適宿主中，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并且在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵?；锇镈NA將取決于宿主的性質(zhì)、將DNA導(dǎo)入宿主的方式以及期望的是附加體維持狀態(tài)還是整合入宿主染色體中。
一般說(shuō)來(lái)，可將DNA以適當(dāng)?shù)姆较蚝驼_的閱讀框架插入一表達(dá)載體如質(zhì)粒中以進(jìn)行表達(dá)。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將該載體導(dǎo)入宿主中，并且通常必需進(jìn)行選擇以獲得已被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
如果期望發(fā)生整合，則將DNA以適當(dāng)?shù)姆较蚝驼_的閱讀框插入到一酵母整合質(zhì)粒載體如pJJ215、pJJ250、pJJ236、pJJ248、pJJ242(Jones & Prakash，酵母，6:363,1990)或pDP6(Fleig等，基因，46:237,1986)中以進(jìn)行表達(dá)，該DNA兩側(cè)是任何非必需酵母基因的同源序列、轉(zhuǎn)座子序列或核糖體基因。優(yōu)選兩側(cè)序列是酵母蛋白酶基因或用作選擇標(biāo)記的基因。然后通過(guò)使用Rothstein(酶學(xué)方法，194:281-301,1991)和Cregg等(生物技術(shù)，11:905-910,1993)所示的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，經(jīng)兩側(cè)序列中發(fā)生的同源重組而將該DNA整合入宿主染色體上。
然后，在由于本發(fā)文所公開(kāi)的教導(dǎo)而使本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的合適條件下，將已轉(zhuǎn)化了本發(fā)明重組DNA的宿主細(xì)胞培養(yǎng)足夠長(zhǎng)時(shí)間，以使本發(fā)明方法中欲生產(chǎn)的多肽得到表達(dá)和分泌，然后可回收該多肽，正如我們所知。優(yōu)選的多肽范例是胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、CRF和EEID-CART55-102，或它們的功能性類似物。
有用的酵母質(zhì)粒載體包括POT(Kjeldsen等，基因，170:107-112,1996)和YEp13、YEp24(Rose和Broach，酶學(xué)方法，185:234-279,1990)和pG質(zhì)粒(Schena等，酶學(xué)方法，194:289-398,1991)。
釀酒酵母的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化、乙酸鋰轉(zhuǎn)化和電穿孔，參見(jiàn)《酶學(xué)方法》，194卷，1991年。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化如本文實(shí)施例中所述。
對(duì)釀酒酵母合適的啟動(dòng)子包括MFα1啟動(dòng)子、半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如GAL1、GAL7和GAL10啟動(dòng)子)、糖酵解酶啟動(dòng)子(包括TPI和PGK啟動(dòng)子)、TRP1啟動(dòng)子、CYCI啟動(dòng)子、CUP1啟動(dòng)子、PHO5啟動(dòng)子、ADH1啟動(dòng)子和HSP啟動(dòng)子。畢赤酵因?qū)僦泻线m的啟動(dòng)子是AOXI(甲醇利用)啟動(dòng)子。
轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)優(yōu)選真核基因3’旁側(cè)序列，其中含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號(hào)。合適的3’旁側(cè)序列可以是諸如與所用表達(dá)控制序列即啟動(dòng)子天然相連的基因的那些序列。
用于提供本發(fā)明多肽的分泌性表達(dá)的DNA構(gòu)建體中包含一段DNA序列，該DNA序列中包括一個(gè)通過(guò)酵母加工信號(hào)而與該多肽連接的前導(dǎo)序列。該前導(dǎo)序列包括一段信號(hào)肽(“前序列”)以用于穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，并且任選地可包含一附加序列(“原序列”)，在多肽被釋放到周圍培養(yǎng)基中之前，該序列在酵母細(xì)胞中可以被切割，也可以不被切割。有用的前導(dǎo)序列是小鼠α-淀粉酶的信號(hào)肽、釀酒酵母MFα1、YAP3、BARI、HSP150的信號(hào)肽，克魯弗酵母MFα信號(hào)肽，還有釀酒酵母MFα1、YAP3、PRC、HSP150和克魯弗酵母MFα的前原序列，以及WO92/11378、WO90/10075和WO95/34666中所述的合成前導(dǎo)序列。此外，可按照WO95/35384中所述，以具有N-末端延伸的形式提供欲根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的多肽。
