專利名稱：除草劑抗性植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)，且特別是當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因樣植物比較時(shí)對除草劑顯示實(shí)質(zhì)(Substantial)抗性或?qū)嵸|(zhì)耐性的轉(zhuǎn)基因植物的制備。
對除草劑具有實(shí)質(zhì)“耐性”的植物當(dāng)受試于除草劑時(shí)，與同樣受試于除草劑的非耐性樣植物相比提供了右移的劑量/反應(yīng)曲線。該劑量/反應(yīng)曲線具有繪于x-軸上的“劑量”和繪于y-軸上的“殺死百分比”、“除草效應(yīng)”等。為了產(chǎn)生擬定的除草效應(yīng)，耐性植物較非耐性樣植物將需要更多的除草劑。對除草劑具有實(shí)質(zhì)“抗性”的植物當(dāng)以農(nóng)業(yè)化肥團(tuán)體一般用于殺死田間雜草的濃度和速率受試于除草劑時(shí)，如果有的話，也顯示出極少的壞死、裂解、萎黃病或其它損傷。對除草劑具有抗性的植物也對該除草劑具有耐性。在本申請的上下文里將術(shù)語“抗性”和“耐性”解釋為“耐性和/或抗性”。
根據(jù)本發(fā)明提供了這樣的多核苷酸，其至少包括編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性或耐性的第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域，和編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑抗性的第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域，并具有以下的附加條件(ⅰ)該多核苷酸不編碼包括僅僅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)該多核苷酸不包括僅僅編碼超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域；和(ⅲ)該多核苷酸不包括僅僅編碼GST和膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，由該多核苷酸所包括的區(qū)域每個(gè)均在植物可操作啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)控制之下。這樣的啟動(dòng)子和終止子對技術(shù)人員是眾所周知的，他們可根據(jù)其特定的需要挑選啟動(dòng)子及終止子。例如，適宜的啟動(dòng)子包括35S CaMV或FMV啟動(dòng)子以及擬南芥菜和玉米泛素的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，這些啟動(dòng)子為組成性的。這避免了外部誘導(dǎo)并且意味著該植物對每種相應(yīng)的除草劑永久具有耐性或抗性。編碼除草劑抗性基因的DNA也可在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下包括進(jìn)植物轉(zhuǎn)化載體中以在該轉(zhuǎn)基因植物中得到可誘導(dǎo)的除草劑抗性。這樣的啟動(dòng)子包括可化學(xué)誘導(dǎo)的已知的GST-27啟動(dòng)子，借此通過施加適宜的誘導(dǎo)物(如化學(xué)安全劑)可開啟抗性。在有些情況中，該僅在需要時(shí)表達(dá)或增加對除草劑抗性的能力可能是優(yōu)越的，例如，在作物輪作期間，第一種作物的一些個(gè)體可能在下一年在待種植第二種作物的田間生長。除草劑可用于毀壞這些未被誘導(dǎo)并且仍為易感的“自生自長”植物。僅僅需要除草劑抗性時(shí)(即，就在應(yīng)用除草劑之前)除草劑抗性基因表達(dá)的誘導(dǎo)也可能在有些情況中在代謝上更為有效，因?yàn)槟菚r(shí)植物僅在需要時(shí)產(chǎn)生抗性多肽。適宜的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子進(jìn)一步包括可誘導(dǎo)的四環(huán)素啟動(dòng)子、細(xì)菌lac阻遏物/操縱子系統(tǒng)、與地塞米松一起的糖皮質(zhì)激素受體、可誘導(dǎo)的銅和水楊酸啟動(dòng)子、國際專利申請No.PCT/GB96/01195中所述的依據(jù)蛻皮激素受體的啟動(dòng)子和國際專利申請No.WO93/2 334中所述的所謂Alc啟動(dòng)子。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少由該肽所包括的區(qū)域中至少其中一個(gè)提供對出苗前除草劑的抗性并且至少這些區(qū)域中另一個(gè)提供對出苗后除草劑的抗性。同時(shí)技術(shù)人員無需對出苗前和出苗后的定義，“出苗前”意為在萌發(fā)的種子出現(xiàn)于土表以上之前施用，即在土地之上可見到任何植物材料之前施用。出苗后意為在土表之上可見到幼苗之后施用。
出苗前的除草劑可選自二硝基苯胺除草劑、除草定、flupoxam、毒莠定、氟咯草酮、四唑啉酮包括N-氨甲酰四唑啉酮、如在EP-A-612,735中所述的那些物質(zhì)、sulcatrione、達(dá)草伏、RP201772、阿特拉津或別的三嗪、亞氨基噻重氮(iminothiadozole)、diflufenicon、磺酰脲、咪唑啉酮、硫代氨基甲酸酯、三嗪、尿嘧啶、尿素、三酮、異噁唑、乙酰替苯胺、噁二唑、EP-A-511,826中所述的二氧磷基磺酸酯類除草劑、三嗪酮、磺酰苯胺(sulfonanilide)、酰胺、羥乙酰胺(oxyacetamides)如fluthiamide、N-酰苯胺(anilide)和三唑啉酮型除草劑。三酮類除草劑的實(shí)例包括2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲?；?-環(huán)己烷-1,3-二酮。
2-(2-氯-4-甲烷磺酰苯甲?；?-環(huán)己烷-1,3-二酮，2-(2-2-硝基-4-甲烷磺酰苯甲?；?-環(huán)己烷-1,3-二酮，〔5-環(huán)丙基4-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯甲?；?異噁唑，等。為了避免疑惑，“三酮類除草劑”意為能夠抑制4-羥苯基丙酮酸鹽(或丙酮酸)雙加氧酶(HPPD)的任何化合物。在本發(fā)明上下文里，術(shù)語4-羥苯基丙酮酸鹽(或丙酮酸)雙加氧酶(4-HPPD)和p-羥苯基丙酮酸鹽(或丙酮酸)雙加氧酶(p-OHPP)為同義的。
出苗后除草劑可選自鎮(zhèn)草寧及其鹽、glufosinate、二苯醚、磺草靈、滅草松、bialaphos、除草定、稀禾定或別的環(huán)己烷二酮、麥草畏、fosamine、flupoxam、苯氧丙酸、喹禾靈或別的芳氧基-苯氧丙酸酯、毒莠定、伏草隆、阿特拉津或別的三嗪、metribuzin、氯嘧黃隆、綠黃隆、flumetsulam、halosulfuron、嘧黃隆、滅草喹、咪草煙、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、芐嘧黃隆、煙嘧黃隆、氟黃胺草醚、fluroglycofen、KIH9201、ET751、carfentrazone、carfentrazone、ZA1296、ICIA0051、RP201772、flurochloridone、達(dá)草滅(norflurazon)、百草枯、敵草快、溴苯腈和惡唑禾草靈。本發(fā)明多核苷酸能夠賦予對其抗性(或本發(fā)明植物對其具有抗性或耐性的)這些除草劑的特別優(yōu)選的組合為(ⅰ)鎮(zhèn)草寧和二苯醚或乙酰N-酰苯胺型除草劑；(ⅱ)鎮(zhèn)草寧和/或glufosinate和N-酰苯胺和/或三唑啉酮型除草劑；(ⅲ)三酮和鎮(zhèn)草寧和/或glufosinate；(ⅳ)鎮(zhèn)草寧和/或glufosinate和三酮及N-酰苯胺型除草劑；(ⅴ)鎮(zhèn)草寧和/或glufosinate和PDS抑制劑(如下述化學(xué)式Ⅰ-Ⅲ的化合物)。
由該多核苷酸所述區(qū)域所編碼的蛋白可選自鎮(zhèn)草寧氧化-還原酶、5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)、羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、細(xì)胞色素P450、乙酰-COA羧化酶(ACC)、乙酰乳酸合酶(ALS)、原卟啉原(protoporphyrinogen)氧化酶(protox)、dihydropteroate合酶、多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、超氧物歧化酶(SOD)、溴苯腈水解酶(bromoxynil nitrilase)(BNX)、八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)、可從真氧產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneseutrophus)獲得的tfdA基因的產(chǎn)物以及所述蛋白已知的誘變或其它修飾變異體。所述的tfdA基因的產(chǎn)物為能夠氧化苯氧羧酸，如2,4-D成為相應(yīng)的酚。EPSPS可從為歐洲專利No.546,090中所述的所謂Ⅱ類EPSPS。作為選擇、和/或此外，可對其進(jìn)行突變從而在特定位置包括已知導(dǎo)致對鎮(zhèn)草寧(和其農(nóng)業(yè)上可接受的鹽)增強(qiáng)抗性的氨基酸替代。例如，相對于在SEQ ID NO:9中所述的EPSPS，該EPSPS可至少在相應(yīng)于174、178、173和264位置處具有殘基Thr、Pro、Gly和Ala，變化如下(ⅰ)Thr174-Ile(ⅱ)Pro178-Ser(ⅲ)Gly173-Ala(ⅳ)Ala264-Thr其中(ⅰ)Thr174在鄰接包括Ala-Gly-Thr-Ala-Met的序列內(nèi)發(fā)生；(ⅱ)Pro178在鄰接包括Met-Arg-Pro-Leu-Thr的序列內(nèi)發(fā)生；(ⅲ)Gly173在鄰接包括Asn-Ala-Gly-Thr-Ala的序列內(nèi)發(fā)生；并且(ⅳ)Ala264在鄰接包括Pro-Leu-Ala-Leu-Gly的序列內(nèi)發(fā)生。此外，在相應(yīng)于跨越SEQ ID NO:9中位置192到232的EPSPS酶區(qū)域中的基序Glu-Arg-Pro-AA1-AA2-Leu-Val-AA3-AA4-Leu-AA5-AA6-AA7-Gly中的末端Gly殘基可用Asp或Asn殘基替代。
在該多核苷酸的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼HPPD的區(qū)域具有描述于SEQ ID NOs:1或3中的序列，或者作為選擇與這樣的序列互補(bǔ)，即該序列當(dāng)于60和65℃之間的溫度在含有0.1％SDS的0.3強(qiáng)度的檸檬酸緩沖鹽中孵育后以相同的溫度用含0.1％SDS的0.3強(qiáng)度的檸檬酸緩沖鹽沖洗后仍然分別與SEQ ID NO:1或3中所描述的序列雜交。
當(dāng)測試和發(fā)明序列為雙鏈時(shí)，構(gòu)成測試序列的核酸TM優(yōu)選與所述的SEQ ID NO:1序列TM相差在15℃以內(nèi)。當(dāng)測試和SEQ IDNO:1序列(或測試和SEQ ID NO:3序列)混合到一起并同時(shí)變性時(shí)，這些序列相互間TM值差異優(yōu)選在5℃以內(nèi)。更為優(yōu)選地，雜交在相對嚴(yán)格的條件下進(jìn)行，優(yōu)選支持測試或發(fā)明序列。這樣，將或者是變性的測試序列或者是變性的發(fā)明序列優(yōu)選首先結(jié)合到支持物上并且在60和65℃之間的溫度在含有0.1％SDS的0.3強(qiáng)度的檸檬酸緩沖鹽中進(jìn)行一特定長時(shí)間的雜交然后以相同的溫度但用0.1強(qiáng)度的檸檬酸緩沖鹽沖洗支持物。雜交包括本發(fā)明序列的地方，雜交條件也可以較少嚴(yán)格，這些對于技術(shù)人員都是顯而易見的。
當(dāng)該多核苷酸包括能夠賦予對三酮類除草劑抗性的HPPD基因時(shí)，以該多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物材料可受試于三酮類除草劑并且當(dāng)受試于所述的除草劑時(shí)根據(jù)轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化材料之間的顏色差異用視覺加以篩選。因此，當(dāng)受試于此篩選方法時(shí)未轉(zhuǎn)化的材料可變成和維持白色，而當(dāng)受試于所述的篩選方法時(shí)，轉(zhuǎn)化的材料可能變白但后來變成綠色，或可能維持綠色樣的顏色。
本發(fā)明多核苷酸的進(jìn)一步實(shí)施方案包括編碼能夠提供給植物對昆蟲、脫水和/或真菌、細(xì)菌或病毒感染抗性或耐性的蛋白的進(jìn)一步區(qū)域。由該區(qū)域所編碼的蛋白對技術(shù)人員是已知的并且包括，例如，來自蘇云金桿菌的Δ內(nèi)毒素和來自病毒的包被蛋白。
該多核苷酸可以包括所述區(qū)域的5′及與其鄰接的序列，這些序列編碼(ⅰ)能夠靶向該區(qū)域的翻譯產(chǎn)物至質(zhì)體如葉綠體、線粒體，其它細(xì)胞器或植物細(xì)胞壁的肽；和/或(ⅱ)非翻譯的翻譯增強(qiáng)序列。適宜的靶向序列編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，特別是在緊臨其下游的賦予對除草劑抗性的區(qū)域?yàn)镋PSPS或GOX酶時(shí)更是如此。編碼該多核苷酸中含有序列的蛋白的翻譯表達(dá)可通過包括此所述蛋白編碼區(qū)5′已知的非翻譯的翻譯增強(qiáng)序列而得到相對增強(qiáng)。技術(shù)人員對這種增強(qiáng)序列非常熟悉，包括稱為Ω的來源于TMV的序列和Ω引物(prime)以及特別是可從其它病毒包被蛋白編碼序列，如煙草蝕刻病毒5′區(qū)域得到的其它序列。至于核苷酸序列在植物體內(nèi)(in planta)的表達(dá)，修飾編碼能夠賦予對除草劑抗性已知蛋白的序列也許是合意的。因此，本發(fā)明也包括如上所述但mRNA不穩(wěn)定性基序和/或偶然發(fā)生的剪切區(qū)域，或者使用植物優(yōu)選的密碼子因而被修飾的被除去多核苷酸從而這樣修飾的多核苷酸在植物中的表達(dá)產(chǎn)生與通過該未修飾多核苷酸在有機(jī)體中表達(dá)而獲得的蛋白具有基本上(substantially)類似活性/功能的基本上類似的蛋白，其中該未修飾多核苷酸的蛋白編碼區(qū)對該有機(jī)體是內(nèi)源性的，該多核苷酸具有以下的附加條件，即如果這樣修飾的多核苷酸包括植物優(yōu)選的密碼子，那么在該修飾多核苷酸內(nèi)的蛋白編碼區(qū)與所述植物內(nèi)源性含有的并編碼基本上相同蛋白的同樣的蛋白編碼區(qū)之間的相同程度小于約70％。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有所述多核苷酸的載體。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供包括至少2種編碼能夠賦予對至少2種除草劑抗性蛋白的核苷酸序列并且從以本發(fā)明多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化的材料中再生出的植物。轉(zhuǎn)化技術(shù)是眾所周知的并且包括粒子介導(dǎo)的biolistic轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、(任選在聚乙二醇存在下的)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化；在包括該多核苷酸培養(yǎng)基中的植物組織細(xì)胞或原生質(zhì)體的超聲破碎；(任選利用已知的碳化硅“whiskers”技術(shù)的)顯微插入該多核苷酸到全能植物材料中，電穿孔等。轉(zhuǎn)化的發(fā)明植物包括小型谷物(smallgrain cereals)、油料種子植物、纖維植物、果樹、蔬菜、種植作物及樹木。特別優(yōu)選的這樣的植物包括大豆、棉花、煙草、甜菜、油菜、canola、亞麻、向日葵、土豆、番茄、苜蓿、萵苣、玉米、小麥、高粱、黑麥、香蕉、大麥、燕麥、草皮草、料草、甘蔗、豌豆、蠶豆、水稻、松樹、楊木、蘋果樹、葡萄、柑桔或栗樹以及這些植物的后代、種子及一部分。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括含有編碼至少2種能夠賦予該材料對至少2種除草劑抗性蛋白區(qū)域的核酸的植物材料，其具有以下的附加條件，即該材料不包含編碼包括僅僅5-烯酮-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白的多核苷酸；(ⅱ)該材料不包含包括僅僅編碼超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)區(qū)域的多核苷酸；(ⅲ)該材料不包含包括僅僅編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)區(qū)域的多核苷酸；和(ⅳ)當(dāng)該材料的來源植物為甜菜時(shí)，其包括的賦予對除草劑抗性或耐性的基因不僅僅是EPSPS和PAT。
