專利名稱：抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括抗副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的鼠單克隆抗體可變區(qū)(V區(qū))和人抗體恒定區(qū)(C區(qū))的人/鼠嵌合抗體，抗副甲狀腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)的鼠單克隆抗體V區(qū)輕鏈(L鏈)和重鏈(H鏈)的互補(bǔ)決定區(qū)移植到人抗體上的人源化抗體，所述抗體的L鏈和H鏈，以及含構(gòu)成所述抗體L鏈或H鏈V區(qū)的多肽。
本發(fā)明還涉及編碼上述抗體尤其是其V區(qū)的堿基序列的DNA，以及編碼V區(qū)的L或H鏈的DNA。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含所述DNA的重組載體和所述載體轉(zhuǎn)化的宿主。
另外，本發(fā)明涉及制備抗PTHrP嵌合和人源化抗體的方法。并且本發(fā)明涉及包括抗PTHrP抗體作為有效成分的高鈣血癥抑制劑或低磷酸鹽血癥促進(jìn)劑的藥劑組合物。
背景技術(shù)：
與惡性腫瘤有關(guān)的高鈣血癥是在5％到20％的惡性腫瘤病人中發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，它被認(rèn)為是惡性腫瘤的最終癥狀，因?yàn)槿绻Ａ粼摪Y狀不治療的話它必然導(dǎo)致死亡。高鈣血癥的控制極大程度地影響病人的預(yù)測(cè)和QOL(生命質(zhì)量)；因此，它將在臨床上起重要作用。
通常，惡性腫瘤病人的高鈣血癥粗略地分為HHM(惡性體液性高鈣血癥)，其基于產(chǎn)生腫瘤的體液性骨重吸收因子，和LOH(局部溶骨性高鈣血癥)，其基于轉(zhuǎn)移或滲透到骨的腫瘤的局部活性。HHM中，認(rèn)為骨吸收或骨硬化被促進(jìn)從而增加鈣的流動(dòng)并產(chǎn)生高鈣血癥同時(shí)伴隨腎鈣排泄能力的降低(S.Wada和N.Nagata，國(guó)際醫(yī)學(xué)，69，644-648)。
據(jù)認(rèn)為血清鈣濃度超過(guò)12毫克/dl時(shí)表現(xiàn)出高鈣血癥的癥狀；因?yàn)槠浒Y狀厭食(食欲不振)，惡心和嘔吐在惡性腫瘤病人的早期是非特異性癥狀。當(dāng)高鈣血癥惡化，由于腎小管遠(yuǎn)側(cè)的損傷造成水濃縮能力的降低導(dǎo)致多尿，厭食的惡心并伴隨由于水?dāng)z入缺乏導(dǎo)致的脫水。
Moseley，J.M.等發(fā)現(xiàn)類似副甲狀腺激素(PTH)的物質(zhì)副甲狀腺激素相關(guān)蛋白(此后用作“PTHrP”)是一類與惡性腫瘤有關(guān)的高鈣血癥中導(dǎo)致HHM的體液因子美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)(1987)84,5048-5052。
因此，分離了編碼PTHrP的基因(Suva，L.J.等，科學(xué)(1987)237，893)，并且該分析說(shuō)明了由于基因的交替拼接產(chǎn)生具有139、141和173個(gè)氨基酸的三種人PTHrP，這是由于具有完全結(jié)構(gòu)的PTHrP(1-139)的限制性降解各種片段都出現(xiàn)在血液中Baba，H.，臨床鈣(1995)5，229-223。PTHrP中，N末端13個(gè)氨基酸中的8個(gè)氨基酸與PTH的相應(yīng)部位等同，推測(cè)其14到34位的氨基酸位點(diǎn)也與PTH類似具有立體結(jié)構(gòu)；因此，PTHrP和PTH至少在N末端區(qū)與共同的PTH/PTHrP受體結(jié)合Jueppner，H.等，科學(xué)(1991)254，1024-1026；Abou-Samra，A-B.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)(1992)89，2732-2736。
有報(bào)道大量腫瘤組織產(chǎn)生PTHrP，還曾闡述不僅在腫瘤中，胎兒以及成人的各種正常組織也產(chǎn)生PTHrP，包括皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮、胎盤(pán)、哺乳期乳腺、甲狀腺、副甲狀腺、腎上腺、肝、腎和膀胱Burtis，W.J.，臨床化學(xué)(1992)38,2171-2183；Stewart，A.F.和Broadus，A.E.，臨床內(nèi)分泌學(xué)雜志(1991)71，1410-1414。另外，認(rèn)為PTHrP對(duì)胎兒到新生兒期比在母親中維持更高濃度的鈣的代謝調(diào)節(jié)起重要作用。
目前已知PTH/PTHrP受體主要存在于骨和腎中(C.Shigeno，臨床鈣(1995)5，355-359)，其通過(guò)PTHrP與受體的結(jié)合激活多數(shù)胞間信號(hào)傳送系統(tǒng)。其中之一是腺苷酸環(huán)化酶，另一個(gè)磷脂酶C。腺苷酸環(huán)化酶的激活增加了胞間cAMP的濃度從而激活蛋白激酶A。磷脂酶C分解4，5-二磷酸酯酰肌醇產(chǎn)生肌醇1，4，5-三磷酸酯和二酯酰甘油。G蛋白也參與這些信號(hào)傳送系統(tǒng)Coleman，D.T.等，副甲狀腺激素活性的生化機(jī)理，“副甲狀腺素”(Bilezikian，J.P.等)，Raven Press，New York(1994)239頁(yè)。
通過(guò)這些信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，PTHrP導(dǎo)致HHM中觀察到的高鈣血癥、低磷酸鹽血癥，腎磷酸鹽重吸收能力的降低，腎cAMP排泄的增加等。