本發(fā)明也涉及具有降低了的Yap3p活性的酵母的制備方法，該方法包括以下步驟a)提供一含有YAP3基因一部分并且適于轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中的雜合質(zhì)粒；b)通過(guò)缺失YAP3片段從而破壞YAP3基因，并代之以插入U(xiǎn)RA3基因以獲得Δyap3∷URA3基因破壞質(zhì)粒；c)提供一種酵母Δura3缺失突變體；d)用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述突變體；e)在無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基上選擇出Δyap3∷URA3缺失突變體。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及用反義技術(shù)制備Yap3p活性有所降低的酵母的方法。
此外，欲按本發(fā)明方法生產(chǎn)的多肽可以方便地以與N-或C-末端標(biāo)記相偶聯(lián)的形式表達(dá)，或者以前體或融合蛋白形式表達(dá)，盡管表達(dá)多肽的全長(zhǎng)可能超過(guò)總共55或70個(gè)氨基酸。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示pS194質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖2顯示質(zhì)粒pME834和pME1389的構(gòu)建。
圖3為人胰高血糖素表達(dá)質(zhì)粒pMT703的限制性圖譜。
圖4是人GLP-1(7-37)表達(dá)質(zhì)粒pLaC253的限制性圖譜。
圖5是人GLP-2表達(dá)質(zhì)粒pKV210的限制性圖譜。
圖6是pME973質(zhì)粒的限制性圖譜，其中包含插入于YEp13質(zhì)粒中的編碼HO(同宗配合)核酸內(nèi)切酶和Ura3p的基因。
發(fā)明詳述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案如下表1所示。只要具備本領(lǐng)域的知識(shí)，每個(gè)熟練技術(shù)人員可以很清楚地知道如何利用相似的構(gòu)建體通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)其他多肽以及它們的功能性類似物，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。
表1
1LA19，參見(jiàn)本文SEQ ID NO:1和WO95/34666,2spx3-LaC212，參見(jiàn)WO89/02463和WO90/10075。
本文所用的啤酒酵母株的遺傳背景如下所示E11-3C MATα YAP3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 URA3SY107 MATα YAP3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3ME1487 MATα Δyap3∷URA3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3ME1656 MATα Δyap3∷ura3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3ME1684 MATa Δyap3∷URA3∷Δylr121c pep4-3 Δtpi∷LEU2leu2Δura3ME1695 MATα Δyap3∷ura3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3ME1719 MATa/α Δyap3∷URA3/Δyap3∷ura3 pep4-3/pep4-3Δtpi∷LEU2/Δtpi∷LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3MT663 MATa/α YAP3/YAP3 pep4-3/pep4-3 Δtpi∷LEU2/Δtpi∷LEU2leu2/leu2 URA3/URA3 HIS4/his4以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明作了說(shuō)明，但它們并不能被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。前文及下面實(shí)施例中所公開(kāi)的特征分別或它們的任何組合對(duì)于以多種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明都可能是重要的。
實(shí)施例1:Δyap3∷URA3基因破壞Δura3缺失突變的構(gòu)建如下用StyⅠ消化pJJ244(包括URA3基因1.2kb HindⅢ片段的pUC18)，用Klenow聚合酶補(bǔ)平，并進(jìn)行自身連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱為pS194，其中含有缺失了84bp StyⅠ-StyⅠ片段的URA基因，參見(jiàn)圖1。