通過對于技術(shù)人員已知的方法，該材料可再生成形態(tài)上正常且可育的完整植物。在該材料的優(yōu)選實(shí)施方案中，至少其中的一個(gè)區(qū)域編碼能夠賦予對出苗前型除草劑抗性的蛋白，并且至少其中的另一個(gè)區(qū)域編碼能夠提供對出苗后型除草劑抗性的蛋白。這樣的蛋白編碼區(qū)域及除草劑已在上面討論過。技術(shù)人員將認(rèn)識到，由于包括編碼能夠賦予對第一種除草劑抗性的第一種蛋白多核苷酸的第一種植物與包括編碼能夠賦予對第二種除草劑抗性的第二種蛋白多核苷酸的第二種植物雜交，賦予對多種除草劑抗性的區(qū)域可存在于植物(或其一部分)中(參見本申請的實(shí)驗(yàn)部分)。賦予對除草劑抗性基因的優(yōu)選組合為(ⅰ)HPPD基因和EPSPS或GOX基因；(ⅱ)HPPD基因和PAT基因；(ⅲ)GST基因和EPSPS/GOX基因；(ⅳ)EPSPS/GOX基因和PAT基因；(ⅳ)HPPD基因、GOX和/或EPSPS基因，和PAT基因；(ⅴ)ACC′ase基因和PAT和/或EPSPS基因；(ⅵ)PDS基因和PAT和/或EPSPS和/或GOX基因；(ⅶ)可從真氧產(chǎn)堿桿菌獲得的tfda基因與EPSPS和/或GOX和/或PAT和/或PDS基因。此外，這些組合中的每一種可具有一個(gè)或更多個(gè)由SOD、protox和/或ALS基因所替代的除草劑基因這樣的植物在本申請中稱為本發(fā)明的植物。
本發(fā)明也包括選擇性控制包括雜草和作物植物的大田間雜草方法，其中的作物植物包括(ⅰ)這樣的多核苷酸，其至少包括編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性或耐性的第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域和編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑抗性的第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域，其具有以下附加條件(ⅰ)該多核苷酸不編碼包括僅僅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)該多核苷酸不包括僅僅是編碼超氧物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域；(ⅲ)該多核苷酸不包括僅僅是編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域；和(ⅳ)當(dāng)該作物為甜菜時(shí)，其包括的賦予對除草劑抗性或耐性的基因不僅僅是EPSPS和PAT。或者是這樣的多核苷酸，其至少包括編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性或耐性的第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域，及下面的多核苷酸，其包括編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑抗性的第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域，具有下面的附加條件(ⅰ)該多核苷酸不編碼包括僅僅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)該多核苷酸不包括僅僅編碼超氧物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域；(ⅲ)該多核苷酸不包括僅僅編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域；和(ⅳ)當(dāng)該作物植物為甜菜時(shí)，其包括的賦予對除草劑抗性或耐性的基因不僅僅是EPSPS和PAT，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響作物植物的量施用至少一種所述的除草劑到田間。賦予對除草劑抗性的基因可存在于植物中分離的多核苷酸上。在優(yōu)選的方法中該植物含有編碼EPSPS和/或GOX酶和HPPD酶的基因，此方法包括以足以控制雜草而基本上不影響作物植物的量施用鎮(zhèn)草寧和三酮類除草劑到田間。在該方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該植物含有編碼EPSPS和/或GOX酶及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，此方法包括施用鎮(zhèn)草寧和glufosinate到田間。在此方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該植物含有編碼EPSPS和/或GOX酶及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和HPPD酶的基因，該方法包括施用鎮(zhèn)草寧和glufosinate及三酮類除草劑到田間。在此方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該植物含有編碼EPSPS和/或GOX酶和/或膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的基因，此方法包括施用鎮(zhèn)草寧和/或glufosinate和?；桨奉惓輨?，如acetochlor到田間。在該方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該植物含有編碼ACC′ase和PAT和/或EPSPS酶的基因，此方法包括施用fluazifop型除草劑和glufosinate和/或鎮(zhèn)草寧到田間。在此方法更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該植物含有編碼可獲自真氧產(chǎn)堿桿菌(任選優(yōu)化密碼子的)tfdA基因產(chǎn)物和EPSPS和/或GOX和/或PAT和/或PDS酶的基因，此方法包括施用2,4D和鎮(zhèn)草寧和/或glufosinate和/或除草劑型八氫番茄紅素脫氫酶抑制劑到田間。此外，這些組合中的每一個(gè)可能具有一個(gè)或更多個(gè)由SOD、protox和/或ALS基因所替代的除草劑基因。
在該發(fā)明方法特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在施用一種或更多種除草劑到田間后施用殺蟲有效量的一種或更多種殺蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑和抗-病毒劑到田間。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備對二種或更多種除草劑實(shí)質(zhì)上具有耐性或?qū)嵸|(zhì)上具有抗性的植物的方法，包括以下步驟(ⅰ)以本發(fā)明多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物材料；(ⅱ)篩選這樣轉(zhuǎn)化的材料；和(ⅲ)將這樣篩選出的材料再生成形態(tài)上正常且可育的完整植物。
本發(fā)明植物可任選通過下面的方法獲得，包括以賦予對第一種除草劑抗性的序列轉(zhuǎn)化第一種植物，并且以賦予對第二種除草劑抗性的序列轉(zhuǎn)化第二種植物，將這樣轉(zhuǎn)化的材料再生成可育完整的植物并對這些植物異花傳粉以得到包括既對所述第一種除草劑具有抗性的基因又對第二種除草劑具有抗性的基因的后代。任選地，該第一種和/或第二種材料可事先以包括以下區(qū)域的多核苷酸加以轉(zhuǎn)化，這些區(qū)域編碼一種或更多種賦予對除草劑抗性的蛋白、殺蟲劑蛋白、抗真菌劑蛋白、抗病毒劑蛋白和/或能夠賦予植物對干旱改進(jìn)耐性的蛋白。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供了本發(fā)明多核苷酸或載體在制備對二種或更多種除草劑實(shí)質(zhì)上具有耐性或抗性的植物組織和/或形態(tài)上正常且可育完整植物(Ⅰ)中的應(yīng)用。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供了本發(fā)明多核苷酸或載體在體外就高流通量篩選潛在除草劑而制備除草劑目標(biāo)中的使用。該多核苷酸的蛋白編碼區(qū)可在大腸桿菌或酵母中異源表達(dá)。
本發(fā)明更進(jìn)一步包括以包括SEQ ID NO:1中描述序列并且編碼雙加氧酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物組織。這可能是該材料中唯一賦予對除草劑抗性的基因?？捎靡阎姆椒▽⒃摬牧显偕尚螒B(tài)上正常且可育的植物。在該轉(zhuǎn)化組織特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼與SEQ ID NO:1所編碼蛋白基本上具有類似活性蛋白的多核苷酸與這樣的的序列互補(bǔ)即該序列當(dāng)于60到65℃間溫度在含有0.1％SDS的0.3強(qiáng)度的檸檬酸緩沖鹽中孵育后于相同的溫度用含0.1％SDS的0.3強(qiáng)度的檸檬酸緩沖鹽沖洗后仍與SEQ ID NO:1中描述的序列雜交。
通過下面的描述及相關(guān)的附圖和序列描述，本發(fā)明將進(jìn)一步顯而易見。
SEQ ID NO:1顯示了從集胞藍(lán)細(xì)菌分離的DNA序列，其編碼具有p-羥苯基丙酮酸雙加氧酶活性的酶(如SEQ ID NO:2所述)。
SEQ ID NO:3顯示了從假單胞菌87/79中分離的DNA序列，其中第1217到2290的核苷酸編碼具有p-羥苯基丙酮酸雙加氧酶活性的酶(如SEQ ID NO:4中所述)。
SEQ ID NO:5和6描述一種用于從細(xì)菌基因組中分離SEQ IDNO:3的具有最低豐余的合成PCR引物(參見下面的HPPD-P4和HPPD-REV1)。
SEQ ID NOs:7和8也是用于修飾SEQ ID NO:3序列從而其可摻入到所需植物轉(zhuǎn)化載體中的合成PCR引物。
SEQ ID NO:9顯示矮牽牛EPSPS酶(包括葉綠體信號肽)的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:10-32為插入到限制性消化過的質(zhì)粒中從而能夠制備包括能賦予對除草劑抗性多種基因的構(gòu)建體的PCR引物或多-接頭。


圖1顯示包括在SEQ ID NO:3中描述序列的克隆的圖解，SEQID NO:3中鑒定出三個(gè)開放閱讀框第一個(gè)起于核苷酸15且止于核苷酸968；第二個(gè)起于核苷酸215且止于核苷酸1066且第三個(gè)起于核苷酸1217且止于核苷酸2290。該圖也顯示通過用引物SEQ ID NOs:7和8進(jìn)行遺傳工程操作過的序列內(nèi)含有的限制性位點(diǎn)，圖2圖解描述了含有植物表達(dá)彈夾(expression cassette)的4-HPPD的制備，該彈夾中PCR編輯的圖1的DNA片以酶Nco1和Kpn1限制性酶切，然后連接到也以Nco1和Kpn1限制性酶切的載體(pMJB1)中。圖3圖解顯示如何對植物轉(zhuǎn)化雙重載體pBin19進(jìn)行遺傳工程操作以含有圖2的4-HPPD表達(dá)彈夾。
圖4圖解顯示包括SEQ ID NO:1中描述序列的克隆。圖5圖解描述含有植物表達(dá)彈夾的4-HPPD的制備，該彈夾中PCR編輯的圖4的DNA片段以酶Nco1和Kpn1限制性酶切，然后連接到也以Nco1和Kpn1限制性酶切的載體(pMJB1)中。
圖6圖解顯示用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體的構(gòu)建并且也包括質(zhì)粒pJRlRi和pGST-273in的圖譜；圖7顯示在受試于四種除草劑的轉(zhuǎn)化煙草中GST的活性；圖8為比較在以1400g/ha metolachlor處理3周后野生型植物和GST-2系的損傷的圖；圖9為質(zhì)粒pDV3-puc的圖譜；圖10為質(zhì)粒pDV6-Bin的圖譜；圖11為含有來自玉米泛素啟動(dòng)子片段PCRed的質(zhì)粒pUB-1的圖譜，將2kb的片段克隆αpUC19中并對接點(diǎn)(junction)進(jìn)行測序以確證該泛素啟動(dòng)子的存在；圖12為質(zhì)粒pIE98的圖譜；圖13為質(zhì)粒pIGPAT的圖譜；圖14為質(zhì)粒pCAT10的圖譜；圖15為質(zhì)粒pCAT11的圖譜；圖16為質(zhì)粒pPG6的圖譜；圖17為質(zhì)粒pMV1質(zhì)粒的一部分。實(shí)施例1克隆假單胞菌的4-HPPD基因、轉(zhuǎn)化該基因到植物材料中并且制備對三酮類除草劑具有抗性的植物以酪氨酸作為唯一碳源而培養(yǎng)的熒光假單胞菌PJ-874中純化的4-HPPD的氨基酸序列是已知的。(Ruetschi等，歐洲生物化學(xué)雜志1992,202(2):459-466)，用該序列設(shè)計(jì)具有最少豐余的PCR引物以用于從不同的菌株(熒光假單胞菌菌株87-79)基因組DNA中擴(kuò)增大段但不完整的4-HPPD基因片段。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識到什么是術(shù)語“具有最少豐余引物”的意義所在，在下述的序列中此豐余用方括號表示。各個(gè)引物中每個(gè)引物的一個(gè)實(shí)例(相應(yīng)于HPPD基因中5′和3′位置)分別示于SEQ ID NOs:3和4中。
17聚體的引物1(SEQ ID NO:5)根據(jù)發(fā)表蛋白序列(見上面)的4-9氨基酸的序列知識而設(shè)計(jì)并且同樣為17聚體的引物2根據(jù)334到339殘基的知識而設(shè)計(jì)。
引物1(HPPD-P4)具有序列5′TA〔T/C〕GA〔G/A〕AA〔T/C〕CC〔T/C/G/A〕ATGGG且引物2(HPPD-REV1)具有序列 5′GC〔T/C〕TT〔G/A〕AA〔G/A〕TT〔T/C/G/A〕CC〔T/C〕TC。用標(biāo)準(zhǔn)的方法制備100ng假單胞菌87-79的基因組DNA并且與100pmol的每種引物相混合。用Taq聚合酶和其它標(biāo)準(zhǔn)的試劑在下面的DNA合成和解離條件下對該混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(35輪循環(huán))94℃×1.5分鐘55℃×2分鐘74℃×3分鐘擴(kuò)增出的序列包括含有4HPPD基因編碼區(qū)5′端3個(gè)密碼子和3′端約30個(gè)密碼子的區(qū)域。用標(biāo)準(zhǔn)的方法將此PCR產(chǎn)物平端克隆入持家載體pGEM3Z-f(+)中。
部分測序證實(shí)此克隆的PCR片段為4-HPPD特異性的。得到的此氨基酸序列與發(fā)表的有關(guān)熒光假單胞菌PJ-874酶的序列相比含有數(shù)處不同。4-HPPD基因的此部分片段在低嚴(yán)格雜交/洗條件下與植物DNA的基因組Southern印跡中得到陰性雜交信號。從預(yù)先克隆的部分基因的中部切下900bp的EcoR1/EcoR1片段以用作探針。用多種酶對該基因組DNA限制消化后的Southern印跡與該放射性標(biāo)記的片段雜交。
Bcl1限制性消化的DNA得到單一的約2.5kb的陽性帶，該帶足以含有整個(gè)基因加上非翻譯DNA的側(cè)翼區(qū)。將基因組DNA以Bcl1限制性消化并于制備性瓊脂糖凝膠上電泳。切出含有2-3kb大小片段的消化過DNA的區(qū)域并且進(jìn)行DNA電洗脫。將回收的DNA克隆入pUC18的BamH1(與Bcl1兼容)位點(diǎn)中。以該900bp的片段檢測菌落印跡并分離出12個(gè)陽性菌落。從這些菌落中小量制備(DNA)，并以EcoR1切割以尋找鑒別性的900bp的帶。在這12個(gè)菌落中，當(dāng)過夜培養(yǎng)于LB中的7個(gè)形成棕色色素以制備小量(DNA)，這其中的5個(gè)為該900bp陽性帶，其它5個(gè)小量制備物為陰性并且不產(chǎn)生棕色的色素?！白厣亍钡男纬膳c4-HPPD基因的異源表達(dá)有關(guān)。
限制性分析顯示該克隆的插入子為2.5kb的長度，具有4-HPPD基因上游約1.2kb的DNA和400bp的下游。用適當(dāng)?shù)囊锖蛠碜詐UC18的引物對該基因末端進(jìn)行測序。此測序證明該基因?yàn)橥暾牟⑶蚁鄬τ趐UC18的多接頭位點(diǎn)以2個(gè)方向存在。
