專利名稱：Ii合成的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)背景對特定抗原的免疫應(yīng)答是通過這些抗原的肽片斷的識別被T淋巴細胞調(diào)節(jié)。在抗原呈現(xiàn)細胞(APC)中，加工抗原的肽片斷變?yōu)榻Y(jié)合在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的抗原肽結(jié)合部位。然后這些肽-MHC復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到細胞表面而被輔助細胞的或細胞毒性T淋巴細胞上的T細胞受體所識別(外源肽和呈現(xiàn)MHC分子的相鄰表面)。
已經(jīng)鑒定了兩類MHC分子。類型ⅠMHC分子從內(nèi)源性合成蛋白，如感染病毒，在大約類型ⅠMHC分子的合成時候從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中得到肽類。MHC類型Ⅰ復(fù)合的肽在CD8-正效細胞毒性T淋巴細胞上出現(xiàn)，然后其被活化并且可以直接殺死病毒-表達細胞。然而，MHC類型Ⅱ分子的抗原肽結(jié)合部位在合成時被不變體鏈蛋白[Ii,(Invariant Chain Protein)]阻斷。這些MHC類型Ⅱ-Ii蛋白復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至后-Golgi區(qū)室，在那Ii通過蛋白酶解被釋放并且特異性抗原肽結(jié)合在MHC類型Ⅱ分子上。這些抗原肽通常來自外源性抗原，這些抗原經(jīng)過非特定胞吞或通過與抗原呈現(xiàn)細胞上的特定細胞表面受體的相互作用被內(nèi)化。例如，B淋巴細胞上的表面免疫球蛋白識別未損的蛋白抗原。然后抗原被內(nèi)化，消化并且結(jié)合在抗原呈現(xiàn)細胞中的MHC類型Ⅱ分子上。這些抗原肽-MHC類型Ⅱ分子復(fù)合物被再表達在抗原呈現(xiàn)細胞表面上并且由CD4-正效輔助細胞T淋巴細胞識別。然后輔助細胞T淋巴細胞經(jīng)過物理接觸幫助細胞毒T淋巴細胞和B淋巴細胞并釋放細胞因子。
抗原肽與MHC類型Ⅱ分子的結(jié)合以幾種方式通過不變體鏈(其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的合成時結(jié)合MHC類型Ⅱ分子)調(diào)節(jié)。Ii從后-Golgi區(qū)室中的MHC類型Ⅱ分子作為內(nèi)源性抗原肽結(jié)合MHC類型Ⅱ分子的抗原肽結(jié)合部位的協(xié)同步驟通過蛋白酶解釋放[Daibata等人，《分子免疫學(xué)》(Molecular Immunology)31:255-260(1994)；Xu等人，《分子免疫學(xué)》(Molecular Immunology)31:723-731(1994)]。Ii蛋白防止在細胞質(zhì)中被衍生及被轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)源性抗原肽的出現(xiàn)。這些內(nèi)源性衍生的抗原肽不能結(jié)合MHC類型Ⅱ分子，因為Ii鏈阻斷MHC類型Ⅱ分子的抗原肽結(jié)合部位直到它們到達特定后-Golgi區(qū)室，在那內(nèi)源性抗原肽發(fā)生結(jié)合。Ii的區(qū)室蛋白酶解消化/釋放發(fā)生在與具有抗原肽(得自特定選擇的外源性抗原)的MHC類型Ⅱ分子的協(xié)同過程中。
在正常情況下，內(nèi)源性肽(具有強烈導(dǎo)致自身免疫疾病的自身決定子)不能結(jié)合MHC類型Ⅱ分子，因為Ii蛋白總是與新生MHC類型Ⅱ分子共合成。因此，通過身體免疫監(jiān)視系統(tǒng)甚至沒有看到與自身決定子肽(在肽通常出現(xiàn)的表面上的抗原呈現(xiàn)細胞中被合成和加工的一種肽)的復(fù)合物。因此，就不能開發(fā)對這種決定子的耐受性。如果Ii蛋白的表達在某些易于自身免疫疾病的細胞類型中被抑制，這種內(nèi)源性自身決定子可能變?yōu)橛蒑HC類型Ⅱ分子呈現(xiàn)，開始自身免疫應(yīng)答這些內(nèi)源性抗原。通過在惡性細胞中的這種工程作用，對內(nèi)源性腫瘤抗原的這種“自身免疫應(yīng)答”可在治療上用于限制生長或消除這些腫瘤細胞。
已經(jīng)證明了在MHC類型Ⅱ-負(fù)效細胞中增加MHC類型Ⅱ表達的治療效果[Clements等人，《免疫學(xué)》(Immunol.),149:2391-2396(1992)；Baskar等人，《(細胞免疫學(xué)》(Cell.Immunol.),155:123-133(1 994)；和Baskar等人，《實驗藥物學(xué)雜志》(J.Exp.Med.),181:619-629(1995)]。在這些研究中，MHC類型Ⅱ分子基因至MHC類型Ⅱ-負(fù)效鼠肉瘤的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生MHC類型Ⅱ-正效、Ii-負(fù)效腫瘤細胞系。將這些細胞注射MHC相容宿主中導(dǎo)致親代腫瘤的生長延緩。Ii蛋白基因至肉瘤細胞系和MHC類型Ⅱ基因的共轉(zhuǎn)染抑制MHC類型Ⅱ基因的腫瘤治療效果，因為Ii鏈阻斷內(nèi)源性腫瘤抗原的出現(xiàn)。
本發(fā)明的概述本發(fā)明一方面涉及表達逆基因構(gòu)件，及寡核苷酸，其特征在于它們能與Ii mRNA分子雜交，因此抑制Ii mRNA分子的翻譯。所涉及的這些組合物通常被稱為Ii表達的抑制劑。通過對Ii的mRNA的作用，這些抑制劑在治療細胞中降低了Ii蛋白表達多達約90％。降低Ii表達使MHC類型Ⅱ分子與內(nèi)源性T細胞呈現(xiàn)抗原決定子結(jié)合，否則，這種決定子將永遠不會被免疫系統(tǒng)看到。
本發(fā)明另一方面涉及含有Ii表達抑制劑的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞。一類特別重要的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞是惡性MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞(例如白血病，淋巴瘤和黑素瘤)。
