專利名稱：調(diào)節(jié)體重的化合物的篩選方法
1．引言本發(fā)明闡述用于處理如肥胖、厭食及惡病質(zhì)等體重失調(diào)的藥物篩選方法、和診斷及治療方法，這些方法涉及黑素皮質(zhì)素(melanocortin)受體(MC4-R)。本發(fā)明也闡述調(diào)節(jié)MC4-R活性或表達(dá)的化合物，和上述化合物在治療體重失調(diào)中的應(yīng)用。
2．發(fā)明背景已知黑素皮質(zhì)素(來源于阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin)翻譯后加工的各種不同的肽產(chǎn)物)具有系列廣泛的生理作用。除了眾所周知的對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能(如通過ACTH，促腎上腺皮質(zhì)激素)和對(duì)黑色素細(xì)胞(如通過α-MSH，促黑素細(xì)胞激素)作用外，黑素皮質(zhì)素表現(xiàn)為影響行為、學(xué)習(xí)和記憶、心血管系統(tǒng)的控制、痛覺缺失、體溫調(diào)節(jié)以及包括催乳激素、黃體激素和生物產(chǎn)生的胺類的其他神經(jīng)體液因子的釋放。從外周作用來看，黑素皮質(zhì)素被確認(rèn)為具有免疫調(diào)節(jié)作用和神經(jīng)營養(yǎng)特性，參與分娩有關(guān)的各種事件。
黑素皮質(zhì)素通過黑素皮質(zhì)素受體(MC-R)介導(dǎo)效應(yīng)，該受體為G-蛋白偶聯(lián)受體亞族。除了MC1-R被確認(rèn)為對(duì)α-MSH特異和MC2-R被確認(rèn)為對(duì)ACTH特異外，迄今為止克隆和確認(rèn)的黑素皮質(zhì)素受體(MC3-R、MC4-R、MC5-R)被認(rèn)作“弧兒”受體，即針對(duì)每一受體的天然配基的特性仍未被確定，每種類型受體的生理功能仍然未知。
野灰色蛋白是一種在小鼠中表達(dá)的基因產(chǎn)物，已知它涉及決定皮毛的顏色，但當(dāng)其正常的表達(dá)類型脫調(diào)節(jié)，蛋白到處表達(dá)時(shí)，也認(rèn)為野灰色蛋白在肥胖中起作用。然而，野灰色蛋白的受體一直來未被確定或被克隆，已知觀察到野灰色蛋白拮抗由MSH誘導(dǎo)的2種黑素皮質(zhì)素受體的活化。
2.1黑素皮質(zhì)素受體2種首先被克隆的黑素皮質(zhì)素受體是黑色素細(xì)胞MSH受體，MC1-R和腎上腺皮質(zhì)ACTH受體，MC2-R、(Moutioy等，1992,科學(xué)257:1248-1251；Chtajlani和Wikberg,1992,FEBS Lett.309:417-420)。接著，克隆到3種另外的黑素皮質(zhì)素受體基因，這些基因能識(shí)別黑素皮質(zhì)素核心七肽序列(MEHFRWG)。這些受體中的2種，MC3-R(Roselli-Rehfuss等，1993，美國國家科學(xué)院院報(bào)90:8856-8860；Gantz等，1993，生物化學(xué)雜志268:8246-8250)和MC4-R(Gantg等，1993，生物化學(xué)雜志268:15174-15179；Mountjoy等，1994,Mol.Endo.8:1298-1308)，已表明主要在腦中表達(dá)。第五種黑素皮質(zhì)素受體(最初稱為MC2-R)在許多外周器官及腦中表達(dá)(Chhajlani等，1993，生物化學(xué)生物物理研究通訊195:866-873；Gantz等，1994，生物化學(xué)生物物理研究通訊200:1214-1220)。后3種受體的天然配基和功能仍然未知。
因?yàn)樗鼈冏鳛槭荏w卻沒有確定的配基的“孤兒”狀態(tài)，和缺乏任何已知的針對(duì)這些新受體的生理作用，研究者們企圖通過它們對(duì)各種已知的黑素皮質(zhì)素(如見Roselli-Rehfuss,1993同上；和Gantz,1993同上)或來源于MSH和ACTH氨基酸序列的激動(dòng)劑和拮抗劑(如，見Hruby等，1995，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志38:3454-3461；和Adan等，1994，歐洲藥理學(xué)雜志269:331-337)的結(jié)合和反應(yīng)能力(例如，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào))，體外描述受體的特性。在另一種方法中，黑素皮質(zhì)素受體家族的成員，作為一種假定功能的工具，根據(jù)它們的組織分布類型加以劃分(如，見Gantz,1993，同上；和Mountjoy,1994，同上)。例如，MC1-R的表達(dá)被定位在黑色素細(xì)胞中，MC2-R被定位在腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中，而MC3-R和MC4-R主要在腦中但不在腎上腺皮質(zhì)或黑色素細(xì)胞中找到，MC4-R不在胎盤中表達(dá)，胎盤是大量表達(dá)MC3-R的組織。根據(jù)在腦海馬區(qū)表達(dá)類型，提出了MC4-R在學(xué)習(xí)和記憶中的作用(Gantz,1993，同上)，但注意到了“藥理學(xué)上自相矛盾的現(xiàn)象”，MC4-R對(duì)學(xué)習(xí)行為的保持有影響的已知化合物沒有良好地反應(yīng)(Mountjoy,1994，同上)。Mountjoy 1994進(jìn)一步建議MC4-R可能參與對(duì)視覺和感覺信息流或軀體動(dòng)作控制的協(xié)調(diào)方面的調(diào)節(jié)，和/或可能參與對(duì)心臟的自主性流出的調(diào)節(jié)。
因此，盡管上述的努力，MC3-R、MC4-R和MC5-R的天然配基和功能仍然難以捉摸。
2.2野灰色蛋白預(yù)見野灰色蛋白基因編碼一種在毛囊和表皮表達(dá)的分泌蛋白，該表達(dá)與野灰色表型有關(guān)的黃色素的合成相關(guān)(Miller等，1993，基因與發(fā)育7:454-467)野灰色基因的某些顯性突變導(dǎo)致野灰色蛋白在小鼠中脫調(diào)節(jié)性地廣泛表達(dá)，表現(xiàn)為包括肥胖和增加腫瘤易感性的多種效應(yīng)(Miller等，1993，同上；Michaud等，1993，基因與發(fā)育7:1203-1213)。在轉(zhuǎn)基因小鼠中，正常野生型的野灰色蛋白的異位表達(dá)導(dǎo)致在偶發(fā)的肥胖突變體中，常常觀察到的肥胖、糖尿病和皮毛黃色(Klebig等，1995，美國國家科學(xué)院院報(bào)92:4728-4732)。綜述可見Jackson,1993，自然362:587-588；Conklin和Bourne,1993，自然364:110；Siracusa,1 994,TIG 10:423-428；Yen等，1994,FASEB J8:479-488；Ezzell,1994,J.NIH Res.6:31-33；和Manne等，1995,Proc.Sci USA 92:4721-4724。
野灰色蛋白的受體仍未鑒別出來。據(jù)報(bào)道，在體外野灰色蛋白是結(jié)合到MC1-R和MC4-R的αMSH的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑(Lu等，1994，自然371:799-802)，作者推測(cè)，通過在毛囊外側(cè)表達(dá)的黑素皮質(zhì)素受體的拮抗作用，野灰色蛋白的異位表達(dá)可能導(dǎo)致肥胖。在這方面，已經(jīng)提出許多理論解釋野灰色蛋白的異位表位引起肥胖的原因。例如，野灰色蛋白在骨骼肌的表達(dá)，通過提高Ca2+水平可能導(dǎo)致胰島素抗性，高胰島素血癥和肥胖；或者野灰色蛋白在脂肪細(xì)胞中的異位表達(dá)可能降低脂肪水解；反之野灰色蛋白對(duì)胰腺β胰島細(xì)胞的直接效應(yīng)可能導(dǎo)致高胰島素血癥和肥胖；而另一種可能為野灰色蛋白在腦中表達(dá)可能導(dǎo)致肥胖是因?yàn)橹饕饔糜趯?duì)控制體重調(diào)節(jié)和胰島素產(chǎn)生的大腦區(qū)域(見Klebig,1995，同上)。
總之，野灰色蛋白誘導(dǎo)小鼠肥胖的機(jī)制仍屬未知，這種現(xiàn)象與人類肥胖表型的相關(guān)性，如果有任何聯(lián)系的話，也未確立。
3．發(fā)明概述本發(fā)明闡述應(yīng)用MC4-R作為靶點(diǎn)，鑒別治療如肥胖、厭食和惡病質(zhì)等體重失調(diào)化合物的藥物篩選方法。本發(fā)明還闡述通過MC4-R調(diào)節(jié)體重的化合物。本發(fā)明也闡述通過MC4-R為靶點(diǎn)治療體重失調(diào)。
本發(fā)明部分依據(jù)于MC4-R在體重調(diào)節(jié)中的特別作用的發(fā)現(xiàn)。如在此表明一樣，完全缺乏MC4-R的小鼠出現(xiàn)和飲食亢進(jìn)、高胰島素血和高血糖相關(guān)的成熟發(fā)作肥胖綜合癥。特別是與MC4-R雜合子或野生型雌性同窩鼠相比較，編碼MC4-R基因缺陷的敲除小鼠表現(xiàn)為明顯的體重增加。本發(fā)明部分也依據(jù)于如下的發(fā)現(xiàn)，已知當(dāng)在小鼠中，異位性表達(dá)涉及肥胖表型的野灰色蛋白，能與MC4-R結(jié)合。
進(jìn)一步來說，本發(fā)明部分依據(jù)于如下的發(fā)現(xiàn)，已找到MC4-R的突變存在于極度肥胖的病人中。在各種激動(dòng)劑存在下測(cè)定cAMP誘導(dǎo)變化，比較野生型和突變受體的信號(hào)傳遞反應(yīng)顯示突變受體的受損的信號(hào)傳遞。
本發(fā)明闡述針對(duì)篩選調(diào)節(jié)MC4-R活性的化合物或組合物的方法，即化合物或組合物作為MC4-R的激動(dòng)劑或拮抗劑起作用。因而調(diào)節(jié)體重控制。為達(dá)到該目的，基于細(xì)胞的方法或非基于細(xì)胞的方法能用于檢測(cè)和MC4-R細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(“ECD”)相互作用，如能與其結(jié)合的化合物?；诩?xì)胞的方法優(yōu)點(diǎn)是它們能用于鑒別影響MC4-R生物活性(即，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))的化合物，包括鑒別不和MC4-R ECD相互作用，但能與由MC4-R介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細(xì)胞內(nèi)組分作用的化合物。
本發(fā)明也闡述用作篩選調(diào)節(jié)MC4-r基因表達(dá)的化合物或組合物的方法。例如，基于細(xì)胞的方法或細(xì)胞裂解物的方法(如，體外轉(zhuǎn)錄或翻譯的方法)能用于篩選調(diào)節(jié)MC4-r轉(zhuǎn)錄的化合物或組合物(例如，調(diào)節(jié)涉及MC4-r基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，產(chǎn)生或活性的化合物；與MC4-r調(diào)節(jié)區(qū)形成三鏈螺旋結(jié)構(gòu)，抑制MC4-r基因轉(zhuǎn)錄的多核苷酸等)。另一種方法是，基于細(xì)胞的方法或細(xì)胞裂解物的方法能用于篩選調(diào)節(jié)MC4-R轉(zhuǎn)錄體翻譯的化合物或組合物(如，反義分子和核酶分子)。