對細(xì)菌細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE顯示存在一40kDa大小的新的蛋白，其對于4-HPPD是正確的(大小)。細(xì)胞提取物中存在一較大的條帶，其中具有以第一個(gè)方向插入基因從而使該基因從載體中的lac啟動(dòng)子開始表達(dá)。當(dāng)裂解液從其中的基因?yàn)橄喾捶较虻募?xì)胞中獲得時(shí)沒能見到明顯的40kD的條帶，雖然二種克隆產(chǎn)生棕色色素表明在這二種細(xì)胞類型中均有活性蛋白的存在。此40kDa的重組蛋白以可溶性而不是不溶性蛋白成分而存在。將其中的基因?yàn)榈诙N方向的克隆進(jìn)行自動(dòng)DNA序列分析以顯示出SEQ ID NO:3中描述的序列。編輯此序列以導(dǎo)入數(shù)個(gè)單一的限制位點(diǎn)從而有利于其裝配進(jìn)適于植物轉(zhuǎn)化工作的載體中。SEQ ID NOs:7和8中描述的編輯寡核苷酸的引物3(HPPD SYN1)5′-GTTAGGTACCAGTCTAGACTGACCATGGCCGACCAATACGAAAACC-3′和引物4(HPPD SYN2)5′-TAGCGGTACCTGATCACCGGGTTATTAGTCGGTGGTCAGTAC-3′。假單胞菌4-HPPD基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)將PCR編輯的DNA片段從酶Nco1和Kpn1限制性消化，然后連接到也以Nco1和Kpn1限制性消化的載體(pMJB1)中。pMJB1為來源于pUC19的質(zhì)粒，其含有2個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子；TMVΩ增強(qiáng)子和NOS轉(zhuǎn)錄終止子。得到的質(zhì)粒圖示于圖2中。所有的DNA操作使用對植物分子生物學(xué)技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法。
分離大批DNA并通過EcoR1部分消化而切下4-HPPD表達(dá)彈夾(即，從2×35S到nos 3′終止子)且然后以Hind 3完全消化。這是為了避免在4-HPPD基因內(nèi)部的EcoR1位點(diǎn)切割。制備性瓊脂糖凝膠電泳后，通過電洗脫回收需要的DNA片段。
然后將4-HPPD表達(dá)彈夾連接到以Hind 3和EcoR1限制性消化過的雙重載體pBin19中。得到質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖示于圖3中。
再次用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離DNA并用于轉(zhuǎn)化卡那霉素抗性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)對煙草(Nicotiana plumbaginifolia varSamsun)葉子背面(discs)/葉片(slices)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。從卡那霉素抗性的愈傷組織中再生轉(zhuǎn)化的幼枝。將幼枝于含有卡那霉素的MS瓊脂上生根。將存活的生根外植體再次生根以提供約80株卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化煙草植物。通過PCR證實(shí)4-HPPD基因的存在(用預(yù)先-存在的EDIT引物)約60株植物為PCR陽性。
將外植體(即葉子加上含有附屬芽的短的莖段)置于含有0.02到2ppm各種濃度ZA1206(三酮類除草劑)的MS瓊脂(+3％蔗糖)上。未轉(zhuǎn)化的煙草外植體在0.02ppm時(shí)被完全漂白。以后繼續(xù)暴露于除草劑中它們沒有恢復(fù)。在這些特定的實(shí)驗(yàn)中，僅僅是從芽中長出的幼枝受到漂白。而外植體組織上的葉子保持綠色。
大約30株P(guān)CR陽性(PCR+ve)的轉(zhuǎn)化植物耐受0.1ppm的ZA1296(大約是導(dǎo)致野生型煙草癥狀時(shí)的水平的5倍)而無漂白跡象。它們生根正常并且在表型上與未轉(zhuǎn)化植物難以分辨，這些轉(zhuǎn)化子中有一部分耐受0.2ppm且少數(shù)轉(zhuǎn)化子耐受達(dá)0.5-1ppm的濃度。在除草劑存在下這些植物仍然表型正常且生根良好。有些轉(zhuǎn)化的植物當(dāng)受試于所述較高濃度除草劑時(shí)開始時(shí)被漂白，但繼續(xù)暴露它們逐漸“綠起來”并且“恢復(fù)”。
用已知的除草劑Isoxaflutole〔5-環(huán)丙基-4-(2-甲基磺酰-4-三氟甲基苯甲?；?異噁唑或RPA210772〕處理此對所述除草劑具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的一部分植物。這些植物對該除草劑較對命名為ZA1296的除草劑甚至具有更多的抗性因而清楚地表明這些植物對各種4-HPPD抑制劑具有交叉抗性。實(shí)施例2將集胞藍(lán)細(xì)菌的4-HPPD基因克隆入植物材料并且再生此材料以產(chǎn)生對三酮類除草劑具有抗性的植物集胞藍(lán)細(xì)胞PCC6803的基因組已被測序。為了導(dǎo)入獨(dú)特物限制位點(diǎn)以利于其裝配入適于植物轉(zhuǎn)化工作的載體中，用標(biāo)準(zhǔn)的方法制備集胞藍(lán)細(xì)菌的DNA，并且與100pmol的二種適于PCR擴(kuò)增(35個(gè)循環(huán))SEQ ID NO:1中指定序列的引物混合，使用優(yōu)選具有糾錯(cuò)閱讀活性的DNA熱穩(wěn)定DNA聚合酶和其它標(biāo)準(zhǔn)的試劑在適當(dāng)?shù)腄NA合成和解離條件下，下面為典型的條件94℃×1.5分鐘55℃×2分鐘74℃×3分鐘擴(kuò)增出的片段包括含有4-HPPD基因編碼區(qū)的區(qū)域。用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將此PCR產(chǎn)物平端克隆入標(biāo)準(zhǔn)的持象載體中，例如pGEM3Z-f(+)中。
自動(dòng)DNA序列分析證實(shí)此克隆的PCR產(chǎn)物為4-HPPD特異性的。有些帶有克隆的4-HPPD基因的轉(zhuǎn)化菌落當(dāng)過夜培養(yǎng)于LB中時(shí)形成棕色色素。“棕色色素”的形成與4-HPPD基因的異源表達(dá)有關(guān)(Denoya等1994細(xì)菌學(xué)雜志176:5312-5319)。
結(jié)細(xì)菌細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE顯示它們含有一種新的蛋白，其具有4-HPPD基因產(chǎn)物的預(yù)期分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中該重組蛋白或者以可溶性成分存在而不以不溶性成分存在，或者將其加工成這樣的成分存在。此克隆優(yōu)選進(jìn)行自動(dòng)DNA序列分析以證實(shí)PCR產(chǎn)生的人工產(chǎn)物的缺如。集胞藍(lán)細(xì)胞pcc6803 4-HPPD基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)將此PCR編輯的DNA片段以適宜的酶如Nco1和Kpn1限制性消化，然后連接到例如適當(dāng)限制性消化過的大腸桿菌表達(dá)載體(如已知的pET系列)中。所有的DNA操作使用對分子生物學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員為已知的標(biāo)準(zhǔn)方法。
適宜的宿主菌如帶有所述載體的BL21(DE3)或其它DE3溶原菌表達(dá)大量的HPPD酶從而足以提供其用于大量的篩選過程中從而鑒定出候選4-HPPD抑制子。從所述轉(zhuǎn)化宿主菌株中純化的HPPD可用于提供抗血清從而用于分析以編碼4-HPPD的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。集胞藍(lán)細(xì)胞pcc6803 4-HPPD基因在轉(zhuǎn)基因組植物中的異源表達(dá)將PCR編輯的DNA片段以適宜的酶如Nco1和Kpn1限制性消化，然后連接到例如適宜的持家載體，如pMJB1中以產(chǎn)生含有適當(dāng)植物可操作啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)彈夾。pMJB1為pUC19衍生的質(zhì)粒，其含有2個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子；TMVΩ增強(qiáng)子和nos轉(zhuǎn)錄終止子。得到的質(zhì)粒圖解顯示于圖4中。
然后將4-HPPD表達(dá)彈夾連接到以Hind3和EcoR1限制性消化過的雙重載體pBin19中。得到質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖解顯示于圖5中。
再次用標(biāo)準(zhǔn)的方法分離DNA并用于轉(zhuǎn)化對卡那霉素具有抗性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404。用標(biāo)準(zhǔn)的方法對土豆和番茄進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。從對卡那霉素具有抗性愈傷組織中再生轉(zhuǎn)化的幼枝。將幼枝于含有卡那霉素的MS瓊脂上生根。將存活生根的外植體再次生根以提供大約80株對卡那霉素具有抗性的轉(zhuǎn)化的煙草植物。通過PCR證實(shí)4-HPPD基因的存在(用預(yù)先存在的EDIT引物)。篩選大量的PCR陽性植物以用于進(jìn)一步分析。
將外植體(即，葉子加上含有附屬芽的短的莖段)置于含有0.02到2ppm各種濃度ZA1206(三酮類除草劑)的MS瓊脂(+3％蔗糖)中。未轉(zhuǎn)化的植物在0.02ppm時(shí)被完全漂白。繼續(xù)暴露于該除草劑它們沒有恢復(fù)。在這些特定的實(shí)驗(yàn)中，僅僅是從芽生長出的幼枝受到漂白，外植體組織上的葉子保持綠色。
大約30株P(guān)CR陽性的轉(zhuǎn)化植物耐受0.1ppm的ZA1296(大約是導(dǎo)致野生型煙草癥狀的水平的5倍)而沒有漂白跡象。它們生根正常并且與未轉(zhuǎn)化植物在表型上難以區(qū)分。這些轉(zhuǎn)化子中的一部分耐受0.2ppm并且少數(shù)轉(zhuǎn)化子耐受達(dá)0.5-1ppm的濃度。在除草劑存在下這些植物仍然表型正常且生根良好。當(dāng)受試于所述較高濃度的除草劑時(shí)有些轉(zhuǎn)化的植物起始被漂白，但繼續(xù)暴露(于除草劑)時(shí)它們逐漸“綠起來”并且“恢復(fù)”。
用已知的除草劑Isoxaflutole〔5-環(huán)丙基-4-(2-甲基磺酰-4-三氟甲基苯甲?；?異噁唑或RPA210772〕處理對所述除草劑具有抗生的轉(zhuǎn)基因植物的一部分。這些植物對該除草劑具有抗性并且對部分為ZA1296的除草劑具有抗性因而清楚地表明該植物對多種4-HPPD抑制劑具有交叉抗性。
實(shí)施例3將GST基因克隆入植物材料中并且產(chǎn)生對N-酰苯胺和二苯醚類除草劑具有抗性的植物植物將煙草(Nicotiana tabacum cv Samsum)的莖干(Stocks)保存于Musharige和Skoog培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基補(bǔ)充以3％蔗糖和0.8％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的MS鹽(4.6g/l),pH5.9)中。將這些植物，用于生根分析的外植體和用于萌發(fā)測試的種子于25℃室溫光照培養(yǎng)16小時(shí)。當(dāng)培養(yǎng)于溫室中時(shí)，將這些植物轉(zhuǎn)移到堆肥(JohnInnes堆肥3號，Minster Brand產(chǎn)品)中。細(xì)菌菌株大腸桿菌菌株DH5(GIBCO BRL)為F-,80dlac ZM15,(lacZYAargF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rK-,mK+),supE44,-thi-gyrA96relA1。根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404用于轉(zhuǎn)化煙草葉片。質(zhì)粒將GST-27DNA插入到命名為pIJ21-3A的2.961kb的pBluescript_ⅡSK(+/-)噬菌粒(Jepson等1994)中。pJR1Ri為12.6kb的質(zhì)粒。該pJR1Ri質(zhì)粒含有細(xì)菌卡那霉素抗性標(biāo)記(KAN)。其具有2個(gè)25bp的重復(fù)序列右邊界(RB)和左邊界(LB)。T-DNA含有由NOS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的卡那霉素抗性標(biāo)記基因。GST-27蛋白編碼序列在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。大小標(biāo)記當(dāng)在瓊脂糖凝膠上檢查消化和PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))產(chǎn)物時(shí)將1kb DNA梯子用作DNA大小標(biāo)記(Bethesda ResearchLaboratories Life Technologies，有限公司)。正如技術(shù)人員所知道的將虹色蛋白分子量標(biāo)記(Amersham)加樣于聚丙烯酰胺凝膠中用于Western分析?；瘜W(xué)試劑活性成分acetochlor、alachlor和metolachlor生產(chǎn)于ZENECAAgrochemicals(UK),Jealott’s HillResearchStation。在乙醇中制備技術(shù)成分(fechnical ingredients)且用于HPLC分析、生根分析和萌發(fā)測試(參見下面)。質(zhì)粒構(gòu)建在1×Tris乙酸鹽(TA)緩沖液中用限制酶EcoRⅠ(發(fā)瑪西亞)消化含有GST-27DNA基因的質(zhì)粒pIJ21-3A。于0.8％瓊脂糖凝膠上檢查消化(結(jié)果)。用Klenow DNA聚合酶(發(fā)瑪西亞)添平突出端后將EcoRⅠ消化的片段連接到pJR1Ri的Smal(發(fā)瑪西亞)位點(diǎn)中(圖6)。連接GST基因之前用中堿性磷酸酶(C.A.P)防止pJR1Ri的自連。通過熱休克方法用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(DH5)。將其培養(yǎng)于L-瓊脂及卡那霉素平板上。通過PCR或以標(biāo)記探針(α-32P dNTP)于42℃雜交過夜檢查陽性菌落。通過每個(gè)A或T增加2℃并且每個(gè)G或C增加4℃來確定探針的解鏈溫度(TM)。反應(yīng)根據(jù)制造商方法用Taq聚合酶(Ampli-Taq DNA聚合酶，PerkinElmer Cetus)在最低的Tm-5C進(jìn)行，按如下設(shè)立36個(gè)環(huán)循環(huán)的PCR條件94℃DNA變性48秒，在最低的Tm時(shí)退火1分鐘且于72℃延伸2.5分鐘。第一輪循環(huán)之前，以85℃開始反應(yīng)。
挑選8個(gè)陽性菌落并于37℃振蕩培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基和卡那霉素培養(yǎng)中過夜。提取這些細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA且然后通過以50,000rpm在CsCl梯度中超速離心而純化。