因此，曾經(jīng)闡述PTHrP與惡性腫瘤有關(guān)的高鈣血癥密切相關(guān)。治療惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥時(shí)，曾使用降血鈣素、類固醇藥物、消炎痛、無(wú)機(jī)磷酸鹽、二磷酸鹽等，還曾使用體液置換。然而，這些藥物連續(xù)使用后發(fā)現(xiàn)其作用降低，表現(xiàn)出嚴(yán)重副作用，或其藥理作用的緩慢表達(dá)；因此十分期望使用具有較高治療作用和較低副作用的試劑或藥物。
另一方面，Kukreja，S.C.等報(bào)道了一種新的治療惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥的方法當(dāng)對(duì)人肺或喉癌細(xì)胞移植產(chǎn)生高鈣血癥的無(wú)胸腺鼠以抗PTHrP的中和抗血清給藥時(shí)，血鈣濃度和尿cAMP水平降低臨床研究雜志(1988)82，1798-1802。Kanji Sato等報(bào)道當(dāng)對(duì)移植產(chǎn)生PTHrP的人腫瘤的裸鼠使用抗PTHrP(1-34)抗體給藥時(shí)，高鈣血癥緩解，鼠的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)J.Bone&Mine.Res.(1993)8，849-860。另外，日本未審專利申請(qǐng)(公開(kāi)號(hào)為4-228089)公開(kāi)了抗人PTHrP(1-34)的鼠/人嵌合抗體。
鼠單克隆抗體在人體中具有高度免疫原性(有時(shí)也用作“抗原性”)，其限制了鼠單克隆抗體在人體中的藥物治療價(jià)值。例如，當(dāng)給人使用鼠抗體給藥時(shí)，它可能被作為外源物質(zhì)代謝掉；因此，鼠抗體在人體中的半衰期相對(duì)較短，其期望作用就不能有效表達(dá)。另外，抗給藥的鼠抗體的人抗鼠抗體(HAMA)可能導(dǎo)致對(duì)病人不利和危險(xiǎn)的免疫反應(yīng)，例如血清疾病和其它過(guò)敏反應(yīng)。因此，不能頻繁地對(duì)人使用鼠單克隆抗體給藥。
為了解決這些問(wèn)題，已經(jīng)研究出了降低非人來(lái)源的抗體，例如，來(lái)源于鼠的單克隆抗體的免疫原性的方法。方法之一是制備嵌合抗體，其中可變區(qū)(V區(qū))來(lái)源于鼠單克隆抗體，恒定區(qū)(C區(qū))來(lái)源于合適的人抗體。
由于產(chǎn)生的嵌合抗體具有原始鼠抗體的完整可變區(qū)，可以認(rèn)為該嵌合抗體S具有與原始鼠抗體相同的特異性的抗原結(jié)合。進(jìn)一步，這樣的嵌合抗體具有的來(lái)源于非人動(dòng)物的氨基酸序列的比例實(shí)質(zhì)上降低；因此，與原始鼠抗體相比，該單克隆抗體同等程度與其抗原結(jié)合，而免疫原性降低，但是仍然可能產(chǎn)生對(duì)鼠可變區(qū)產(chǎn)生一些免疫應(yīng)答LoBuglio，A.F.等人，美國(guó)科學(xué)院年報(bào)，86，4220-4224，1989。
降低鼠抗體的免疫原性的第二個(gè)方法還更復(fù)雜，但是預(yù)期可進(jìn)一步大大地降低鼠抗體的潛在免疫原性。這種方法中，僅僅鼠抗體可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體可變區(qū)從而產(chǎn)生“改造”的人可變區(qū)。如果需要，鼠抗體可變區(qū)中支持CDR的框架區(qū)(FR)的部分氨基酸序列可以移植到人抗體可變區(qū)，以使改造的人可變區(qū)CDR結(jié)構(gòu)更接近來(lái)原始鼠抗體的類似結(jié)構(gòu)。
然后，這些人源化的改造的人抗體可變區(qū)與人恒定區(qū)組合。在最后的改造的人源化抗體中，來(lái)源于非人氨基酸序列的部分僅僅是CDR以及很少一部分FR。CDR由高度可變氨基酸序列和不表現(xiàn)任何種屬特異性的序列組成。因此，包含鼠CDR的人源化抗體將不再顯示比含人CDR的天然存在的人抗體更強(qiáng)的免疫原性。
關(guān)于人源化抗體，還有如下參考文獻(xiàn)Riechmann，L.等，自然，332，323-327，1988；Verhoeye，M.等，科學(xué)，239，1534-1536，1988；Kettleborough，C.A.等，蛋白工程，4，773-783，1991；Maeda，H.等，人抗體和雜交瘤，2，124-134，1991；Gorman，S.D.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，88，4181-4185，1991；Tempest，P.R.等，生物/技術(shù)，9，266-271，1991；Co，M.S.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，88，2869-2873，1991；Carter，P.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，89，4285-4289，1992；Co，M.S.等，免疫學(xué)雜志，148，1149-1154，1992；Sato，K.等，癌癥研究，53，851-856，1993。