而在另一個(gè)實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的方法或細(xì)胞裂解物的方法能用于體內(nèi)測(cè)定用作修飾MC4-r基因表達(dá)的多核苷酸構(gòu)建體。上述構(gòu)建體包括用作基因治療的多核苷酸構(gòu)建體；如在強(qiáng)啟動(dòng)子系統(tǒng)，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子系統(tǒng)或組成性啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制下置有MC4-r基因的表達(dá)構(gòu)建體或基因取代構(gòu)建體。
本發(fā)明也包括MC4-R的激動(dòng)劑和拮抗劑，包括小分子、大分子和抗體，以及能用于抑制MC4-r基因表達(dá)的核苷酸序列(如反義分子和核酶分子)，用作增強(qiáng)MC4-r基因表達(dá)的基因構(gòu)建體或調(diào)節(jié)序列取代構(gòu)建體(如，在強(qiáng)啟動(dòng)子系統(tǒng)控制下置有MC4-r基因的表達(dá)構(gòu)建體)。上述化合物可用于治療體重失調(diào)。
此外，本發(fā)明描述包括肥胖、厭食和惡病質(zhì)的體重失調(diào)的診斷評(píng)價(jià)和預(yù)后的方法，和鑒別易于出現(xiàn)上述病情的患者的方法。例如，編碼MC4-R的核苷酸分子能用作診斷雜交探針或診斷PCR方法的引物，用于部分根據(jù)在人類肥胖患者鑒別出MC4-R突變體而在MC4-R基因中鑒別MC4-R的基因突變、等位基因變異和調(diào)節(jié)缺陷。
本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)MC4-R活性或MC4-r基因表達(dá)以治療體重失調(diào)的上述化合物和組合物，包括基因治療方法的應(yīng)用。
3.1．定義在此使用的下列措詞具有所說明的意義。
MC4-r核苷酸或編碼序列意指編碼MC4-R mRNA轉(zhuǎn)錄體、MC4-R蛋白、MC4-R蛋白的多肽或肽片段、或MC4-R融合蛋白的DNA序列。MC4-r核苷酸序列包括DNA、包括基因組DNA(如，MC4-r基因)或cDNA。MC4-R蛋白的多肽或肽片段稱為MC4-R多肽或MC4-R肽。MC4-R融合體、或MC4-R多肽、或相對(duì)于非相關(guān)蛋白的肽片段在此稱作MC4-R融合蛋白。功能性的MC4-R指的是體內(nèi)或體外能與黑素皮質(zhì)素蛋白結(jié)合的蛋白。
ECD意為“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”。
TM意為“跨膜結(jié)構(gòu)域”。
CD意為“細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”。
4．附圖描述

圖1．推導(dǎo)的黑素皮質(zhì)素受體的氨基酸序列。黑素皮質(zhì)素受體的螺旋形結(jié)構(gòu)預(yù)示為位于TM結(jié)構(gòu)域之間的親水性結(jié)構(gòu)域交替地排列在細(xì)胞外側(cè)和細(xì)胞中，以形成受體的ECD(圖1中，氨基酸殘基為1-74、137-155、219-231和305-316)和CD(在圖1中，氨基酸殘基為102-112、178-197、251-280和339-末端)。預(yù)期的跨膜結(jié)構(gòu)域用上線和羅馬數(shù)字表示，也顯示了4個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD1、ECD2、ECD3和ECD4)和4個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD1、CD2、CD3和CD4)。
圖2.MC4-R靶向載體構(gòu)建體的示意圖。圖2A:MC4-R基因座的部分限制性圖譜。圖2B:MC4 KO 5′構(gòu)建體，含有在載體pJN2中來自MC4-R基因3′端的基因組序列。圖2C:MC4-R KO 5′3′構(gòu)建體，其中來自MC4-R基因5′端的基因組序列已被插入到MC4KO 5′構(gòu)建體中。圖2D:MC4-R KO 5′3′neo構(gòu)建體，其中neo表達(dá)盒已被插入到MC4-R基因的5′和3′側(cè)翼序列之間。點(diǎn)線代表pJN2載體?？湛虼鞵GK-neo表達(dá)盒，影線框代表MC4-R基因，箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。
圖3．滅活MC4-R的基因靶向策略的示意圖。圖3A:MC4-R基因座圖解。影線框代表MC4-R編碼序列，實(shí)線框顯示用于鑒別同源重組體的SacⅠ-SphⅠ探針的位置。箭頭表示MC4-R基因轉(zhuǎn)錄的方向。圖3B:MC4-R靶向構(gòu)建體的圖解。點(diǎn)線代表pJN2質(zhì)粒序列，箭頭表示neo轉(zhuǎn)錄的方向。圖3C:與具有靶向載體的同源性重組體鄰接的MC4-R基因座的圖解。圖3D:用所示的酶消化和周SacⅠ-SphⅠ探針探測(cè)的野生型和突變的MC4-R基因座的預(yù)示的限制性片段長度。圖3E:Southern印跡分析來自F2子代尾巴DNA的放射自顯影圖?；蚪MDNA用ApaⅠ或NcoⅠ消化，如圖所示，用在(A)中顯示的放射性標(biāo)記的探針雜交，然后洗去，用由人MC4-R編碼序列組成的放射性探針重新雜交。+/+、+/-和-/-分別表示來自野生型、雜合子和純合子F2同窩子代的DNA。
圖4.MC4-R缺陷和對(duì)照同窩小鼠的重量增加。每條線表示一只小鼠的重量增加。圖4A雌性純合(-/-)突變小鼠(實(shí)方形)和野生型(+/+)F2對(duì)照(空?qǐng)A圈)的重量增加。在所示的時(shí)間點(diǎn)給出了9只純合和12只對(duì)照小鼠的重量。圖4B雌性雜合(+/-)突變小鼠(×)和野生型(+/+)F2對(duì)照(空?qǐng)A圈)的重量增加。在所示的時(shí)間點(diǎn)，給出了18只雜合小鼠和12只對(duì)照小鼠的重量。圖4C雄性純合(-/-)突變小鼠(實(shí)方形)和野生型(+/+)F2對(duì)照(空?qǐng)A圈)的重量增加。在所示的時(shí)間點(diǎn)，給出了9只純合小鼠和17只對(duì)照小鼠的重量。圖4D雄性雜合(+/-)突變小鼠(×)和野生型(+/+)F2對(duì)照(空?qǐng)A圈)的重量增加。在所示的時(shí)間點(diǎn)，給出了18只雜合小鼠和17只對(duì)照小鼠的重量。
圖5.人MC4-R的序列。跨膜結(jié)構(gòu)域有下劃線。大鼠MC4-R的氨基酸差異顯示在人序列之下。
圖6.MC4-R缺陷小鼠的線性增加生長。雌性(空柱)和雌性(交叉影線柱)的鼠體長大約在19周齡(132～138天)測(cè)量。圖中各柱顯示12只野生型(+/+)和9只純合突變(-/-)雌性F2小鼠以及15只野生型、20只雜合和9只純合突變雄性F2小鼠的平均長度。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤，星號(hào)表示在相似的性別中與野生型的值相比較的顯著性差異(由雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)為p＜0.02)。
圖7.缺乏MC4-R的小鼠為飲食過量。配對(duì)分籠的雌性小鼠的食物吸收，在2周內(nèi)每個(gè)工作日測(cè)定?？罩韺?duì)一籠的2只Ay和2只對(duì)照C57 BL/6小鼠的每一只，8次測(cè)定的平均值。影線柱代表2只純合突變小鼠(-/-)和2只F2野生型對(duì)照(+/+)的2籠的每一籠，8次測(cè)定的平均值。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。星號(hào)表示Ay與C57BL/6相比較、或MC4-R(-/-)純合突變小鼠與MC4-R(+/+)野生型F2小鼠相比較的顯著差異性(由雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)為p＜0.01)。
圖8.缺乏MC4-R小鼠的血清葡萄糖、胰島素和leptin的水平。對(duì)同樣的血清樣品逐一測(cè)定葡萄糖、胰島素和leptin?？罩黼s合型小鼠，陰影柱代表純合突變小鼠。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。星號(hào)表示在相同的性別和年齡組中，與對(duì)照比較的顯著差異性(由雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)為p＜0.05)。對(duì)雌性小鼠來說，在4-8周、10-14周和17-23周的野生型小鼠的n值分別為11、14和7，而純合突變小鼠的n值分別為7、11和3。對(duì)雄性小鼠來說，在4-8周、10-14周和17-23周的野生型小鼠的n值分別為14、14和6，而純合突變小鼠分別為8、8和9。圖8A和8B分別為雌性和雄性小鼠的血清葡萄糖水平。用葡萄糖氧化酶法分析了5μl的血清。圖8C和8D分別為雌性和雄性小鼠的血清胰島素水平，用放射免疫法以大鼠胰島素為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。圖8E和8F分別為雌性和雄性小鼠的血清leptin水平。用放射免疫法測(cè)定。
圖9.MC4-R基因缺失不影響基礎(chǔ)血清皮質(zhì)酮。在含有代表每種基因型動(dòng)物+/+野生型對(duì)照、+/-雜合子、-/-純合突變的3組性別配對(duì)的同窩鼠中，測(cè)定血清皮質(zhì)酮的水平。自左至右組分別為雄性、雌性和雄性。雄性為15周齡，雌性為18周齡。數(shù)據(jù)表示用不同日獲得的2個(gè)血清樣品進(jìn)行測(cè)定的平均值。每日的測(cè)定用重復(fù)的樣品進(jìn)行。線條表示標(biāo)準(zhǔn)差。通過雙向ANOVA數(shù)據(jù)分析顯示基因型的作用，在皮質(zhì)酮水平方面沒有顯著差異。
圖10.MC4-R基因缺失不影響腦POMC mRNA水平。圖10A、10B和10C，蘇木精和伊紅染色分別來自野生型、雜合、和純合突變MC4-R缺乏小鼠的腦切片。圖10D、10E和10F，用35S-POMC反義cDNA探針與分別來自野生型、雜合和純合突變MC4-R缺乏小鼠的腦切片雜交的放射自顯影圖。
圖11A-11B.突變的MC4-R序列。突變?yōu)镮le137Thr(T變C)突變。
圖12A-12B.突變的MC4-R序列。突變?yōu)閂al102Ile(G變A)突變。
圖13A-13B.突變的MC4-R序列。突變?yōu)門hr112Met(C變T)突變。
圖14.I137T突變受體受損的信號(hào)通路。比較了野生型(wt)和突變(mt)受體對(duì)5種內(nèi)源黑素皮質(zhì)素，α-MSH(阿爾發(fā))、β-MSH(貝塔)、γ1-MSH9(伽馬1)、γ2-MSH(伽馬2)和ACTH的信號(hào)傳遞反應(yīng)。
5．發(fā)明詳述以下部分描述的發(fā)明包括篩選方法(如，測(cè)定法)，以鑒別影響體重調(diào)節(jié)的化合物。本發(fā)明也包括MC4-R的激動(dòng)劑和拮抗劑，包括小分子、大分子和抗體，以及用于抑制MC4-r-基因表達(dá)的核苷酸序列(如，反義分子和核酶分子)、用作增強(qiáng)MC4-r基因表達(dá)的基因構(gòu)建體或調(diào)節(jié)序列取代構(gòu)建體(如，在強(qiáng)啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制下置有MC4-r基因的表達(dá)構(gòu)建體)。上述化合物可用于治療體重失調(diào)。