Δyap3∷URA3基因破壞質(zhì)粒pME1389構(gòu)建如下將pME768(Egel-Mitani等，酵母6:127-137,1990)中包含YAP3基因的2.6kb SacⅠ-PstⅠ片段插入pIC19R(Marsh等，基32:481-485,1984)的2.6kb SacⅠ-PstⅠ片段中，產(chǎn)生的質(zhì)粒是pME834。用HindⅢ消化pME834以缺失0.7kb YAP3片段，再代之以插入U(xiǎn)RA3基因(Rose等，基因，29:113-124,1984)的1.2kb HindⅢ片段，形成的質(zhì)粒是pME1389。質(zhì)粒pME834和pME1389的構(gòu)建過(guò)程以圖解形式示于圖2中。
用線性化pS194(BsgⅠ消化)轉(zhuǎn)化釀酒酵母株E11-3C(MATαYAP3 pep4-3Δtpi∷LEU2 leu2 URA3)(參見(jiàn)ATCC20727，美國(guó)專利4766073)，以制得Δura缺失突變。通過(guò)在含有5-FOA(5-氟-乳清酸)的基本培養(yǎng)基平板上進(jìn)行選擇得到稱為SY107的Δura3突變體。
然后用已被SalⅠ和SacⅠ切割的質(zhì)粒pME1389轉(zhuǎn)化SY107菌株(MATα YAP3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3)，并分離出Δyap3∷URA3的3kb片段以用于轉(zhuǎn)化。在無(wú)尿嘧啶的基本培養(yǎng)基平板上選擇出Δyap3∷URA3缺失突變體。用PCR和Southern雜交對(duì)URA3轉(zhuǎn)化體進(jìn)行鑒定以確證Δyap3∷URA3片段在YAP3位點(diǎn)的正確整合。分離出Δyap3∷URA3缺失突變體(MATαΔyap3∷URA3 pep4-3Δtpi∷LEU2leu2Δura3)，稱為ME1487。
實(shí)施例2二倍體Δyap3/Δyap3菌株的構(gòu)建用EMS(甲磺酸乙酯)誘變ME1487，在含5-FOA的平皿上選擇出ura3突變體。然后通過(guò)用圖6所示的pME973瞬時(shí)轉(zhuǎn)化選擇出的分離菌之一-ME1656而使其進(jìn)行交配型轉(zhuǎn)換(mating type switch)(Herskowitz和Jensen，酶學(xué)方法，194:132-146,1991)。pME973中含有插入到Y(jié)Ep13質(zhì)粒(Rose和Broach，酶學(xué)方法，185:234-279,1990)中編碼HO(同宗配合)核酸內(nèi)切酶及URA3的基因。從瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體中篩選出單倍體菌株ME1695，該菌株已從MATα轉(zhuǎn)換為MATa，并具有以下遺傳背景MATaΔyap3∷ura3 pep4-3Δtpi∷LEU2 leu2Δura3。
然后通過(guò)顯微操作將ME1695與ME1487雜交(Sherman和Hicks，酶學(xué)方法，194:21-37,1991)以得到Δyap3/Δyap3二倍體。從產(chǎn)生的二倍體中，選擇出具有下述遺傳背景的株系ME1719:MATa/αΔyap3∷ura3/Δyap3∷URA3 pep4-3/pep4-3 Δtpi∷LEU2/Δtpi∷LEU2leu2/leu2 Δura3/Δura.
實(shí)施例3Δyap3∷URA3∷Δylr121c雙破壞菌株的構(gòu)建為了構(gòu)建一個(gè)編碼YAP3和YLR121C的兩個(gè)緊密連接基因的一步基因破壞菌株，合成了以下兩個(gè)寡核苷酸引物P1長(zhǎng)57bp:YLR121C/URA3引物5′-GAT CGA ACG GCC ATG AAA AAT TTG TAC TAG CTA ACGAGC AAA GCT TTT CAA TTC AAT-3′P2長(zhǎng)57bp:YAP3/URA3引物5′-CCA GAA TTT TTC AAT ACA ATG GGG AAG TTG TCG TATTTA TAA GCT TTT TCT TTC CAA-3′P1和P2各含有分別對(duì)應(yīng)于YLR121C和YAP3編碼區(qū)內(nèi)序列的40個(gè)核苷酸，還含有一個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)(AAGCTT)和對(duì)應(yīng)于URA3基因(YEL021W)旁側(cè)序列的12個(gè)核苷酸。以URA3基因作模板，利用P1和P2進(jìn)行PCR，產(chǎn)生的1248bp PCR片段中包含了URA3選擇性標(biāo)記，此標(biāo)記旁側(cè)是來(lái)源于YAP3或YLR121C編碼區(qū)的40個(gè)核苷酸。然后將PCR片段轉(zhuǎn)化到ME1655中，再如實(shí)施例1中所述，選擇出Δyap3∷URA3∷Δylr121c缺失突變體并對(duì)其進(jìn)行表征。分離出Δyap3∷URA3∷Δylr121c突變體ME1684，其具有下述遺傳背景MATαΔyap3∷URA3∷Δylr121c pep4-3Δtpi∷LEU2 leu2Δura3.