通過用Sequenese_(2.0版，美國生化公司)根據(jù)制造商步驟；按照Sanger方法對35S啟動(dòng)子和GST基因之間的區(qū)域進(jìn)行測序而檢查插入到pJR1Ri中的方向。用Hostler等1987所述的凍融方法將得到的質(zhì)粒(pGST-27Bin)(圖6)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。通過農(nóng)桿菌的葉片轉(zhuǎn)化根據(jù)Bevan1984所述方法將pGST-27Bin轉(zhuǎn)化入煙草中。培養(yǎng)于MS上3周齡的無菌煙草(Nicotiana tabacum cv Samsum)培養(yǎng)物用于轉(zhuǎn)化。于NBM培養(yǎng)基(補(bǔ)充以1mg/l6-苯甲氨基嘌呤(6-BAP)、0.1mg/l萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基)和卡那霉素中將這些葉片孵育1天。此培養(yǎng)基能使從葉片中長出幼枝(Shoot)。一天后，切掉葉片邊緣并將葉片切成碎片。然后將其與含有具有插入子的pJR1RⅠ質(zhì)粒(pGST-27Bin)的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞懸液(菌株LBA4404)一起孵育20分鐘。然后將碎片返回到含有NBM培養(yǎng)基的平板中。2天后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)充以羧芐青霉素(500mg/l)和卡那霉素(100mg/l)的NBM培養(yǎng)基的培養(yǎng)盤中。5周后，將每個(gè)葉片背面的1根幼枝轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充以羧芐青霉素(200mg/l)和卡那霉素(100mg/l)的NMB培養(yǎng)基中。2-3周后，將其有根的幼枝轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。將每個(gè)幼枝的2根插條轉(zhuǎn)移到各自的培養(yǎng)盤中。一個(gè)保存為組織培養(yǎng)原種(Stock)，另一個(gè)在生根后轉(zhuǎn)移到溫室中生長。將帶有GST-27構(gòu)建體的42個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到溫室中。用于PCR反應(yīng)的葉片DNA提取通過PCR證實(shí)推斷性轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)基因的存在。從培養(yǎng)于無菌條件中3-4周齡的植物中采集葉片樣品。將大約5mm直徑的葉片于200μl提到緩沖液(0.5％十二烷基磺酸鈉(SDS)、250mM NaCl、100mM Tris HCl(pH8)中研磨30秒。將樣品以13,000rpm離心5分鐘且然后向上層液中加入等體積150μl的異丙醇。將樣品置于冰上10分鐘，以13,000rpm離心10分鐘并放置至干燥。然后將其重懸于100μl去離子水中，其中的15μl用于PCR反應(yīng)。PCR用Jepson(1991)所述的條件進(jìn)行。用對GST-27 3′區(qū)域特異性的引物GSTⅡ/7(AACAAGGTGGCGCAGTT)(SEQ IDNO:10)和對NOS終止子特異性的NOS3(CATCGCAAGACCGGCAACAG)(SEQ ID NO:11)分析以GST-27DNA轉(zhuǎn)化的植物。通過PCR,42個(gè)初始轉(zhuǎn)化子中的39個(gè)得到了310bp的片段。Western印跡分析為了證實(shí)GST-27在煙草中的異源表達(dá)，進(jìn)行Western印跡分析。于4℃在聚乙烯poly-pyrolidone(PVPP)(為了吸附苯類化合物)和0.5ml提取緩沖液(1M Tris HCl,0.5MEDTA(乙二胺-四乙酸)、5mM DTT(二硫蘇糖醇)、pH7.8)中研磨120mg來自于無菌條件下培養(yǎng)3-4周植物的葉片。然后再加入200μl提取緩沖液。混合該樣品且然后于4℃離心15分鐘。去除上清液，用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)通過Bradford分析估計(jì)蛋白的濃度。將樣品保存于-70℃直至需用。
煮沸2分鐘后，將5μg具有33％(v/v)Laemmli染料(97.5％Laemmli緩沖液(62.5mM Tris HCl,10％w/v蔗糖、2％w/vSDS,pH6.8),1.5％焦寧y和1％-巰基乙醇)的蛋白樣品上樣于SDS-聚丙烯酰胺凝膠(17.7％30:0.174丙烯酰胺雙丙烯酰胺)中。在下面的緩沖液(14.4％w/v甘油，1％w/v SDS,3％w/v Tris堿)中電泳分離蛋白提取物。然在下面的印跡緩沖液(14.4％w/v甘油，3％w/v Tris堿，0.2％w/v SDS,20％v/v甲醇)中用電印跡方儀(Biorad unit)于40mV過夜將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(Hybond-CAmersham)上。
通過在0.05％CPTS(酞菁銅四磺酸四鈉鹽(Copperphtalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium salt))及12mM HCl中染色新印跡的硝酸纖維素而檢查上樣等量的蛋白。然后通過在12mMHCl溶液中2-3次沖洗而對印跡進(jìn)行脫色并且過量的染料通過在0.5MNaHCO3溶液中5-10分鐘并且以去離子水沖洗而去除。濾膜用含有5％w/v BSA的TBS-Tween(2.42％的w/v Tris HCl,0.8％w/vNaCl,5％Tween20(聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單月桂酸酯)，pH7.6)封閉1小時(shí)。然后將其在補(bǔ)充以2％w/v BSA的TBS-Tween中洗20分鐘。用1∶2000稀釋的綿羊GST-27抗血清作為一級抗體并且用1∶1000稀釋的兔抗綿羊抗血清作為與辣根過氧化物酶(HRP)的二級抗體進(jìn)行間接免疫測定。用補(bǔ)充以2％w/v BSA和TBS-Tween洗去任何多余的抗血清。和Amersham描述的方法進(jìn)行ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)檢測。通過在上述溶液中再次洗膜而去掉任何背景。
在LKB 2222-020Ultroscan XL激光光密度計(jì)(發(fā)瑪西亞)上對GST基因的表達(dá)水平進(jìn)行估計(jì)。Western分析表明PCR陽性的初級轉(zhuǎn)化子中有8個(gè)沒有顯示出可檢測到的GST-27的表達(dá)。剩下的31個(gè)顯示出不同的表達(dá)水平，其變化從幾乎檢測不到的水平到如同在純玉米GSTⅡ樣品中檢測到的相當(dāng)于1％總可溶性蛋白的高水平。Southern印跡分析通過Southern印跡分析確定轉(zhuǎn)基因的整合模式。自培養(yǎng)于溫室中植物采集的置于含有0.75ml提取緩沖液(0.35M山梨糖醇，0.1M Tris HCl,0.005M EDTA,0.02M偏亞硫酸氫鈉，pH7.5)的塑料袋中的2.5g新鮮煙草葉片通過穿過“Pasta機(jī)器”的滾動(dòng)器(roller)而壓碎。然后在6000rpm于室溫中離心壓碎的提取物5分鐘。棄上清液后，將沉淀物重懸于300μl提取緩沖液和300μl核團(tuán)(nuclei)裂解緩沖液(2％w/v CTAB),0.2M Tris HCl,0.05MEDTA,2M NaCl,pH7.5)中。加入120μl5％的Sarkosyl并且將該樣品置于65℃水浴中15分鐘。加入600μl24∶1的氯仿∶異戊醇后以6000rpm離心提取物5分鐘。將700μl異丙醇加入到相同體積的上清液中并以13,000rpm離心10分鐘。然后以70％乙醇洗沉淀物并放置氣干。將沉淀物于4℃置于30μl TE(10mM Tris HCl,1mMEDTA)中過夜以將其重懸。將樣品保存于20℃直至需用。
對于含有GST-27基因的植物的提取物，將葉片總RNA于37℃在1×Phor-one-all緩沖液(20mM Tris乙酸鹽，20mM乙酸鎂，100mM乙酸鉀，發(fā)瑪西亞)中用下面的限制酶SacⅠ和XbaⅠ消化6小時(shí)。DNA于0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離，通過在0.5M NaOH、1.5MNaCl中輕輕搖動(dòng)30分鐘而變性并且通過在0.5M Tris HCl,1.5MNaCl中搖動(dòng)75分鐘而中和該凝膠。然后通過于20×SSC(3MNaCl,0.3M Na3citrate)中毛細(xì)印跡將此DNA轉(zhuǎn)移至Hybond-N(Amersham)尼龍膜上。聯(lián)合使用UV層聚(Strata)交聯(lián)(Stratagene)并且于80℃烘烤20分鐘而將DNA固定于膜上。通過用EcoRⅠ消化從含有GST-27基因的質(zhì)粒(用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化)中切下探針。用Prime-a-Gene試劑盒(Promega)，根據(jù)Feinberg和Vogelstein所述隨機(jī)引物方法用α-32P dNTP(3,000Ci/mM)標(biāo)記該探針。通過以SacⅠ和EcoRⅠ消化pIJ21-3A而制備陽性對照。
在5×SSPE(0.9M NaCl,0.05M磷酸鈉，0.005M EDTA,pH 7.7),0.5％SDS,1％w/v Marvel(干奶粉)，200μg/ml變性鮭精DNA中于65℃3-4小時(shí)進(jìn)行預(yù)雜交。在相同的緩沖液(但沒有最后一種成分)中進(jìn)行雜交。于-70℃放射自顯影之間，于65℃在3×SSC,0.5％SDS中洗30分鐘并且于1×SSC,0.1％SDS中洗2次而進(jìn)行洗膜。HPLC分析為了證實(shí)表達(dá)GST-27的植物顯示抗除草劑底物的GST活性，用HPLC進(jìn)行體外除草劑分析。從培養(yǎng)于溫室中3-4月齡的開花煙草植物中采集1g葉片組織，并于液氮和7ml提取緩沖液(5mM甘氨酰甘氨酸、0.5mM EDTA、1mM DTT,pH 7.5)中研磨。將提取物轉(zhuǎn)移至含有0.1g PVPP的離心管中并以16,500rpm于4℃離心30分鐘。將2.5ml上清液上樣于Sephadex G-25(PD 10)柱(發(fā)瑪西亞)中并且以3.5ml含有1mM EDTA和1mM DTT的磷酸鈉緩沖液(50mM,pH 7.0)洗脫。用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)通過Bradford方法對蛋白進(jìn)行估計(jì)。將提取物分成數(shù)多份并于-70℃保存?zhèn)溆?。?5:35乙腈1％水溶性磷酸流動(dòng)相以1.5ml/分鐘的速率在Spherisorb5μ ODS2柱(25cm*4.6mm i.d.，制造商Hichrom)上進(jìn)行HPLC分析。在UVLC-6A Schimadzu檢測器上(波長200nm)上檢測該化合物。
反應(yīng)在室溫(20-25℃)于0.8ml HPLC小瓶中進(jìn)行。將15-94％體積的植物外植體加入到磷酸鈉緩沖液(pH7),5mM谷胱甘肽成同型谷胱甘肽及2或20ppm化合物(2ppm消草醚，20ppmacetochlor,alachlor及metolachlor)中。同樣用相同的比例但以磷酸鈉緩沖液代替提取物而設(shè)立對照。通過加入用作底物的除草劑而起始反應(yīng)。監(jiān)測化合物反應(yīng)性最長達(dá)9-19小時(shí)。通過JCL6000色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)包(Jones色譜)計(jì)算特異性滯留時(shí)間點(diǎn)的HPLC峰值面積對時(shí)間圖。根據(jù)校正峰值面積對時(shí)間數(shù)據(jù)的指數(shù)適合度(fits)獲得半壽期及假一級速率常數(shù)(psendo first-order rate constant data)。用2.0版的FIT軟件包對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行控制(master)。
用上述方法學(xué)，分析轉(zhuǎn)化植物抗不同除草劑底物GST活性。這些除草劑由3種二氯乙酰硝基苯胺(acetochlor alachlor metolachlor)和二苯醚(消草醚)所組成。已知這些化學(xué)藥品，特別是二氯乙酰硝基苯胺被結(jié)合到谷胱甘肽上。提取在PVPP及低溫時(shí)進(jìn)行以限制蛋白的變性。對GST穩(wěn)定性研究顯示當(dāng)貯存于-20℃時(shí)玉米粗提物中GST活性下降73％。因此，決定將提取物分成多等份。將其保存于-70℃?zhèn)溆?。對每個(gè)樣品于冰上過夜解凍僅一次。提取后2周內(nèi)進(jìn)行分析。
根據(jù)其溶解性限度設(shè)定除草劑在HPLC小瓶中的濃度。在20ppm分析acetochlor,alachlor及metolachlor并且于2ppm分析消草醚。根據(jù)除草劑的反應(yīng)性將此分析進(jìn)行9-19小時(shí)。對metolachlor分析更長的時(shí)間，因?yàn)槠浒雺燮谠谶@些條件下較長。于200nm處在UV檢測器上對這些化合物進(jìn)行測定。監(jiān)測除草劑的特異性滯留時(shí)間及峰值面積。根據(jù)7-11個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)算GST活性。指數(shù)下降曲線后進(jìn)行酶交聯(lián)，被分析除草劑峰值面積的下降用于計(jì)算GST活性。同時(shí)計(jì)算半壽期及第一級速率常數(shù)。
分析包括野生型(陰性對照)、4GST-275、6、12和17品系的5個(gè)煙草品系。挑選它們是因?yàn)橥ㄟ^Western分析測定其高表達(dá)。為了限制監(jiān)測前的任何迅速交聯(lián)，最后加入除草劑。同時(shí)分析GST-2717品系將acetochlor交聯(lián)到同型半胱氨酸上。結(jié)果報(bào)告于圖7中并且顯示表達(dá)GST-27的植物在體外表現(xiàn)出抗氯乙酰硝基苯胺除草劑的活性。
總之，轉(zhuǎn)基因煙草植物表達(dá)GST-27蛋白并且可通過其在體外抗除草劑底物的相對活性而別它們。體內(nèi)分析-生根分析GST-27品系在體個(gè)具有顯著的抗至少3種氯乙酰N-酰苯胺的活性。此外，已知大多數(shù)這類除草劑抑制根部延長。因此，決定設(shè)立對acetochlor,alachlor和metolachlor的生根測試。
建立導(dǎo)向(pilot)實(shí)驗(yàn)以找出最為有效的濃度。挑選7種濃度范圍0,1,5,10,20,40和100ppm。用alachlor測試二種轉(zhuǎn)化的品系(GST-276和17品系)和野生型煙草。挑選6和17品系因?yàn)楦鶕?jù)Western印跡分析它們代表最低和最高表達(dá)的植物。將由附著到一條動(dòng)枝上的葉片所組成的三個(gè)外植體轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充以除草劑的MS培養(yǎng)基中。2周后觀察到根部的生長(圖8)。對于該植物的普通(general)方面，可觀察到1ppm濃度的除草劑對野生型的影響，葉片更帶有黃色且更小。隨著濃度的增加，這些影響更大并且新葉片的數(shù)目下降。從10ppm開始，該植物不產(chǎn)生新的葉片。相反，對于轉(zhuǎn)化的品系，從20ppm濃度可觀察到除草劑對品系2的影響且從40ppm可觀察到除草劑對品系6的影響。在這些濃度之間，雖然葉片似乎更小且其數(shù)目略有下降，但它們?nèi)詾榫G色的。其次，野生型在達(dá)5ppm時(shí)仍產(chǎn)生一些根，但其長度在0到5ppm之間的濃度內(nèi)劇烈下降。至于2和6品系，分別在10ppm和20ppm時(shí)仍產(chǎn)生根，較低濃度其長度下降。在這些條件下且2周后，可觀察到對于該實(shí)驗(yàn)的此時(shí)期而測試的“最佳”品系來說，限制生根的濃度在20到40ppm之間。
建立隨后的實(shí)驗(yàn)用野生型(對照)、4個(gè)GST-27(5,6,12和17品系)。用acetochlor、alachlor和metolachlor分析這些植物，對于提及的20ppm acetochlor和metolachlor除草劑用下面的范圍0,10,20,40ppm，并且對于alachlor用0,20,40,100ppm。挑選這些濃度是因?yàn)樵贖PLC中這些植物顯示出抗acetochlor和metolachlor的最終活性。使用相同的條件每個(gè)濃度每個(gè)品系的3個(gè)外植體轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充以除草劑的MS培養(yǎng)基中。開始分析后觀察根部生長3周時(shí)間。
至于導(dǎo)向?qū)嶒?yàn)，每盤中外植體的反應(yīng)通常一致。對于alachlor，在除草劑存在時(shí)野生型外植體沒有顯示任何生根或任何新的葉片的產(chǎn)生。但是GST-27 6品系和17品系在10和20ppm時(shí)幾乎沒有生根及小葉片。品系5和12與這2個(gè)品系抗性不同。對于alachlor，在該測試范圍時(shí)野生型不產(chǎn)生任何根，但在20ppm時(shí)產(chǎn)生一些葉片。品系6和17在達(dá)40ppm的濃度時(shí)仍生根，其生根似乎不受該除草劑的影響。隨著除草劑濃度的增加根的數(shù)目似乎越少。對于這些品系，在這些條件下且3周后生根濃度的限度在40到60ppm之間。在20和40ppm該除草劑時(shí)9和16品系不產(chǎn)生任何根但產(chǎn)生很小的葉片。對于metolachlor，在10和20ppm時(shí)，野生型煙草產(chǎn)生很少的小根。6和17品系產(chǎn)生短根，但不如對于alachlor所產(chǎn)生的根多。對于該除草劑，對6品系的生根濃度限制在20到40ppm之間且對17品系則大于40ppm。以除草劑處理植物為了證實(shí)表達(dá)GST-27的轉(zhuǎn)基因植物賦予對除草劑處理的抗性，在溫室中進(jìn)行出苗前及出苗后除草劑試驗(yàn)。