本發(fā)明還涉及在MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞表面上導(dǎo)致與MHC類型Ⅱ蛋白相關(guān)的自身決定子肽出現(xiàn)的方法。在這種方法中，Ii合成的特定抑制劑被引入MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞。這種特定抑制劑的直接或間接功能是通過mRNA編碼Ii的雙螺旋分子的形成。雙螺旋分子形成的功能是在翻譯水平上抑制Ii合成。
本發(fā)明其它方面包括在MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞和從MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞分離的自身決定子肽中治療惡性腫瘤的治療方法。
附圖簡要說明附

圖1是在RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(ss)的構(gòu)建物中使用的克隆策略的圖解說明。
本發(fā)明的詳細敘述本發(fā)明以發(fā)現(xiàn)Ii表達可以特定和有效地在細胞中被抑制為基礎(chǔ)，并且這種抑制可以探索治療方案。如上所述，MHC類型Ⅱ分子的抗原肽結(jié)合部位在MHC類型Ⅱ合成時通過Ii結(jié)合被阻斷。類型ⅡMHC-Ii復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至后-Golgi區(qū)室，在那Ii通過蛋白酶解被釋放并且特定抗原肽(通常得自內(nèi)化外源性抗原)被結(jié)合在MHC類型Ⅱ分子上。因此，Ii蛋白防止在細胞質(zhì)中被衍生及被轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)源性抗原肽的出現(xiàn)。通常，這種內(nèi)源性衍生的抗原肽不能結(jié)合MHC類型Ⅱ分子，因為Ii鏈阻斷MHC類型Ⅱ分子的抗原肽結(jié)合部位直到它們被轉(zhuǎn)移至后-Golgi區(qū)室。
如上所述，通過抑制Ii表達，現(xiàn)在可以將MHC類型Ⅱ分子與得自內(nèi)源性合成的蛋白的肽結(jié)合。MHC類型Ⅱ分子與得自內(nèi)源性合成蛋白的肽結(jié)合的能力能通過患者自身免疫系統(tǒng)靶向患者中不良細胞(例如惡性細胞)來摧毀這些細胞。
本發(fā)明方法和組合物適用一般的哺乳動物系統(tǒng)。編碼Ii蛋白的cDNA已經(jīng)從許多哺乳動物系統(tǒng)分離的mRNA產(chǎn)生并且已經(jīng)測定了核酸序列[Singer等人，EMBO J.3:873-877(1984)；Strubin,M.等人，EMBO J.3:869-872(1984)；Henkes,W.等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)16:11822(1988)]。已經(jīng)測定編碼Ii的哺乳動物基因是高度保守的。例如，已經(jīng)測定編碼鼠和人Ii的cDNA序列約為85％同源性。小鼠和大鼠序列間的保守程度大于90％[Henkes,W.等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)16:11822(1988)]。
本發(fā)明另一方面涉及表達逆基因構(gòu)建物。逆基因構(gòu)建物是表達DNA構(gòu)建物，其表達產(chǎn)生mRNA分子，這種分子互補編碼野生型Ii的mRNA分子。當(dāng)在Ii產(chǎn)生細胞中共表達時，表達逆基因構(gòu)建物的mRNA產(chǎn)物可以雜交編碼Ii的mRNA，因此形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這種雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成對編碼Ii的mRNA的翻譯具有抑制作用。這種雙螺旋形成的凈效果是降低細胞中Ii蛋白水平。細胞中Ii水平的降低使Ⅱ類MHC能與得自內(nèi)源性合成抗原的抗原肽結(jié)合。
逆基因構(gòu)建物優(yōu)選用從其中逆基因?qū)⒈槐磉_的相應(yīng)細胞類型的生物體的編碼Ii的cDNA合成。如上所述，已經(jīng)出版了編碼Ii的人cDNA序列。根據(jù)哺乳動物Ii基因之間的高度保守性，對任何實際上有意義的哺乳動物系統(tǒng)的cDNA庫都可以用Ii探針(例如人或鼠物種)篩選以分離相應(yīng)的Ii基因。
對用于構(gòu)建逆基因構(gòu)建物的表達載體背景的選擇是根據(jù)在其中發(fā)生的表達是所需要的表達的細胞類型而進行的。可以得到許多適當(dāng)?shù)妮d體并且本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要過分的實驗就能從多種可獲得的載體中選擇出適用的載體。類似地，可以根據(jù)需要表達的細胞類型來選擇有效表達所需的調(diào)節(jié)信號。這種調(diào)節(jié)信號的要求在本領(lǐng)域是已知的并且這種信號的非限制源通常是已知的。
制備逆基因構(gòu)建物是通過將Ii cDNA片斷以相對啟動子并與野生型取向比較為逆取向而引入到表達載體中來實現(xiàn)的。根據(jù)這樣一個事實，即已知mRNA假定為能干擾其雜交互補分子的復(fù)合二級結(jié)構(gòu)，全長逆基因構(gòu)建物(即編碼mRNA分子的逆基因構(gòu)建物，這種分子互補編碼Ii的全長mRNA)不總是最有效的設(shè)計。為了開發(fā)用于Ii抑制的更有效的構(gòu)建物，經(jīng)常需要進行常規(guī)實驗以鑒別小于全長的CDNA片斷，并且當(dāng)引入逆基因構(gòu)建物時，這種片斷在抑制Ii合成中是有效的。
在設(shè)計小于全長構(gòu)建物時，經(jīng)常需要鑒別編碼Ii的mRNA的功能重要區(qū)域，并且設(shè)計逆基因構(gòu)建物以便由逆基因構(gòu)建物編碼的mRNA與功能重要區(qū)域互補。例如，功能重要區(qū)域包括涉及mRNA的核糖體識別區(qū)域，翻譯起始位點，mRNA剪接點和聚腺苷酸化需要的翻譯末端密碼子的3’區(qū)域。