尤其是，所述的細(xì)胞和非細(xì)胞的測(cè)定法能用于鑒別和MC4-R相互作用的化合物，例如調(diào)節(jié)MC4-R的活性和/或與MC4-R結(jié)合的化合物?；诩?xì)胞的測(cè)定法能用于鑒別影響MC4-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的化合物或組合物，不管它們與MC4-R結(jié)合或與涉及MC4-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細(xì)胞內(nèi)因子作用。本發(fā)明的、上述基于細(xì)胞的測(cè)定法使用表達(dá)MC4-R的細(xì)胞、細(xì)胞系或工程細(xì)胞或工程細(xì)胞系。細(xì)胞能進(jìn)一步進(jìn)行工程操作以摻入與由活化的MC4-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物連接的報(bào)告基因分析，有助于鑒別調(diào)節(jié)MC4-R信號(hào)傳遞活性的化合物。
本發(fā)明還包括應(yīng)用基于細(xì)胞的測(cè)定法或細(xì)胞裂解物測(cè)定法(如體外轉(zhuǎn)錄或翻譯測(cè)定法)，以篩選調(diào)節(jié)MC4-r基因表達(dá)的化合物或組合物。為達(dá)到這個(gè)目的，含連接有MC4-r基因調(diào)節(jié)元件的報(bào)告序列的構(gòu)建體能用在工程化的細(xì)胞中或細(xì)胞裂解提取物中，以篩選在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)報(bào)告基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物。例如，上述測(cè)定法能用于篩選調(diào)節(jié)涉及在MC4-r基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性的化合物，或測(cè)試三鏈螺旋多核苷酸的活性。另一種方法為工程化的細(xì)胞或翻譯提取物能用于篩選調(diào)節(jié)MC4-R mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯，因而影響MC4-R表達(dá)的化合物(包括反義構(gòu)建體和核酶構(gòu)建體)。
本發(fā)明也包括用于非基于細(xì)胞的篩選測(cè)定法，用于產(chǎn)生抗體和用作診斷及治療的MC4-R蛋白、多肽(包括可溶性MC4-R多肽或肽)和MC4-R融合蛋白。預(yù)示MC4-R為跨膜7次的螺旋形受體，形成4個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECDs)和4個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)域(見圖1)。與每個(gè)ECD相應(yīng)的肽段，或包括組或多組4個(gè)ECDs連接在一起的多肽能用5.3.1節(jié)下部分所述的方法進(jìn)行工程化處理?？蛇x擇的方法為上述肽段或多肽能與例如報(bào)告基因，Ig Fc區(qū)等的異源蛋白融合，而產(chǎn)生融合蛋白。上述肽段、多肽和融合蛋白能用在基于非細(xì)胞的測(cè)定法中，以篩選與MC4-R相互作用，例如調(diào)節(jié)MC4-R活性或與MC4-R結(jié)合的化合物。
MC4-R蛋白產(chǎn)物能用于治療諸如肥胖、厭食或惡病質(zhì)的體重失調(diào)。上述MC4-R蛋白產(chǎn)物包括但不局限于與1個(gè)或多個(gè)MC4-RECDs相應(yīng)的如肽段或多肽的可溶性衍生物；缺乏1個(gè)或多個(gè)ECD或TM的截短的MC4-R多肽和MC4-R融合蛋白產(chǎn)物(特別是MC4-R-Ig融合蛋白，即MC4-R或MC4-R的1個(gè)結(jié)構(gòu)域與1個(gè)IgFc的結(jié)構(gòu)域融合)。另一種方法是針對(duì)MC4-R的抗體或模擬MC4-R抗獨(dú)特型抗體(包括Fab片段)，拮抗劑或激動(dòng)劑(包括在MC4-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，調(diào)節(jié)可能對(duì)下游靶物起作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物)能用于治療諸如肥胖、厭食或惡病質(zhì)的體重失調(diào)。
例如，服用有效量可溶的MC4-R多肽，或MC4-R融合蛋白(如，MC4-R ECD-IgFc)或模擬MC4-R ECD抗獨(dú)特型的抗體(或其Fab)能相互作用，因此“抹去(mop up)”或“中和”內(nèi)源的MC4-R配基，防止或降低導(dǎo)致體重增加的結(jié)合和受體活化。而在另一方法中，編碼上述MC4-R產(chǎn)物的核苷酸構(gòu)建體能用遺傳工程法導(dǎo)入宿主細(xì)胞以體內(nèi)表達(dá)上述MC4-R產(chǎn)物；這些遺傳工程化的細(xì)胞在體內(nèi)起“生物反應(yīng)器”的作用，持續(xù)地供給傳送“抹去”或“中和”MC4-R配基的MC4-R、MC4-R肽、可溶的MC4-R多肽或MC4-R融合蛋白。
在治療體重失調(diào)中，調(diào)節(jié)MC4-R表達(dá)和/或活性的“基因治療”方法也在本發(fā)明的范圍之中。例如，編碼功能性的MC4-Rs、突變的MC4-Rs和反義分子及核酶分子的核苷酸構(gòu)建體能用于調(diào)節(jié)MC4-r表達(dá)。
本發(fā)明還包括治療體重失調(diào)的藥物制劑和方法。
5.1.MC4-R在體重調(diào)節(jié)中的作用通過遺傳工程法“敲除”MC4-R的小鼠研究了MC4-R蛋白在體內(nèi)的特異作用，這種小鼠中大部分內(nèi)源的MC4-R基因序列缺乏，因而創(chuàng)造了不能產(chǎn)生功能性MC4-R蛋白的小鼠。不像復(fù)雜的MC-R激動(dòng)劑/拮抗劑研究，因?yàn)椴粌H是MC4-R、每個(gè)MC受體都會(huì)被影響，這種特異地僅消除MC4-R功能將允許做MC4-R生物學(xué)功能的評(píng)價(jià)。
為產(chǎn)生MC4-R敲除小鼠，利用人MC4-r基因序列分離和克隆鼠MC4-r基因。然后，依靠和內(nèi)源MC4-r基因同源重組，產(chǎn)生了用作刪除大部分鼠MC4-r編碼序列的鼠MC4-r靶向構(gòu)建體。產(chǎn)生的含有破壞的MC4-r基因的胚胎性干(ES)細(xì)胞，被分離、微注射到鼠囊泡中而產(chǎn)生含有破壞的MC4-r基因細(xì)胞的嵌合小鼠。獲得了來自ES基因組胚系傳遞的嵌合小鼠的子代，鑒別出對(duì)破壞的(disrupted)MC4-R雜合的動(dòng)物。
為評(píng)價(jià)MC4-R在體內(nèi)的作用，對(duì)MC4-r破壞基因來說雜合的動(dòng)物養(yǎng)在一起，產(chǎn)下的同窩鼠含有野生型小鼠、雜合的MC4-r突變小鼠和純合的MC4-R突變小鼠。通過基因打靶法失活MC4-R得到的小鼠，出現(xiàn)了和飲食過量、高胰島素血和高血糖有關(guān)的成熟始發(fā)肥胖綜合癥。
定期測(cè)定動(dòng)物的體重增加。與對(duì)MC4-R缺失雜合的小鼠和野生型小鼠比較，純合無效MC4-R突變小鼠出現(xiàn)重量增加早于25天齡。大約到5周齡，大部分純合突變鼠，無論雄性和雌性，比相同性別的野生型子代更重，到7周齡，所有無效突變小鼠比對(duì)照更重(圖4A和4C)。到15周齡，純合突變雌性鼠平均比野生型子代重2倍，而純合突變雄性鼠比野生型對(duì)照更重約50％。對(duì)MC4-R缺失雜合小鼠顯示的重量增加為野生型和純合突變子代的中間值(圖4B和4D)，這說明去除MC4-R的基因劑量對(duì)體重調(diào)節(jié)的影響。
此外，如在圖6說明那樣，MC4-R缺失小鼠明顯地比野生型對(duì)照長。純合突變雌性鼠的平均長度，相對(duì)于野生型F2小鼠增加約11％，而雜合雌性鼠比對(duì)照長約7％。雄性純合小鼠和雜合小鼠分別比對(duì)照長約8％和2.5％。相對(duì)于野生型F2對(duì)照鼠，MC4-R缺少還導(dǎo)致食物消耗明顯增加(46％)。
從MC4-R缺失小鼠中收集血液，測(cè)定血清水平的葡萄糖、胰島素和leptin濃度。在對(duì)MC4-R缺失雜合或純合的雌性鼠中，血清葡萄糖水平基本上沒有變化，但雜合和純合雄性鼠為高血糖(圖8A和8B)。雄性和雌性小鼠中也找到了高胰島素血(圖8C和8D)。雜合突變鼠為高胰島素血，盡管比純合突變體更少。除了葡萄糖和胰島素外，血清leptin水平在MC4-R缺失小鼠中也有改變(圖8R和8F)。就絕大部分而言，雜合小鼠顯示的leptin水平為野生型小鼠和純合突變小鼠觀察值之間的中間值。
在此描述的敲除實(shí)驗(yàn)代表MC4-R在體重調(diào)節(jié)中的作用的說明性證據(jù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不依賴于野灰色配基對(duì)MC4-R功能作用特性的關(guān)系，即使有任何關(guān)系也是如此。
此外，MC4-R在體重調(diào)節(jié)中的作用，可通過在肥胖病人中發(fā)現(xiàn)MC4-R變異的突變形式加以說明。在各種激動(dòng)劑存在下通過cAMP誘導(dǎo)測(cè)定，比較野生型和突變受體的信號(hào)傳遞反應(yīng)顯示突變受體受損的信號(hào)傳遞。和野生型受體相比較，突變型有更低的最大活化值，即所獲的最大cAMP水平更低；而通常具有更高的EC50值，即達(dá)到半數(shù)最大活化所需的激動(dòng)劑濃度更高。在非常高的激動(dòng)劑濃度存在下，突變受體僅勉強(qiáng)活化，該濃度在體內(nèi)生理?xiàng)l件下不可能達(dá)到。
5.2.用于調(diào)節(jié)體重的藥物的篩選法在本節(jié)下面描述至少3種不同的測(cè)定系統(tǒng)，能用于鑒別調(diào)節(jié)MC4-R活性或MC4-r基因表達(dá)，因而調(diào)節(jié)體重控制的化合物或組合物。
以下所述的系統(tǒng)可配成試劑盒。為達(dá)到該目的，MC4-R或表達(dá)MC4-R的細(xì)胞能包裝在各種各樣的容器中，如小瓶、管、微滴定孔板、大瓶等等。在其他試劑也能包括在不同的容器中，提供作試劑盒，如，陽性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、黑素皮質(zhì)素肽(包括但不局限于αMSH和ACTH衍生物)、緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)基等。