通過對于每種范圍的除草劑播種每個(gè)品系大約50粒種子于沙(25％篩過的泥沙，75％grift，緩釋肥料)中進(jìn)行出苗前測試。每個(gè)化學(xué)范圍處理4份。用牽引式噴霧器(tracksprayer)施用在5％JF5969(905.6g/l環(huán)己酮，33.33g/lsynperonic NPE1800和16.7g/lTween85)中制備的除草劑(0,300和350g/ha)至種子栽培入箱(fray)中。使種子在溫室中萌發(fā)并于3周后對萌發(fā)計(jì)分。對于alachlor的結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)基因植物對除草劑的出苗前施用具有抗性。對于ocetochlor、metolachlor和EPTC(12000g/ha)獲得了類似的結(jié)果。
通過在堆肥中每種除草劑范圍種植每個(gè)品系的28粒種子進(jìn)行出苗后測試。16天后用牽引式噴霧器以5％JF5969制劑中的alachlor噴灑煙草植物(1cm高)。噴灑處理后3周用相對于未噴灑對照的植株大小、壞死、葉尖狀態(tài)、葉片形態(tài)來對損傷計(jì)分。100％損傷的得分意為該植物被除草劑殺死且0％的得分意為該植物與未處理對照類似。對于alachlor的出苗后結(jié)果表明該轉(zhuǎn)基因植物對此除草劑具有抗性。圖9中圖解描述了以1400g/ha metolachlor處理后對野生型植物和各個(gè)(segregating)GST-27品系的損傷。從2000g/ha acetochlor進(jìn)行類似研究得到類似結(jié)果。
實(shí)施例4將鎮(zhèn)草寧抗性基因克隆到植物材料中并產(chǎn)生對鎮(zhèn)草寧抗性的植物用于該實(shí)施例中所有彈夾和特異性植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體示于歐洲專利申請No.EP A1536330的圖中。雙子葉(Dicot)植物載體1載體1為組成性對照質(zhì)粒，其含有融合到來自由增強(qiáng)的35S CaMV啟動(dòng)所驅(qū)動(dòng)的擬南芥菜Rubisco基因葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)(CTP)序列1上的鎮(zhèn)草寧氧化酶基因(GOX)。該構(gòu)建體在CTP編碼序列的5′端含有Ω翻譯增強(qiáng)子。載體1利用NOS終止子。CTP-GOX構(gòu)建體根據(jù)WO92-00377中公開的序列合成，在翻譯起始ATG處添加NcoⅠ位點(diǎn)并且在3′末端添加KpnⅠ位點(diǎn)。在合成過程中刪除內(nèi)部的SphⅠ位點(diǎn)和NcoⅠ位點(diǎn)而不改變蛋白序列。將CTP-GOX序列分離為NcoⅠKphⅠ片段并用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)將其連接到NcoⅠKphⅠ切割過的pMJB1中，該pMJB1為基于pIBT211的質(zhì)粒，含有CaMV啟動(dòng)子，其2個(gè)增強(qiáng)子連接到代替煙草蝕刻病毒5′非-翻譯前導(dǎo)序列的煙草馬賽克病毒翻譯增強(qiáng)子序列上，并終止于NOS終止子。
將含有增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子Ω增強(qiáng)子-CTP-GOX-Nos序列的彈夾分離為HindⅢEcoRⅠ片段并連接到HindⅢEcoRⅠ切割的pJRIi(一種基于pBin19的植物轉(zhuǎn)化載體)中。雙子葉植物載體2根據(jù)WO92-0449中描述的序列合成融合到矮牽牛葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽上的CP4-EPSPS(其為Ⅱ類EPSPS)，其在翻譯起始ATG處具有NcoⅠ位點(diǎn)。沉寂EPSPS中的內(nèi)部SphⅠ位點(diǎn)而不改變蛋白序列。分離含有合成CTP-EPSPS序列的片段作為NcoⅠSacⅠ片段并連接入pMJBⅠ中。將該序列置于增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子和NOS終止子的表達(dá)控制之下，其中Ω序列位于該蛋白編碼區(qū)的5′端，并且將該序列分離為EcoRⅠHindⅢ片段，將其克隆入pJRIi以得到雙子葉植物載體2。雙子葉植物載體3通過用EcoRⅠ切割雙子葉植物載體2并插入EcoRⅠ-SphⅠ-EcoRⅠ接頭而構(gòu)建既具有EPSPS又具有GOX基因的對照載體。以SphⅠ切割得到的載體以釋放彈夾(“B”)，將其克隆入雙子葉植物載體1啟動(dòng)子5′端的SphⅠ位點(diǎn)中以形成pDV3puc(圖9)。然后從pDV3puc中切下包括來自載體(1)和(2)啟動(dòng)子和終止子的編碼區(qū)作為HindⅢ和EcoRⅠ片段并克隆入pJRIi中。用已知的技術(shù)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將雙重載體pJRIi質(zhì)粒pDV3導(dǎo)入到煙草中。從獲自這樣轉(zhuǎn)化材料的愈傷組織中取出270根幼枝，其中的77根生根。為了證實(shí)EPSPS和GOX基因在這樣生根的幼枝中的存在，從pDV3植物中制備DNA提取物并且用下面的引物通過PCR加以分析3′末端EPSPS基因GATCGCTACTAGCTTCCCA(SEQ ID NO:12)EPSPS25′末端GOX基因AATCAAGGTAACCTTGAATCCA(SEQ ID NO:13)GOX1如果兩個(gè)基因均存在，PCR反應(yīng)提供1.1kb的條帶。為了證實(shí)鎮(zhèn)草寧耐性基因的功能，將pDV3組織培養(yǎng)外植體轉(zhuǎn)移到含有0.01mM和0.05mM鎮(zhèn)草寧的MS培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)移到含有鎮(zhèn)草寧的培養(yǎng)基中2周后對植物進(jìn)行計(jì)分。用在兔子中產(chǎn)生的抗純化GOX和EPSPS的抗血清通過Western分析在含有除草劑培養(yǎng)基中成功生長的抗性品系。
從每個(gè)初級轉(zhuǎn)化子中制備葉片DNA提取物并用于PCR反應(yīng)以證實(shí)載體的存在。用前述的方法對每個(gè)PCR陽性的pDV3植物進(jìn)行Western印跡分析以證實(shí)GOX和EPSPS的異源表達(dá)。對高水平表達(dá)植株進(jìn)行自我傳粉并且在卡那霉素平板上進(jìn)行種子篩選(seed screen)。保存單座位植物用于純合子制備。證明以pDV3構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物對鎮(zhèn)草寧具有抗性的數(shù)據(jù)可見于實(shí)施例8中。
實(shí)施例5對N-酰苯胺型除草劑和鎮(zhèn)草寧具有抗性植物的制備將表達(dá)GOX和EPSPS的雜合和純合煙草品系異花傳粉到表達(dá)GST-27的純合煙草品系。用前述的方法，種植在該異花傳粉中產(chǎn)生的種子并采集葉片材料用于Western分析。然后用GOX/EPSPS抗體篩選來自GST-27Western陽性植物的蛋白提取物以篩選出同時(shí)表達(dá)GST-27、GOX和EPSPS的品系。然后將這些品系用于以acetochlor、alachlor和metoloachlor和EPTC的出苗前除草劑噴灑中。隨后，可用配制的鎮(zhèn)草寧以出苗后的方式噴灑這些植物。
實(shí)施例6通過不包括異花傳粉的方法制備同時(shí)對N-酰苯胺和鎮(zhèn)草寧型除草劑具有抗性的植物用EcoRⅠ切割載體pDV3puc，酚氧化提取并沉淀。將ΔEcoRⅠ-HindⅢ-EcoRⅠ接頭NKOL3 5′AATTACGGAAGCTTCCGT 3′(SEQID NO:14)加熱到70℃并冷卻至室溫以使其自我退火。然后將退火的接頭連接到EcoRⅠ切割的pDV3puc中。以末端標(biāo)記的寡核苷酸MKOL3篩選推斷的組合。從陽性雜交菌落中分離質(zhì)粒DNA。以HindⅢ限制性消化釋放出5.4kb的片段，其含有驅(qū)動(dòng)Ω-CTP2-EPSPS-NOS表達(dá)的35S CaMV啟動(dòng)子和驅(qū)動(dòng)Ω-CTP1-GOX-NOS表達(dá)的35S CaMV啟動(dòng)子。將此片段克隆入以HindⅢ切割并以CIP脫磷酸的pGST-27Bin中。用插入探針篩選重組子。用適當(dāng)?shù)男蛄蟹治龃_定此得到的載體pDV6-Bin(圖10)。用已知的技術(shù)經(jīng)過農(nóng)桿菌將此得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入煙草中。轉(zhuǎn)化后回收270根幼枝，其中的80根生根。從每個(gè)級轉(zhuǎn)化子中制備葉片DNA提取物并用于PCR反應(yīng)中以證實(shí)編碼該載體區(qū)域的蛋白在葉片中的存在。這些引物如上所示(SEQ IDNOs:12和13)。為了證實(shí)該轉(zhuǎn)基因的功能，在組織培養(yǎng)基中用0,0.01mM和0.05mM鎮(zhèn)草寧和10ppm和40ppm alachlor分析來自pDV6-Bin的初級轉(zhuǎn)化子。許多轉(zhuǎn)基因(植物)成功生長于野生型對照不能生長條件下的2種培養(yǎng)基中。用前述方法對每個(gè)PCR陽性植物進(jìn)行western印跡分析以證實(shí)GOX和EPSPS及GST-27的異源表達(dá)。然后用acetochlor alachlor metoloachlor和EPTC將這些品系用于出苗前除草劑噴灑中。隨后，可以配制的鎮(zhèn)草寧用出苗后的方式噴灑這些植物。下表1給出了除草劑處理DV6植物(即同時(shí)表達(dá)鎮(zhèn)草寧抗性基因和GST的植物)前后的數(shù)據(jù)。頂部上半個(gè)表顯示出苗前除草劑施用的幅度及其在沒有出苗后除草劑施用時(shí)的連續(xù)狀態(tài)。頂部表的下半部給出了800g/ha鎮(zhèn)草寧處理后發(fā)生的損傷。底部表顯示由于出苗后鎮(zhèn)草寧處理對未經(jīng)出苗前處理前植物造成損傷的復(fù)制子得分(replicatescores)。野生型植物的所有復(fù)制子得分類似而轉(zhuǎn)基因得分反映出這為一個(gè)單獨(dú)的種群的事實(shí)，即不表達(dá)轉(zhuǎn)基因的不成對的(azygous)植物能夠活過出苗后噴灑測試。表1出苗后除草劑處理的平均值21DAT
FOE5043是已知作為fluthiamide的氧代乙酰胺。
實(shí)施例7對glufosinate和N-酰苯胺型除草劑具有抗性玉米的制備按如下制備含有賦予對出苗前除草劑抗性GST-27和賦予對出苗后除草劑glufosinate抗性膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的單子葉(玉米、小麥)轉(zhuǎn)化載體步驟1以HindⅢ消化pUB1(基于pUC的含有玉米泛素啟動(dòng)子的內(nèi)含子的載體)(圖1 1)。向由該消化產(chǎn)生的缺口中插入HindⅢ-AgeⅠ-HindⅢ接頭(5′AGCTTGTACACCGGTGTACA3′(SEQ IDNO:15))。將得到的重組載體命名為pUB2。步驟2用KpnⅠ和BamHⅠ從pIJ21-3A中切下GST-27cDNA并且克隆入BamHⅠ和KpnⅠ切割的pUB2中以形成pUB3。步驟3將KpnⅠ-PacⅠ-KpnⅠ接頭(5′CGGACAATTAATTGTCCGGTAC3′(SEQ ID NO:16))自我退火并克隆入KpnⅠ切割的pUB3中以形成pUB4。步驟4從pIE98中將NOS終止子分離為SmaⅠ片段(圖12)，并且平端克隆入EcoRⅤ切割的pUB4中以形成pUB5。通過以EcoRⅠ和BamHⅠ限制性消化確定NOS終止子在pUB5中的方向。測序所有的接頭以確定各種構(gòu)建體成分正確的插入。步驟5通過用AgeⅠ和PacⅠ消化將存在于pUB5中的泛素GST-27 NOS彈夾從其中切出并且克隆于含有在35S-CaMV啟動(dòng)子控制下PAT基因的氨芐基青霉素負(fù)性載體pIGPAT中(圖13)。通過以來自pIJ21-3A的EcoRⅠcDNA插入子的菌落雜交檢測重組子。通過以來自pIJ21-3A的EcoRⅠcDNA插入子的菌落雜交檢測重組子。以NcoⅠ限制性消化獲取重組子以形成pCAT10(圖14)。步驟6通過以AscⅠ消化切下35S-PAT-NOS彈夾并插入pPUN14的AscⅠ泛素-PAT-NOS彈夾以形成pCAT11(圖15)。用已知的須狀體(whiskers)和粒子轟擊技術(shù)將pCAT11轉(zhuǎn)化入小麥和玉米中。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有bialophos的培養(yǎng)基中以篩選出表達(dá)PAT基因的愈傷組織材料。然后用下面的引物(分別為SEQ ID NOs:33和34)對培養(yǎng)于含有此除草劑培養(yǎng)基中的愈傷組織進(jìn)行PCR以證實(shí)GST-27基因在該愈傷組織中的存在。
5′CCAACAAGGTGGCGCAGTTCA 3′(SEQ ID NO:33)5′CATCGCAAGACCGGCAACAG 3′(SEQ ID NO:34)。將含有GST-27表達(dá)彈夾的愈傷組織轉(zhuǎn)移到植物再生培養(yǎng)基中并回收玉米植物。通過對葉片總蛋白提取物的Western印跡證實(shí)此轉(zhuǎn)化的玉米植物以高水平組成性表達(dá)GST基因。將此植物與優(yōu)良的玉米近交品系間異花傳粉并回收種子。為了證實(shí)該植物對除草劑acetochlor的增強(qiáng)的耐性。將所述的種子種植于每公頃施用2,000到8,000克除草劑的土壤中。讓這些種子萌發(fā)并培養(yǎng)7天后分析得到的幼苗樣品由化學(xué)藥品所致的損傷并與在相同條件下種植的非轉(zhuǎn)基因種子得到的幼苗(如果有的話)進(jìn)行比較。培養(yǎng)于以除草劑和相應(yīng)的安全劑處理土壤中的“轉(zhuǎn)基因”幼苗和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼酌鐜缀鯖]有表現(xiàn)出損傷(如果有的話)，而培養(yǎng)于含有除草劑而無完全劑的土壤中的非轉(zhuǎn)基因幼苗顯示出非常大的損傷。使存活過第一種除草劑處理后的幼苗進(jìn)一步培養(yǎng)20天左右，然有用的約0.1到1％活性成分的各種濃度商業(yè)glufosinate混合物噴灑。當(dāng)與不含PAT基因的幼苗比較時(shí)，依據(jù)施用的濃度，含有PAT基因(其表達(dá)通過De Block M等(EMBO雜志6(9):2513-2518(1981)所述方法加以測定)的幼苗或者是對glufosinate具有完全抗性，或者對該除草劑具有相對耐性。
實(shí)施例8同時(shí)對鎮(zhèn)草寧和glufosinate具有抗性植物(單子葉及雙子葉)的制備該實(shí)施例顯示同時(shí)對glufosinate和鎮(zhèn)草寧具有抗性植物的制備。該多除草劑抗性源自被遺傳工程操作為對glufosinate具有抗性的第一種植物與被操作為對鎮(zhèn)草寧具有抗性的第二種植物之間的雜交。Glufosinate抗性構(gòu)建體pPG6的制備pPG6為源自pBin19RiPAT的基于Bin19的載體并且含有具有驅(qū)動(dòng)GUS基因35S CaMV啟動(dòng)子的彈夾。在啟動(dòng)子與GUS之間插入ST-LS1基因的第二個(gè)內(nèi)含子。該序列為189bp，具有80％的A/T含量，在所有三個(gè)閱讀框中為典型的剪切點(diǎn)和終止密碼子。內(nèi)含子的存在阻止了GUS在農(nóng)桿菌中的表達(dá)因?yàn)樵谠思?xì)胞中不發(fā)生剪切。其也含有帶有驅(qū)動(dòng)PAT基因表達(dá)35S CaMV啟動(dòng)子的彈夾。圖16顯示pPG6的圖譜。鎮(zhèn)草寧抗性構(gòu)建體按上面實(shí)施例4中所述制備雙子葉植物載體1-3。單子葉植物載體1單子葉植物載體1為同時(shí)含有CTP1 GOX和CTP2 EPSPS的質(zhì)粒，在來源于pUC的質(zhì)粒中二者均由玉米多泛素啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)并由玉米多泛素內(nèi)含子1所增強(qiáng)。其也含有賦予對膦絲菌素耐性的彈夾。
質(zhì)粒1將載體pUB1以KpnⅠ消化并插入KpnⅠ-Not1-Kpn1接頭(序列5′CAT TTG CGG CCG CAA ATG GTA C3-SEQ IDNO:17)。將EcoRⅠ-Not1-EcoR1接頭(5′AAT TCA TTT GCG GCCGCA AAT G3′(SEQ ID NO:18))插入到DV1-pUC的EcoR1位點(diǎn)中。以Nco1切割得到的質(zhì)粒并用DNA聚合酶1Klenow片段補(bǔ)平5′突出端。然后和Not1消化線性載體并分離Not1-平端片段。將含有CTP1-GOX和NOS序列的該片段連接到Sma1-Not1消化修飾的pUB1中。將Hind111-Not1｀-Hind111接頭(序列5′AGC TTG CAGCGG CCG CTG CA3′(SEQ ID NO:19))插入到該質(zhì)粒中以得到質(zhì)粒1。
