專利名稱：細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和谷胱甘肽濃度的評價的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及營養(yǎng)學(xué)和生物化學(xué)以及細(xì)胞的谷胱甘肽代謝領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及測定半胱氨酸和谷胱甘肽胞內(nèi)功能水平，以提供對預(yù)防退化性疾病和應(yīng)付氧化應(yīng)力的個體能力的衡量。
相關(guān)技術(shù)的說明目前被廣泛認(rèn)可的是，反應(yīng)性氧分子，即通常所謂的自由基的存在，會令包括衰老、關(guān)節(jié)炎、癌、動脈粥樣硬化、心血管梗塞、中風(fēng)、病毒性感染、肺病、腸道病和神經(jīng)退化性疾病等許多人體健康狀況發(fā)展或惡化。這些不良分子是生理過程的正常副產(chǎn)物，而且是由氧代謝產(chǎn)生的；例如，通過細(xì)胞呼吸，功免疫系統(tǒng)功能(殺傷外來物質(zhì))和代謝所必須的許多酶反應(yīng)而產(chǎn)生。此外，自由基在環(huán)境中也是常見的。自由基的環(huán)境來自包括煙霧、離子幅射、空氣污染、化學(xué)物質(zhì)(致癌物、許多石油化學(xué)物質(zhì)、殺蟲劑、染料、溶劑、細(xì)胞生長抑制劑等)、毒性重金屬和氧化或腐敗脂肪。最常見的自由基有一部分是超氧化物、羥基自由基、單態(tài)氧和過氧化物，其中包括過氧化氫。某些價態(tài)的鐵和銅能夠催化自由基的形成，這些自由基雖然存在時間很短，但是啟動了自由基形成的鏈反應(yīng)，隨后引起生物分子的改變、破壞。
自由基對活的生物有毒，會導(dǎo)致生物分子的結(jié)構(gòu)破壞。分子破壞可能造成遺傳密碼的改變、破壞細(xì)胞膜的完整性、神經(jīng)紊亂、內(nèi)分泌失調(diào)、過敏性增高、血管內(nèi)皮破壞和關(guān)節(jié)退化和發(fā)炎。
人們發(fā)現(xiàn)許多被稱為抗氧化劑的分子具有對抗自由基有害作用的保護(hù)功能?？寡趸瘎┛梢詫⒆杂苫捌滏湻磻?yīng)副產(chǎn)物中和掉并轉(zhuǎn)化為危害性較低的產(chǎn)物?？寡趸瘎┛梢允敲?例如過氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶)，必需營養(yǎng)素(例如β胡蘿卜素、維生素C和E、硒)或各種內(nèi)源性化合物(如谷胱苷肽)或飲食化合物(例如生物類黃酮)。所以，人體具有多種自由基的天然猝滅劑。
人體研究表明，營養(yǎng)性抗氧化劑的攝入不足與癌癥、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障等的較高危險性相關(guān)。此外，較多攝入營養(yǎng)性抗氧化劑與慢性退化性疾病的較低發(fā)生相關(guān)。以上鼓舞人心的研究表明，補(bǔ)充營養(yǎng)性抗氧化劑進(jìn)行干預(yù)可能對人具有治療作用。
出于多種原因，抗氧化劑狀態(tài)的實驗室分析還沒有常規(guī)進(jìn)行。自由基存在時間極短，通常不易直接測定。自由基損傷的副產(chǎn)物是可以測定的，例如血清或尿液中的丙二醛酸(malondialdehyde)(MDA)，硫巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)或脂質(zhì)過氧化物；然而，這些測試也許是氧化應(yīng)力的指示，但是只反映對某些類型生物分子的破壞(主要是多聚不飽和脂肪酸和核酸)。另外，測定血清或細(xì)胞內(nèi)抗氧化營養(yǎng)素水平和細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的方法，能夠確定某些特定成份的缺乏水平。
谷胱甘肽是一種突出的細(xì)胞抗氧化劑，它富含于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體內(nèi)。谷胱甘肽除了強(qiáng)烈的抗氧化功能外，它還起著強(qiáng)抗毒劑的作用，令機(jī)體能夠消除各種生物異源物質(zhì)和致癌化合物。而且，谷胱甘肽為細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能所必需，對于維持血液紅細(xì)胞完整性至關(guān)重要。而且，通常認(rèn)為，谷胱甘肽系統(tǒng)的缺陷引起明顯的細(xì)胞老化以及最終細(xì)胞死亡。
細(xì)胞谷胱甘肽濃度對抗氧化功能具有重要作用；而且，營養(yǎng)限制、運動和氧化應(yīng)力對細(xì)胞谷胱甘肽的濃度具有顯著影響。在氧化性條件下，經(jīng)與生物異源物質(zhì)的偶聯(lián)，谷胱甘肽偶聯(lián)物和谷胱甘肽二硫化物從受影響細(xì)胞的分泌，可能大大削弱了谷胱甘肽的功能。在嚴(yán)重的氧化應(yīng)力下，相當(dāng)數(shù)量的谷胱甘肽會成為結(jié)合蛋白質(zhì)。幸好，可有諸如N-乙酰-半胱氨酸之類的化合物來提高細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽功能。
谷胱甘肽可以用ATP、鎂和甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸這三種氨基酸經(jīng)一系列生物化學(xué)反應(yīng)來合成。通常，γ谷氨酰半胱氨酸的合成速度決定了谷胱甘肽的合成速度，而半胱氨酸的巰基(sulfyhydryl)為谷胱甘肽提供了生物活性。所以，在測定谷胱甘肽的功能利用度和評價抗氧化功能時，都必需測定半胱氨酸的利用度(availability)。
評價半胱氨酸和谷胱甘肽還有助于評價硒缺乏。當(dāng)谷胱甘肽作為抗氧化劑起作用時，它在由谷胱甘肽過氧化物酶催化的反應(yīng)中與過氧化氫反應(yīng)形成谷胱甘肽二硫化物。谷胱甘肽過氧化物酶需要硒作為功能性輔因子。所以，充足的半胱氨酸功能伴隨以缺陷性或一般性SPECTROXTM結(jié)果，表明細(xì)胞內(nèi)缺乏硒并需要進(jìn)一步檢測。
現(xiàn)有技術(shù)的不足在于缺乏用生物化學(xué)方法來評價人細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和谷胱甘肽水平(亦即個體應(yīng)付氧化應(yīng)力的能力)的簡單而經(jīng)濟(jì)的方法。本發(fā)明滿足了該領(lǐng)域長期以來的這一需求。