實(shí)施例4轉(zhuǎn)化酵母為了制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，在100ml YPGGE培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％甘油，2％半乳糖，1％乙醇)中將酵母單倍體菌株SY107和ME1487或二倍體ME1719菌株培養(yǎng)至OD600=0.2。通過(guò)在2000rpm離心5分鐘收獲細(xì)胞，并用10ml水洗滌1次。再將細(xì)胞重新懸浮于10ml SED(1M山梨醇，25mM Na2EDTA pH8,6.7mg/ml二硫蘇糖醇)中，在30℃保溫15分鐘。通過(guò)離心收獲細(xì)胞，并重新懸浮于10ml SCE(1M山梨醇，0.1M檸檬酸鈉，10mMNa2EDTA,pH5.8)+2mg Novozyme SP234中并于30℃保溫30分鐘。通過(guò)離心收獲細(xì)胞，用10ml 1.2M山梨醇洗滌細(xì)胞1次，隨后用10ml CAS(1M山梨醇，10mM氯化鈣，10mM Tris-HCl pH7.5)再洗滌細(xì)胞1次后，再離心收獲細(xì)胞，最后重新懸浮于2ml CAS中。以每Eppendorf管各100μl的小份分裝感受態(tài)細(xì)胞，并凍存于-80℃。
轉(zhuǎn)化過(guò)程操作如下將冷凍的感受態(tài)細(xì)胞(100μl)迅速融化并加入1μg質(zhì)粒DNA。于室溫溫育細(xì)胞15分鐘，加入1ml PEG(20％聚乙二醇4000,10mM CaCl2,10mM Tris-HCl,pH7.5)。于室溫放置30分鐘后，通過(guò)在2000rpm離心15分鐘收獲細(xì)胞，再重新懸浮于100μlSOS(1M山梨醇，1/2體積YPGGE,0.01％尿嘧啶，7mM CaCl2)中。于30℃保溫2小時(shí)后，再離心細(xì)胞并將其重新懸浮于0.5ml 1M山梨醇中。然后將細(xì)胞與6ml頂層瓊脂(含有2.5％瓊脂的YPD)一起涂布于YPD平板(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)上。將平板放于30℃培養(yǎng)3-5天直至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例5異源蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒下述實(shí)施例中所用的酵母-大腸桿菌穿梭載體含有一外源蛋白質(zhì)表達(dá)盒，該表達(dá)盒中包括一編碼前導(dǎo)序列及其后的目的異源多肽的DNA序列，所述DNA序列被可操作性地置于POT質(zhì)粒(Kjeldsen等，1996，出處同前)中釀酒酵母TPI啟動(dòng)子和TPI終止子之間，所述前導(dǎo)序列是MFα1前原序列及其修飾序列。范例如下所示表2
實(shí)施例6胰高血糖素的表達(dá)將人胰高血糖素表達(dá)質(zhì)粒pMT703(參見(jiàn)圖3)轉(zhuǎn)化到三個(gè)菌株如YAP3已被破壞的單倍體菌株ME1487(Δyap3)、YAP3已被破壞的二倍體菌株ME1719(Δyap3/Δyap3)和YAP3野生型菌株SY107(YAP3 WT)中。通過(guò)在YPD平板(1％w/v酵母提取物，2％w/v蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)中將葡萄糖用作碳源來(lái)選擇轉(zhuǎn)化體。ME1532和YES1746是分別獲自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pMT703轉(zhuǎn)化體，而ME1530則是獲自SY107(YAP3 WT)的pMT703轉(zhuǎn)化體。在5ml YPD液體培養(yǎng)基中于30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體3天。于2500rpm離心5分鐘后收獲培養(yǎng)物上清液，用反相HPLC分析1ml上清液。如表3所示的生產(chǎn)水平是兩個(gè)獨(dú)立分離轉(zhuǎn)化體之培養(yǎng)物的平均值(實(shí)驗(yàn)1)，或是3個(gè)轉(zhuǎn)化體混合培養(yǎng)物的值(實(shí)驗(yàn)2)，校正生產(chǎn)水平，從而將單倍體YAP3野生型的生產(chǎn)水平設(shè)為100％。HPLC分析表明ME 1532或YES1746比ME1530多生產(chǎn)約4-6倍的胰高血糖素。
用于胰高血糖素檢測(cè)的HPLC裝置HPLC柱 4×250mm Novo Nordisk YMC-OdDMeSi C185μm。
柱溫50℃流速1ml/minHPLC溶劑A0.2M Na2SO4中的10％(v/v)乙腈，0.04MH3PO4，用乙醇胺將pH調(diào)至2.3B水中的50％(v/v)乙腈注射體積150μl用23.6％-32.9％的乙腈在40分鐘內(nèi)將胰高血糖素從HPLC柱中洗脫出來(lái)。
表3
>實(shí)施例7
GLP-1(7-37)的表達(dá)將人GLP-1(7-37)表達(dá)質(zhì)粒pLaC253(參見(jiàn)圖4)轉(zhuǎn)化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。如實(shí)施例6所述對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇和分析。ME1535和YES1823是分別得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pLaC253轉(zhuǎn)化體，而ME1534是得自SY107(YAP3 WT)的pLaC253轉(zhuǎn)化體。表4所示的生產(chǎn)水平是兩個(gè)獨(dú)立分離轉(zhuǎn)化體之培養(yǎng)物的平均值(實(shí)驗(yàn)1)或3個(gè)轉(zhuǎn)化體混合培養(yǎng)物的值(實(shí)驗(yàn)2)，校正生產(chǎn)水平，以將單倍體YAP3野生型的生產(chǎn)水平設(shè)為100％。HPLC分析表明ME1535或YES1823生產(chǎn)的GLP-1(7-37)比ME1530多約2-3倍。