在真核細胞中，起始核糖體與mRNA接合的機理不同于原核生物的機理。在真核生物中，最靠近5’-端的甲硫氨酸特異性密碼子通常是用作翻譯起始點的。真核mRNAs的5’末端具有包括在5’-5’焦磷酸酯連接(經(jīng)常稱為5’帽結(jié)構(gòu))中連接第一個未修飾的核苷酸的甲基化鳥苷酸基的修飾的末端。例如，實驗已經(jīng)證明，缺乏5’-帽結(jié)構(gòu)的mRNA不能有效被翻譯。因此，真核生物中翻譯起始似乎涉及5’-帽結(jié)構(gòu)的識別及AUG密碼子周圍的共有序列的定位。接近蛋白編碼序列的核糖體識別的共有序列是“5’-ACCAUGG-”。
通過將基因組的DNA序列(其編碼初級轉(zhuǎn)錄物)與相應(yīng)的cDNA序列(從加工的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生)比較可以測定在初級轉(zhuǎn)錄物中的剪接點的定位。在這種比較中發(fā)現(xiàn)的不連續(xù)，標(biāo)記內(nèi)含子/外顯子的邊界。這種邊界研究已經(jīng)揭示了在內(nèi)含子/外顯子邊界的中等保守的、短共有序列及僅在3’剪接點上游的富含嘧啶區(qū)域的趨勢。另外，在前兩個(GU)和最后兩個(AG)內(nèi)含子位置發(fā)現(xiàn)完全保守的核苷酸。
聚腺苷酸化需要多聚A信號，AAUAAA，以及自多聚A附加部位往下游的約30個核苷酸。聚腺苷酸化穩(wěn)定mRNA，因此延長細胞中的半衰期。
在下面實施例部分所述的實驗中，設(shè)計和試驗了用于抑制鼠細胞中Ii表達的逆基因構(gòu)建物。鼠Ii蛋白由215個氨基酸殘基組成[[Singer等人，EMBO J.3:873-877(1984)]。因此，編碼該分子的全長cDNA包括645個堿基對的編碼序列。
在以下實施例中，一個全長逆基因構(gòu)建物，及小于全長的一個逆基因構(gòu)建物被設(shè)計和試驗。更具體地，RSV.5-mIi(R)逆基因構(gòu)建物含有得自鼠含mIi cDNA質(zhì)粒pcEXV-mIi31的EcoR1片斷[Miller和Germain，《實驗藥物學(xué)雜志》(J.Experi.Med.),164:1478-1489(1986)]。該構(gòu)建物含有逆取向的全鼠Ii cDNA編碼序列。當(dāng)在鼠A20細胞中表達時[Kim等人，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.),122:549-554(1979)]，在進行的兩個試驗中測定了全長逆基因構(gòu)建物RSV.5-mIi(R)對Ii表達的抑制為39.5％和71.9％。
小于全長的構(gòu)建物RSV.5-mIi(SS)的產(chǎn)生是，通過Sal1和Sac1消化RSV.5-mIi(R)以產(chǎn)生含有47個上游5’未翻譯序列的核苷酸和前97個Ii編碼序列的核苷酸的IicDNA片斷。當(dāng)在鼠A20細胞中表達時，在進行的兩個試驗中測定了小于全長逆基因構(gòu)建物RSV.5-mIi(SS)對Ii表達的抑制為89.3％和95.3％。
如上所述，用抑制翻譯的逆基因構(gòu)建物抑制內(nèi)源性蛋白表達的有效性在很大程度上依賴于mRNA編碼內(nèi)源性蛋白的二級結(jié)構(gòu)。這里所述實驗說明，Ii蛋白特別易于發(fā)生通過逆基因構(gòu)建物的抑制表達。該結(jié)果基于的事實是，甚至全長逆基因構(gòu)建物也顯示出抑制Ii表達的顯著能力。而且，甚至逆基因構(gòu)建物的截短變體也產(chǎn)生更高的抑制。該實驗工作以及已知哺乳動物Ii基因間的高度保守性，可以認(rèn)為是對逆基因構(gòu)建物活性在其它哺乳動物系統(tǒng)，包括人系統(tǒng)的有效性的預(yù)測。
除了逆基因構(gòu)建物外，可以使用在或接近Ii mRNA的功能重要區(qū)域特異性雜交的寡核苷酸以在翻譯水平抑制Ii表達[參見，例如，Helene和Toulme,Biochimica et Biophsica Acta 1049:99-125,(1990)；和Eguchi,Annu.Rev.Biochem.60:631-652,(1991)]。IimRNA的各種功能重要區(qū)域可以這種方式被靶向。
例如，可以使用對翻譯起始位點和/或與核糖體識別有關(guān)的重要上游區(qū)域為互補的寡核苷酸來抑制翻譯。類似地，可以使用對剪接和腺苷酸化有關(guān)的重要特定序列為互補的寡核苷酸在翻譯水平抑制Ii表達。
如以下實施例部分所述，將A20細胞在96孔微盤(每孔105個細胞)中在含有公開在SEQ ID NOS:1-3中的寡核苷酸的混合物存在下培養(yǎng)。在混合物中每種寡核苷酸濃度為90μM時，測定Ii表達被抑制約66％。在SEQ ID NO:1中特定的寡核苷酸互補于被認(rèn)為是與翻譯起始相關(guān)重要的Ii mRNA的區(qū)域。在SEQID NO:2中特定的寡核苷酸互補于被認(rèn)為是與內(nèi)含子剪接相關(guān)重要的Ii mRNA的區(qū)域。最后，在SEQ ID NO:3中特定的寡核苷酸互補與被認(rèn)為是與聚腺苷酸化相關(guān)重要的Ii mRNA的區(qū)域。
如上所述，抗原肽與MHC類型Ⅱ分子的結(jié)合以幾種方式通過不變體鏈被調(diào)節(jié)，不變體鏈在MHC類型Ⅱ分子于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成時結(jié)合MHC類型Ⅱ分子。在從后-Golgi區(qū)室中的MHC類型Ⅱ分子對Ii的釋放，是作為外源性抗原肽插入在MHC類型Ⅱ分子的抗原肽結(jié)合部位中的協(xié)同步驟的蛋白酶解的結(jié)果。Ii蛋白防止在細胞質(zhì)中被衍生并且被轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)源性抗原肽的出現(xiàn)。這些內(nèi)源性衍生的抗原肽不能結(jié)合MHC類型Ⅱ分子，因為，Ii鏈阻斷MHC類型Ⅱ分子的結(jié)合部位直到它們到達特定后-Golgi區(qū)室，并在那里發(fā)生外源性抗原肽結(jié)合。在該區(qū)室，蛋白酶解消化/Ii釋放是以與將特定選擇的外源性抗原的抗原肽插入MHC類型Ⅱ分子的過程為協(xié)同過程的方式發(fā)生的[Daibata等人，《分子免疫學(xué)》(Molecular Immunology)31:255-260(1994)；和Xu等人，《分子免疫學(xué)》(Molecular Immunology)31:723-731(1994)]。