發(fā)明概述本發(fā)明目的之一是提供一種用于測定淋巴細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽功能水平和進(jìn)行抗氧化功能生物化學(xué)分析的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包含含有以下成份的無血清緩沖液糖，選自葡萄糖或生物學(xué)上能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸，膽堿或能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生膽堿的生物可利用形式的物質(zhì)；生物可利用形式的氯、磷酸根、鈣、鎂、鉀、鈉和鐵等無機(jī)離子；L-丁硫因-[S.R.]-亞砜亞胺(L-Buthionine-[S.R.]-Sulfoximine)；去離子水；和含量能有效刺激被測淋巴細(xì)胞的促細(xì)胞分裂原；所述無血清緩沖液的pH約6.8至7.6；而且，所述細(xì)胞培養(yǎng)基的特征在于能夠有效測定淋巴細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的功能水平，營養(yǎng)缺陷、不足和失調(diào)，并能夠通過生物化學(xué)方法分析淋巴細(xì)胞的抗氧化功能。
本發(fā)明實施方案之一包括在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充了選自生物可利用形式的氨基酸和維生素等物質(zhì)的營養(yǎng)素補(bǔ)充物而在該營養(yǎng)素補(bǔ)充物中刪除了待測的某營養(yǎng)素、或讓此待測營養(yǎng)素以有限量或抑制量存在其中。
本發(fā)明另一目的是提供測定個體內(nèi)谷胱甘肽胞內(nèi)功能水平和生物化學(xué)分析細(xì)胞抗氧化功能的方法，它包括以下步驟將本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基和待測個體的淋巴細(xì)胞一起接種；培育接種后的細(xì)胞培養(yǎng)基；將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與個體對照組淋巴細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行比較。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于測定人淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸功能水平和生物化學(xué)分析抗氧化功能的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含含有以下成分的無血清緩沖液糖，選自葡萄糖或生物學(xué)上能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸；膽堿或能夠在淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生膽堿的生物可利用形式的物質(zhì)；生物可利用形式的氯、磷酸根、鈣、鎂、鉀、鈉和鐵等無機(jī)離子；氫過氧化枯烯；去離子水；N-乙酰-L-半胱氨酸和刺激被測淋巴細(xì)胞的有效量的促細(xì)胞分裂原；所述無血清緩沖液的pH約6.8至7.6；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的特征在于能夠有效測定營養(yǎng)缺陷、不足和失調(diào)，并能夠通過生物化學(xué)方法分析淋巴細(xì)胞的抗氧化功能。
本發(fā)明實施方案之一包括在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充了選自生物可利用形式的氨基酸和維生素等物質(zhì)的營養(yǎng)素補(bǔ)充物，而在該營養(yǎng)素補(bǔ)充物中刪除了待測的某營養(yǎng)素、或讓此待測營養(yǎng)素以有限量或抑制量存在其中。
本發(fā)明另一目的是提供測定個體內(nèi)半胱氨酸胞內(nèi)功能水平和生物化學(xué)法分析細(xì)胞抗氧化功能的方法，它包括以下步驟將本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基和待測個體的淋巴細(xì)胞一起接種；培養(yǎng)接種后的細(xì)胞培養(yǎng)基；將該淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與個體對照組淋巴細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行比較。
通過以下對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的說明，本發(fā)明的其它內(nèi)容、特征和優(yōu)點將是顯而易見。這些實施方案的給出目的是公開本發(fā)明。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及用生物化學(xué)法分析人淋巴細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和谷胱甘肽細(xì)胞內(nèi)功能的方法。這樣的分析反映出外周淋巴細(xì)胞中個體抗氧化系統(tǒng)的生理健康狀態(tài)。本發(fā)明方法能夠準(zhǔn)確評價人淋巴細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和谷胱甘肽的胞內(nèi)功能，由此就可以采取治療措施來改善個體的抗氧化功能特性。
采用淋巴細(xì)胞的本發(fā)明方法具有獨特的優(yōu)點，因為淋巴細(xì)胞(1)是細(xì)胞介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的主角，并且易于受刺激而生長(細(xì)胞分裂)；(2)反映了長時期內(nèi)的平均營養(yǎng)狀態(tài)(淋巴細(xì)胞的生命周期約6個月)；(3)具有與其它細(xì)胞共同的代謝通路；而且(4)用標(biāo)準(zhǔn)的靜脈穿刺術(shù)收集方便。
通過測定淋巴細(xì)胞的生長來評價半胱氨酸和谷胱甘肽的胞內(nèi)功能，本發(fā)明方法可以反映出各病人各不相同的獨有特征。所以，可以根據(jù)各患者(而不是根據(jù)用所謂標(biāo)準(zhǔn)測定的“一般”患者)的特殊生物化學(xué)需求采用相應(yīng)的治療方法。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，對于在此公開的本發(fā)明內(nèi)容可能進(jìn)行的各種取代和修改都屬于本發(fā)明的范圍和宗旨內(nèi)。
給出以下實施例是為了說明本發(fā)明的各種實施方式，而不是對本發(fā)明作任何形式的限制。
實施例l抽取患者血樣本發(fā)明方法需要兩份10ml用檸檬酸-葡萄糖保存的全血標(biāo)本，無須禁食。全部所需就是抽取血樣?？梢跃偷剡M(jìn)行本發(fā)明的試驗，或者在室溫下將患者的血樣送至合適的實驗室。不需要離心血樣。全面的測試結(jié)果提供了對患者谷胱甘肽或半胱氨酸特征的可信而科學(xué)的分析。
實施例2樣品的處理分離細(xì)胞全部過程均在層流罩下以無菌技術(shù)進(jìn)行，以確保樣品的無菌性。實驗室在收到各個患者的血樣后分別指定登記號。以該登記號作為樣品編號，從而能夠在貫穿處理、數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)分析的各步驟中進(jìn)行追蹤。處理患者血樣涉及到的每根試管、離心管、微滴板和數(shù)據(jù)輸出都以該樣品(登記)號標(biāo)記。