用于GLP-1(7-37)檢測(cè)的HPLC裝置除了GLP-1是用31.2％-41.2％的乙腈在40分鐘內(nèi)從HPLC柱上洗脫下來(lái)的以外，其余參數(shù)與實(shí)施例6中所述相同。
表4
實(shí)施例8GLP-2的表達(dá)將人GLP-2表達(dá)質(zhì)粒pKV210(參見(jiàn)圖5)轉(zhuǎn)化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。如實(shí)施例6所述對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇和分析。ME1615和YES1827是分別得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pKV210轉(zhuǎn)化體，而ME1614則是得自SY107(YAP3 WT)的pKV210轉(zhuǎn)化體。表5所示的生產(chǎn)水平是2個(gè)獨(dú)立分離轉(zhuǎn)化體之培養(yǎng)物的平均值(實(shí)驗(yàn)1)或3個(gè)轉(zhuǎn)化體混合培養(yǎng)物的值(實(shí)驗(yàn)2)，校正生產(chǎn)水平，以將YAP3野生型的產(chǎn)量水平視為100％。HPLC分析表明ME1615和YES1827生產(chǎn)的GLP-2比ME1614多約6-11倍。
用于GLP-2檢測(cè)的HPLC裝置HPLC柱Vydac214 TP54柱。流速 1ml/minHPLC溶劑A0.1％TFAB于乙腈中的0.07％TFA在60分鐘內(nèi)用在20％-80％乙腈中的0.07％TFA將GLP-2從HPLC柱中洗脫下來(lái)。
表5
實(shí)施例9CRF1-41(本文的SEQ ID NO:3)的表達(dá)將人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF1-41)表達(dá)質(zhì)粒pKV241(相當(dāng)于圖5中的pKV210，只是其中的MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-GLP2被MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-CRF1-41所取代)轉(zhuǎn)化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。按實(shí)施例6中所述對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇和分析。ME1813和YES1810是分別得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pKV241轉(zhuǎn)化體，而ME1812是得自SY107(YAP3 WT)的pKV241轉(zhuǎn)化體。表6所示的產(chǎn)量水平是3個(gè)轉(zhuǎn)化體混合培養(yǎng)物的值(實(shí)驗(yàn)2)，校正產(chǎn)量水平以將單倍體YAP3野生型的產(chǎn)量水平視為100％。如實(shí)施例8中所述完成HPLC分析，結(jié)果表明ME1813或YES1810比ME1812多生產(chǎn)CRF1-41約8-9倍。
表6<
實(shí)施例10EEID-CART55-102(本文的SEQ ID NO:2)的表達(dá)將人可卡因和苯異丙胺調(diào)控的轉(zhuǎn)錄物的N末端延伸(EEID)片段(EEID CART55-102)表達(dá)質(zhì)粒pSX637(相當(dāng)于圖5的pKV210，只是其中的MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-GLP2被MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-EEID-CART55-102所取代)轉(zhuǎn)化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。如實(shí)施例6中所述對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇和分析。ME1817和YES1820是分別得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pSX637轉(zhuǎn)化體，而ME1816則是得自SY107(YAP3 WT)的pSX637轉(zhuǎn)化體。表7所示的產(chǎn)量水平是來(lái)自3個(gè)轉(zhuǎn)化體混和培養(yǎng)物的值(實(shí)驗(yàn)2)，校正產(chǎn)量水平，以將單倍體YAP3野生型的產(chǎn)量水平設(shè)為100％。如實(shí)施例8中所述進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明ME1817或YES1820比ME1816多生產(chǎn)EEID-CART55-102約2-3倍。
表7<
>
實(shí)施例11表8給出了被具有不同前原序列(前導(dǎo)序列)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的ME1487(Δyap3)中人胰高血糖素、GLP-1(1-37)和GLP-2表達(dá)水平的數(shù)據(jù)。除了表8中所列的細(xì)節(jié)外，表達(dá)質(zhì)粒如圖5所述。校正表達(dá)產(chǎn)率，以將MT663(YAP3/YAP3)轉(zhuǎn)化體中的產(chǎn)率設(shè)為100％。
表8