質(zhì)粒2將EcoRⅠ-Not1-EcoR1接頭(5′AAT TCA TTT GCGGCC GCA AAT G3′(SEQ ID NO:20))插入DV2-pUC的EcoR1位點(diǎn)(分離不含有上述接頭的另一個(gè)克隆，因而允許此克隆策略)。將得到的質(zhì)粒以Nco1消化并且用DNA聚合酶1 Klenow片段將5′突出端補(bǔ)平。然后用Not1切割線性載體并將得到的片段克隆入剛才所述的相同載體(修飾的pUB1)中以產(chǎn)生質(zhì)粒2。從pIE108中切下包括35SCaMV啟動(dòng)子、Adh1內(nèi)含子、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)和nos終止子的PAT可篩選標(biāo)記彈夾并且克隆入質(zhì)粒2的Hind111位點(diǎn)以得到彈夾2。用鑒別性限制性分析確定該P(yáng)AT彈夾與CTP2 EPSPS彈夾是相同的方向。
從質(zhì)粒1上的Not1片段切下帶有多泛素啟動(dòng)子和內(nèi)含子、CTP1GOX及nos終止子的彈夾并連接到Not1切割的彈夾2中以得到單子葉植物載體1,pMV1(圖17)。煙草的轉(zhuǎn)化用Holsters等的凍融方法(1978)將用于雙子葉植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到根癌桿菌LBA4404中。通過Bevan等所述的葉片方法(leaf disc method)(1984)轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiane tabaccumvar Samsun)。在含有100g/l卡那霉素的培養(yǎng)基中再生出幼枝。生根和篩選后將植物轉(zhuǎn)移到溫室中并且于16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)。玉米轉(zhuǎn)化用Klein等所述的粒子轟擊方法(1988)對玉米進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化材料的篩選于1mg/l bialophos上進(jìn)行。植物分析PCR對所有在組織培養(yǎng)中生根的煙草品系和玉米愈傷組織進(jìn)行此分析。通過對技術(shù)人員已知的方法提取DNA。用下面的寡核苷酸分析初級轉(zhuǎn)化子pDV1 TMV1+GOX1,GOX3+nos1pDV2 TMV1+EPSPS, EPSPS1+nos1pDV3 EPSPS3+GOX3,pPG6 35S+BARJAP2RpMV1 GOX4+GOX5 EPSPS4+EPSPS535S+BARJAP2R這些寡核苷酸序列為TMV15’CTCGAGTATTTTTACAACAATTACCAAC(SEQ ID No.21)GOX15’AATCAAGGTAACCTTGAATCCA(SEQ ID No.22)GOX35’ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA(SEQ ID No.23)nos15’GCATTACATGTTAATTATTACATGCTT(SEQ ID No.24)EPSPS1 5’GTGATACGAGTTTCACCGCTAGCGAGAC(SEQ ID No.25)EPSPS3 5’TACCTTGCGTGGACCAAAGACTCC(SEQ ID No.26)EPSPS4 5’ATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCC(SEQ ID No.27)EPSPS5 5’CGAGACCCATAACGAGGAAGCTCA(SEQ ID No.28)GOX45’ATTGCGTGATTTCGATCCTAACTT(SEQ ID No.29)GOX55’GAGAGATGTCGATAGAGGTCTTCT(SEQ ID No.30)35S 5’GGTGGAGCACGACACACTTGTCTA(SEQ ID No.31)BARJAP2R5’GTCTCAATGTAATGGTTA(SEQ ID No.32)篩選出PCR陽性植物用于進(jìn)一步分析。用鎮(zhèn)草寧的篩選構(gòu)建煙草在含有鎮(zhèn)草寧在含有鎮(zhèn)草寧培養(yǎng)基中進(jìn)行組織培養(yǎng)的殺死曲線。這通過將～6mm長并帶有葉結(jié)(leaf node)的莖段插入含有一定濃度范圍鎮(zhèn)草寧異丙胺的MS培養(yǎng)基中而完成。每個(gè)濃度使用4/5個(gè)莖段。2周后對該結(jié)果計(jì)分并示于表2中。
表2鎮(zhèn)草寧對野生型煙草的殺死曲線
通過培養(yǎng)于含有0.01和0.05mM鎮(zhèn)草寧異丙胺鹽的上述培養(yǎng)基中篩選pDV1、2和3的初級轉(zhuǎn)化子。結(jié)果示于表3中。
表3在組織培養(yǎng)中對鎮(zhèn)草寧耐性品系的篩選
對PAT的篩選在1mg/l bialophos上測試再生的愈傷組織。Western分析通過技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行GOX和EPSPS蛋白的過度表達(dá)及抗體的產(chǎn)生。按如下分析煙草的初級轉(zhuǎn)化子。將～100mgPVPP加入到Eppendorf管底部。收獲葉片材料(通過用管蓋作為切割器而獲得的4只葉圓片)于冰上。加入0.5ml提取緩沖液(50mM TrisHCl pH7.8,1mM EDTA鈉鹽，3mM DTT)和2μl100mMPMSF。用電動(dòng)研磨器在冷室中研磨這些樣品。研磨持續(xù)10秒，將未磨碎的材料推回管中并繼續(xù)研磨10-15秒直到樣品均一。在冷室中將這些管離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新管中并于-70℃冷凍備用。用已知的Bradford方法測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離25μg蛋白并以40mA過夜印跡至Hybond-N膜上。以印跡儀上取下該濾膜并置于100ml 1×Tris-Saline5％Marvel中且于室溫振搖45分鐘。通過在室溫于1×Tris-Saline0.1％Tween20中振搖，第一次洗5分鐘，第二次洗20分鐘而洗該濾膜。一級抗體以1×Tris-Saline0.02％Tween20中1∶10000的稀釋液使用。將該膜與一級抗體在室溫孵育2小時(shí)或4℃孵育過夜。用在1×T-S0.1％Tween在室溫中10分鐘然后1小時(shí)洗膜。以1∶10000的稀釋液用二級抗體(抗兔IgG過氧化物酶交聯(lián)物)，于室溫與該膜孵育1小時(shí)。按上述洗膜。用AmershamECL檢測試劑盒進(jìn)行檢測。根據(jù)Western結(jié)果觀察pDV1和2品系中蛋白表達(dá)水平的幅度。GOX和EPSPS在pDV3中的表達(dá)水平在表達(dá)的GOX量上幾乎未表現(xiàn)出變化但EPSPS的量變化增加。篩選出同時(shí)表達(dá)二種基因的品系用于進(jìn)一步分析。
用同樣的方法分析玉米愈傷組織，將表達(dá)GOX和EPSPS的愈傷組織再生成完整植株并再次分析葉片材料中二種基因的表達(dá)。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性分析用14C標(biāo)記的乙酰CoA測定PAT活性。通過葉片提取物中存在的PAT將標(biāo)記的乙?；D(zhuǎn)移到膦絲菌素(PPT)底物中。乙?；腜PT和14C在TLC平板上以不同的速率遷移，并可通過放射自顯影加以觀察。用10×T50E2緩沖液(TE)-50ml1MTris-HCl pH7.5,4ml0.5M EDTA和46ml雙蒸水制備葉片提取緩沖液，將亮抑蛋白酶肽調(diào)至1×TE中15mg/ml的水平。將貯備PMSF在甲醇中制成30mg/ml。BSA貯備液中在TE中制成30mg/ml并將DTT制成1M。PPT在TE中作為1mM溶液使用。14C乙酰CoA為58.1mCi/mmol(Amersham)。通過混合4315μl雙蒸水、500μl10×TE、50μl亮抑蛋白酶肽、25μl PMSF貯備液、100μl BSA貯備液及10μlDTT貯備液制備提取緩沖液(終體積5000μl)。用管蓋作為切割器在冰上收獲葉片樣品到Eppendorf管中。用電動(dòng)研磨器在冷室中在100μl提取緩沖液中研磨此樣品(三片)。將此樣品離心10分鐘并取出50μl到冰上的新管中。將樣品于-70℃貯存?zhèn)溆?。用Bradford分析定量存在于提取物中的蛋白。通過混合5體積標(biāo)記的乙酰CoA與3體積1mMPPT溶液而制備底物溶液。向～25μl葉片總蛋白樣品(～2μg/ml)中加入2μl底物溶液，于37℃將此混合物孵育30秒，然后移至冰上以終止反應(yīng)。將6μl樣品點(diǎn)樣于硅膠TLC平板(Sigma T-6770)上。在異丙醇和25％銨溶液的3∶2混合物中進(jìn)行上行層析3小時(shí)。將平板包于塑料薄膜中并對Kodak XAR-5膠片進(jìn)行曝光。用該分析方法分析所有26個(gè)初級轉(zhuǎn)化子的PAT活性。表4給出了此分析結(jié)果的細(xì)節(jié)。
表4PAT活性數(shù)據(jù)
葉片涂抹除草劑通過涂抹接種物(Challenge)至單獨(dú)的葉片而測試表現(xiàn)出一定范圍PAT活性的35S-PAT初級轉(zhuǎn)化子和對照植物。以1％和0.2％該貯備液(150g/l)的水溶液涂抹標(biāo)記葉片的上下二個(gè)表面。48小時(shí)和一周后進(jìn)行計(jì)分并采集葉片樣品用于PAT分析。表5顯示葉片涂抹的結(jié)果。
表5葉片涂抹分析
除草劑噴灑試驗(yàn)Glufosimate(接種物Challenge或Basta)，建立接種物對野生型煙草影響的劑量反應(yīng)曲線。將5株植物用每種處理中，14天后進(jìn)行計(jì)分。構(gòu)建殺死曲線后，用接種物以相同的施用水平噴灑篩選出的35SPAT品系。表6顯示對于#12和27兩個(gè)品系的數(shù)據(jù)。在這些水平轉(zhuǎn)基因植物設(shè)有顯示出損傷。
表6對35S初級轉(zhuǎn)化子噴灑試驗(yàn)的結(jié)果
建立鎮(zhèn)草寧對野生型煙草影響的殺死曲線。通過取莖段并培養(yǎng)于新鮮培養(yǎng)基中以產(chǎn)生20株新的植物而傳代培養(yǎng)生長于組織培養(yǎng)中的野生型煙草。在轉(zhuǎn)移到3英寸培養(yǎng)盤中的John Innes No3堆肥中之前將這些植物在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)一個(gè)月。起初將其用羊毛覆蓋以保護(hù)它們。揭開(覆蓋物)后讓其適應(yīng)4小時(shí)后噴灑。噴灑后將水只澆至盤中，即不讓水觸及葉片，進(jìn)行5天。處理后8天和28天進(jìn)行計(jì)分。表7顯示以一定施用濃度范圍時(shí)平均百分損害(每種處理重復(fù)(reps)三次)。
表7以所示水平的鎮(zhèn)草寧處理野生型煙草的劑量反應(yīng)曲線
構(gòu)建鎮(zhèn)草寧殺死曲線后，用適當(dāng)水平的鎮(zhèn)草寧對多個(gè)pDV1,2和3品系進(jìn)行噴灑試驗(yàn)。表8顯示了pDV3的結(jié)果，pDV1和pDV2品系的結(jié)果類似于pDV3。
表8用鎮(zhèn)草寧處理的pDV3初級轉(zhuǎn)化子的劑量/反應(yīng)
分離分析將每個(gè)初級轉(zhuǎn)化子(pPG6、pDV1、pDV2和pDV3)的種子于10％Domestos中消毒20分鐘。在無菌水中洗數(shù)次后，將每種近交初級轉(zhuǎn)化子的100粒種子種植于含有100mg/l卡那霉素的0.5XMS(2.3g/lMS鹽，1.5％蔗糖，0.8％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂，pH5.9)培養(yǎng)基中。在26℃于16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的條件下生長3周后對幼苗進(jìn)行計(jì)分。以3∶1的比例分離的品系被認(rèn)為是具有單個(gè)轉(zhuǎn)基因插入。在pPG6品系中，#12、20、27以所需的比例分離。對于pDV3品系，#14、19、21、31、34、43和45以所需的比例分離。純合品系的產(chǎn)生將分離實(shí)驗(yàn)中10株未漂白的幼苗(雜合或純合)轉(zhuǎn)移到盤中的新鮮培養(yǎng)基中并培養(yǎng)2-3周。然后將其轉(zhuǎn)移到31只盤中的JI No3堆肥中直到開花。用含有Km的0.5XMS再次測試種子以鑒定出純合品系。煙草品系的雜交將含有pDV1、pDV2和pDV3的純合品系，即分別表達(dá)GOX、EPSPS和GOX/EPSPS基因的植物對表達(dá)PAT基因的純合pPG6品系，#27品系進(jìn)行異花傳粉。同時(shí)用pPG6品系作為雄性品系進(jìn)行傳粉。轉(zhuǎn)基因谷物(corn)品系的分析用上述的寡聚體即35S-AlcR、AlcA-GOX1和對于GOX和EPSPS的內(nèi)部寡聚體通過PCR測試再生的愈傷組織。同時(shí)對此PCR陽性愈傷組織進(jìn)行Western分析以篩選表達(dá)GOX和EPSPS的愈傷組織。再生這些愈傷組織并通過PCR再次分析此得到的植物。然后對這些植物進(jìn)行回交和近親雜交。煙草子代的分析GOX、EPSPS及PAT的表達(dá)，所有子代為二種基因純合體。播種來自每種雜交的種子和來自純合體母本的種子并從大量植物中收獲葉片材料。通過Western印跡且然后通過前述的PAT活性測定方法分析蛋白提取物。發(fā)現(xiàn)GOX和EPSPS及PAT活性表達(dá)的水平在特定的雜交內(nèi)彼此類似并且類似于純合體母體的表達(dá)水平。對植物的外觀、重量、生長活力等進(jìn)行計(jì)分。除草劑處理設(shè)計(jì)三個(gè)廣義(broad)的實(shí)驗(yàn)1．35S-PAT cf pDV1 cf pDV1-PAT2．35S-PAT cf pDV2 cf pDV2-PAT3．35S-PAT cf pDV3 cf pDV3-PAT用一定濃度范圍的glufosinate在不同的時(shí)間點(diǎn)處理35S-PAT品系并鑒定出現(xiàn)特定程度損傷的水平。用鎮(zhèn)草寧以一定濃度范圍處理DV品系并且鑒定損傷水平。然后用不同比例的二種除草劑混合物處理DV-PAT品系并且分析損傷的水平。在5-6個(gè)葉片期處理每個(gè)種群(每個(gè)處理重復(fù)5次)。對病原體攻擊的抗性將表達(dá)高水平每種蛋白并顯示出對除草劑具有良好耐性的35S-PAT、DV1、2和3及DV-PAT品系暴露于多種真菌病原體并對感染的水平進(jìn)行計(jì)分和比較。玉米子代的分析將從初級轉(zhuǎn)化子雜交而得到的種子用于產(chǎn)生植物進(jìn)而從其中篩選出最高表達(dá)的品系。這通過對GOX、EPSPS表達(dá)水平的western分析并且通過上述的PAT活性實(shí)驗(yàn)來完成。進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)以鑒定對單獨(dú)施用或以各種組合施用的鎮(zhèn)草寧和glufosinate的耐性。
實(shí)施例9對出苗前漂白除草劑如fluorochloridone、達(dá)草滅、fluridone、flurtamone及diflufencican和對鎮(zhèn)草寧具有耐性植物的制備八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)抑制劑如flurochloridone及達(dá)草滅為一類阻止類胡蘿卜素生物合成并且導(dǎo)致漂白癥狀的除草劑。PDS基因(crtl)克隆自噬夏孢歐文氏菌，一種非綠色的植物病原菌腐敗菌(bacterial rot)，并且用含有CaMV35S啟動(dòng)子的質(zhì)粒和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(pYPIET4)(Misawa等，1993)在轉(zhuǎn)基因煙草(及番茄)中過渡表達(dá)。與獲取含有相同構(gòu)建體的番茄植物一樣獲取過渡表達(dá)crtl基因的ET4-208品系煙草植物的純合種子。除草劑耐性試驗(yàn)試驗(yàn)化學(xué)式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)的化合物(見下面)。將轉(zhuǎn)基因和野生型番茄種子(cv Ailsa Craig)種植于JIP3的3″盤中，每盤三粒種子。于4％JF5969中配制每種化合物(除了商業(yè)制劑化合物Ⅰ以外)并且用牽引式噴霧器以200l/ha噴灑于每只盤中。在13、20和27DAT(處理后天數(shù))分析該測試。對野生型番茄的所有處理中均有明顯的劑量反應(yīng)，其中在所有情況中的最高水平得到87-100％的植物毒性。轉(zhuǎn)基因番茄對測試的所有PDS抑制劑具有高度耐性，即對至少達(dá)1kg/ha化合物Ⅱ和Ⅲ及達(dá)9kg/ha化合物Ⅰ具有耐性(見表9)。對于轉(zhuǎn)基因煙草獲得了類似的結(jié)果。