各患者的樣品包括各含8ml全血的(2)兩管檸檬酸-葡萄糖(頂端黃色)真空試管。在指定了登記(樣品)號后，顛倒6次混合全血。將兩管全血合并到一根50ml的一次性離心試管內(nèi)。
從各份樣品中無菌取500μl的一小份加到一個12×17mm試管中。用該份樣品在CoulterT540型細(xì)胞計數(shù)儀上進(jìn)行全血細(xì)胞計數(shù)。Coulter打印出的全血細(xì)胞計數(shù)結(jié)果標(biāo)上登記號，并貼在該患者的檢查單(worksheet)上。
在15ml的圓錐形試管內(nèi)加入5.0ml Histopaque 1077(Ficoll/3，5-雙(乙酰氨基))-2，4，6-三碘苯甲酸鈉，Sigma Chemical，St Louis，Missouri)，每個血樣如此準(zhǔn)備(2)兩根Ficoll梯度試管。用一根10ml的移液管和一臺電動移液輔助儀緩慢地在各Ficoll梯度試管中鋪疊上8ml全血。將Ficoll梯度試管封蓋，以2160RPM離心20分鐘。
離心完畢，小心地從離心機(jī)中取出梯度試管避免擾亂梯度。用5ml移液管將位于中部Ficoll層界面處的淺黃色層(內(nèi)含淋巴細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到一個15ml一次性圓錐形離心試管內(nèi)。將淺黃層與磷酸鹽緩沖液-0.72％葡萄糖溶液(PBS-G)合并，使最終體積達(dá)12ml。將試管加蓋，顛倒6次以混合淺黃層和PBS-G。
含有淺黃層和PBS-G的離心管以2160RPM離心5分鐘。離心后，吸棄上清液，留下細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸在12ml PBS-G中，然后顛倒6次以確保細(xì)胞沉淀充分分散。然后如上所述再次離心樣品。
在第二次離心后，吸棄上清液。將細(xì)胞沉淀重懸在6.0ml PBS-G中。用與一電動移液輔助儀連接的5ml移液管將細(xì)胞沉淀打散并與PBS-G混合。在得到均質(zhì)細(xì)胞懸液后，取200μl的一份懸液轉(zhuǎn)移到一個12×75mm的試管內(nèi)。用該份樣品在Coulter T540型細(xì)胞計數(shù)儀上進(jìn)行初始的細(xì)胞懸液(ICS)計數(shù)。
該份樣品的打印結(jié)果標(biāo)上樣品號并貼在檢查單上。如果淋巴細(xì)胞數(shù)量在每立方毫米3.9至1.2×103細(xì)胞之間(THSD/mm3)，則該樣品可用于微滴板接種。加入的細(xì)胞懸液體積見表I和表IV。如果淋巴細(xì)胞數(shù)量超過3.9THSD/mm3，則該樣品需要再稀釋。但是，如果淋巴細(xì)胞數(shù)量低于1.2THSD/mm3，則放棄該樣品。
用以下計算公式來確定適當(dāng)再稀釋需加入的PBS-G量C1，V1＝C2V2C＝淋巴細(xì)胞濃度(THSD/mm3)V＝體積當(dāng)C2＝3.0THSD/mm3時，這是最終細(xì)胞懸液要求的淋巴細(xì)胞濃度。例如，當(dāng)6.0ml的初始細(xì)胞懸液計數(shù)(LY#)＝5.6THSD/mm3時，C1，V1＝C2V2(5.6)(6.0ml)＝(3.0)(X)X＝11.2ml的最終體積在重懸細(xì)胞中加入適當(dāng)體積的PBS-G使最終體積為11.2ml。在該實例中，要達(dá)到11.2ml的最終體積，需在原來的6.0ml中加入5.2ml。將所需體積的PGS-G加入(ICS)中形成最終細(xì)胞懸液(FCS)。將LY#計數(shù)和PBS-G體積記錄在SPECTROXTM測試檢查單上。
再稀釋后，如前所述，將200μl的一份再稀釋細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個新的12×75mm試管內(nèi)，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將再稀釋細(xì)胞懸液計數(shù)打印結(jié)果(最終細(xì)胞懸液LY#)貼在檢查單上，并記錄接種體積。
實施例3谷胱甘肽濃度的評價A.微滴板接種將最終細(xì)胞懸液加入一無菌槽中，并在層流罩內(nèi)放置含培養(yǎng)基的微滴板。用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手動微量移液管，將特定量(根據(jù)表I)的最終細(xì)胞懸液分置在微滴板的各孔內(nèi)。
表I根據(jù)所列的最終細(xì)胞懸液淋巴細(xì)胞數(shù)(LY#)用下列體積進(jìn)行微滴板接種。
最終細(xì)胞懸液的LY# 用于接種的調(diào)整后體積3.9-0.37 8.0μl3.6 8.5μl2.5-3.5 10.0μl2.4 12.5μl2.3 13.0μl2.2 14.0μl2.1 14.5μl2.0 15.0μl1.9 16.0μl1.8 17.0μl1.7 18.0μl1.6 19.0μl1.5 20.0μl1.4 21.5μl1.3 23.0μl＜＝1.2 25.0μl細(xì)胞加入培養(yǎng)基后，將微滴板加蓋，置于CO2培養(yǎng)箱中在37℃維持96小時。B.標(biāo)記全部標(biāo)記過程均在放射性同位素室(Radioisotope Room)中進(jìn)行。從冰箱中取出氚化胸腺嘧啶(H3-TdR)工作液，水浴溫?zé)嶂?7℃。96小時后，從培養(yǎng)箱中取出微滴板。將H3-TdR工作液加入一無菌槽中，用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手功微量移液管將10μl的H3-TdR工作液分置到微滴板的各孔內(nèi)。微滴板返回37℃培養(yǎng)箱內(nèi)再放置24小時。將執(zhí)行標(biāo)記的技術(shù)人員的日期和姓名首字母記錄在樣品記錄單上。C.收獲全部收獲過程均在放射性同位素室中進(jìn)行。用#2鉛筆在一張玻璃纖維濾板(Packard Part#6005416)上標(biāo)以樣品號。啟動真空泵，并將干燥烘箱設(shè)定在100℃。將與收獲器相連的蒸餾水罐裝滿。加入H3-TdR 24小時后，從培養(yǎng)箱中取出微滴板。將執(zhí)行收獲的技術(shù)人員的日期和姓名首字母記錄在樣品記錄單上。
細(xì)胞收集器(Packard#C9619型)處于打開位置，暴露出O環(huán)，將玻璃纖維濾板放在收集器上，以粗糙面與O環(huán)接觸。將細(xì)胞收集器關(guān)好，用清洗盤的蒸餾水濕潤濾板。將收集器留置在真空循環(huán)(vacuum cycle)(VAC)上。去除微滴板上的蓋子，將微滴板置于收集器的探頭吸嘴下。緩慢抬高微滴板至收集器探頭，直至探頭吸嘴觸及板底。抽吸培養(yǎng)基，緩慢地以圓周運動方式移動微滴板，藉此用探頭吸嘴刷擦孔底。刷擦持續(xù)10秒鐘。即，保持微滴板與收集器的探頭吸嘴接觸，連續(xù)刷擦抽吸，按住“洗滌”鈕10秒鐘。抽吸出孔內(nèi)液體，重復(fù)上述刷吸步驟。取下微滴板，在清洗盤中裝入甲醇，抬高清洗盤，吸取甲醇，再降低清洗盤。