序列表SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu1 5 10 15Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr Leu20 25 30Ala Leu Asp Val Val Asn Leu Ile Ser Met Ala35 40SEQ ID NO:2的有關(guān)信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度52個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Glu Glu Ile Asp Ile Pro Ile Tyr Glu Lys Lys Tyr Gly Gln Val1 5 10 15Pro Met Cys Asp Ala Gly Glu Gln Cys Ala Val Arg Lys Gly Ala20 25 30Arg Ile Gly Lys Leu Cys Asp Cys Pro Arg Gly Thr Ser Cys Asn35 40 45Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu50SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Ser Glu Glu Pro Pro Ile Ser Leu Asp Leu Thr Phe His Leu Leu15 10 15Arg Glu Val Leu Glu Met Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Gln Gln20 25 30Ala His Ser Asn Arg Lys Leu Met Glu Ile Ile35 40
權(quán)利要求
1．在酵母內(nèi)生產(chǎn)短鏈多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)一種具有降低了的Yap3蛋白酶或其同系物活性的酵母，所述酵母已被一種雜合載體所轉(zhuǎn)化，該載體中含有與編碼一種多肽的DNA序列可操作性地連接的酵母啟動(dòng)子，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵，以及分離所述多肽。
2．在酵母中生產(chǎn)具開(kāi)放結(jié)構(gòu)的短鏈多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)具有降低了的Yap3蛋白酶或其同系物活性的酵母，所述酵母已被一雜合載體所轉(zhuǎn)化，該載體含有與編碼一種多肽的DNA序列可操作性地相連的酵母啟動(dòng)子，所述多肽在多肽鏈中具有10-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選15-40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選20-30個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有不超過(guò)一個(gè)二硫鍵，以及分離所述多肽。
3．按照權(quán)利要求1或2的方法，其中所述酵母缺乏Yap3蛋白酶活性。
4．按照權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的方法，其中所述酵母是二倍體酵母。
5．按照權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的方法，其中所述酵母選自由下述組成之組釀酒酵母、克魯弗酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、Pichia methanolica、克魯弗畢赤酵母、Yarrowia lipolytica、假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、可可假絲酵母、地霉和Geotrichum fermentans。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中所述酵母是釀酒酵母。
7．按照上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述酵母另外還具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶選自由下述基因所編碼的蛋白酶之組BAR1、STE13、PRA、PRB、KEX1、PRC、CPS和YAP3同系物MKC7、YAP3-link(由GeneBank acc.No.X89514位置25352-26878)、YIV9(Swiss Prot acc.No.P40583)，以及天冬氨酰蛋白酶(Ⅳ)(由GeneBank acc.No.U28372位置326-2116)基因。
8．按照權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法，其中所述酵母另外還具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶選自由STE13、PRA、PRB、KEX1和PRC基因所編碼的蛋白酶之組。
9．按照權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法，其中所述酵母另外還具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶是由酵母開(kāi)放閱讀框架YGL259W所編碼的天冬氨酰蛋白酶或者選自由KEX2基因和酵母開(kāi)放閱讀框架YCR045C和YOR003W所編碼的絲氨酸蛋白酶之組。
10．按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述酵母另外還具有pep4-3突變。
11．按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述雜合載體中含有可操作性地連接了第一種DNA序列的酵母啟動(dòng)子以及含酵母轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列，所述第一種DNA序列以正確閱讀框架與編碼一種多肽的第二種DNA序列相連，該第一種DNA序列編碼前序列(信號(hào)序列)或前原序列之類的前導(dǎo)序列，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。
12．按照權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的方法，其中所述雜合載體中含有可操作性地連接了第一種DNA序列的酵母啟動(dòng)子以及含有酵母轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列，所述第一種DNA序列以正確閱讀框架與編碼一種多肽的第二種DNA序列相連，該第一種DNA序列編碼前序列(信號(hào)序列)或前原序列之類的前導(dǎo)序列，所述多肽在多肽鏈中具有10-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選15-40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選20-30個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。