表9:27PAT的植物毒性
用常見的方式將DV3#43B(包括EPSPS和GOX基因的鎮(zhèn)草寧抗性品系-見實(shí)施例4)異花傳粉到純合的ET4-208中并反過來也是這樣。收集種子并用于類似于上述的除草劑試驗(yàn)中。在處理的前一天將番茄種子以多排播種于小容器中。于4％JF5969中配制每種化合物(除了商業(yè)制劑Racer之外)并且用牽引式噴霧器以200l/ha噴灑于容器中。于13、20和27DAT分析該測試，在最后一次分析后將對漂白除草劑具有耐性的幼苗轉(zhuǎn)移到3″盤中的新鮮John Innes111堆肥中。2周后以500和800g/ha對其施用鎮(zhèn)草寧除草劑。14和28DAT時(shí)進(jìn)行計(jì)分。得到的植物對二種除草劑均具有抗性，并且此抗性以孟德爾方式遺傳。化學(xué)式Ⅰ的化合物
化學(xué)式Ⅱ的化合物
化學(xué)式Ⅲ的化合物
實(shí)施例10對三酮、乙酰N-酰苯胺和鎮(zhèn)草寧具有耐性植物的制備按前述將pDV6#71GpDV3#19J異花傳粉到純合三酮耐性的品系中并且反過來也一樣。按下述收集種子并用于除草劑試驗(yàn)中。在處理的前一天將從DV6/HPPD雜交而獲得的煙草種子以多排播種于小容器中。一些容器以acefochlor處理(75g/ha)，一些以alachlor處理(300g/ha)且其它以ZA1296處理(100和300g/ha)。于21DAT時(shí)進(jìn)行分析。對于21DAT分析的得分列于下面并且代表植物毒性。
以800g/ha的鎮(zhèn)草寧噴灑存活過300g/ha ZA1296處理的幼苗并且證實(shí)對此具有耐性。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名Zeneca Ltd(B)街道15 Stanhope Gate(C)城市倫敦(E)國家英國(F)郵編W1Y 6LN(G)電話0171-304 5000(ⅱ)發(fā)明題目核苷酸抗性植物(ⅲ)序列號32(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利公開#1.0,#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度1020個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)生物集胞藍(lán)細(xì)菌PCC 6803(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵CDS(B)位置1..1020(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATG GAA TTC GAC TAT CTT CAT TTA TAC GTT GAC GAT TAT CAG TCA GCT 48Met Glu Phe Asp Tyr Leu His Leu Tyr Val Asp Asp Tyr Gln Ser Ala1 5 10 15CAT CGT TGT TAT CAA CGT CAA TGG GGT TTC ACT TGC GTA AAT AAA ATT 96His Arg Cys Tyr Gln Arg Gln Trp Gly Phe Thr Cys Val Asn Lys Ile20 25 30ATT ACT GAC CAA GGA ATT ACT GGC ATC TAC CAA CAG GGG CAA ATA CTT 144Ile Thr Asp Gln Gly Ile Thr Gly Ile Tyr Gln Gln Gly Gln Ile Leu35 40 45CTG CTA ATT TCG GCA TCG GAA TCT AGT TTG AGT AGA TAT GCC GAC TAT 192Leu Leu Ile Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ala Asp Tyr50 55 60CTC CAG AAA CAT CCC CCC GGC GTA GGT 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(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵CDS(B)位置1217..2290(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATTAGTCGAA GAATATGCCC ATCCTGTCGC CTGTCGAGCA ACTGCTAATG CAACCTCCGT60CTGATCGCCT CACCTACCTG AAGCTGGCCG CTGTGACCAT GATTTGGGGT GGCACTTTTG 120TCGCCGGACG TTACCTGACC AATCAAGTCG ACCCGCTGCT GGCCGCCAGC CTGCGGTTTA 180TCCTGGCCAG CCTGGCGCTG CTGCTGTTTA TGCTGTGTGC ACGCATCCCG CTGGCGCGGC 240CACGTCCCCG GCAACTGCTG CATCTGGCGG TGCTGGGGTT TTTCGGGATC TTTTTCTACA 300ACCTGTGTTT TTTCTACGGC CTGCAGTACA TCAACGCCTC GCGCGCTTCG TTGATCGTGG 360CGTTGAATCC GGCGGTGATC GGCCTGGCTT CCTGGTGGTT GTTCAAAGAG CGCCTCGGCA 420CTGCCAGGGT GCTGGGTATC GCGTTGTGCC TGGCCGGCGC TGCGACGGTG ATCGTCAGTC 480GCAACCCGCA GTTGCTGCAA GGTGCATCGA GTACCTGGCA GGGCGACCTG CTGGTGTTCG 540GCTGTGTGCT GGGGTGGGGG ATTTACTCGT TGTTTTCCCG CGCATTGAAT CAAAGCCTGG 600GGCCGTTGCA AACGGTCACC TGGTCAGTGC TGCTGGGCAC CCTGATGCTG ACGGCTGTCA 660CCGCGCTCGC CGGGCGCTTC ACGCTTGCAG GGCTTGGCAG CCTGCACCTG CCGCAGGTTG 720TGAGCCTGTT GTATTTGGGC GTGCTCGGCT CCGCGCTGGC GTACATCGGC TATTACGATG 780GCATCCGGCG TATCGGCGCG ACCCGCGCAG GCGTGTTTAT 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(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TATGAGAATC CTATGGG17(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GCTTTGAA GTTTCCCTC17(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源
(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GTTAGGTACCAGTCTAGACTGACCATGGCCGACCAATACGAAAACC 46(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長度43個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TAGCGGTACC TGATCACCCG GGTTATTAGT CGGTGGTCAG TAC 43(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長度516個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Met Ala Gln Ile Asn Asn Met Ala Gln Gly Ile Gln Thr Leu Asn Pro1 5 10 15Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gln Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu20 25 30Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val35 40 45Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gln Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile50 55 60Ser Ala Sar Val ALa Thr Ala Gln Lys Pro Ser Glu Ile Val Leu Gln65 70 75 80Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser85 90 95Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr100 105 110Val Val Asp Asn Leu Leu Ser Ser Asp Asp Ile His Tyr Met Leu Gly115 120 125Ala Leu Lys Thr Leu Gly Leu His Val Glu Glu Asp Ser Ala Asn Gln130 135 140Arg Ala Val Val Glu Gly Cys Gly Gly Leu Phe Pro Val Gly Lys Glu145 150 155 160Ser Lys Glu Glu Ile Gln Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met165 170 175Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Val Ala Gly Gly Asn Ser Arg Tyr180 185 190Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro Ile Ser Asp Leu195 200 205Val Asp Gly Leu Lys Gln Leu Gly Ala Glu Val Asp Cys Phe Leu Gly210 215 220Thr Lys Cys Pro Pro Val Arg Ile Val Ser Lys Gly Gly Leu Pro Gly225 230 235 240Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Thr Ala245 250 255Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile260 265 270Ile Asp Lys Leu Ile Ser Val Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Lys Leu275 280 285Met Glu Arg Phe Gly Ile Ser Val Glu His Ser Ser Ser Trp Asp Arg290 295 300Phe Phe Val Arg Gly Gly Gln Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Lys Ala Phe305 310 315 320Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala325 330 335Val Thr Gly Gly Thr Ile Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Asn Ser Leu340 345 350Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Glu355 360 365Val Thr Trp Thr Glu Asn Ser Val Thr Val Lys Gly Pro Pro Arg Ser370 375 380Ser Ser Gly Arg Lys His Leu Arg Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys385 390 395 400Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Tyr Ala Asp405 410 415Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr420 425 430Glu Arg Met Ile Ala Ile Cys Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr435 440 445Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu450 455 460Asn Val Thr Asp Ile Asp Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala465 470 475 480Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr Ile Asn Asp Pro485 490 495Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asn Tyr Phe Asp Val Leu Gln Gln500 505 510Tyr Ser Lys His515(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:AACAAGGTGG CGCAGTT17(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:CATCGCAAGA CCGGCAACAG20(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GATCGCTACT AGCTTCCCA19(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA22(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:AATTACGGAA GCTTCCGT 18(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:AGCTTGTACA CCGGTGTACA20(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CGGACAATTA ATTGTCCGGT AC 22(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:CATTTGCGGC CGCAAATGGT AC 22(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1 8:AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG222)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:AGCTTGCAGC GGCCGCTGCA 20(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG22(2)SEQ ID NO:21信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:CTCGAGTATT TTTACAACAA TTACCAAC28(2)SEQ ID NO:22信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA 22(2)SEQ ID NO:23信息(ⅰ)序列特征(A)長度26個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:ACCACCAACG GTGTTCTTGC TGTTGA26(2)SEQ ID NO:24信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:GCATTACATG TTAATTATTA CATGCTT27(2)SEQ ID NO:25信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:GTGATACGAG TTTCACCGCT AGCGAGAC28(2)SEQ ID NO:26信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:TACCTTGCGT GGACCAAAGA CTCC24(2)SEQ ID NO:27信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:ATGGCTTCCG CTCAAGTGAA GTCC24(2)SEQ ID NO:28信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:CGAGACCCAT AACGAGGAAG CTCA24(2)SEQ ID NO:29信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:ATTGCGTGAT TTCGATCCTA ACTT24(2)SEQ ID NO:30信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:GAGAGATGTC GATAGAGGTC TTCT24(2)SEQ ID NO:31信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:GGTGGAGCAC GACACACTTG TCTA24(2)SEQ ID NO:32信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假定無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機(jī)物引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:GTCTCAATGT AATGGTTA 18