通過抑制感興趣細胞中的Ii表達，內(nèi)源性自身決定子可以結(jié)合MHC類型Ⅱ分子并且通過MHC類型Ⅱ分子出現(xiàn)在細胞表面。這種情況導(dǎo)致刺激對內(nèi)源性自身決定子肽的免疫應(yīng)答。在惡性細胞中產(chǎn)生這種效果導(dǎo)致對內(nèi)源性腫瘤抗原的“自身免疫應(yīng)答”。這種應(yīng)答在治療上對于限制生長或消除腫瘤細胞是有用的。
這種治療方法與其它用反義構(gòu)建物治療疾病的方法比較的重要價值在于臨時和偶爾使用公開的組合物導(dǎo)致免疫系統(tǒng)中灌注腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)性的決定子。灌注后，沒有附加的反義治療的情況下，免疫系統(tǒng)能抵制腫瘤。相反，在多數(shù)目前用于控制疾病(例如病毒疾病如HIV)使用的反義治療中，在中斷反義治療后，病毒會復(fù)發(fā)。如上所述，在體內(nèi)或體外使用反義藥物可以用于實現(xiàn)對抗腫瘤的免疫應(yīng)答的灌注。
在下述實驗中，使用含或不含上述類型的逆基因構(gòu)建物的惡性MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)鼠A20細胞接種小鼠。下表2顯示用A20細胞接種的小鼠存活百分?jǐn)?shù)。這些實驗證明接種帶有逆基因構(gòu)建物RSV.5-mIi(ss)的A20細胞的鼠與接種沒有攜帶外源性質(zhì)粒的A20細胞或僅攜帶RSV.5載體(給予潮霉素抗性)但沒有Ii插入的A20細胞的鼠比較，顯示了更高的存活率。
因此，本發(fā)明另一方面涉及含有Ii合成抑制劑的MHC類型Ⅱ正效細胞。例如，這種細胞用于選擇性治療患有惡性腫瘤(例如白血病，淋巴瘤和黑素瘤)的患者的治療方案中。惡性MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞從患者中被分離。這些方法遵循免疫治療中的一般方法[Clements等人，《免疫學(xué)》(Immunol.),149:2391-2396(1992)；Basker等人，《細胞免疫學(xué)》(Cell.Immunol.),155:123-133(1994)；Basker等人，《實驗藥物學(xué)雜志》(J.Exp.Med.),181:619-629(1995)；Hersey，《藥物》(Drugs),47:373(1994)和Pardoll,《當(dāng)代免疫學(xué)》(Immunol.Today),14:310(1993)]。Ii表達抑制劑被引入細胞并且培養(yǎng)細胞。如上所述，這種抑制劑包括逆基因構(gòu)建物和反義寡核苷酸。由于Ii被抑制，內(nèi)源性產(chǎn)生的抗原(包括惡性特異性抗原)在培養(yǎng)的細胞表面上呈現(xiàn)。然后將培養(yǎng)的細胞再灌注至患有惡性腫瘤的患者。再灌注前，優(yōu)選阻斷細胞增生(例如用放射治療)。這種再灌注細胞刺激患者自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生直接針對惡性細胞的響應(yīng)。通過使用這種策略，刺激患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生直接特異性針對惡性細胞的自身免疫響應(yīng)。
除了使用從要治療的患者中分離的惡性細胞外，Ii合成抑制劑也可以被引入建立的惡性細胞培養(yǎng)物，或新鮮惡性組織的外植體中。在該方法中處理的細胞還可以用于上述類型的相關(guān)治療中。
另一方面，Ii抑制產(chǎn)物的鑒定，其用于修飾Ii蛋白表達方法的具體要求將導(dǎo)致用于控制自身免疫疾病的新治療和診斷方法。一個具體的實例是使用本發(fā)明產(chǎn)物和方法鑒定相關(guān)自身免疫疾病的自身決定子。MHC類型Ⅱ-正效細胞的Ii-反義治療導(dǎo)致結(jié)合了擴大的所有成分和/或增加量的自身決定子結(jié)合到MHC類型Ⅱ分子上。從其中Ii表達已經(jīng)被例如用上述組合物抑制的細胞而來的免疫純化的MHC類型Ⅱ分子中，可以洗脫那些呈現(xiàn)T細胞、疾病誘發(fā)的肽。這些自身決定子(其中一些是腫瘤特異性決定子)的發(fā)現(xiàn)是在開發(fā)疾病特異性的自身免疫治療中的第一步。一旦得到了這種自身決定子肽類，那么，開發(fā)新治療方法就僅僅是常規(guī)實驗了。
本發(fā)明另一方面涉及提高可以導(dǎo)致消除患者中不良細胞的內(nèi)源性抗原的出現(xiàn)。本發(fā)明這方面可以應(yīng)用到消除以存在非天然細胞內(nèi)蛋白(其是抗原上可區(qū)別于天然細胞內(nèi)蛋白)為特征的任何細胞。如上所述，惡性細胞包括在這類細胞中，因為它們含有，例如抗原上可區(qū)別于其天然細胞相應(yīng)物的致癌基因產(chǎn)物。除了上述惡性細胞外，可以通過抑制Ii表達消除其它非惡性細胞(例如病毒感染細胞)。在該方案中，在體外治療中可以使用Ii合成抑制劑?；蛘撸瑢⑦m于患者組織特異性表達的表達載體用于將逆基因構(gòu)建物引入到細胞或患者中。組織特異性調(diào)節(jié)信號可以提供用于這種治療方法中的精細表達需要。
例如，用Ii反義構(gòu)建物治療的病毒感染細胞可以提高導(dǎo)致破壞這些感染細胞和/或增加調(diào)節(jié)免疫球蛋白介導(dǎo)響應(yīng)病毒感染的輔助T淋巴細胞的病毒決定子的MHC類型Ⅱ的出現(xiàn)。為此，僅部分病毒感染的細胞需要用Ii反義構(gòu)建體外治療及再灌注患者。對于EB病毒感染的正常B細胞，且已經(jīng)證明其中Ii被大大過度表達以部分抑制抗-EBV免疫應(yīng)答，這種治療對于提高抗-EBV免疫應(yīng)答是有效的。同樣，對于HIV-感染的CD4+T淋巴細胞(可在活化后表達MHC類型Ⅱ抗原)，用抗-Ii構(gòu)建物治療這些細胞可以提高抗-HIV免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還可用于治療病原自身免疫疾病中。更具體地，在自身免疫疾病循環(huán)的某些階段提高內(nèi)源性抗原的出現(xiàn)的刺激，是為了降低調(diào)節(jié)病原性自身免疫應(yīng)答。例如，已經(jīng)證明，在某些動物關(guān)節(jié)炎模型(例如大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎)中，當(dāng)疾病侵入發(fā)展階段開始后，抑制因子T淋巴細胞(直接對抗開始病原過程的相同抗原決定子)將抑制這些免疫應(yīng)答。在疾病過程的降低調(diào)節(jié)的第二階段期間(臨床稱為緩解指示)，與Ii-反義構(gòu)建物接觸的細胞中的內(nèi)源性自身抗原出現(xiàn)的提高將減緩疾病。而且，Ii反義構(gòu)建物治療缺乏共同刺激信號的細胞(例如，沒有B7的細胞，或其中用B7反義構(gòu)建物治療抑制了B7的表達的細胞)將導(dǎo)致無反應(yīng)性的響應(yīng)。