雖然期望人源化抗體對(duì)以前提及的治療目的有益，但是上述的參考文獻(xiàn)中未公開(kāi)抗PTHrP的人源化抗體，也沒(méi)有任何建議。另外，在人源化抗體的制備過(guò)程中通常沒(méi)有適用于任何抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法；有必要研究特異抗原顯示充分結(jié)合力和中和活性的人源化抗體的多種手段和方法參見(jiàn)，例如，Sato，K.等，癌癥研究，53，851-856，1993。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含抗PTHrP鼠單克隆抗體可變區(qū)(V區(qū))和人抗體恒定區(qū)(C區(qū))的人/鼠嵌合抗體，在人源化抗體中抗PTHrP鼠單克隆抗體輕鏈(L鏈)和重鏈(H鏈)構(gòu)成的V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)移植到人抗體的人源化抗體，所述抗體的L鏈和H鏈，以及含所述抗體L鏈或H鏈構(gòu)成的V區(qū)的多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含編碼上述抗體尤其是其V區(qū)的堿基序列的DNA，編碼含V區(qū)多肽的L或H鏈的DNA。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含所述DNA的重組載體和用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主。另外，本發(fā)明的目的還在于提供制備抗PTHrP嵌合人源化抗體的方法。本發(fā)明的目的還在于提供具有高度中和活性的抗PTHrP抗體。本發(fā)明的目的還在于提供一種抗PTHrP的抗體或人源化抗體作為有效成分的藥物組合物和高鈣血癥抑制劑、低磷酸鹽血癥改善劑、或堿毒癥改善劑。
作為綜合上述目的后充分研究的結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)成功地獲得一種抗PTHrP鼠單克隆抗體，其免疫原性在人體中降低；從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及含人抗體L鏈C區(qū)和抗PTHrP的鼠單克隆抗體L鏈V區(qū)的嵌合L鏈。上述L鏈V區(qū)包括如SEQ ID NO45所示的氨基酸序列，L鏈C區(qū)包括Cλ區(qū)。
本發(fā)明還涉及含人抗體H鏈C區(qū)和抗PTHrP的鼠單克隆抗體H鏈V區(qū)的嵌合H鏈。上述H鏈V區(qū)包括如SEQ ID NO46所示的氨基酸序列，H鏈C區(qū)包括Cλ1區(qū)。
另外，本發(fā)明還涉及含所述嵌合L鏈和所述嵌合H鏈的抗PTHrP的嵌合單克隆抗體。
并且，本發(fā)明還包括含人抗體L鏈V區(qū)的1到4框架區(qū)和抗PTHrP的鼠單克隆抗體L鏈V區(qū)的1到3互補(bǔ)決定區(qū)的人源化抗體的L鏈V區(qū)的多肽。互補(bǔ)決定區(qū)1到3分別為如SEQ ID NO59-61所示的氨基酸序列；框架區(qū)1到3分別來(lái)源于人抗體HSU03868的1到3框架區(qū)，框架區(qū)4包括來(lái)源于人抗體S25755框架區(qū)4；或者框架區(qū)1到3包括基本上分別與人抗體HSU03868的框架區(qū)1到3相同的序列，框架區(qū)4包括基本上與人抗體S25755的框架區(qū)4相同的序列。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上相同”是指人源化抗體中使用的人抗體的框架區(qū)具有形成鼠單克隆抗體互補(bǔ)決定區(qū)需要的氨基酸缺失、替換和/或添加以使人源化抗體具有與鼠單克隆抗體等同的活性。
因此，本發(fā)明涉及含人源化抗體L鏈V區(qū)的多肽，其中框架區(qū)的第36和49位氨基酸按照Kabat的規(guī)定(Kabat，E.A.等，美國(guó)健康和人類服務(wù)部，美國(guó)政府印刷局，1991)分別為酪氨酸和天冬氨酸。
本發(fā)明還涉及含人源化抗體L鏈V區(qū)的多肽，該人源化抗體含如SEQ ID NO48-51所示的任意一種氨基酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含人源化抗體L鏈V區(qū)的多肽，其中框架區(qū)的第45位和87位氨基酸按照Kabat的規(guī)定分別為賴氨酸和異亮氨酸。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及含人源化抗體L鏈V區(qū)的多肽，該人源化抗體含如SEQ ID NO52-55所示的任意一種氨基酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含人源化抗體H鏈V區(qū)的多肽，該人源化抗體包括人抗體H鏈V區(qū)的框架區(qū)1到4以及抗人PTHrP的鼠單克隆抗體H鏈V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)1到3。該互補(bǔ)決定區(qū)1到3分別包括含SEQ IDNO62-64所示的氨基酸序列，該框架區(qū)1到4包括來(lái)源于人亞群III(人亞群III(HSG III)，Kabat，E.A.等，美國(guó)健康和人類服務(wù)部，美國(guó)政府印刷局，1991)的人抗體的框架區(qū)1到4，尤其是那些分別來(lái)源于人抗體S31679的框架區(qū)1到4的序列，或者分別與人抗體S31679的框架區(qū)1到4基本上等同的序列。
本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO56所示氨基酸序列的人源化抗體的H鏈V區(qū)的多肽。