打開收集器，濾板粘貼在上部，在真空VAC中繼續(xù)操作5秒鐘。5秒后，關(guān)閉VAC，同時從收集器表面取下濾板。將濾板粗面朝上在干燥烘箱內(nèi)放置10分鐘。從烘箱中取出濾板，冷卻至室溫。D.放射活性的計量全部計量過程均在放射性同位素室中進(jìn)行。將濾板裝入計量盒中，粗面朝上。在濾板上方放置一準(zhǔn)直儀，即將濾板固定在位的不銹鋼薄板。將該盒裝入Packard Matrix9600β粒子放射活性計量儀內(nèi)，并啟動Q-氣流(含1.3％丁烷的氦氣)流入Matrix9600中。按“啟動”鈕，啟動計量程序，對每孔進(jìn)行3分鐘的總放射活性計量。將各樣品的計量值記錄在Matrix9600硬驅(qū)中。此外，打印出放射活性原計量值的硬拷貝。E.數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)從Matrix9600的硬驅(qū)中下載到一張3.5時磁盤上。利用Microsoft Excel內(nèi)的宏將原數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成可記錄格式。該宏從各數(shù)據(jù)點中減去微滴板背景值，產(chǎn)生一式三份孔值的平均值，以微滴板對照值設(shè)定為100％，將該平均值表示為對照值的百分?jǐn)?shù)。F.數(shù)據(jù)的分析(標(biāo)準(zhǔn)化)利用淋巴細(xì)胞生長應(yīng)答試驗來檢測谷胱甘肽(GSH)的抗氧化功能。將細(xì)胞置于化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基中(內(nèi)含5μM L-丁硫因-(S，R)-亞砜亞胺(BSO))，加入促細(xì)胞分裂化合物來刺激其生長。通過3H-胸腺嘧啶摻入法測定的生長反應(yīng)以對照生長的百分比表示。BSO抑制合成谷胱甘肽所需的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的合成。所以，在培養(yǎng)基中加入BSO及其對谷胱甘肽合成的抑制反映為細(xì)胞生長的改變，以淋巴細(xì)胞中谷胱甘肽的狀態(tài)表示。所用的BSO劑量(5μM)是在1995年確定的。
個體的淋巴細(xì)胞生長以在含有或不含BSO的培養(yǎng)基中的生長百分比表示。用Microsoft Excel計算相對于100％生長(不含BSO)的+BSO生長比率。輸入了1000多個患者的結(jié)果比值，并用標(biāo)準(zhǔn)Excel程序進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，以確定比值的平均值、中值、范圍和方差。將“無關(guān)項”，即離差落在±2個標(biāo)準(zhǔn)離差范圍外的數(shù)據(jù)從總體基數(shù)中去除。余下的數(shù)據(jù)用來確定參照點和確立總體參照范圍。該總體參照范圍在圖形上表現(xiàn)為散在圖分布。已經(jīng)測得，谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)/參考值大于85％(＞85％)；所以，谷胱甘肽值低于85％的任何人都?xì)w類為缺乏谷胱甘肽。G.設(shè)備和試劑本發(fā)明試驗中使用了以下設(shè)備層流罩；離心機(jī)，Beckman GS-6；細(xì)胞計數(shù)儀(Coulter T540型)；12通道移液器(5-500μl)；電動吸量泵(Drummond)；無菌的50ml有蓋圓錐形塑料試管；12×75mm聚丙烯試管；無菌的15ml有蓋圓錐形塑料離心試管；移液管(0-20，0-200，0-100μl量程)；無菌玻璃一次性移液管-5.0ml，10.0ml；試管架和吸氣屏蔽吸嘴(0-50μl)。
表II 列出了本發(fā)明方法中所用的各種試劑及其來源表II試劑鹽酸腺嘌呤 Sigma A 8751抗生素溶液(PSF) GIBCO 15245-012鹽酸精氨酸 Sigma A5131L-丁硫因-(S，R)-亞砜亞胺Sigma B2515d-生物素Sigma B4501無水氯化鈣 Sigma C4901鹽酸膽堿Sigma C1879氫過氧化枯烯Sigma C0524氰鈷胺素(維生素B12)Sigma V2876無水鹽酸半胱氨酸Sigma C1276EDTA二鈉Sigma E4884七水合硫酸亞鐵 Sigma F8633葉酸，鈣鹽 Sigma F7878葡萄糖 Sigma G5767葡萄糖溶液(10％)Sigma G3126L-谷胺酰胺 Sigma G3126甘氨酸 Sigma G7126HEPES，無酸 SigmaH3375L-組氨酸(鹽酸單水合鹽) SigmaH8125Histopaque(Ficoll/3，5-雙(乙酰氨基))-Sigma1077-12，4，6-三碘苯甲酸鹽)羥鈷胺素(HCI(B12)) SigmaH7126肌醇 SigmaI5125L-異亮氨酸 SigmaI2752L-亮氨酸 SigmaL8000L-賴氨酸 SigmaL5626無水硫酸鎂 SigmaM7506純甲醇 VWR VWR4300-7L-甲硫氨酸 SigmaM9625煙酰胺(維生素B3)SigmaN3376D-泛酸鈣 SigmaP0290酚紅溶液，0.5％PBS SigmaP0290L-苯丙氨酸 SigmaP2126磷酸鹽緩沖液，pH7.4 SigmaP3813植物血凝素，PHA-PSigmaL8754磷酸氫二鉀 SigmaP3786吡哆素(HCI(維生素B6)) SigmaP9755核黃素(維生素B2)SigmaR4500L-絲氨酸 SigmaS4500氯化鈉 SigmaS9625氫氧化鈉，5.0N的溶液 VWR RS4151丙酮酸鈉 SigmaP2256丙酮酸鈉溶液，(100mM)SigmaS8636硫胺素(維生素B1)SigmaT4625L-蘇氨酸 SigmaT8625胸腺嘧啶 SigmaT9250[3H]-胸腺嘧啶 ICN 24066L-色氨酸 SigmaT0254L-酪氨酸 SigmaT3754L-纈氨酸 SigmaV0500H.溶液所有溶液都是用組織培養(yǎng)級去離子水(tcd H2O)配制的。
1.磷酸鹽緩沖液。欲制備磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.72％葡萄糖(PBS-G)溶液，用去離子水根據(jù)包裝說明制備PBS。加入足量的10％葡萄糖溶液，達(dá)0.72％的最終濃度。溶液經(jīng)過濾滅菌，保存在冰箱中(2至8℃)。
2.儲備液。按以下方法制備濃縮(2X)儲備液在去離子水中將(1)23.80gHEPES；(2)14.02g氯化鈉；(3)1.05g磷酸氫二鉀；(4)0.241g硫酸鎂；(5)1.0ml(10μM)鹽酸腺嘌呤；(6)30.0ml(100mM)丙酮酸鈉；(7)0.5ml 0.5％酚紅；(8)5.0ml抗生素混合液；(9)8.0ml 5N氫氧化鈉；(10)20.0ml Fe/EDTA(1.0mM FeSO4/0.4mM Na2EDTA)混合。在全部物質(zhì)都混合充分后，用5N氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至7.60。加入去離子水令最終體積達(dá)1.0L。溶液經(jīng)0.2μM的濾膜過濾除菌，并保存于4℃的冰箱中。溶液的穩(wěn)定期為4周。