5.2.1.基于細(xì)胞的測(cè)定法根據(jù)本發(fā)明，基于細(xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)能用于篩選調(diào)節(jié)MC4-R活性而因此調(diào)節(jié)體重的化合物。為達(dá)到這個(gè)目的，內(nèi)源性表達(dá)MC4-R的細(xì)胞能用于篩選化合物。另一種方法是細(xì)胞系，如293細(xì)胞、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等被遺傳工程處理而表達(dá)MC4-R，這些細(xì)胞能用作篩選目的。優(yōu)選的是遺傳工程處理而表達(dá)對(duì)由黑素皮質(zhì)素肽活化有反應(yīng)的功能性受體的宿主細(xì)胞，能用作測(cè)定的終點(diǎn)，例如，用作測(cè)定由化學(xué)、生理、生物或表型的變化，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞基因或報(bào)告基因，cAMP水平的變化，腺苷環(huán)化酶活性，宿主細(xì)胞G蛋白活性，細(xì)胞外酸化率，宿主細(xì)胞激酶活性，增殖，分化等。
此外，基于細(xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)能用于篩選調(diào)節(jié)突變的MC4-R活性而因此調(diào)節(jié)體重的化合物。例如，可鑒別增加突變的MC4-R活性的化合物而因此減輕由突變的MC4-R引起的體重失調(diào)癥狀。細(xì)胞系如293細(xì)胞、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等可被遺傳工程處理而表達(dá)突變受體。另一種方法是，內(nèi)源性表達(dá)突變的MC4受體的細(xì)胞能用于篩選化合物。
為用于篩選測(cè)定法中，表達(dá)功能性的MC4-R的宿主細(xì)胞應(yīng)對(duì)MC4-R配基產(chǎn)生明顯反應(yīng)，優(yōu)選的是大于背景5倍的誘導(dǎo)活性。根據(jù)讀出數(shù)值，優(yōu)選的宿主細(xì)胞應(yīng)擁有許多特性，使由黑素皮質(zhì)素肽引起的誘導(dǎo)反應(yīng)最大化。例如，為檢測(cè)CRE報(bào)告基因的強(qiáng)誘導(dǎo)(a)cAMP的低自然水平，(b)能與MC4-R相互作用的G蛋白，(c)高水平的腺苷環(huán)化酶，(d)高水平的蛋白激酶A，(e)低水平的磷酸二酯酶，和(f)高水平的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白會(huì)是有利的。為增加對(duì)黑素皮質(zhì)素肽的反應(yīng)，宿主細(xì)胞可進(jìn)行工程處理，以表達(dá)更大量的有利因子或更少量的不利因子。此外，誘導(dǎo)CRE報(bào)告基因的替代通路可被消除，以降低基礎(chǔ)水平。
在應(yīng)用上述細(xì)胞系統(tǒng)中，表達(dá)黑素皮質(zhì)素受體的細(xì)胞與測(cè)試化合物或載體對(duì)照(如安慰劑)接觸。接觸后，細(xì)胞可被進(jìn)行測(cè)定黑素皮質(zhì)素受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組分的表達(dá)和/或活性，或者可測(cè)定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路本身的活性。例如，接觸后，細(xì)胞裂解液可進(jìn)行誘導(dǎo)cAMP測(cè)定。測(cè)試化合物增加cAMP水平的能力，高于用載體對(duì)照處理的細(xì)胞所觀察到的水平，表明測(cè)試化合物誘導(dǎo)了通過宿主細(xì)胞表達(dá)的黑素皮質(zhì)素受體所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
為測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，可使用閃爍親近測(cè)定法(SPA)(SPA試劑盒可通過Amersham生命科學(xué)公司提供，伊利諾斯)。測(cè)定使用125I標(biāo)記的cAMP，抗cAMP的抗體和摻入閃爍劑包被有第二抗體的微球。當(dāng)通過標(biāo)記的cAMP抗體復(fù)合物帶到微球非常接近的位置時(shí)，125I將激發(fā)閃爍液發(fā)射光線。從細(xì)胞中提取沒有標(biāo)記的cAMP與125I標(biāo)記的cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，因此減弱閃爍作用。測(cè)定可在96孔板中進(jìn)行，以能作高通量篩選，如由Wallac或PAckard制造的基于96孔板的閃爍計(jì)數(shù)儀可用于讀出數(shù)據(jù)。
在篩選可能作MC4-R拮抗劑作用的化合物中，必需包括活化MC4-R如α-MSH、β-MSH或ACTH的配基，以測(cè)定與載體對(duì)照相比由測(cè)試化合物引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制作用。
在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，含與各種不同的報(bào)告基因的任一種連接的cAMP反應(yīng)元件的構(gòu)建體可導(dǎo)入到表達(dá)黑素皮質(zhì)素受體的細(xì)胞中。上述報(bào)告基因可包括但不局限于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢光素酶、GUS、生長激素或胎盤堿性磷酸酶(SEAP)。細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸后，報(bào)告基因的表達(dá)水平可定量以確定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)受體活性的能力。堿性磷酸酶測(cè)定法尤其適用于本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中，因?yàn)樵撁改軓募?xì)胞中分泌出來。因此，組織培養(yǎng)液上清可作分泌的堿性磷酸酶測(cè)定。此外，堿性磷酸酶活性可通過如在Bronstein I等(1994，生物技術(shù)17:172-177)所述的比色法、生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。上述測(cè)定法提供了一種進(jìn)行藥物篩選的簡單、敏感、易于自動(dòng)化的檢測(cè)系統(tǒng)。
當(dāng)需要區(qū)分黑素皮質(zhì)素受體和鑒別選擇性地激動(dòng)或拮抗MC4-R的化合物時(shí)，上述測(cè)定法應(yīng)用一組宿主細(xì)胞進(jìn)行，每種細(xì)胞用遺傳工程處理以表達(dá)黑素皮質(zhì)素受體的一種(MC1-R到MC5-R)。為發(fā)現(xiàn)藥物的目的，優(yōu)選的是人黑素皮質(zhì)素受體的表達(dá)。為達(dá)到這種目的，宿主細(xì)胞用遺傳工程處理，以表達(dá)在圖1所示的黑素皮質(zhì)素受體1至5的任一種氨基酸序列。每種受體的克隆過程和特征被描述MC1-R和MC2-R(Mountjoy,1992，科學(xué)257:1248-1251；Chhajlani和Wikberg,1992,FEBS Letl.309:417-420)；MC3-R(Roselli-Rehfuss等，1993，美國國家科學(xué)院院報(bào)90:8856-8860；Gantz等，1993，生物化學(xué)雜志268:8246-8250)；MC4-R(Gantz等，1993，生物化學(xué)雜志268:15174-15179；Mountjoy等，1994,Mol Endo.8:1298-1308)；和MC5-R(Chhajlani等，1993，生物化學(xué)生物物理研究通訊195:866-873；Gantz等，1994，生物化學(xué)生物物理研究通訊200:1214-1220)，就整體而言，每種資料在此引入僅作參考。因此，每種前述的序列能用于工程處理細(xì)胞或細(xì)胞系，這些細(xì)胞表達(dá)1種用于在此所述的篩選測(cè)定法中的黑素皮質(zhì)素受體。為鑒別特異或選擇性地調(diào)節(jié)MC4-R活性的化合物，MC4-R活化或MC4-R活化的抑制可與測(cè)試化合物對(duì)其他黑素皮質(zhì)素受體的影響相比較。
在一具體的實(shí)施方案中，MC1-R至MC5-R cDNAs在CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下，在293細(xì)胞中表達(dá)。建立了穩(wěn)定的細(xì)胞系。由于轉(zhuǎn)染的人MC2-R(ACTH-R)在293細(xì)胞中表達(dá)不佳，在篩選測(cè)定法中除了使用表達(dá)轉(zhuǎn)染有ACTH-R的穩(wěn)定細(xì)胞系外，可用人腎上腺皮質(zhì)H295癌細(xì)胞系(ATCC No.CRL-2128)，該細(xì)胞系表達(dá)內(nèi)源的ACTH-R。在第一輪篩選中，表達(dá)MC4-R的細(xì)胞系用于鑒別活化MC4-R的候選化合物。一旦被確認(rèn)，可測(cè)定這些篩選化合物以確定它們是否選擇性地活化MC4-R。黑素皮質(zhì)素受體的活化，可用如上述的SPA法測(cè)定。
另一種可能是，如果宿主細(xì)胞表達(dá)多于1種黑素皮質(zhì)素肽受體，在對(duì)黑素皮質(zhì)素肽反應(yīng)中由這些受體產(chǎn)生的背景信號(hào)必須從信號(hào)值中“減去”(見Gantz等，同上)。由這些非MC4-R黑素皮質(zhì)素受體產(chǎn)生的背景反應(yīng)能通過許多方法測(cè)定，包括由反義、抗體或拮抗劑消除MC4-R活性。在這點(diǎn)上，應(yīng)該注意野生型CHO細(xì)胞表明對(duì)黑素皮質(zhì)素肽低度內(nèi)源反應(yīng)，必須從背景值中減去。另一種方法是，來自其他黑素皮質(zhì)素受體起作用的活性可通過用MC4-R特異配基活化宿主細(xì)胞消除，或者用包括其他黑素皮質(zhì)素受體的特異抑制劑消除。
5.2.2.非基于細(xì)胞的測(cè)定法除了基于細(xì)胞的測(cè)定法外，非基于細(xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)可用于鑒別與MC4-R相互作用，如與MC4-R結(jié)合的化合物。上述化合物可作MC4-R活性的拮抗劑或激動(dòng)劑起作用，也可用于治療體重失調(diào)。
分離的膜可用于鑒別和MC4-R相互作用的化合物。例如，在1個(gè)用分離的細(xì)胞膜的典型實(shí)驗(yàn)中，293細(xì)胞可被遺傳工程法處理而表達(dá)MC4-R。細(xì)胞膜可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)收集，用于體外結(jié)合測(cè)定。125I標(biāo)記的配基(如，125I標(biāo)記的α-MSH、β-MSH或ACTH)結(jié)合到細(xì)胞膜上，作特異活性測(cè)定；特異結(jié)合通過在過量非標(biāo)記配基存在下，進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，比較后確定。
為鑒別MC4-R配基，細(xì)胞膜在測(cè)試化合物存在或缺乏下，和標(biāo)記配基溫育。與載體對(duì)照樣品相比，與受體結(jié)合和標(biāo)記配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到細(xì)胞膜上的化合物降低信號(hào)。