實際中，首先用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從患者中分離細胞種群(例如淋巴細胞)。然后，將細胞種群如上所述用Ii合成抑制劑體外處理。然后監(jiān)視患者緩解信號。當(dāng)觀察到癥狀緩解(由預(yù)先確定的臨床信號和癥狀決定)后，用Ii合成抑制劑處理的細胞再灌注患者。
在本發(fā)明的另一方面，在控制組織特異性啟動子的情況下，可將通過Ii基因的基因插入使Ii蛋白表達增加應(yīng)用到抑制包括這些組織的自身免疫疾病中。適用Ii引入患者細胞的載體在文獻中已經(jīng)被詳細描述了。例如，在控制胰島素啟動子的情況下，插入Ii基因?qū)?dǎo)致提高糖尿病中被破壞的β細胞中的Ii表達。另外，在控制甲狀腺球蛋白啟動子的情況下，插入Ii基因?qū)?dǎo)致提高在某些形式甲狀腺炎中被破壞的甲狀腺雌酮細胞中的Ii表達。在預(yù)防自身免疫疾病中，這種構(gòu)建物的機理被認(rèn)為是隨著在細胞活化過程中Ii組成型表達增加，例如，病毒感染，可能發(fā)現(xiàn)其中MHC類型Ⅱα和β鏈的表達增加而Ii蛋白表達沒有隨之增加。沒有通過Ii蛋白“保護”的MHC類型Ⅱ抗原結(jié)合部位將發(fā)生增加自身抗原的出現(xiàn)。這種治療概念是一種為了提高自身決定子的出現(xiàn)而應(yīng)用Ii反義構(gòu)建物的鏡象概念。
實施例實施例1:逆基因構(gòu)建物的設(shè)計和合成如附圖1所示，將含有鼠Ii(mIi)基因的質(zhì)粒pcEXV-mIi31[Miller和Germain，《實驗藥物學(xué)雜志》(J.Experi.Med.)164:1478-1489(1986)]用限制內(nèi)切核酸酶Eco RI消化以釋放mIi基因。純化后，將mIi基因克隆到Bluescript載體(Stratagene)的Eco RJ結(jié)合部位。通過用BglI限制內(nèi)切核酸酶消化圖譜分析測定mIi基因的取向。如圖1選擇用轉(zhuǎn)錄SalI定向取向的含有mIi基因的Bluescript-mIi構(gòu)建物。
然后用限制內(nèi)切核酸酶SalⅠ和Bam HⅠ消化Bluescript-mIi構(gòu)建物以釋放含有mIi基因的片段。將該片段亞克隆至已經(jīng)被SalⅠ和Bam HⅠ內(nèi)切核酸酶消化的RSV.5表達載體上[Long,Hum.《免疫學(xué)》(Immunol.),31:229-235(1991)]。RSV.5載體也含有潮霉素抵抗基因，因此可以用潮霉素選擇。所得含有整個逆mIi基因的RSV.5--mIi反義構(gòu)建物被稱為RSV.5-mIi(R)。
將RSV.5-mIi(R)構(gòu)建物進一步用限制內(nèi)切核酸酶SalⅠ和SacⅠ消化。用這些酶消化產(chǎn)生的Ii編碼片段含47個5’未翻譯區(qū)的核苷酸和編碼序列的前94個核苷酸。用凝膠電泳純化長片段后，用Klenow DNA聚合酶處理Ii片段以填補SalⅠ和SacⅠ末端，因此得到平端。用T4 DNA連接酶連接該平端。所得含有Ii結(jié)構(gòu)基因的前94個核苷酸和在逆取向中上游序列的47個核苷酸的mIi反義質(zhì)粒被命名為RSV.5-mIi(SS)。
RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(SS)構(gòu)建物的構(gòu)建策略如附圖1所示。由Rous Sarcoma病毒長末端重復(fù)(LTR)的啟動子驅(qū)動的RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(SS)的反義質(zhì)粒構(gòu)建物可轉(zhuǎn)錄為反義RNA，與Ii mRNA互補，并因此而與Ii mRNA雜交，以使Ii mRNA失活。Ii cDNA插入RSV.5-mIi(SS)的序列在SEQ ID NO:4中給出。
實施例2:轉(zhuǎn)染的細胞系的產(chǎn)生將A20細胞[Kim等人，《免疫學(xué)》(Immunol.),122:549-554(1979)](15×106)用預(yù)熱的沒有血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)洗滌兩次并再懸浮在0.5ml RPMI-1640培養(yǎng)基中。將15μg質(zhì)粒DNA[RSV.5-mIi(R)或RSV.5-mIi(SS)]與細胞懸浮液混合。將該混合物用電穿孔儀在每0.5ml為300V,625μF的條件下進行電穿孔。將細胞懸浮液在室溫培養(yǎng)10分鐘。然后用10ml含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋該細胞并在24孔微量滴定盤中培養(yǎng)24小時。然后加入抗菌素潮霉素(每毫升800μg)用于選擇。每兩天改變一次含有每毫升800μg潮霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基直到看到克隆。用細胞內(nèi)抗-鼠Ii單克隆抗體，In.1[Koch,N.等人，《自然》(Nature),299:644-645(1982)]染色檢測Ii蛋白表達的抑制。在該鑒定中，將細胞涂片在顯微鏡的載玻片上，空氣干燥，固定在丙酮中并與大鼠抗-鼠Ii單克隆抗體培養(yǎng)40分鐘。用磷酸鈉緩沖的鹽水溶液洗滌載玻片兩次并與熒光黃異硫氰酸酯-標(biāo)記的山羊抗-鼠Ig(H,L)抗體培養(yǎng)。