3.基礎(chǔ)液。如下制備用于100％微滴板對照和本發(fā)明新方法的基礎(chǔ)液過濾后必須使用無菌技術(shù)。在層流罩下制備基礎(chǔ)液，將表III所列的各成份混合，并加去離子水至要求的最終體積。溶液經(jīng)真空除菌過濾裝入一無菌瓶中。加入適當(dāng)體積的PHA儲備液。
表III最終體積基礎(chǔ)液(ML)儲備液 100ml250ml500ml 1000ml 1500ml 2000ml2X儲備液(ml) 50 125 250 500 750 1000硫胺素(B1)儲備液(μl)10 25 50 100 150 200核黃素(B2)儲備液(μl)10 25 50 100 150 200煙酰胺(B3)儲備液(μl)10 25 50 100 150 200吡哆素(B6)儲備液(μl)10 25 50 100 50 200羥鈷胺素(B12)儲備液(μl) 10 25 50 100 150 200亞葉酸(Folimic)第二儲備液(μl)10 25 50 100 150 200生物素儲備液(μl) 10 25 50 100 150 200葡萄糖儲備液(ml) 0.721.8 3.6 7.2 10.8 14.4Cho/Ino儲備液(ml) 10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0各種氨基酸儲備液(ml) 10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0CaCl2儲備液(ml) 10 1.25 2.5 5.0 7.5 10.0PHA(ml) 10 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
4.L-丁硫因-(S，R)-亞砜亞胺(BS)工作液的制備(5μM/L)。將0.2223gBSO(Sigma B 2515)溶解在20ml PBS-G中制備成50mM的儲備液。然后該溶液用無菌技術(shù)經(jīng)真空抽濾除菌進(jìn)入一無菌瓶。在900μl無菌PBS-G中加入100μl 50mMBSO制得第二BSO儲備液(500μM)。將2.5ml第二儲備液、500μM BSO儲備液加入247.5ml基礎(chǔ)液中并充分混合，制備成5μM的BSO工作液。
該溶液的穩(wěn)定期為1周。
5.胸腺嘧啶(ThY)儲備液。如下制備冷胸腺嘧啶(ThY)儲備液(1.33mM ThY，0.322g/L)稱取0.161g ThY溶解在去離子水中，最終體積為500ml。該溶液用無菌技術(shù)經(jīng)真空抽濾除菌裝入一無菌瓶內(nèi)。將該溶液等分置入50ml的離心管中。欲短期保存，溶液可保存在冰箱內(nèi)(4℃)，穩(wěn)定期為1個月。欲長期保存，可將溶液冷凍(-70℃)，穩(wěn)定期為6個月。為了標(biāo)記細(xì)胞，應(yīng)用胸腺嘧啶工作液稀釋放射性胸腺嘧啶(H3TdR)。
為了制備胸腺嘧啶工作液，ThY+3H-TdR，在300ml無菌除氣去離子水中加入以下化合物1.15ml 1.33mM ThY(低溫)，1.70ml比活性為300μCi/mmol的3H-TdR(ICN part#24066)。一經(jīng)制成，溶液可在冰箱條件下(4℃)保存1周。
實施例4半胱氨酸濃度的評價A.微滴板接種將最終細(xì)胞懸液加入一無菌槽中，并在層流罩下放置含培養(yǎng)基的微滴板。用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手動微量移液管將特定體積(根據(jù)表IV)的最終細(xì)胞懸液分置到微滴板的各孔中。
表 IV根據(jù)下列最終細(xì)胞懸液淋巴細(xì)胞數(shù)量(LY#)，使用下列體積進(jìn)行微滴板接種。
最終細(xì)胞懸液LY# 用于接種的調(diào)整后體積3.9-0.37 8.0μl3.6 8.5μl2.5-3.5 10.0μl2.4 12.5μl2.3 13.0μl2.2 14.0μl2.1 14.5μl2.0 15.0μl1.9 16.0μl1.8 17.0μl1.7 18.0μl1.6 19.0μl1.5 20.0μl1.4 21.5μl1.3 23.0μl＜＝1.2 25.0μl將細(xì)胞加入培養(yǎng)基后，在微滴板的1至3排1至9列中加入10μl N-乙酰-L-半胱氨酸溶液(最終濃度為150mM)。
在微滴板上另6排的1至3列中加入10μl 200μM氫過氧化枯烯(CuOOH)。在此6排的4至6列中加入10μl 300μM氫過氧化枯烯(CuOOH)。在此6排的7至9列中加入10μl 400μM氫過氧化枯烯(CuOOH)。在微滴板中加入CuOOH后，將微滴板加蓋放置于CO2培養(yǎng)箱中在37℃維持96小時。B.標(biāo)記全部標(biāo)記過程均在放射性同位素室中進(jìn)行。從冰箱中取出氚化胸腺嘧啶(H3-TdR)工作液，水浴溫?zé)嶂?7℃。96小時后，從培養(yǎng)箱中取出微滴板。將H3-TdR工作液加入一無菌槽中，用配有0-50μl屏蔽吸嘴的12通道手動微量移液管將10μl的H3-TdR工作液分置入微滴板的各孔內(nèi)。微滴板返回37℃培養(yǎng)箱內(nèi)再放置24小時。將執(zhí)行標(biāo)記的技術(shù)人員的日期和姓名首字母記錄在樣品記錄單上。C.收獲全部收獲過程均在放射性同位素室中進(jìn)行。用#2鉛筆在玻璃纖維濾板(Packard Part#6005416)上標(biāo)以樣品號。啟動真空泵，并將干燥烘箱設(shè)定在100℃。將與收獲器相連的蒸餾水罐裝滿。加入H3-TdR 24小時后，從培養(yǎng)箱中取出微滴板。將執(zhí)行收獲的技術(shù)人員的日期和姓名首字母記錄在樣品記錄單上。
細(xì)胞收集器(Packard#C9619型)處于打開位置，暴露出O環(huán)，將玻璃纖維濾板放在收集器上，以粗糙面與O環(huán)接觸。將細(xì)胞收集器關(guān)好，用清洗盤的蒸餾水濕潤濾板。將收集器留置在真空循環(huán)(vacuum cycle)(VAC)上。去除微滴板上的蓋子，將微滴板置于收集器的探頭吸嘴下。緩慢抬高微滴板至收集器探頭，直至探頭吸嘴觸及板底。抽吸培養(yǎng)基，緩慢地以圓周運動方式移動微滴板，藉此用探頭吸嘴刷擦孔底。刷擦持續(xù)10秒鐘。即，保持微滴板與收集器的探頭吸嘴接觸，連續(xù)刷擦抽吸，按住“洗滌”鈕10秒鐘。抽吸出孔內(nèi)液體，重復(fù)上述刷吸步驟。取下微滴板，在清洗盤中裝入甲醇，抬高清洗盤，吸取甲醇，降低清洗盤。