另一種方法是，可溶的MC4-R可重組性表達(dá)，用在基于非細(xì)胞的測(cè)定法中，以鑒別結(jié)合到MC4-R上的化合物。按5.3.1節(jié)下部分所述制備，含有1或多個(gè)MC4-R的ECDs的重組表達(dá)的MC4-R多肽或融合蛋白，能用在基于非細(xì)胞的篩選測(cè)定法中?？蛇x擇的方法是，與1或多種MC4-R的CDs相應(yīng)的肽，或含有1或多種MC4-R的CDs的融合蛋白能用在非基于細(xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)中，以鑒別結(jié)合到MC4-R細(xì)胞質(zhì)部分的化合物；上述化合物可用于調(diào)節(jié)MC4-R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在非基于細(xì)胞的測(cè)定法中，用本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所熟知的方法(見Ausubel等，同上)，重組表達(dá)的MC4-R被連接到諸如試管，微滴定孔或柱的固體基質(zhì)上。然后測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合到MC4-R上的能力。
5.2.3.調(diào)節(jié)MC4-R表達(dá)的化合物或組合物的測(cè)定法基于細(xì)胞的體外測(cè)定法可用作篩選在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)MC4-R表達(dá)的化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼報(bào)告分子的DNA能被連接到MC4-r基因的調(diào)節(jié)元件上，用在合適的完整細(xì)胞、細(xì)胞提取物或裂解物中，以鑒別調(diào)節(jié)MC4-r基因表達(dá)的化合物。合適的細(xì)胞或細(xì)胞提取物可從正常表達(dá)MC4-r基因的任一種類型的細(xì)胞中制備，因而保證細(xì)胞提取物含有在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄中所需要的轉(zhuǎn)錄因子。篩選法能用于鑒別調(diào)節(jié)報(bào)告基因構(gòu)建體表達(dá)的化合物。在上述篩選法中，報(bào)告基因的表達(dá)水平可在測(cè)試化合物存在下測(cè)定，與在缺乏測(cè)試化合物時(shí)的表達(dá)水平相比較。
為鑒別調(diào)節(jié)MC4-R翻譯的化合物，含有MC4-R轉(zhuǎn)錄體的細(xì)胞或體外細(xì)胞裂解物可用作MC4-R mRNA翻譯的調(diào)節(jié)測(cè)定。為分析MC4-R翻譯的抑制劑，可測(cè)定測(cè)試化合物在體外翻譯抽提物中調(diào)節(jié)MC4-R mRNA翻譯的能力。
不論在轉(zhuǎn)錄還是在翻譯水平降低MC4-R表達(dá)的化合物，可用于治療諸如厭食和惡病質(zhì)等體重失調(diào)。相形之下，那些增加MC4-R表達(dá)的化合物可用于治療諸如肥胖等失調(diào)。
5.2.4.根據(jù)本發(fā)明能被篩選的化合物上述測(cè)定法能鑒別影響MC4-R活性的化合物。例如，影響MC4-R活性的化合物，包括但不局限于結(jié)合到MC4-R上，抑制天然配基結(jié)合，和要么活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(激動(dòng)劑)或阻斷活化(拮抗劑)的化合物，以及結(jié)合到MC4-R天然配基上而中和配基活性的化合物。影響MC4-R基因活性的化合物(通過影響MC4-r基因表達(dá)，包括的分子如蛋白或有機(jī)小分子影響轉(zhuǎn)錄或干擾拼接事件，結(jié)果MC4-R全長或截短形式的表達(dá)能被調(diào)節(jié))，也能在本發(fā)明的篩選法中鑒別。然而，應(yīng)該注意所述的測(cè)定法也能鑒別調(diào)節(jié)MC4-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物(例如，影響信號(hào)傳遞事件下游的化合物，如通過配基結(jié)合到MC4-R上活化而參與轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的G蛋白活性的抑制劑或增強(qiáng)劑)。影響MC4-R信號(hào)傳遞下游事件而因此調(diào)節(jié)MC4-R對(duì)體重失調(diào)的發(fā)展效應(yīng)的上術(shù)化合物的鑒別和應(yīng)用，在本發(fā)明的范圍之中。在某些實(shí)例中，已經(jīng)觀察到G蛋白耦聯(lián)的受體反應(yīng)減退，或隨著接觸配基的時(shí)間延長出現(xiàn)脫敏。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定法可用于鑒別阻斷MC4-受體脫敏的化合物，上述化合物可用于維持MC4-受體的活性。上述化合物能用作治療方法的一部分，以治療體重失調(diào)。
根據(jù)本發(fā)明可篩選的化合物，包括但不局限于以下物質(zhì)，結(jié)合到MC4-R的ECD上，模擬由天然配基(即激動(dòng)劑)激發(fā)的活性或抑制由天然配基(即拮抗劑)激發(fā)的活性的肽、抗體和其片段、和其他有機(jī)化合物(肽模擬物peptidomimetics)；以及包括MC4-R(或其部分)的ECD和結(jié)合及“中和”天然配基的肽、抗體或其片段和其他有機(jī)化合物。
化合物可包括但不局限于如肽，例如可溶性肽，包括但不局限于隨機(jī)肽文庫的成員(如見Lam K.S.等，1991，自然354:82-84；Houghten R.等，1991，自然354:84-86)，制取自D-和/或L-構(gòu)型氨基酸來源于組合化學(xué)的分子文庫的成員，磷脂肽(包括但不局限于隨機(jī)或部分變性指導(dǎo)磷脂肽文庫的成員；如見Songyang,Z.等，1993，細(xì)胞72:767-778)、抗體(包括但不局限于多克隆、單克隆、人源化的、抗獨(dú)特型的、嵌合的或單鏈抗體，F(xiàn)Ab、F(ab′)2和FAb表達(dá)文庫片段，以及其結(jié)合表位的片段)，和有機(jī)或無機(jī)的小分子。
根據(jù)本發(fā)明篩選的其他化合物，包括但不局限于如下活性的有機(jī)小分子或化合物，這些有機(jī)小分子能穿過血腦屏障，到達(dá)進(jìn)入到合適的細(xì)胞中和影響MC4-R基因或涉及MC4-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一些其他基因的表達(dá)(例如，通過與涉及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子相互作用)；上述化合物指的是影響MC4-R活性，或影響涉及在MC4-R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中某些其他的細(xì)胞內(nèi)因子的活性，如MC4-R相關(guān)的G蛋白的化合物。
計(jì)算機(jī)模型和研究技術(shù)可允許作鑒別化合物或者改善已經(jīng)鑒別過的化合物，這些化合物能調(diào)節(jié)MC4-R表達(dá)或活性。鑒別上述的化合物或組合物，需鑒別活性位點(diǎn)或活性區(qū)。上述活性位點(diǎn)可能是典型的配基結(jié)合位點(diǎn)?；钚晕稽c(diǎn)能用本領(lǐng)域熟知的方法鑒別，包括如根據(jù)肽的氨基酸序列，核苷酸的核苷酸序列或根據(jù)研究和其天然配基相關(guān)的化合物或組合物的復(fù)雜性的方法。在最后的情況下，化學(xué)或X-射線晶體學(xué)的方法能用于尋找活性位點(diǎn)，該法通過尋找復(fù)雜的配基對(duì)因子的作用部位實(shí)現(xiàn)。
下一步，測(cè)定活性位點(diǎn)的三維幾何結(jié)構(gòu)。這可通過能測(cè)定完整分子結(jié)構(gòu)的熟知方法，包括X-射線晶體學(xué)方法進(jìn)行。另一方面，固相或液相NMR能用于測(cè)定某些分子內(nèi)的距離。任何其他的結(jié)構(gòu)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法能用于獲得部分或完整的幾何結(jié)構(gòu)。幾何結(jié)構(gòu)可用復(fù)雜的配基，天然或人工的配基測(cè)定，這可增加被測(cè)定的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的精確性。
如果測(cè)定出了不完整或不充分精確的結(jié)構(gòu)，基于計(jì)算機(jī)的數(shù)字模型方法可用于完成結(jié)構(gòu)或改善其精確性?？捎萌我环N確認(rèn)的模型方法，包括對(duì)特殊的生物高聚物如蛋白或核苷酸特異的參數(shù)化模型，基于計(jì)算分子運(yùn)動(dòng)的分子動(dòng)力模型，基于熱學(xué)整體的統(tǒng)計(jì)力學(xué)模型或綜合模型。對(duì)大多數(shù)類型的模型來說，代表組成原子和基團(tuán)之間力的標(biāo)準(zhǔn)分子力場(chǎng)是必須的，這可從在物理化學(xué)中已知的力場(chǎng)中選擇。不完整或不太精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)能用作約束因素，通過這些模型方法計(jì)算出完整和更精確的結(jié)構(gòu)。
最后，實(shí)驗(yàn)性地通過建立模型或綜合方法確定活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，候選的建?；衔锟捎蓪ふ液綆в衅浞肿咏Y(jié)構(gòu)信息的化合物的數(shù)據(jù)庫鑒定。上述的研究是尋找具有如下結(jié)構(gòu)的化合物，該結(jié)構(gòu)與已確定的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)相匹配，能與確定為活性位點(diǎn)的基團(tuán)相互作用。上述的研究可手工進(jìn)行，但優(yōu)選的是計(jì)算機(jī)輔助的。根據(jù)這種研究找到的這些化合物是潛在的調(diào)節(jié)MC4-R的化合物。
選擇性方法是，這些方法能用于鑒別來自已知的建?；衔锘蚺浠母纳七^的建模化合物。已知化合物的組成可被修飾，修飾的結(jié)構(gòu)效應(yīng)可用上面描述的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)建模方法應(yīng)用到新組成上測(cè)定。然后，改變的結(jié)構(gòu)與化合物活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)相比較，以確定是否改善了合適性或相互作用結(jié)果。用這種方式，組成的系統(tǒng)變化，如改變次要基團(tuán)，能迅速地被評(píng)價(jià)而得到改變特異性或活性的修飾過的建模化合物或配基。
依據(jù)鑒別MC4-R活性位點(diǎn)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)建模方法可用于鑒別建?；衔?，而相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