本發(fā)明還涉及含所述人源化抗體L鏈V區(qū)多肽以及含人抗體L鏈C區(qū)多肽的抗人PTHrP的人源化抗體的L鏈。C區(qū)包括Cλ區(qū)，框架區(qū)1到3包括基本上分別與人抗體HSU03868的框架區(qū)1到3等同的序列，框架區(qū)4包括基本上與人抗體S25755的框架區(qū)4等同的序列，互補(bǔ)決定區(qū)1到3的氨基酸序列分別包括SEQ ID NO59-61表示的序列。
本發(fā)明還涉及抗人PTHrP人源化抗體的H鏈，該人源化抗體包含所述人抗體H鏈C區(qū)和H鏈V區(qū)的多肽。C區(qū)包括Cγ1區(qū)，框架區(qū)1到4包括來(lái)源于HSG III的人抗體的框架區(qū)1到4，互補(bǔ)決定區(qū)1到3分別為SEQ ID NO62-64所示的氨基酸序列。
仍進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及具有弱抗原性和高度中和活性的抗PTHrP抗體。PTHrP抗體包括可以在人類疾病治療中使用的人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和靈長(zhǎng)類源化抗體。該抗體具有低解離常數(shù)。本發(fā)明的該抗體由于其具有低解離常數(shù)而具有高度中和活性，因此可以治療人類疾病。
本發(fā)明抗體的解離常數(shù)為1.86×10-7[M]或更低，解離率常數(shù)為1.22×10-1[1/Sec]或更低，結(jié)合率常數(shù)為6.55×104[1/M.Sec]或更高。這些常數(shù)使用RI標(biāo)記配基或表面質(zhì)?；蚪M共振傳感器通過(guò)Scatchard分析測(cè)定。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含編碼抗人PTHrP的鼠單克隆抗體L鏈V區(qū)或H鏈V區(qū)堿基序列的DNA。上述L鏈V區(qū)和H鏈V區(qū)分別包括SEQ IDNO45-46所示的氨基酸序列，包括編碼L鏈V區(qū)的堿基序列的DNA包括例如，SEQ ID NO65所示序列的，包括編碼H鏈V區(qū)的堿基序列的DNA包括SEQ ID NO57所示序列。
另外，本發(fā)明也涉及編碼所述嵌合L或H鏈的DNA。編碼所述L鏈的DNA包括，例如，SEQ ID NO65所示的堿基序列，編碼所述H鏈的DNA包括SEQ ID NO57所示的堿基序列。
仍然進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及包括編碼所述人源化抗體L鏈V區(qū)或H鏈V區(qū)的堿基序列的DNA。含編碼L鏈V區(qū)堿基序列的DNA包括SEQID NO66-74所示的堿基序列，含編碼H鏈V區(qū)堿基序列的DNA包括SEQ ID NO58所示的序列。
本發(fā)明還涉及含編碼SEQ ID NO47-55所示氨基酸序列之一的堿基序列的人源化抗體的L鏈V區(qū)的DNA。所述DNA包括SEQ IDNO66-74所示的堿基序列。
仍然進(jìn)一步，本發(fā)明涉及編碼SEQ ID NO56所示氨基酸序列的人源化抗體的H鏈V區(qū)的DNA。所述DNA包括SEQ ID NO58所示的堿基序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含任意一種所述DNA的重組載體。
本發(fā)明仍然進(jìn)一步涉及用所述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
另外，本發(fā)明也涉及制備抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的嵌合或人源化抗體的方法，包括培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中收集抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的嵌合或人源化抗體。
仍然進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及包括所述抗體作為有效成分的藥物組合物，或高鈣血癥抑制劑或低磷酸鹽血癥促進(jìn)劑。惡性腫瘤導(dǎo)致鈣血，惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥病人通常觀察到低磷酸鹽血癥癥狀。因此，本發(fā)明的抗體可用于治療惡性腫瘤或用于改善高鈣血或低磷酸鹽血癥癥狀。惡性腫瘤包括，但不限于，至少選自于下述之一胰腺、肺、咽、喉、舌、齒齦、食道、胃、膽管、乳腺、腎、膀胱、子宮和前列腺癌，以及惡性淋巴瘤。本發(fā)明的高鈣血癥抑制劑可以用于治療產(chǎn)生高鈣血癥的任何惡性腫瘤。
下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。
1.制備抗人PTHrP的鼠單克隆抗體可以通過(guò)骨髓瘤細(xì)胞與來(lái)源于用抗原免疫接種的動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞之間的細(xì)胞融合制備雜交瘤，并且從得到的雜交瘤中選擇產(chǎn)生特異性抑制PTHrP活性的抗體的克隆，以獲得抗PTHrP的鼠單克隆抗體。
(1)抗原的制備用于免疫接種動(dòng)物的PTHrP包括具有采用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成制備的PTHrP，和來(lái)源于產(chǎn)生高鈣血癥的癌細(xì)胞上清液的PTHrP的全部或部分氨基酸序列的多肽。例如，含已知PTHrP(Kemp，B.E.等，科學(xué)(1987)238,1568-1570)第1到第34位氨基酸的多肽[PTHrP(1-34)]可以用作上述抗原。人PTHrP(1-34)具有SEQ ID NO75所示的氨基酸序列。