打開收集器，濾板粘貼在上部，繼續(xù)VAC操作5秒鐘。5秒后，關(guān)閉VAC，同時從收集器表面取下濾板。將濾板粗面朝上在干燥烘箱內(nèi)放置10分鐘。從烘箱中取出濾板，冷卻至室溫。D.放射活性的計量全部計量過程均在放射性同位素室中進(jìn)行。將濾板裝入計量盒中，粗面朝上。在濾板上方放置一準(zhǔn)直儀，即將濾板固定在位的不銹鋼薄板。將該盒裝入Packard Matrix9600β粒子放射性計量儀內(nèi)，并啟動Q-氣流(含1.3％丁烷的氦氣)流入Matrix9600中。按“啟動”鈕，啟動計量程序，對每孔進(jìn)行3分鐘的總放射性計量。將各樣品的計量值記錄在Matrix9600硬驅(qū)中。此外，打印出放射性原計量值的硬拷貝。E.數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)從Matrix9600的硬驅(qū)中下載到一張3.5時磁盤上。利用Microsoft Excel內(nèi)的宏將原數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成可記錄格式。該宏從各數(shù)據(jù)點中減去微滴板背景值，產(chǎn)生一式三份孔值的平均值，以微滴板對照值設(shè)定為100％，將該平均值表示為對照值的百分?jǐn)?shù)。F.數(shù)據(jù)的分析(標(biāo)準(zhǔn)化)本測試是對胞內(nèi)半胱氨酸濃度的評價，該濃度是細(xì)胞抗氧化能力的一個量度。使用經(jīng)促細(xì)胞分裂原刺激而生長的淋巴細(xì)胞，通過比較在氫過氧化枯烯(CuOOH)存在下，加或不加半胱氨酸時淋巴細(xì)胞生長反應(yīng)的差異，由此表示抗氧化功能。CuOOH產(chǎn)生了用于測定患者個體內(nèi)全面抗氧化狀態(tài)的氧化應(yīng)力。在培養(yǎng)基中加入半胱氨酸提供了一種抗氧化劑，它能夠修復(fù)CuOOH產(chǎn)生的氧化應(yīng)力造成的損傷。CuOOH和半胱氨酸的劑量分別為300μM和150μM。
個體的淋巴細(xì)胞生長以在含有CuOOH，或在含有半胱氨酸+CuOOH的培養(yǎng)基中的生長百分比表示。用Microsoft Excel計算在半胱氨酸+CuOOH中生長相對于在CuOOH中生長的比值。輸入了1000多個患者的結(jié)果比值，用標(biāo)準(zhǔn)Excel程序進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以確定比值的平均值、中值、范圍和方差。將“無關(guān)項”，即離差落在±2個標(biāo)準(zhǔn)離差范圍外的數(shù)據(jù)從總體基數(shù)中去除。余下的數(shù)據(jù)用來確定參照點和確立總體參照范圍。該總體參照范圍在圖形上表現(xiàn)為散在圖分布。已經(jīng)測得，半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)/參考值低于127％(＜127％)；所以，半胱氨酸值等于或高于127％的任何人都?xì)w類為缺乏半胱氨酸。G.設(shè)備和試劑本發(fā)明試驗中使用了以下設(shè)備層流罩；離心機(jī)，Beckman GS-6；細(xì)胞計數(shù)儀(Coulter T540型)；12通道移液器(5-500μl)；電動吸量泵(Drummond)；無菌的50ml有蓋圓錐形塑料試管；12×75mm聚丙烯試管；無菌的15ml有蓋圓錐形塑料離心試管；移液管(0-20，0-200，0-100μl量程)；無菌玻璃一次性移液管-5.0ml，10.0ml；試管架和吸氣屏蔽吸嘴(0-50μl)。
表V列出了本發(fā)明方法中所用的各種試劑及其來源表V試劑鹽酸腺嘌呤 Sigma A8751抗生素溶液(PSF) GIBCO 15245-012鹽酸精氨酸 Sigma A5131N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma A8199d-生物素 Sigma B4501無水氯化鈣 Sigma C4901鹽酸膽堿 Sigma C1879氫過氧化枯烯 Sigma C0524氰鈷胺素(維生素B12) Sigma V2876無水鹽酸半胱氨酸 Sigma C1276EDTA二鈉 Sigma E4884七水合硫酸亞鐵 Sigma F8633葉酸，鈣鹽 Sigma F7878葡萄糖Sigma G5767葡萄糖溶液(10％) Sigma G3126L-谷胺酰胺Sigma G3126甘氨酸Sigma G7126HEPES，無酸 Sigma H3375L-組氨酸(鹽酸單水合鹽)Sigma H8125Histopaque(Ficoll/3，5-雙(乙酰氨 Sigma 1077-1基))-2，4，6-三碘苯甲酸鹽)羥鈷胺素(HCI(B12)) Sigma H7126肌醇 Sigma I5125L-異亮氨酸Sigma I2752L-亮氨酸 Sigma L8000L-賴氨酸 Sigma L5626無水硫酸鎂Sigma M7506純甲醇VWRVWR4300-7L-甲硫氨酸Sigma M9625煙酰胺(維生素B3) Sigma N3376D-泛酸鈣 Sigma P0290酚紅溶液，0.5％PBSSigma P0290L-苯丙氨酸Sigma P2126磷酸鹽緩沖液，pH7.4 Sigma P3813植物血凝素，PHA-P Sigma L8754磷酸氫二鉀Sigma P3786吡哆素(HCI(維生素B6))Sigma P9755核黃素(維生素B2) Sigma R4500L-絲氨酸 Sigma S4500氯化鈉Sigma S9625氫氧化鈉，5.0N的溶液 VWRRS4151丙酮酸鈉 Sigma P256丙酮酸鈉溶液，(100mM) Sigma S8636硫胺素(維生素B1) Sigma T4625L-蘇氨酸 Sigma T8625胸腺嘧啶 Sigma T9250[3H]-胸腺嘧啶ICN24066L-色氨酸 Sigma T0254L-酪氨酸 Sigma T3754L-纈氨酸 Sigma V0500H.溶液所有溶液都是用組織培養(yǎng)級去離子水(tcd H2O)配制的。
1.磷酸鹽緩沖液。欲制備磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.72％葡萄糖(PBS-G)溶液，用去離子水根據(jù)包裝說明制備PBS。加入足量的10％葡萄糖溶液，達(dá)0.72％的最終濃度。溶液經(jīng)過濾滅菌，保存在冰箱中(2至8℃)。
2.儲備液。按以下方法制備濃縮(2X)儲備液在去離子水中將(1)23.80gHEPES；(2)14.02g氯化鈉；(3)1.05g磷酸氫二鉀；(4)0.241g硫酸鎂；(5)1.0ml(10μM)鹽酸腺嘌呤；(6)30.0ml(100mM)丙酮酸鈉；(7)0.5ml 0.5％酚紅；(8)5.0ml抗生素混合液；(9)8.0ml 5N氫氧化鈉；(10)20.0ml Fe/EDTA(1.0mM FeSO4/0.4mM Na2EDTA)混合。在全部物質(zhì)都混合充分后，用5N氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至7.60。加入去離子水令最終體積達(dá)1.0L。溶液經(jīng)0.2μM的濾膜過濾除菌，并保存于4℃的冰箱中。溶液的穩(wěn)定期為4周。
3.基礎(chǔ)液。如下制備用于100％微滴板對照和本發(fā)明新方法的基礎(chǔ)液過濾后必須使用無菌技術(shù)。在層流罩下制備基礎(chǔ)液，將表VI所列的各成份混合，并加去離子水至要求的最終體積。溶液經(jīng)真空除菌過濾進(jìn)入一無菌瓶中。加入適當(dāng)體積的PHA儲備液。