實施例3在轉(zhuǎn)染細胞中Ii的表達將在A20細胞(A20)、用RSV.5-mIi(R)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A20細胞[A20(R)]、用RSV.5-mIi(SS)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A20細胞[A20(SS)]中的Ii蛋白表達通過用于內(nèi)源性Ii蛋白(用In.1單克隆抗體鑒定)的細胞內(nèi)免疫熒光染色定量。然后將染色細胞的載玻片用定量熒光圖象掃描顯微鏡檢查。每個試驗載玻片配以從作為陽性對照的A20細胞小孔來制備的載玻片。觀察對細胞中帶有逆基因構(gòu)建物的Ii表達的抑制。攜帶逆基因構(gòu)建物的細胞系中的Ii表達的抑制被表示為陽性對照的百分比。在兩個如表1所示的試驗中，用RSV.5-mIi(R)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒導(dǎo)致Ii合成的抑制為39.5％和71.9％。如表1所示，在用RSV.5-mIi(SS)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的兩個試驗中，觀察到Ii蛋白表達抑制為89.3％和95.3％。還如表1所示，獲得這些結(jié)果的同時，并沒有觀察到顯著影響MHC類型Ⅱ蛋白的表達的結(jié)果。在該表中，(R1)和(R2)，(SS1)和(SS2)分別是用RSV.5-mIi(R)和RSV.5-mIi(SS)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的患者的細胞系。
表1．在A20,A20(R)，和A20(SS)中Ii的表達細胞系 MHC類型Ⅱ的表達 Ii的表達A20 100100A20(R1) 96 60.5A20(R2) 99 28.1A20(SS1) 84 10.7A20(SS1) 92 4.7
實施例4用轉(zhuǎn)染細胞接種鼠的存活率在腫瘤細胞接種前，用0.5ml姥鮫烷/鼠灌注小鼠一星期。將每只小鼠用3×106下列物質(zhì)腹膜內(nèi)注射A20細胞(沒有攜帶質(zhì)粒)(在表2中稱為A20)，或A20(hygro)細胞(僅含有RSV.5質(zhì)粒)[在表2中稱為A20(hygro)]，或攜帶RSV.5-mIi(SS)質(zhì)粒的A20細胞[在表2中稱為“A20(SS)”]。分別測定接種三種類型細胞系的小鼠的存活率。接種A20細胞的小鼠的存活率與接種A20(hygro)細胞的小鼠的存活率沒有明顯不同。接種攜帶RSV.5-mIi(SS)質(zhì)粒的A20細胞的小鼠的存活率明顯長于用A20細胞或潮霉素抵抗質(zhì)粒(表2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A20細胞接種的小鼠的存活率。例如，在第22天，用攜帶RSV.5-mIi(SS)質(zhì)粒的A20細胞接種的小鼠存活率為100％，相比之下，僅用A20細胞，或只含有RSV.5質(zhì)粒的A20細胞接種的小鼠的存活率為40％。
表2.接受用有或沒有Ii反義的A20細胞處理的小鼠的存活百分?jǐn)?shù)天 細胞系A(chǔ)20 A20(hygro)A20(SS)2 100 100 1004 100 100 1006 100 100 1008 100 100 10010 80 80 10012 80 80 10014 40 40 10016 40 40 10018 40 40 10020 40 40 10022 40 40 10024 40 40 8026 20 20 6028 20 20 6030 020 4032 020 4034 020 4036 020 4038 020 4040 020 20
實施例5用反義寡核苷酸抑制Ii表達將A20細胞(105)在96孔微盤中，在37℃及在寡核苷酸1(SEQ ID NO:1),2(SEQ ID NO:2)，和3(SEQ ID NO:3)的混合物存在下的100μ1培養(yǎng)基中培養(yǎng)2.5小時。更具體地，試驗含有10,30或90μM每種寡核苷酸的三種寡核苷酸的混合物。如前所述，稱為SEQ ID NO:1的寡核苷酸是互補被認(rèn)為與翻譯起始有關(guān)的重要的Ii mRNA的區(qū)域；稱為SEQ ID NO:2的寡核苷酸是互補被認(rèn)為與內(nèi)含子剪接有關(guān)的重要的Ii mRNA的區(qū)域；及稱為SEQ ID NO:3的寡核苷酸是互補被認(rèn)為與聚腺苷酸化有關(guān)的重要的Ii mRNA的區(qū)域。
除去培養(yǎng)基并在相同濃度寡核苷酸1,2和3的存在下加入100μl標(biāo)記的培養(yǎng)基(沒有甲硫氨酸)和50μCi[35S]甲硫氨酸2.5小時。收集細胞并用磷酸鹽緩沖液洗滌并裂解。用抗-鼠Ii單克隆抗體，In.1免疫沉淀細胞裂解液。計算免疫沉淀物的放射性。通過放射性測定可知，寡核苷酸1,2和3的濃度分別為90μM時，Ii表達被抑制約66％?；旌衔餄舛葹?0μM和30μM時沒有效果。以試驗濃度的寡核苷酸應(yīng)用于患者時也沒有觀察到效果。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Antigen Express,Inc.
(ⅱ)發(fā)明名稱Ii合成的抑制(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)通信地址(A)收信人Kevin M.Farrell,P.C.
(B)街道P.O.Box 999(C)城市York Harbor(D)州ME(E)國家US(F)郵政編碼03911(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOC/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0,Version#1.25(ⅵ)本申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類
(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/661,627(B)申請日1996年6月11日(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Farrell.Kevin M.