13．按照權(quán)利要求11或12的方法，其中所述酵母啟動(dòng)子選自由下述組成之組MFα1啟動(dòng)子，CYC1啟動(dòng)子，半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如GAL1、GAL7和GAL10啟動(dòng)子，包括TPI和PGK啟動(dòng)子等在內(nèi)的糖酵解酶啟動(dòng)子，TRP1啟動(dòng)子，CUP1啟動(dòng)子、PHO5啟動(dòng)子，ADH1啟動(dòng)子和HSP啟動(dòng)子。
14．按照權(quán)利要求11或12的方法，其中所述雜合載體中包含的第一種DNA序列編碼小鼠α-淀粉酶的信號(hào)肽，釀酒酵母MFα1、BAR1、YAP3、HSP150及克魯弗酵母MFα信號(hào)肽，或者編碼釀酒酵母MFα1、YAP3、PRC、HSP150和克魯弗酵母MFα的前原序列，和/或WO92/11378、WO90/10075和WO95/34666中所述的合成前導(dǎo)序列。
15．按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中編碼多肽的DNA序列選自由編碼下述的DNA序列組成之組胰高血糖素家族諸如GRPP(胰高血糖素樣肽相關(guān)多肽)、胰高血糖素、GLP-1(胰高血糖素樣肽1)和GLP-2(胰高血糖素樣肽2)，其中包括截短的形式如GLP-1(7-36)，還包括它們的類似物，如GLP-1(7-35)R36A GLP-2 F22Y、GLP-2 A19T+34Y.GLP-2A2G和GLP-2 A19T，以及具有1-3個(gè)氨基酸改變、添加和/或缺失的其它類似物。
16．按照權(quán)利要求1-14中任何一項(xiàng)的方法，其中編碼多肽的DNA序列選自編碼下述的DNA序列組CRF和CART截短的或N末端延伸形式，優(yōu)選EEID-CART55-102。
17．一種酵母細(xì)胞培養(yǎng)物，其含有編碼一種多肽的DNA序列和編碼可使所述多肽從酵母中分泌出來(lái)之前導(dǎo)序列的第二種DNA序列，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵，所述酵母細(xì)胞培養(yǎng)物特征在于其具有降低了的Yap3p活性。
18．按照權(quán)利要求17的酵母細(xì)胞培養(yǎng)物，其已被含有所述DNA序列和所述第二種DNA序列的雜合載體所轉(zhuǎn)化。
19．一種酵母細(xì)胞培養(yǎng)物，其含有編碼一種多肽的DNA序列和編碼可使所述多肽從酵母中分泌出來(lái)之前導(dǎo)序列的第二種DNA序列，所述多肽在多肽鏈中具有10-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選15-40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選20-30個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有不超過(guò)一個(gè)二硫鍵，所述酵母細(xì)胞培養(yǎng)物的特征在于所述酵母細(xì)胞具有降低了的Yap3p活性。
20．按照權(quán)利要求19的培養(yǎng)物，其已被含有所述DNA序列和所述第二種DNA序列的雜合載體所轉(zhuǎn)化。
21．按照權(quán)利要求17-20中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述酵母細(xì)胞缺乏Yap3p活性。
22．按照權(quán)利要求17-21中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述酵母細(xì)胞是二倍體。
23．按照權(quán)利要求17-22中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述酵母選自由下述組成之組釀酒酵母、克魯弗酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、Pichiamethanolica、克魯弗畢赤酵母、Yarrowia lipolytica、假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、可可假絲酵母、地霉和Geotrichum fermentans。
24．按照前一權(quán)利要求的培養(yǎng)物，其中所述酵母是釀酒酵母。
25．按照權(quán)利要求17-24中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述酵母細(xì)胞另外還具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶選自由下述基因所編碼的蛋白酶之組BAR1、STE13、PRA、PRB、KEX1、PRC、CPS和YAP3同系物MKC7、YAP3-link(由Genbank acc.No.X89514位置25352-26878)、YIV9(Swiss Prot acc.NO.P40583)、天冬氨酰蛋白酶(Ⅳ)(由GenBank acc.No.U28372位置326-2116)基因。
26．按照權(quán)利要求17-24中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述酵母細(xì)胞另外還具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶選自由STE13、PRA、PRB、KEX1和PRC基因所編碼的蛋白酶之組。
27．按照權(quán)利要求17-24中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述酵母另外還具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶是由酵母開(kāi)放閱讀框架YGL259W編碼的天冬氨酰蛋白酶或者選自由KEX2基因和酵母開(kāi)放閱讀框架YCR045C和YOR003W所編碼的絲氨酸蛋白酶之組。