得到的PTHrP附著于載體蛋白例如甲狀腺球蛋白，隨后添加佐劑。可以與任何佐劑，包括弗氏的完全和不完全佐劑混和。
(2)免疫接種并收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、馬、猴、兔、山羊或綿羊使用上述得到的抗原給藥?？梢杂靡阎椒ㄟM(jìn)行免疫接種，包括靜脈注射、皮下注射和腹膜內(nèi)注射。免疫接種的注射間歇沒(méi)有特別限制，可以為幾天到幾星期，最好為4到21天。
最后一次免疫接種后兩或三天，收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞包括脾、淋巴結(jié)、和外周血細(xì)胞；通常使用脾細(xì)胞。用于免疫接種的抗原的單劑量為每只鼠100μg。
(3)抗體滴度的確定為了確定免疫接種動(dòng)物的免疫反應(yīng)水平以及從經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合處理的細(xì)胞中選擇感興趣的雜交瘤，測(cè)量了免疫接種動(dòng)物血液中的抗體滴度或抗體產(chǎn)生細(xì)胞上清液中的抗體滴度。
抗體測(cè)定方法是已知的，包括EIA(酶免疫分析)、RIA(放射性免疫分析)、和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)。
(4)細(xì)胞融合用于與抗體生成細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞包括來(lái)源于各種動(dòng)物例如小鼠、大鼠和人的細(xì)胞系，本領(lǐng)域通常提供了這些技術(shù)。使用的合適細(xì)胞系是具有藥物抗性，在選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基中非融合狀態(tài)不能存活，而融合狀態(tài)能夠存活的細(xì)胞系。通常使用8-氮鳥(niǎo)嘌呤抗性細(xì)胞系，其缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能在次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
可以使用的合適骨髓瘤細(xì)胞包括各種已知細(xì)胞系，例如P3(P3×63Ag8.653)(免疫學(xué)雜志，(1979)1231548-1550)；P3×63Ag8U.1(微生物學(xué)和免疫學(xué)當(dāng)前主題(1978)811-7)；NS-1(Kohler，G和Milstein，C.歐洲免疫學(xué)雜志(1976)6511-519)；MPC-11(Margulies，D.H.等，細(xì)胞(1976)8405-415)；SP2/0(Shulman，M.等，自然(1978)8276269-270)；FO(de St.Groth，S.F.等，免疫學(xué)方法雜志(1980)351-21)；S194(Trowbridge，I.S.，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(1978)148313-323)；和R210(Galfre，G等，自然(1979)277131-133)。
可以從脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞等獲得抗體產(chǎn)生細(xì)胞。即，從上述任一種動(dòng)物提取或分離脾、淋巴結(jié)等，壓碎組織。得到的壓碎的材料在培養(yǎng)基或緩沖液中懸浮，例如PBS、DMEM或RPMI1640，用不銹鋼篩等過(guò)濾并離心以制備所需的抗體生成細(xì)胞。
然后，所述骨髓瘤細(xì)胞和抗體生成細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合可以按照下述方式進(jìn)行將骨髓瘤細(xì)胞和抗體生成細(xì)胞以1∶1到1∶10的比率在培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中例如MEM、DMEM或RPME-1640混合，同時(shí)加入融合促進(jìn)劑于30到37℃保持1到15分鐘。為加速細(xì)胞融合，可以使用一些融合促進(jìn)劑或病毒，例如平均分子量為1000到6000的聚乙二醇、聚乙烯醇或仙臺(tái)病毒。也可以在商業(yè)細(xì)胞融合儀中用電刺激例如電穿孔使抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合。
(5)雜交瘤的選擇和克隆細(xì)胞融合后從細(xì)胞選擇感興趣的雜交瘤，例如可以使用在選擇培養(yǎng)基中細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)的方法進(jìn)行篩選。
即，用合適的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸浮液并接種到微滴平板上培養(yǎng)，每孔加入選擇培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，適當(dāng)時(shí)用新鮮培養(yǎng)基更換選擇培養(yǎng)基進(jìn)行保溫。
因此，選擇生長(zhǎng)的細(xì)胞作為雜交瘤。
然后用限制性稀釋、熒光活化的細(xì)胞分類儀或其它方法篩選這些雜交瘤。最后，獲得生成單克隆抗體的雜交瘤。
(6)單克隆抗體的收集從獲得的雜交瘤中收集單克隆抗體的方法包括常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法和腹水形成法。