表VI最終體積基礎(chǔ)液(ML)儲備液 100ml250ml 500ml 1000ml 1500ml 2000ml2X儲備液(ml) 50 125 250 500 750 1000硫胺素(B1)儲備液(μl) 10 2550 100 150 200核黃素(B2)儲備液(μl) 10 2550 100 150 200煙酰胺(B3)儲備液(μl) 10 2550 100 150 200吡哆素(B6)儲備液(μl) 10 2550 100 150 200羥鈷胺素(B12)儲備液(μl)10 2550 100 150 200亞葉酸(Folinic)第二儲備液(μl) 10 2550 100 150 200生物素儲備液(μl)10 2550 100 150 200葡萄糖儲備液(ml) 0.72 1.8 3.6 7.2 10.8 14.4Cho/Ino儲備液(ml)10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0各種氨基酸儲備液(ml) 10 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0CaCl2儲備液(ml) 10 1.25 2.5 5.0 7.5 10.0PHA(ml) 10 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
4.氫過氧化枯烯(CuOOH)儲備液。氫過氧化枯烯的保存期很短。自從Sigma購得之日起的保質(zhì)期為3個月。在從瓶中進(jìn)行CuOOH的移液時，應(yīng)知道CuOOH會增加粘度。必須確保液體完全吸到了吸嘴內(nèi)。為了確保吸嘴充滿，吸取時需要較長的時間和較多的注意力。而且，必須將吸嘴擦凈以去除吸嘴外的過量CuOOH。同樣，必須將CuOOH充分分散。在此程序后，可將該溶液在冰箱條件下(2至8℃)保存，穩(wěn)定期長達(dá)3個月。
就第一CuOOH儲備液(1.0M的CuOOH以PBS-G溶液)配制而言，將9.5μl氫過氧化枯烯(CuOOH)與990.5μlPBS-G混合。
經(jīng)以上過程后，該溶液可在冰箱條件下(2至8℃)保存，穩(wěn)定期長達(dá)3個月。
第二CuOOH儲備液(100mM，以PBS-G溶液配制)必須每天在細(xì)胞分離前制備，而且不能儲存過夜。欲制備第二CuOOH儲備液，將200μl第一CuOOH儲備液與1800μl PBS-G混合。
就氫過氧化枯烯工作液而言，每日在細(xì)胞分離前制備4份工作液。將該溶液加入CuOOH轉(zhuǎn)移板(分開的微滴板)中，用于給患者板上樣。該溶液不得儲存過夜。工作液為300μM CuOOH將330μl第二CuOOH儲備液與4670μl PBS-G混合。
5.胸腺嘧啶(ThY)儲備液。如下制備低溫胸腺嘧啶(ThY)儲備液(1.33mM ThY，0.322g/L)稱取0.161g ThY溶解在去離子水中，最終體積為500ml。該溶液用無菌技術(shù)經(jīng)真空抽濾除菌裝入一無菌瓶內(nèi)。將該溶液等分置入50ml的離心管中。欲短期保存，溶液可放在冰箱內(nèi)(4℃)，穩(wěn)定期為1個月。欲長期保存，可將溶液冷凍(-70℃)，穩(wěn)定期為6個月。為了標(biāo)記細(xì)胞，應(yīng)用胸腺嘧啶工作液稀釋放射性胸腺嘧啶(H3TdR)。
為了制備胸腺嘧啶工作液，ThY+3H-TdR，在300ml無菌除氣去離子水中加入以下化合物1.15ml 1.33mM ThY(低溫)，1.70ml比活性為300μCi/mmol的3H-TdR(ICN part#24066)。一經(jīng)制成，該溶液可在冰箱條件下(4℃)保存1周。
6.N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)工作液。將0.0702gN-乙酰-L-半胱氨酸(SigmaA8199)溶解在4ml PBS-G溶液中形成最終濃度為0.1M的儲備液。將該儲備液分成1ml的等份，加入12×75無菌試管內(nèi)，這些等份可在-70℃的冷凍柜中保存1周。欲制備工作液，可取每份990μl的0.1M NAC儲備液加入29.01ml PBS-G溶液中，并充分混合。工作液應(yīng)用無菌技術(shù)真空抽濾除菌裝入一無菌瓶中。最后，應(yīng)在一式三份的測試孔中加入10μl的該溶液。有一點很重要，即必須每天在進(jìn)行測試前新鮮制備N-乙酰-L-半胱氨酸工作液。
本說明書中提及的任一專利或出版物都反映了本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的水平。而且，本發(fā)明對這些專利或出版物進(jìn)行了同等程度的參考和引用，如同具體而單獨地指出各個出版物為本文所引用和參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，本發(fā)明很適合實施，可達(dá)到所述的目的和獲益，以及隱含于其間的那些目的和利益。以上實施例，連同本文所述的方法、程序、處理方法、分子和特定化合物都提供了優(yōu)選實施方式，它們是示范性的，而不是要限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員對其中作出的改變和其它用途都包含在權(quán)利要求范圍所明確的本發(fā)明宗旨內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于測定淋巴細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽胞內(nèi)功能水平和進(jìn)行所述淋巴細(xì)胞抗氧化功能生物化學(xué)分析的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包含含有以下成份的無血清緩沖液糖，選自葡萄糖和生物學(xué)上能夠在所述淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸，膽堿或能夠在所述淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生膽堿的生物可利用形式的物質(zhì)；生物可利用形式的無機(jī)離子，包括氯、磷酸根、鈣、鎂、鉀、鈉和鐵；L-丁硫因-[S.R.]-亞砜亞胺(L-Buthionine-[S.R.]-Sulfoximine)；去離子水；和含量能有效刺激所述淋巴細(xì)胞的促細(xì)胞分裂原；所述無血清緩沖液的pH約6.8至7.6；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的特征在于能夠有效測定所述淋巴細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的胞內(nèi)功能和生物化學(xué)分析所述淋巴細(xì)胞的抗氧化功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述的培養(yǎng)基補(bǔ)充了選自以下物質(zhì)組的補(bǔ)充營養(yǎng)素生物可利用形式的氨基酸和維生素，在所述補(bǔ)充營養(yǎng)素中刪除了待測的某營養(yǎng)素、或讓此待測營養(yǎng)素以有限量或抑制量存在其中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述的維生素選自生物素、葉酸或生物可利用形式的葉酸、煙酰胺或煙酸、核黃素、硫胺素、維生素B6和維生素B12，以及能夠在細(xì)胞內(nèi)生成以上物質(zhì)的化合物；其中所述的氨基酸或生物學(xué)上能夠生成這些氨基酸的化合物包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷胺酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、 L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸，氨基酸成組存在，各自的量都不超過抑制濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述的L-丁硫因-[S.R.]