分子建模系統(tǒng)的實(shí)例是CHARMm和QUANTA程序(Polygen公司，Walthan,MA)。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建，圖示模型和分析分子結(jié)構(gòu)的功能。QUANTA允許相互作用構(gòu)建，修飾，視圖化和分析分子互相之間的行為。
許多文章綜述了藥物和特異蛋白相互作用的計(jì)算機(jī)建模法，如Retivinen等(1988,Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166)；Ripka(1988新科學(xué)家54-57)；Mckinaly和Rossman(1989，藥理學(xué)毒理學(xué)年評(píng)29:111-122)；Perry和Davies,OSAR在藥物設(shè)計(jì)中數(shù)量性的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系pp.189-193 Alan R.Liss,Inc.1989；Lewis和Dean(1989,Proc.R.Soc.Lond.236:125-140及141-162)；至于核苷酸組分的模型受體見Askew，等(1989，美國化學(xué)學(xué)會(huì)雜志111:1082-1090)。其他篩選和圖示性描述化合物的計(jì)算機(jī)程序可從如BioDesign,Inc.(Pasadena,CA.)、Allelix,Inc.(Mississauga,Ontario,Canada)，和Hypercube,Inc.(Gambridge,Ontario)購得。盡管這些程序最初用于對(duì)特殊蛋白特異的藥物，它們可修改用于對(duì)DNA或RNA的區(qū)域特異的藥物，只要該區(qū)被鑒別出來就行。
盡管上面描述了涉及設(shè)計(jì)和產(chǎn)生能改變結(jié)合的化合物，人們也能篩選已知化合物的資料庫，這些化合物包括天然產(chǎn)物或合成化合物，包括蛋白等生物活性物質(zhì)，篩選出的化合物是抑制劑或活化劑。
通過在此描述的那些測(cè)定法鑒別出的化合物可用于，例如詳細(xì)分析MC4-R基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能，改善體重失調(diào)。在細(xì)胞篩選中鑒別的測(cè)定化合物效能的方法，可在體重失調(diào)的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試。上述動(dòng)物模型可用作測(cè)試基質(zhì)，用作鑒別在治療上述失調(diào)中可能有效的藥物、藥劑、治療和介入方法。例如，動(dòng)物模型可與疑有表現(xiàn)出改善體重失調(diào)癥狀的化合物接觸，在足夠濃度下和接觸足夠時(shí)間，可說明在接觸藥物的動(dòng)物中體重失調(diào)癥狀的改善作用。動(dòng)物對(duì)接觸藥物的反應(yīng)，可通過評(píng)價(jià)和如肥胖等體重失調(diào)有關(guān)的失調(diào)的逆轉(zhuǎn)情況而監(jiān)控。至于介入治療，任何逆轉(zhuǎn)體重失調(diào)樣癥狀的任一種方面的處理，應(yīng)認(rèn)為是人體重失調(diào)介入治療的候選方法。測(cè)試制劑的劑量，可根據(jù)在以下5.5節(jié)討論得到的劑量反應(yīng)曲線確定。
為達(dá)到這個(gè)目的，可用表達(dá)人MC4-r基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。任何物種的動(dòng)物可用于產(chǎn)生MC4-R轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這些動(dòng)物包括但不局限于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、豬、微型豬、山羊和非人靈長類，例如狒狒、猴和黑猩猩。
任何在本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可用于將人MC4-r轉(zhuǎn)基因?qū)氲絼?dòng)物中而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的原種品系。上述技術(shù)包括但不局限于原核微注射(Hoppe,P.C和Wagner,1989，美國專利號(hào)4,873,191)；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)進(jìn)入胚系的基因轉(zhuǎn)移(Van der Putten等，1985，美國國家科學(xué)院院報(bào)82:6148-6152)；在胚胎干細(xì)胞中的基因打靶(Thompson等，1989，細(xì)胞56:313-321)；胚胎的電穿孔(Lo,1983，分子細(xì)胞生物學(xué)3:1803-1814)；和精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，1989，細(xì)胞57:717-723)；等等。上述技術(shù)的綜述，見Gordon,1989，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，Intl.Rev.Cytol,115:171-229，整體而言在此引入僅作參考。
本發(fā)明提供在所有的細(xì)胞中攜帶有MC4-r轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及在一些但不是全部細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，即嵌合動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因可作單轉(zhuǎn)基因整合或在多聯(lián)體中，例如頭對(duì)頭排列或頭對(duì)尾排列。按照如Lasko等介紹的方法(LaskoM.等，1992，美國國家科學(xué)院院報(bào)89:6232-6236)，轉(zhuǎn)基因也可選擇性地導(dǎo)入特殊類型的細(xì)胞中并活化。上述細(xì)胞類型特異活化所需的調(diào)節(jié)序列可根據(jù)關(guān)注的特殊細(xì)胞類型，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。當(dāng)需要MC4-r轉(zhuǎn)基因整合到內(nèi)源MC4-r基因的染色體位點(diǎn)中時(shí)，優(yōu)選的是基因打靶法。簡單來說，當(dāng)上述技術(shù)應(yīng)用時(shí)，含有與內(nèi)源MC4-r基因同源的核苷酸序列和/或該基因側(cè)翼的序列的載體，可用作通過和染色體序列同源重組而整合，以及破壞內(nèi)源MC4-r基因功能的目的。按照如Gu等介紹的方法(Gu等，1994，科學(xué)265:103-106)，轉(zhuǎn)基因也可選擇性地在一特殊的細(xì)胞類型中表達(dá)，同時(shí)伴隨僅在那種細(xì)胞類型中內(nèi)源MC4-r基因的失活。上述細(xì)胞類型特異重組所需的調(diào)節(jié)序列將根據(jù)所關(guān)注的特殊細(xì)胞類型，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
一旦產(chǎn)生了原種動(dòng)物，如Southern印跡分析或PCR技術(shù)等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)能用于分析動(dòng)物組織，以確定轉(zhuǎn)基因的整合是否發(fā)生。在原種動(dòng)物的組織中，轉(zhuǎn)基因的mRNA表達(dá)水平也可用以下技術(shù)評(píng)價(jià)，這些技術(shù)包括但不局限于從動(dòng)物中獲得的組織樣品的Northern印跡分析，原位雜交分析和RT-PCR。表達(dá)MC4-R基因的組織樣品，也可用對(duì)MC4-R轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物特異的抗體、免疫細(xì)胞化學(xué)法評(píng)價(jià)。
5.3.MC4-R蛋白、多肽和抗體MC4-R蛋白、多肽和肽片段、MC4-R突變、截短或缺失的形成、和/或MC4-R融合蛋白能制備作各種用途，包括但不局限于產(chǎn)生抗體，用作診斷測(cè)定的試劑，鑒別其他的涉及體重調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物，用作篩選用于治療體重失調(diào)的化合物測(cè)定中的試劑，以及用作與MC4-R有關(guān)的體重失調(diào)治療中的藥用試劑。
5.3.1.MC4-R多肽的產(chǎn)生推導(dǎo)的包括MC4-R的黑素皮質(zhì)素受體的氨基酸序列，在圖1顯示，其中預(yù)示的跨膜結(jié)構(gòu)域用上線和羅馬數(shù)字注明，顯示了4個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD1、ECD2、ECD3和ECD4)和4個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD1、CD2、CD3和CD4)。位于TM結(jié)構(gòu)域之間預(yù)示為親水結(jié)構(gòu)域的黑素皮質(zhì)素受體的螺旋形結(jié)構(gòu)，交替排列在細(xì)胞外側(cè)和細(xì)胞之中，而形成受體的ECD(在圖1中，氨基酸殘基為1-74、137-155、219-231和305-316)和CD(在圖1中，氨基酸殘基為102-112、178-197、251-280和339至末端)。與1個(gè)或多個(gè)MC4-R結(jié)構(gòu)域相應(yīng)的肽(如ECDs、TMs或CDs)、截短或缺失的MC4-R(例如，在MC4-R中1個(gè)或多個(gè)ECDs、TMs和/或CDs缺失)，以及全長的MC4-R,MC4-R肽或截短的MC4-R融合到無關(guān)蛋白上而成的融合蛋白，也都在本發(fā)明的范圍之中。結(jié)合到MC4-R上而“中和”針對(duì)MC4-R的循環(huán)天然配基的上述可溶性肽、蛋白、融合蛋白或抗體(包括抗獨(dú)特型抗體)，能用在5.5節(jié)下部分所述的方法中，實(shí)現(xiàn)體重增加。為達(dá)到這個(gè)目的，與MC4-R的單獨(dú)ECDs、MC4-R的可溶性缺失突變體(例如△TM突變體)或完整MC4-R ECD(按下列描述的方法，工程化地把4個(gè)ECDs連接在一起)相應(yīng)的肽，可與另一種多肽融合(如，IgFc多肽)。MC4-R或MC4-R ECD與IgFc多肽的融合不僅會(huì)增加制備過程的穩(wěn)定性，還會(huì)增加MC4-R-Ig融合蛋白在體內(nèi)的半壽期和活性。融合蛋白Ig部分的Fc區(qū)可進(jìn)一步修飾，以降低免疫球蛋白效應(yīng)器的功能。