細(xì)胞培養(yǎng)法中，雜交瘤培養(yǎng)在培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中，例如含10％到20％胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基中，常規(guī)條件(例如，37℃，5％CO2)培養(yǎng)2到14天，從上清液中收集抗體。
腹水形成法中，將雜交瘤在與骨髓瘤細(xì)胞相同來(lái)源的哺乳動(dòng)物腹膜內(nèi)接種以使雜交瘤大量生長(zhǎng)。1到4周后，收集腹水或血清。
如果需要純化這些方法中的抗體，可以任意選擇或組合已知的方法例如硫酸銨沉淀、離子交換色譜和親合色譜。
2.嵌合抗體的構(gòu)建(1)含編碼抗人PTHrP的鼠單克隆抗體V區(qū)的堿基序列的DNA的克隆(i)mRNA的制備為克隆含編碼抗人PTHrP的鼠單克隆抗體V區(qū)的堿基序列的DNA，用常規(guī)方法處理收集的雜交瘤，例如，胍-超離心(Chirgwin，J.M.等，生物化學(xué)(1979)18，5294-5299)，或AGPC法(Chomczynski，P等，分析生化(1987)162，156-159)，以制備總RNA，其中mRNA通過(guò)，例如，附加在mRNA純化試劑盒(Pharmacia)上的低聚(dT)-纖維素填充柱制備。也可以使用快速預(yù)備mRNA純化試劑盒(PharmaciaAB)制備mRNA而不必提取總RNA。
(ii)cDNA的制備和擴(kuò)增用上述(i)中獲得的mRNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶合成L和H鏈的V區(qū)的每一cDNA。在cDNA的合成中，低聚-dT引物或其它與L或H鏈C區(qū)雜交的合適引物，例如，可以使用具有SEQ ID NO1所示堿基序列的MHC2引物。
在cDNA的合成中，所述mRNA和引物混合，在逆轉(zhuǎn)錄酶存在下能夠?qū)崿F(xiàn)反應(yīng)，反應(yīng)條件為例如，52℃，30分鐘。
可以通過(guò)5’-RACE法基礎(chǔ)上的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))使用5’-AmpliFINDER RACE試劑盒(CLONTECH Inc.)擴(kuò)增L鏈和H鏈的cDNA(Frohman，M.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究，17，2919-2932，1989)。因此，將AmpliFINDER錨(SEQ ID NO42)連接于上述合成的cDNA的5’末端，PCR合成含編碼L和H鏈V區(qū)堿基序列的DNA。(此后，含編碼L鏈V區(qū)堿基序列的DNA有時(shí)簡(jiǎn)單地表示為“L鏈V區(qū)的DNA”或“編碼L鏈V區(qū)的DNA”。這也同樣適用于H鏈V區(qū)、C區(qū)等。)可以使用的擴(kuò)增L鏈V區(qū)DNA的引物包括，例如，錨引物(SEQID NO2)和從鼠抗體Lλ鏈恒定區(qū)(Cλ區(qū))保守序列設(shè)計(jì)出的引物，例如具有SEQ ID NO4所示堿基序列的MLC引物?？梢允褂玫臄U(kuò)增H鏈V區(qū)DNA的引物包括，例如，錨引物(SEQ ID NO2)和MHC-G1引物(SEQ ID NO3)(S.T.Jones，等，生物技術(shù)，9，88，1991)。
(iii)DNA的純化和堿基序列的確定PCR產(chǎn)物按照常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以切下感興趣的DNA片段，然后回收，純化并且連接到載體DNA上。
DNA的純化可以用商業(yè)試劑盒例如GENECLEAN II、BIO 101進(jìn)行。本文適用的運(yùn)載DNA片段的載體DNA是已知的，例如，pUC19或Bluescript。
用已知連接試劑盒(Takara Shuzo)連接所述DNA和載體DNA以制備重組載體。得到的重組載體導(dǎo)入例如大腸埃希氏桿菌JM109，選擇氨芐青霉素抗性菌落；載體DNA用已知方法制備J.Sambrook，等，“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。限制性酶消化載體DNA后，再用已知方法例如雙脫氧法(J.Sambrook，等，“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)確定需要DNA的堿基序列。本發(fā)明可以使用自動(dòng)堿基序列決定裝置(DNA測(cè)序儀373A；ABI Inc.)。
(iv)互補(bǔ)決定區(qū)H和L鏈V區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，它們的整體結(jié)構(gòu)互相具有某些相似。即，四個(gè)框架區(qū)(FR)部分通過(guò)三個(gè)高變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)連接。FR中的氨基酸序列具有相對(duì)較高的保守性，而CDR區(qū)氨基酸序列的變異性較高Kabat，E.A.等，“免疫相關(guān)蛋白序列”美國(guó)健康和人類服務(wù)部，1983。
四個(gè)框架區(qū)的許多部分具有β片層結(jié)構(gòu)，因此，三個(gè)CDR形成一個(gè)環(huán)。CDR有時(shí)也形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。因此，通過(guò)在成對(duì)區(qū)與三個(gè)CDR結(jié)合形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的FR，三個(gè)CDR在空間上彼此非?？拷?。