-亞砜亞胺以約5μM至約500μM的濃度存在。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充了選自以下物質(zhì)組的一種或多種刺激性營養(yǎng)素丙酮酸、腺嘌呤和肌醇，或能夠在所述淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生上述物質(zhì)的化合物，它們的濃度能夠激發(fā)幾乎是最大強(qiáng)度的反應(yīng)。
6.一種測定個體內(nèi)谷胱甘肽胞內(nèi)功能水平和生物化學(xué)分析細(xì)胞抗氧化功能的方法，它包括以下步驟將所述個體的淋巴細(xì)胞接種到權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中；培養(yǎng)接種后的細(xì)胞培養(yǎng)基；和將淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與個體對照組淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
7.一種用于測定人淋巴細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸胞內(nèi)功能水平和進(jìn)行人淋巴細(xì)胞內(nèi)抗氧化功能生物化學(xué)分析的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包含含有以下成份的無血清緩沖液糖，選自葡萄糖或生物學(xué)上能夠在所述淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡萄糖的化合物；生物可利用形式的泛酸，膽堿或能夠在所述淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生膽堿的生物可利用形式的物質(zhì)；生物可利用形式的無機(jī)離子，包括氯、磷酸根、鈣、鎂、鉀、鈉和鐵；氫過氧化枯烯；去離子水；N-乙酰-L-半胱氨酸和和含量能有效刺激所述淋巴細(xì)胞的促細(xì)胞分裂原；所述無血清緩沖液的pH約6.8至7.6；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的特征能夠有效測定營養(yǎng)缺陷、不足和失調(diào)，并能夠生物化學(xué)分析淋巴細(xì)胞的抗氧化功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述的培養(yǎng)基補(bǔ)充了選自以下物質(zhì)組的補(bǔ)充營養(yǎng)素生物可利用形式的氨基酸和維生素，在所述補(bǔ)充營養(yǎng)素中刪除了待測的某營養(yǎng)素、或讓此待測營養(yǎng)素以有限量或抑制量存在其中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述的維生素選自生物素、葉酸或生物可利用形式的葉酸、煙酰胺或煙酸、核黃素、硫胺素、維生素B6和維生素B12，以及能夠在細(xì)胞內(nèi)生成以上物質(zhì)的化合物；其中所述的氨基酸或生物學(xué)上能夠生成氨基酸的化合物包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷胺酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸，氨基酸成組存在，各自的量都不超過抑制濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述的氫過氧化枯烯以約5μM至約500μM的濃度存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充了選自以下物質(zhì)組的一種或多種刺激性營養(yǎng)素丙酮酸、腺嘌呤和肌醇，或能夠在所述淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生上述物質(zhì)的化合物，它們的濃度能夠激發(fā)幾乎是最大強(qiáng)度的反應(yīng)。
12.一種測定個體中半胱氨酸胞內(nèi)功能水平和生物化學(xué)分析細(xì)胞抗氧化功能的方法，它包括以下步驟將所述個體的淋巴細(xì)胞接種到權(quán)利要求7所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中；培養(yǎng)接種后的細(xì)胞培養(yǎng)基；和將淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與個體對照組淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基和方法,用于測定人淋巴細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽或半胱氨酸的細(xì)胞內(nèi)濃度,為個體應(yīng)付氧化性應(yīng)力(oxidative press)的能力提供生化分析。所述的培養(yǎng)基是一種無血清緩沖溶液,pH約為6.8至7.6,其中含有葡萄糖或能夠在淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡萄糖的化合物、泛酸、膽堿或能夠在淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生膽堿的物質(zhì)、氯、磷酸根、鈣、鎂、鉀、鈉和鐵等無機(jī)離子、L－丁硫因－[S.R.]－亞砜亞胺(L－Buthionine－[S.R.]－Sulfoximine)、去離子水和刺激淋巴細(xì)胞的促細(xì)胞分裂原。在測定半胱氨酸濃度時,該培養(yǎng)基另外含有N－乙酰－L半胱氨酸和氫過氧化枯烯。所述方法是如下進(jìn)行的:將該培養(yǎng)基與某個體的淋巴細(xì)胞一起接種,培養(yǎng)培養(yǎng)基中的淋巴細(xì)胞,并將淋巴細(xì)胞的反應(yīng)與個體對照組淋巴細(xì)胞的平均反應(yīng)進(jìn)行比較。
文檔編號C12N5/02GK1268977SQ97197585
公開日2000年10月4日 申請日期1997年9月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月3日
發(fā)明者J·F·克勞福德 申請人:研究發(fā)展基金會