上述肽、多肽和融合蛋白能通過重組DNA技術(shù)制備。例如，編碼1或多組螺旋形MC4-R ECD的4個(gè)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，能被合成或克隆，連接在一起，以編碼MC4-R的可溶的ECD。編碼1或多組4個(gè)ECDs(在圖中ECD1-4)的DNA序列能直接連接在一起，或通過編碼肽間隙子的連接寡核苷酸連接在一起。上述連接子可編碼柔性、富含甘氨酸的氨基酸序列，因而允許各結(jié)構(gòu)域串在一起，呈現(xiàn)出能結(jié)合MC4-R配基的構(gòu)型。另一種選擇是，編碼在ECD中的單獨(dú)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列能用于表達(dá)MC4-R肽。此外，如在圖11-13所示的突變MC4-R蛋白，可通過重組DNA技術(shù)表達(dá)。
各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)編碼MC4-R合適區(qū)域的核苷酸序列，以產(chǎn)生上述多肽。假如產(chǎn)生的肽或多肽是可溶的衍生物(例如，與ECDs相應(yīng)的肽，其中TMs和/或CDs缺失的截短或缺失的肽)，肽或多肽能從培養(yǎng)基中重新獲得。假如多肽或蛋白不被分泌出來，MC4-R產(chǎn)物能從宿主細(xì)胞本身重新獲得。
宿主表達(dá)載體系統(tǒng)也包括工程化過的宿主細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)MC4-R或功能性的原位等價(jià)物，即錨定在細(xì)胞膜上。從上述表達(dá)系統(tǒng)純化和富集MC4-R能用合適的去垢劑和脂質(zhì)膠粒完成，這些方法在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。然而，上述工程化過的宿主細(xì)胞本身可用在各種情形中，這些情形不僅對(duì)保持MC4-R結(jié)構(gòu)和功能特性，而且對(duì)評(píng)價(jià)生物學(xué)活性是重要的，例如，在藥物篩選測(cè)定法中應(yīng)用。
另一種方法是，宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于工程處理表達(dá)突變MC4-R蛋白的宿主細(xì)胞(如見圖11-13)。上述宿主細(xì)胞可用于評(píng)價(jià)生物學(xué)活性，如在藥物篩選測(cè)定法中應(yīng)用。
可用于本發(fā)明目的的宿主表面載體系統(tǒng)包括但不局限于微生物，如用含MC4-R核苷酸序列的重組細(xì)菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；用含MC4-R核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(如，糖酵母屬、畢赤氏酵母屬)；用含MC4-R序列的重組病毒表達(dá)載體(如，桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含MC4-R核苷酸序列的重組病毒表達(dá)載體(如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞系統(tǒng)，或用含MC4 R核苷酸序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或載有含如下啟動(dòng)子的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(如COS、CHO、BHK、293、3T3)，這些啟動(dòng)子來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組(如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來自哺乳動(dòng)物病毒(如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)被表達(dá)的MC4-R基因產(chǎn)物的應(yīng)用方向，可有利地選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)大量的上述蛋白需生產(chǎn)，用作產(chǎn)生MC4-R蛋白的藥用組合物或發(fā)酵抗MC4-R蛋白的抗體時(shí)，指導(dǎo)高水平地表達(dá)容易純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體可能是合乎需要的。上述載體包括但不局限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983,EMBO J.2:1791)，在pUR278載體中，MC4-R編碼序列可單獨(dú)連接到載體中具有l(wèi)acZ編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)中而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye,1985，核酸研究13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989，生物化學(xué)雜志264:5503-5509)等。pGEX載體也可用于表達(dá)外源多肽，因融合蛋白帶有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。一般來說，上述融合蛋白是可溶的，在游離的谷胱甘肽存在下，通過吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠上然后抽提的方法，能容易地從裂解細(xì)胞中純化。所設(shè)計(jì)的pGEX載體包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點(diǎn)，結(jié)果被克隆的靶基因產(chǎn)物能從GST分子部分釋放。
另一種方法是，任一種融合蛋白可通過利用對(duì)被表達(dá)的融合蛋白特異的抗體容易地純化。例如，由Janknecht等描述的系統(tǒng)，允許方便地純化在人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白(Janknecht等，1991，美國國家科學(xué)院院報(bào)88:8972-8976)。在該系統(tǒng)中，所關(guān)注的基因被亞克隆到牛痘重組質(zhì)粒中，結(jié)果翻譯時(shí)基因開放閱讀框與由6個(gè)組氨酸殘基組成的氨基端尾融合。來自用重組牛痘病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物被負(fù)載到Ni2+-硝基乙酸瓊脂糖柱中，用含咪唑的緩沖液選擇性地抽提帶組氨酸尾的蛋白。
在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)可用作載體以表達(dá)外源基因。病毒生長在草地夜蛾的細(xì)胞中。編碼MC4-R的序列可單獨(dú)克隆到病毒的非必需區(qū)中(例如多角體基因)，基于AcNPV啟動(dòng)子的控制之下(例如多角體起始子)。MC4-R基因編碼序列的成功插入將導(dǎo)致多角體基因失活，產(chǎn)生非閉鎖的重組病毒(即，病毒缺乏由多角體基因編碼的蛋白外殼)。然后，重組病毒用于感染細(xì)胞，插入的基因在該細(xì)胞中表達(dá)(如見，Smith等，1983，病毒學(xué)雜志46:584；Smith，美國專利4,215,651)。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒用作表達(dá)載體的情況中，所關(guān)注的MC4-R核苷酸序列可連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體中，例如，晚期啟動(dòng)子和三部分引導(dǎo)序列。然后，這種嵌合基因可通過體外或體內(nèi)的重組法，插入到腺病毒的基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)(如E1或E3區(qū))的插入，會(huì)產(chǎn)生在被感染的宿主中可存活且能表達(dá)MC4-R基因產(chǎn)物的重組病毒(如見Logan和Shenk,1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)81:3655-3659)。為插入的MC4-R核苷酸序列的有效翻譯，還需要特異的啟始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和鄰近序列。在完整的MC4-R基因或cDNA，包括其自身的起始密碼子和鄰近序列，插入到合適的表達(dá)載體中的情況下，沒有附加的翻譯控制信號(hào)可能是需要的。然而，在僅部分的MC4-R編碼序列插入時(shí)，必需提供外源的翻譯控制信號(hào)，也許包括ATG起始密碼子。因此，起始密碼子必需在具有所需編碼序列的閱讀框的結(jié)構(gòu)中，以確保整個(gè)插入片段的翻譯。這些外源的翻譯控制信號(hào)和起始密碼子會(huì)有天然和合成的各種各樣的來源。表達(dá)的效率可通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等所增強(qiáng)(見Bittner等，1987，酶學(xué)方法153:516-544)。
此外，可選擇調(diào)節(jié)插入的序列表達(dá)，或以所需的特別方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白產(chǎn)物的上述修飾(如糖基化)和加工(如裂解)，對(duì)蛋白的功能可能是重要的。對(duì)于蛋白和基因產(chǎn)物的后翻譯加工和修飾，不同的宿主細(xì)胞各有特點(diǎn)和特異的機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以保證所表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工。因此，擁有進(jìn)行初始轉(zhuǎn)錄體的合適加工、糖基化和基因產(chǎn)物的磷酸化的細(xì)胞機(jī)器的真核宿主細(xì)胞可被采用。上述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，但不局限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38細(xì)胞系。
為長期、高產(chǎn)量地生產(chǎn)重組蛋白，穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。例如，上面所述的穩(wěn)定表達(dá)MC4-R序列的細(xì)胞系可進(jìn)行工程處理。不用含病毒復(fù)制原點(diǎn)的表達(dá)載體，用由合適的表達(dá)控制元件(如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷化位點(diǎn)等)和可選擇的標(biāo)志控制的DNA，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。導(dǎo)入外來DNA之后，工程細(xì)胞可在豐富培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。在重組質(zhì)粒中的可選擇標(biāo)志賦予對(duì)選擇的抗性，使細(xì)胞穩(wěn)定地把質(zhì)粒整合進(jìn)它們的染色體上，生長形成最終能被克隆并擴(kuò)充成細(xì)胞系的集落。這種方法用于表達(dá)MC4-R基因產(chǎn)物的工程細(xì)胞系中是有利的。上述工程化的細(xì)胞系，在篩選和評(píng)價(jià)影響MC4-R基因產(chǎn)物的內(nèi)源活性的化合物中特別有用。