權(quán)利要求
1．至少包括編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性或耐性的第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域和編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑抗性的第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域的多核苷酸，它們具有以下的附加條件(ⅰ)該多核苷酸不編碼包括僅僅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)該多核苷酸不包括僅僅編碼超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域；和(ⅲ)該多核苷酸不包括僅僅是編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中的每個(gè)區(qū)域在植物可操作啟動(dòng)子和終止子的表達(dá)控制之下。
3．根據(jù)前面任一權(quán)利要求的多核苷酸，其中的第一種除草劑為出苗后除草劑且第二種除草劑為出苗前除草劑。
4．根據(jù)前面任一權(quán)利要求的多核苷酸，其中的蛋白選自鎮(zhèn)草寧氧化還原酶、5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶、羥苯基丙酮酸雙加氧酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450、乙酰-COA羧化酶、乙酰乳酸合酶、原卟啉原氧化酶、dihydropteroate合酶、多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、超氧物歧化酶、溴苯腈水解酶、八莖番茄紅素脫氫酶、可從真氧產(chǎn)堿桿菌獲得的tfdA基因的產(chǎn)物以及所述蛋白已知的誘變或其它修飾變異體。
5．根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求的多核苷酸，其進(jìn)一步包括編碼能夠提供植物對昆蟲、干旱和/或真菌、細(xì)菌或病毒感染具有抗性蛋白的區(qū)域。
6．根據(jù)前面任一權(quán)利要求的多核苷酸，其包括所述區(qū)域5′的序列和與所述區(qū)域相鄰的序列，這些序列編碼(ⅰ)能夠靶向該區(qū)域的翻譯產(chǎn)物到質(zhì)體如葉綠體、線粒體、其它細(xì)胞器或植物細(xì)胞壁的肽；和/或(ⅱ)非翻譯的翻譯增強(qiáng)序列。
7．根據(jù)前面任一權(quán)利要求的多核苷酸，其受到以下的修飾，即去除mRNA不穩(wěn)定基序和/或偶然(fortuitous)剪切區(qū)，或者使用植物優(yōu)選的密碼子從而這樣修飾的多核苷酸在植物中的表達(dá)產(chǎn)生與該未修飾多核苷酸蛋白編碼區(qū)為其內(nèi)源性的生物中此未修飾多核苷酸的表達(dá)而獲得的蛋白具有基本上類似活性/功能的基本上類似的蛋白，其具有以下附加條件，即如果這樣修飾的多核苷酸包括植物優(yōu)選的密碼子，那么該修飾多核苷酸內(nèi)的蛋白編碼區(qū)與所述植物中內(nèi)源性所含的并且編碼基本上相同蛋白的同樣蛋白編碼區(qū)之間的相同程度小于約70％。
8．根據(jù)權(quán)利要求3到7中任一權(quán)利要求的多核苷酸，其中的出苗前除草劑選自二硝基苯胺除草劑、二苯醚、磺酰脲、二氧磷基磺酸酯、羥乙酰胺、四唑啉酮和N-氨甲酰四唑啉酮、、咪唑啉酮、硫代氨基甲酸酯、三嗪、三唑嘧啶、尿嘧啶、苯脲、三酮、異噁唑、乙酰替苯胺、噁二唑、三嗪酮、磺酰苯胺、酰胺、N-酰苯胺、RP201772、氟咯草酮、達(dá)草伏和三唑啉酮型除草劑并且出苗后除草劑選自鎮(zhèn)草寧及其鹽、glufosinate、磺草靈、滅草松、bialaphos、除草定、稀禾定或別的環(huán)己烷二酮、麥草畏、fosamine、flupoxam、苯氧丙酸、喹禾靈或別的芳氧基-苯氧丙酸酯、毒莠定、伏草隆、阿特拉津或別的三嗪、metribuzin、氯嘧黃隆、綠黃隆、flumetsulam、halosulfuron、嘧黃隆、滅草喹、咪草煙、isoxaben、imazamox、metosulam、pyrithrobac、rimsulfuron、芐嘧黃隆、煙嘧黃隆、氟黃胺草醚、fluroglycofen、KIH9201、ET751、carfentrazone、ZA1296、sulcotrione、百草枯、敵草快、溴苯腈和噁唑禾草靈。
9．根據(jù)前述權(quán)利要求之任一的多核苷酸，其中出苗前除草劑選自乙酰替苯胺、三酮、PDS抑制劑、硫代氨基甲酸酯、四唑啉酮并且出苗后除草劑選自鎮(zhèn)草寧、glufosinate、百草枯、和bialphos。
10．包括權(quán)利要求1到9中任一權(quán)利要求的多核苷酸。
11．包括至少含有編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性或耐性第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域多核苷酸和含有編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑抗性第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域多核苷酸的植物，其中的多核苷酸具有以下附加條件(ⅰ)該多核苷酸不編碼包括僅僅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)該多核苷酸不包括僅僅編碼超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域；(ⅲ)該多核苷酸不包括僅僅是編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域；和(ⅳ)當(dāng)該植物為甜菜時(shí)，其包括的賦予對除草劑抗性或耐性的基因不僅僅是EPSOS和PAT。
12．前述權(quán)利要求的植物，其中第一種除草劑是出苗前除草劑，第二種除草劑是一種出苗后除草劑。
13．包括其一部分、種子及子代的、對至少2種除草劑具有抗性的植物，其從以權(quán)利要求1到9中任何一個(gè)多核苷酸或權(quán)利要求10載體轉(zhuǎn)化的材料中獲得。
14．根據(jù)前述權(quán)利要求的植物，選自小型谷物作物、油料種子作物、纖維植物、蔬菜、種植作物及樹木。
15．根據(jù)權(quán)利要求11至14中任何一個(gè)的植物，選自大豆、棉花、煙草、甜菜、油菜、canola、亞麻、向日葵、土豆、番茄、苜蓿、萵苣、玉米、小麥、高粱、黑麥、香蕉、大麥、燕麥、草皮草、料草、甘蔗、豌豆、蠶豆、水稻、松樹、楊木、蘋果樹、葡萄、柑桔或栗樹及這些植物的子代、種子及一部分。
16．選擇性控制包括雜草和作物植物的田間中的雜草方法，其中的作物植物包括(ⅰ)至少包括編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性或耐性第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域和編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑抗性第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域的多核苷酸，其具有以下附加條件(ⅰ)該多核苷酸不編碼包括僅僅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)該多核苷酸不包括僅僅編碼超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域；(ⅲ)該多核苷酸不包括僅僅是編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域；和(ⅳ)當(dāng)該植物為甜菜時(shí)，其包括的賦予對除草劑抗性或耐性的基因不僅僅是EPSPS和PAT；或(ⅱ)至少包括編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性或耐性第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域多核苷酸和包括編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑抗性第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域多核苷酸，它們具有下面的附加條件(ⅰ)該多核苷酸不編碼包括僅僅5-烯醇-丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白；(ⅱ)該多核苷酸不包括僅僅編碼超氧物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域；(ⅲ)該多核苷酸不包括僅僅是編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域；和(ⅳ)當(dāng)該植物為甜菜時(shí)，其包括的賦予對除草劑抗性或耐性的基因不僅僅是EPSPS和PAT，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用至少一種所述的除草劑到田間。
17．根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中的作物植物包括編碼EPSPS酶的基因和編碼GST酶的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用鎮(zhèn)草寧和乙酰替硝基苯胺到田間。
18．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的作物植物包括編碼HPPD酶的基因和編碼PAT酶的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用三酮和glufosinate到田間。
19．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的作物植物包括編碼PAT酶的基因和編碼GST酶的基因，該方法包括施用足以有效控制雜草而基本上不影響此作物植物的量的glufosinate和乙酰替硝基苯胺到田間。
20．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的作物植物包括編碼EPSPS和/或GOX酶的基因和編碼HPPD酶的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響該作物植物的量施用鎮(zhèn)草寧和三酮到田間。
21．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的作物植物包括編碼PDS酶的基因和編碼EPSPS和/或GOX酶的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用PDS抑制劑和鎮(zhèn)草寧到田間。
22．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的作物植物包括編碼EPSPS和/或GOX酶的基因和編碼PAT酶的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用鎮(zhèn)草寧和glufosinate到田間，但具有該植物不是甜菜的附加條件。
23．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的作物植物包括編碼PDS酶的基因和編碼PAT酶的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用PDS抑制劑和glufosinate到田間。
24．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的作物植物包括編碼PDS酶的基因和編碼GST酶的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用PDS抑制劑和乙酰替硝基苯胺到田間。
25．根據(jù)權(quán)利要求17到24中任一權(quán)利要求的方法，其中的作物植物進(jìn)一步含有編碼ALS、SOD或BNX的基因，該方法包括以足以控制雜草而基本上不影響此作物植物的量施用磺酰脲、paraquat或bromoxynil除草劑到田間。
26．根據(jù)權(quán)利要求16到25中任一權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括施用殺蟲劑有效量的一種或更多種殺蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑及抗病毒劑到田間。
27．制備對二種或更多種除草劑具有實(shí)質(zhì)耐性或?qū)嵸|(zhì)抗性的植物的方法，包括以下步驟(ⅰ)以權(quán)利要求1至10中任何一權(quán)利要求的多核苷酸或權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化植物材料；(ⅱ)篩選這樣轉(zhuǎn)化的材料；和(ⅲ)再生這樣篩選出的材料成為形態(tài)上正常的可育的完整植株。
28．權(quán)利要求1到9中任一權(quán)利要求的多核苷酸或權(quán)利要求10的載體在制備對二種或更多種除草劑具有實(shí)質(zhì)耐性或?qū)嵸|(zhì)抗性的植物組織和/或形態(tài)上正常的可育的完整植株(Ⅰ)中的使用。
29．權(quán)利要求1到9中任一權(quán)利要求的多核苷酸或權(quán)利要求10的載體在制備用于在體外就高流通量篩選潛在除草劑的除草劑靶目標(biāo)中的應(yīng)用。
30．根據(jù)前面一個(gè)權(quán)利要求的使用，其中的此多核苷酸的蛋白編碼區(qū)在大腸桿菌或酵母中異源表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明特別提供了至少包括編碼能夠賦予植物或形成該植物的組織對第一種除草劑抗性和耐性第一種蛋白的第一個(gè)區(qū)域和編碼同樣能夠賦予對第二種除草劑性第二種蛋白的第二個(gè)區(qū)域的多核苷酸,其具有以下附加條件(i)該多核苷酸不編碼包括僅僅5－烯醇－丙酮酰－3－磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白;(ii)該多核苷酸不包括僅僅編碼超氧物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的區(qū)域;和(iii)該多核苷酸不包括僅僅編碼GST和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的區(qū)域。
文檔編號C12N9/78GK1236394SQ9719954
公開日1999年11月24日 申請日期1997年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月7日
發(fā)明者P·A·湯普森, M·E·奈特, I·杰普森, P·G·托馬斯, T·R·豪克斯 申請人:曾尼卡有限公司