28．按照權(quán)利要求17-27中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述酵母細(xì)胞另外還具有pep4-3突變。
29．按照權(quán)利要求17-28中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述雜合載體中含有可操作性地連接了第一種DNA序列的酵母啟動(dòng)子以及含酵母轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列，所述第一種DNA序列以正確閱讀框與編碼一種多肽的第二種DNA序列相連，該第一種DNA序列編碼前序列(信號(hào)序列)或前原序列之類的前導(dǎo)序列，所述多肽在多肽鏈中具有多達(dá)55個(gè)氨基酸，優(yōu)選10-50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15-40或25-35個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有0-3個(gè)二硫鍵，優(yōu)選不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。
30．按照權(quán)利要求17-28中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中所述雜合載體中含有可操作性地連接了第一種DNA序列的酵母啟動(dòng)子以及含有酵母轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列，所述第一種DNA序列以正確閱讀框架與編碼一種多肽的第二種DNA序列相連，該第一種DNA序列編碼前序列(信號(hào)序列)或前原序列之類的前導(dǎo)序列，所述多肽在多肽鏈中具有10-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選15-40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選20-30個(gè)氨基酸，并在結(jié)構(gòu)中具有不超過(guò)一個(gè)二硫鍵。
31．按照權(quán)利要求29或30的培養(yǎng)物，其中所述酵母啟動(dòng)子選自由下述組成之組MFα1啟動(dòng)子，CYC1啟動(dòng)子，半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如GAL1、GAL7和GAL10啟動(dòng)子，包括TPI和PGK啟動(dòng)子等在內(nèi)的糖酵解酶啟動(dòng)子，TRP1啟動(dòng)子，CUP1啟動(dòng)子，PHO5啟動(dòng)子，ADH1啟動(dòng)子和HSP啟動(dòng)子。
32．按照權(quán)利要求29或30的培養(yǎng)物，其中所述第一種DNA序列是小鼠α-淀粉酶的信號(hào)肽，釀酒酵母MFα1、BAR1、YAP3和HSP150以及克魯弗酵母MFα的信號(hào)肽，或者是釀酒酵母MFα1、YAP3、PRC、HSP150和克魯弗酵母MFα的前原序列，和/或WO92/11378、WO90/10075和WO95/34666中所述的合成前導(dǎo)序列。
33．按照權(quán)利要求17-32中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中編碼多肽的DNA序列是編碼胰高血糖素家族內(nèi)多肽的DNA序列，例如GRPP(胰高血糖素樣肽相關(guān)多肽)、胰高血糖素、GLP-1(胰高血糖素樣肽1)和GLP-2(胰高血糖素樣肽2)，包括截短的形式如GLP-1(7-36)，還包括類似物如GLP-1(7-35)R36AGLP-2 F22Y、GLP-2 A19T+34Y.GLP-2 A2G和GLP-2A19T，以及具有1-3個(gè)氨基酸改變、添加或/和缺失的其它類似物。
34．按照權(quán)利要求17-32中任何一項(xiàng)的培養(yǎng)物，其中編碼多肽的DNA序列選自編碼下述的DNA序列組CRF及截短和/或N末端延伸的CART，優(yōu)選EEID-CART55-102。
35．制備具有降低了的Yap3p活性的酵母的方法，該方法包括以下步驟a)提供一種含有YAP3基因的一部分并適于轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中的雜合載體；b)通過(guò)缺失YAP3片段從而破壞YAP3基因，并代之以插入U(xiǎn)RA3基因以獲得Δyap3∷RA3基因破壞質(zhì)粒；c)提供一種酵母Δura3缺失突變體；d)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述突變體；和e)在無(wú)尿嘧啶的培養(yǎng)基中選擇出Δyap3∷URA3缺失突變體。
36．用反義技術(shù)制備Yap3p活性有所降低的酵母的方法。
37．按照權(quán)利要求35或36的方法，其中所述酵母是釀酒酵母。
38．本文所述特性的任何新特性或組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及在YAP3蛋白酶活性有所降低的基因改造酵母細(xì)胞中生產(chǎn)短鏈多肽的一種新方法,這些短鏈多肽包括具有多達(dá)三個(gè)二硫鍵并且/或者具有富含堿性氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)的多肽,以及具有開(kāi)放結(jié)構(gòu)的短鏈多肽,如胰高血糖素、胰高血糖素樣肽和它們的功能性類似物。本發(fā)明還進(jìn)一步包括經(jīng)基因改造的酵母細(xì)胞,以及制備所述酵母細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1225126SQ97196182
公開(kāi)日1999年8月4日 申請(qǐng)日期1997年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月5日
發(fā)明者M·艾格爾-米塔尼, J·布蘭德特, K·瓦德 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司