鑒于這一事實(shí)，可以比較抗人PTHrP的鼠單克隆抗體可變區(qū)的氨基酸序列和Kabat等制備的抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(“免疫相關(guān)蛋白序列”美國(guó)健康和人類服務(wù)部，1983)尋找CDR區(qū)以便研究二者之間的同源性。
(2)嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)件。
編碼鼠單克隆抗體L和H鏈V區(qū)(此后有時(shí)也將鼠抗體的L或H鏈表示為“鼠L鏈”等，人抗體的L或H鏈表示為“人H鏈”等)的DNA片段被克隆后，將編碼鼠V區(qū)的DNA和編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，并表達(dá)產(chǎn)生嵌合抗人PTHrP抗體。
制備嵌合抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法涉及將存在于克隆cDNA中的鼠引導(dǎo)序列和V區(qū)序列連接到已經(jīng)存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中編碼人抗體C區(qū)的序列上?；蛘?，存在于克隆cDNA中的鼠引導(dǎo)序列和V區(qū)序列連接到編碼人抗體C區(qū)的序列上，隨后連接到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體上。
包含人抗體C區(qū)的多肽可以是人抗體的任意H或L鏈C區(qū)，包括，例如，人H鏈的Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，或者L鏈的Cλ或Cκ。
為制備嵌合抗體，首先構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)載體；即，構(gòu)建了處于表達(dá)控制區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)調(diào)控下，包含編碼鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA的表達(dá)載體，和處于表達(dá)控制區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)調(diào)控下，包含編碼鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)DNA的表達(dá)載體。然后用這些表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞體外或體內(nèi)培養(yǎng)以制備嵌合抗體參見(jiàn)，例如，WO91/16928。
或者，存在于克隆cDNA中的鼠引導(dǎo)序列和編碼鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA以及鼠引導(dǎo)序列和編碼鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA導(dǎo)入單一表達(dá)載體(參見(jiàn)，例如，WO94/11523)，所述載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；然后體內(nèi)或體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主以制備所需的嵌合抗體。
(i)嵌合抗體H鏈的制備可以將包含編碼鼠H鏈V區(qū)堿基序列的cDNA(此后也表示為“H鏈V區(qū)的cDNA”)導(dǎo)入含有包含編碼人抗體H鏈C區(qū)堿基序列的基因組DNA(此后也表示為“H鏈C區(qū)的基因組DNA”)或編碼所述區(qū)的cDNA(此后也表示為“H鏈C區(qū)的cDNA”)的合適表達(dá)載體中。H鏈C區(qū)包括，例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4區(qū)。
(i-a)含有編碼H鏈C區(qū)的基因組DNA的嵌合H鏈表達(dá)載體的構(gòu)建具有編碼H鏈C區(qū)，尤其是編碼Cγ1區(qū)的基因組DNA的表達(dá)載體包括，例如，HEF-PMh-gγ1(WO92/19759)和DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(WO92/19759)。
當(dāng)編碼鼠H鏈V區(qū)的cDNA插入這些表達(dá)載體時(shí)，可以用PCR法將合適的堿基序列導(dǎo)入所述cDNA?？梢杂锰貏e設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR，例如，使得所述cDNA具有識(shí)別合適限制性酶的5’端識(shí)別序列和緊接在起始密碼子之前具有促進(jìn)轉(zhuǎn)錄效能的kozak共有序列，以及使得所述cDNA具有識(shí)別合適限制性酶的3’端識(shí)別序列和拼接供體位點(diǎn)以將基因組DNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物正確地拼接獲得mRNA由此將合適的堿基序列導(dǎo)入表達(dá)載體的PCR引物。