可用許多選擇系統(tǒng)，包括但不局限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，細(xì)胞11:223)次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski,1962，美國國家科學(xué)院院報(bào)48:2026)和腺苷磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，細(xì)胞22:817)，這些酶的基因分別用在tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中。還有抗代謝物抗性能用作下列基因的選擇基礎(chǔ)dhfr，賦予對(duì)氨甲喋呤的抗性(Wigler等，1980，美國國家科學(xué)院院報(bào)77:3567；O’Hare等，1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)78:1527)；gpt，賦予對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)78:2072 )；neo，賦予對(duì)氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin，等，1981，分子生物學(xué)雜志150:1)和hygro，賦予對(duì)潮霉素的抗性(Santerre，等，1984，基因30:147)。
5.3.2.抗MC4-R多肽的抗體特異識(shí)別1或多個(gè)MC4-R表位、或者M(jìn)C4-R保守變異體的表位、或MC4-R的肽片段的抗體也被本發(fā)明所包括。進(jìn)一步來說，特異地識(shí)別如在圖11-13所示的DNA序列編碼的那些MC4-R突變形式，也被本發(fā)明所包括。上述抗體包括但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、通過Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體、和以上任一種結(jié)合表位的片段。
本發(fā)明的抗體可用在，例如，在生物學(xué)樣品中的MC4-R的檢測(cè)，因此可用作診斷或預(yù)后技術(shù)的部分，依靠該技術(shù)對(duì)病人可進(jìn)行異常MC4-R數(shù)量的測(cè)定。特異識(shí)別如在下面第8節(jié)中所描述的那些MC4-R突變形式的抗體，作為診斷或預(yù)后技術(shù)的部分特別有用。上述抗體還可用在，如上所述的化合物篩選計(jì)劃相結(jié)合，以評(píng)價(jià)測(cè)試化合物對(duì)MC4-R基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性的影響。此外，上述抗體能用在如下面所述的基因治療技術(shù)相結(jié)合，如在把基因?qū)氩∪饲霸u(píng)價(jià)正常和/或工程化的MC4-R表達(dá)細(xì)胞。另外，上述抗體可用作抑制異常的MC4-R活性的一種方法。因此，上述抗體可用作體重失調(diào)治療方法的部分。
為產(chǎn)生抗體，可通過注射MC4-R、MC4-R肽(如與受體的1個(gè)功能結(jié)構(gòu)域相應(yīng)的肽，如ECD、TM或CD)、截短的MC4-R多肽(在MC4-R中，例如TM或CD等1或多個(gè)結(jié)構(gòu)域已被缺失)、MC4-R的功能性等價(jià)物或MC4-R的突變體。上述宿主動(dòng)物可能包括但不局限于兔子、小鼠、倉鼠和大鼠，所提到名稱的僅為少數(shù)動(dòng)物。根據(jù)宿主的種類，各種佐劑可用于增加免疫學(xué)應(yīng)答，這些佐劑包括但不局限于弗氏佐劑(完全和不完全)、如氫氧化鋁的礦物膠體、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳化佐劑、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和潛在用于人的佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。多克隆抗體是來源于免疫動(dòng)物血清的并源群體的抗體分子。
單克隆抗體為針對(duì)某一特定抗原的相同來源的一群抗體，可用任一種能提供由連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)得到。這些技術(shù)包括但不局限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，自然256:495-497；美國專利號(hào)4,376,110)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，當(dāng)代免疫學(xué)4:72；Cole等，1983，美國國家科學(xué)院院報(bào)80:2026-2030)，和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss,Inc.pp.77-96)。上述抗體可以是任一種免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任一種它們的亞類。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可體外或體內(nèi)培養(yǎng)。在體內(nèi)產(chǎn)生高效價(jià)的mAbs是目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
此外，可用為產(chǎn)生“嵌合抗體”所開發(fā)的技術(shù)(Morrison等，1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312:604-608；Takeda等，1985，自然，314:452-454)，“嵌合抗體”通過把來自小鼠合適抗原特異性的抗體分子的基因與來自人合適生物活性的抗體分子的基因拼接在一起產(chǎn)生。嵌合抗體是一種各個(gè)部分來源于不同動(dòng)物種類的分子，如來源于鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)。
另一種選擇是，所述的產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778；Bird,1988，科學(xué)242:423-426；Huston等，1988，美國國家科學(xué)院院報(bào)85:5879-5883；和Ward等、1989，自然334:544-546)，能被采用產(chǎn)生抗MC4-R基因產(chǎn)物的單鏈抗體。通過Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段經(jīng)1個(gè)氨基酸橋連接在一起形成單鏈抗體，因而產(chǎn)生單鏈多肽。
識(shí)別特殊表位的抗體片段可用熟知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，上述片段包括但不局限于F(ab′)2片段和Fab片段，F(xiàn)(ab′)2片段能通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生而Fab片段可由還原F(ab′)2片段的二硫鏈產(chǎn)生。另一種方法是，構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，1989，科學(xué)，246:1275-1281)，可快速和容易地鑒別具有所需特異性的單克隆Fab片段。
針對(duì)MC4-R的抗體最終能用于產(chǎn)生“模擬”MC4-R的抗獨(dú)特型抗體，所使用的技術(shù)在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。(如見，Greenspan和Bona,1993 , FASEB J 7 (5):437-444；Nissinoff,1991，免疫學(xué)雜志14718:2429-2438)。例如，結(jié)合到MC4-R ECD上，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制黑素皮質(zhì)素與MC4-R結(jié)合的抗體能用于產(chǎn)生“模擬”ECD，因而結(jié)合和中和黑素皮質(zhì)素的抗獨(dú)特型抗體。上述抗獨(dú)特型的中和性的抗獨(dú)特型抗體或Fab片段能用在治療方案中，以中和天然配基，促進(jìn)體重增加。
另一種選擇是，能產(chǎn)生針對(duì)MC4-R，用作MC4-R活性的激動(dòng)劑的抗體。上述抗體能結(jié)合到MC4-R上，而活化受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。上述抗體對(duì)治療諸如肥胖等體重失調(diào)十分有用。另外，起MC4-R活性的拮抗劑作用，即抑制MC4-R受體活化的抗體，可用于治療如厭食或惡病質(zhì)等體重失調(diào)。
5.4.控制MC4-R活性并調(diào)節(jié)體重的基因治療方法應(yīng)用基因治療的方法，能在體內(nèi)控制MC4-R的表達(dá)(如在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平)，以調(diào)節(jié)MC4-R活性和治療體重失調(diào)。下面描述一些方法。
5.4.1.基因替代治療至于增加正常MC4-R基因表達(dá)水平和/或MC4-R基因產(chǎn)物活性，MC4-R的核苷酸序列能用作治療包括肥胖的體重失調(diào)。只要肥胖是缺陷的MC4-R基因的情況，治療就能用如基因替代治療的方式實(shí)施。具體來說，正常MC4-R基因的1個(gè)或多個(gè)拷貝，或者指導(dǎo)產(chǎn)生表現(xiàn)為正常功能的MC4-R基因產(chǎn)物的部分MC4-R基因，可插入到病人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的合適細(xì)胞里，所用的載體除了把DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其他顆粒體如脂質(zhì)體外，包括但不局限于腺病毒、腺苷相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體。
由于MC4-R基因在腦中，包括在皮質(zhì)、丘腦、腦干和脊髓及下丘腦中表達(dá)，上述基因替代治療技術(shù)應(yīng)能把MC4-R基因序列輸送到病人中這些類型的細(xì)胞里。因此，輸送MC4-R基因序列的技術(shù)應(yīng)設(shè)計(jì)為容易穿過血腦屏障，這些技術(shù)在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知(如見，PCT申請(qǐng)
發(fā)明者F·李, D·胡斯扎, 古威 申請(qǐng)人:千年藥品公司