(B)注冊號35,505(C)參考/案號REH-9501 WO(ⅸ)通訊信息(A)電話(207)363-0558(B)傳真(207)363-0528(2)SEQ ID NO:l信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CGTTGGTCATCCATGGCTCTAGCC 24
(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2CACACATACCTTTCTGGCTCTC22(2)SEQ ID NO:3 言息(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3GCGCTGCTGCTGTGCAGAGCTGG 23
(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長度141個堿基對(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4TGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGGAAAAACTAGAGATTAGAGCCATGGATGACCAAC 60GCGACCTCATCTCTAACCATGAACAGTTGCCCATACTGGGCAACCGCCCTAGAGAGCCAG 120AAAGGTGCAG CCGTGGAGCTC14權(quán)利要求
1．一種表達逆基因構(gòu)建物，包括編碼第一個mRNA分子的DNA分子，第一個mRNA分子互補編碼哺乳動物Ii蛋白的第二個mRNA分子，第一個mRNA分子的特征在于能與第二個mRNA分子雜交，因此抑制第二個mRNA分子的翻譯。
2．權(quán)利要求1的表達逆基因構(gòu)建物，其中DNA分子是cDNA分子。
3．權(quán)利要求2的表達逆基因構(gòu)建物，其中第一個mRNA分子與第二個mRNA分子在全長Ii編碼序列上互補。
4．權(quán)利要求1的表達逆基因構(gòu)建物，其中第一個mRNA分子互補部分第二個mRNA分子，該部分包括小于全長Ii編碼序列。
5．權(quán)利要求4的表達逆基因構(gòu)建物，其中第一個mRNA分子與第二個mRNA分子的一部分互補，所述的這一部分包括翻譯起始位點到至少部分第二個外顯子的部分。
6．權(quán)利要求5的表達逆基因構(gòu)建物，其中編碼第一個mRNA分子的DNA序列包括SEQ ID NO:4。
7．一種互補編碼哺乳動物Ii的mRNA分子的寡核苷酸，該寡核苷酸特征在于能與編碼哺乳動物Ii的mRNA分子特異性雜交，因此抑制mRNA分子的翻譯。
8．權(quán)利要求7的寡核苷酸，其互補翻譯起始位點。
9．權(quán)利要求8的寡核苷酸，包括SEQ ID NO:1。
10．權(quán)利要求7的寡核苷酸，其抑制內(nèi)含子剪接。
11．權(quán)利要求10的寡核苷酸，其互補第一個外顯子的部分3’末端和第一個內(nèi)含子的5’末端。
12．權(quán)利要求11的寡核苷酸，包括SEQ ID NO:2。
13．權(quán)利要求7的寡核苷酸，其互補末端編碼子的3’區(qū)域。
14．權(quán)利要求13的寡核苷酸，包括SEQ ID NO:3。
15．含有Ii表達抑制劑的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞。
16．權(quán)利要求15的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中類型Ⅱ-正效細胞是惡性細胞。
17．權(quán)利要求16的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中惡性細胞選自白血病，淋巴瘤和黑素瘤類。
18．權(quán)利要求16的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中相關(guān)抗原腫瘤肽在與MHC類型Ⅱ蛋白有關(guān)的細胞表面出現(xiàn)。
19．權(quán)利要求15的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中Ii表達抑制劑是表達逆基因構(gòu)建物，該表達逆基因構(gòu)建物包括編碼第一個mRNA分子的DNA分子，第一個mRNA分子互補編碼哺乳動物Ii蛋白的第二個mRNA分子，第一個mRNA分子的特征在于能與第二個mRNA分子雜交，因此抑制第二個mRNA分子的翻譯。
20．權(quán)利要求19的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中DNA分子是cDNA分子。
21．權(quán)利要求19的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中第一個mRNA分子與第二個mRNA分子在全長Ii編碼序列上互補。
22．權(quán)利要求19的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中第一個mRNA分子互補部分第二個mRNA分子，該部分包括小于全長Ii編碼序列。
23．權(quán)利要求22的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中第一個mRNA分子與第二個mRNA分子的一部分互補，所述的這一部分包括翻譯起始位點到至少部分第二個外顯子的部分。
24．權(quán)利要求15的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中編碼第一個mRNA分子的DNA序列包括SEQ ID NO:4。
25．權(quán)利要求15的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中Ii表達抑制劑包括互補編碼Ii的mRNA分子的寡核苷酸，該寡核苷酸特征在于能與mRNA分子雜交形成雙螺旋，因此抑制mRNA分子的翻譯。
26．權(quán)利要求25的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中寡核苷酸互補翻譯起始部位。
27．權(quán)利要求26的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中寡核苷酸包括SEQ ID NO:1。
28．權(quán)利要求25的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中寡核苷酸跨越Ii基因的第一和第二外顯子的接合點。
29．權(quán)利要求28的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中寡核苷酸包括SEQ ID NO:2。
30．權(quán)利要求25的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其互補末端信號的3’區(qū)域。
31．權(quán)利要求30的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其中寡核苷酸包括SEQ ID NO:3。
32．一類MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞，其表面上出現(xiàn)與自身決定子肽相關(guān)的MHC類型Ⅱ蛋白。
33．一種導(dǎo)致在MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞表面上出現(xiàn)與MHC類型Ⅱ蛋白相關(guān)的自身決定子肽的方法，該方法包括(a)提供MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞；及(b)向MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞引入Ii合成特異性抑制劑，該抑制劑的功能是直接或間接地作用于與mRNA編碼Ii形成雙螺旋，該雙螺旋分子形成的功能是在翻譯水平抑制Ii合成。
34．權(quán)利要求33的方法，其中Ii合成的特異性抑制劑包括互補mRNA編碼Ii的寡核苷酸。
35．權(quán)利要求34的方法，其中寡核苷酸互補選自翻譯起始部位，內(nèi)含子剪接連接，和翻譯末端編碼子的3’區(qū)域的部分編碼Ii的mRNA。
36．權(quán)利要求33的方法，其中Ii合成的特異性抑制劑包括表達逆基因構(gòu)建物，該構(gòu)建物包括編碼第一個mRNA分子的DNA分子，第一個mRNA分子互補編碼哺乳動物Ii蛋白的第二個mRNA分子，第一個mRNA分子的特征在于能與第二個mRNA分子雜交，因此抑制第二個mRNA分子的翻譯。
37．權(quán)利要求36的方法，其中DNA分子是cDNA分子。
38．權(quán)利要求36的方法，其中第一個mRNA分子與第二個mRNA分子在全長Ii編碼序列上互補。
39．權(quán)利要求36的方法，其中第一個mRNA分子互補部分第二個mRNA分子，該部分包括小于全長Ii編碼序列。
40．權(quán)利要求39的方法，其中第一個mRNA分子與第二個mRNA分子的一部分互補，所述的這一部分包括翻譯起始位點到至少部分第二個外顯子的部分。
41．權(quán)利要求40的方法，其中編碼第一個mRNA分子的DNA序列包括SEQ ID NO:4。
42．一種在MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞中治療惡性腫瘤的治療方法，該方法包括(a)提供用表達逆基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的MHC類型Ⅱ-正效惡性細胞系，該構(gòu)建物包括編碼第一個mRNA分子的DNA分子，第一個mRNA分子互補編碼哺乳動物Ii蛋白的第二個mRNA分子，第一個mRNA分子的特征在于能與第二個mRNA分子雜交，因此抑制第二個mRNA分子的翻譯；和(b)將轉(zhuǎn)染的人細胞系引入被診斷為具有惡性MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞的患者。
43．權(quán)利要求42的治療方法，其中用表達逆基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的MHC類型Ⅱ-正效人惡性細胞系是從開始由要治療的患者分離的MHC類型Ⅱ-正效惡性黑素瘤或B譜系細胞建立的。
44．權(quán)利要求43的治療方法，其中惡性B譜系細胞選自白血病和淋巴瘤類。
45．權(quán)利要求43的治療方法，其中相關(guān)抗原腫瘤肽在與MHC類型Ⅱ肽相關(guān)的轉(zhuǎn)染MHC類型Ⅱ-正效人惡性細胞系的表面上出現(xiàn)。
46．一種治療黑素瘤或B譜系惡性腫瘤的方法，其中該方法包括(a)提供MHC類型Ⅱ-正效人惡性細胞系；(b)向MHC類型Ⅱ正效人惡性細胞系引入互補編碼Ii的mRNA分子的寡核苷酸，該寡核苷酸的特征在于能與mRNA分子雜交形成雙螺旋，因此抑制mRNA分子翻譯；和(c)將步驟(b)中的MHC類型Ⅱ-正效人惡性細胞系引入至被診斷為黑素瘤B譜系惡性腫瘤的患者。
47．權(quán)利要求46的方法，其中用表達逆基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的MHC類型Ⅱ-正效人惡性細胞系是從開始由要治療的患者分離的MHC類型Ⅱ-正效惡性黑素瘤或B譜系細胞建立的。
48．權(quán)利要求47的方法，其中惡性腫瘤B譜系細胞選自白血病和淋巴瘤類。
49．權(quán)利要求47的治療方法，其中相關(guān)抗原腫瘤肽在與MHC類型Ⅱ肽相關(guān)的含有寡核苷酸MHC類型Ⅱ-正效人惡性細胞系的表面上出現(xiàn)。
50．用以下步驟分離的自身決定子肽(a)提供MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞；(b)向MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞引入Ii合成的特異性抑制劑，其功能是直接或間接地與編碼Ii的mRNA形成雙螺旋，該雙螺旋分子的形成在翻譯水平抑制Ii合成；(c)溶解步驟b)的MHC類型Ⅱ-正效抗原呈現(xiàn)細胞；(d)免疫純化MHC類型Ⅱ分子；及(e)從用酸處理的步驟d)的MHC類型Ⅱ分子中洗脫自身決定子肽。
51．一種從患者中消除不良細胞的方法，不良細胞的特征在于存在抗原上可區(qū)別于天然細胞內(nèi)蛋白的非-天然細胞內(nèi)蛋白，該方法包括(a)從患者中分離包括不良細胞的種群；(b)向該細胞種群引入Ii合成抑制劑，因此提高了從對不良細胞為特異性的非-天然細胞內(nèi)蛋白衍生的抗原決定子的出現(xiàn)；及(c)給患者再灌注經(jīng)過處理的步驟(b)的細胞種群。
52．權(quán)利要求51的方法，其中不良細胞是病毒感染細胞。
53．權(quán)利要求51的方法，其中不良細胞是惡性細胞。
54．一種治療患者自身免疫疾病的方法，包括(a)從患者中分離細胞種群；(b)用Ii合成抑制劑體外處理該細胞種群；(c)監(jiān)視患者緩解信號；及(d)檢出緩解信號后，給患者再灌注步驟b)的細胞。
55．一種在組織特異性自身免疫失調(diào)危險時預(yù)防組織特異性自身免疫失調(diào)開始的方法，包括(a)在控制組織特異性自身免疫失調(diào)影響組織中活化的啟動子的情況下提供含有Ii基因的表達構(gòu)建物；和(b)給組織特異性自身免疫開始失調(diào)前的危險時的患者引入步驟a)的表達構(gòu)建物。
全文摘要
公開了表達逆基因構(gòu)建物,和寡核苷酸,其特征在于能與Ii mRNA分子雜交,因此抑制Ii mRNA分子的翻譯。所涉及的組合物通常作為Ii表達的抑制劑。還公開了含有Ii表達抑制劑的MHC類型Ⅱ－正效抗原呈現(xiàn)細胞。特別重要的一類MHC類型Ⅱ－正效抗原呈現(xiàn)細胞是惡性MHC類型Ⅱ－正效抗原呈現(xiàn)細胞(例如白血病,淋巴瘤和黑素瘤)。還公開了導(dǎo)致與MHC類型Ⅱ蛋白相關(guān)的自身決定子肽在MHC類型Ⅱ－正效抗原呈現(xiàn)細胞表面上出現(xiàn)的方法。在該方法中,Ii合成的特定抑制劑被引入MHC類型Ⅱ－正效抗原呈現(xiàn)細胞。特定抑制劑的直接或間接功能是通過與mRNA編碼Ii形成雙螺旋分子。雙螺旋分子的形成功能在翻譯水平上抑制Ii合成。還公開了在MHC類型Ⅱ－正效抗原呈現(xiàn)細胞中治療惡性腫瘤的治療方法,和從MHC類型Ⅱ－正效抗原呈現(xiàn)細胞分離的自身決定子肽類。
文檔編號C12N15/63GK1225019SQ97196311
公開日1999年8月4日 申請日期1997年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月11日
發(fā)明者羅伯特·E·哈姆費雷斯, 徐民振 申請人:抗原表達公司