編碼鼠H鏈V區(qū)的構(gòu)建的cDNA用合適的限制性酶處理后，即插入所述表達(dá)載體以構(gòu)建包含編碼H鏈C區(qū)(Cγ1區(qū))基因組DNA的嵌合H鏈表達(dá)載體。
(i-b)含有包括編碼H鏈堿基序列的cDNA的嵌合H鏈表達(dá)載體的構(gòu)建具有編碼H鏈C區(qū)(例如Cγ1區(qū))cDNA的表達(dá)載體可以按照下列方式構(gòu)建包括編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)的DNA和人抗體H鏈C區(qū)Cγ1(N.Takahashi等，細(xì)胞，29，671-679(1982))的基因組DNA的表達(dá)載體DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(參見(jiàn)WO92/19759)以及包括編碼人源化PM1抗體L鏈V區(qū)的基因組DNA和人抗體Lκ鏈C區(qū)的基因組DNA的表達(dá)載體RV1-PM1a(參見(jiàn)，WO92/19759)導(dǎo)入CHO細(xì)胞，從上述CHO細(xì)胞制備mRNA，編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)的cDNA和編碼人抗體H鏈C區(qū)(Cγ1)的cDNA通過(guò)RT-PCR方法克隆，并且連接到用合適限制性酶處理的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體上，以構(gòu)建需要的表達(dá)載體。
當(dāng)編碼鼠H鏈V區(qū)的cDNA直接連接到編碼人抗體H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA上時(shí)，可以用PCR法將合適的堿基序列導(dǎo)入包含編碼H鏈V區(qū)的cDNA的片段。例如，可以用特別設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR，例如，使得所述cDNA具有5’端識(shí)別序列以識(shí)別合適的限制性酶并且緊接在密碼子之前具有kozak共有序列由此促進(jìn)轉(zhuǎn)錄效能的PCR引物，以及使得所述cDNA具有3’端識(shí)別序列以識(shí)別合適的限制性酶由此將這些合適的堿基序列導(dǎo)入所述cDNA的PCR引物。
編碼鼠H鏈V區(qū)的構(gòu)建cDNA用合適的限制性酶處理，連接到編碼所述H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA上，然后插入表達(dá)載體例如pCOS1或pCHO1，以構(gòu)建包含編碼嵌合抗體H鏈cDNA的表達(dá)載體。
(ii)嵌合抗體L鏈的制備可以將編碼鼠L鏈V區(qū)的cDNA與編碼人抗體L鏈C區(qū)的基因組DNA或cDNA連接起來(lái)，并導(dǎo)入合適的表達(dá)載體，獲得表達(dá)嵌合抗體的L鏈的載體。L鏈C區(qū)包括，例如，κ鏈和λ鏈。
(ii-a)包含編碼嵌合Lλ鏈cDNA的表達(dá)載體的構(gòu)建當(dāng)構(gòu)建包含編碼鼠L鏈V區(qū)cDNA的表達(dá)載體時(shí)，可以用PCR法將合適的堿基序列導(dǎo)入所述表達(dá)載體中。例如，可以用特別設(shè)計(jì)的PCR引物，例如，使得所述cDNA具有5’端的識(shí)別合適限制性酶的識(shí)別序列和緊接在密碼子之前促進(jìn)轉(zhuǎn)錄效能的Kozak共有序列，以及使得所述cDNA具有3’端識(shí)別合適限制性酶的識(shí)別序列，由此將合適的堿基序列導(dǎo)入所述cDNA的PCR引物實(shí)現(xiàn)PCR。
編碼人Lλ鏈C區(qū)的cDNA的全部堿基序列可以用DNA合成儀合成，并用PCR法構(gòu)建。已知人Lλ鏈C區(qū)具有至少四種不同的同種型，每一型都可以用于構(gòu)建表達(dá)載體。例如，在尋找與克隆的鼠單克隆抗體Lλ鏈C區(qū)的同源性時(shí)，可以選擇人Lλ鏈C區(qū)片段(登記號(hào)X57819)的同種型Mcg+Ke+Oz-(P.Dariavach等美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，84，9074-9078，1987)用來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體。為構(gòu)建已知的人Lλ鏈C區(qū)例如Mcg+Ke+Oz-的cDNA，例如，設(shè)計(jì)了下面四種如SEQ ID NO11-14所示的引物引物MBC1HGP1(SEQ ID NO11)和MBC1HGP3(SEQ ID NO13)具有有義DNA序列，引物MBC1HGP2(SEQ IDNO12)和MBC1HGP4(SEQ ID NO14)具有反義DNA序列，其中每種引物的每一末端都具有20到23個(gè)堿基對(duì)的互補(bǔ)序列。
MBC1HGPS(SEQ ID NO15)和MBC1HGPR(SEQ ID NO16)稱為外部引物，它們具有分別和MBC1HGP1和MBC1HGP4同源的序列，并且具有合適限制性酶的識(shí)別序列。通過(guò)PCR法，四種引物被組裝起來(lái)合成全長(zhǎng)cDNA，并且加入外部引物以擴(kuò)增cDNA。
通過(guò)PCR法組裝是指MBC1HGP1和MBC1HGP2或MBC1HGP3和MBC1HGP4通過(guò)它們的互補(bǔ)序列退火以合成MBC1HGP1-MBC1HGP2片段和MBC1HGP3-MBC1HGP4片段，每一片段再次通過(guò)互補(bǔ)序列退火合成編碼全長(zhǎng)人Lλ鏈C區(qū)的cDNA。
編碼人Lλ鏈C區(qū)的構(gòu)建的cDNA和上述編碼鼠L鏈V區(qū)的構(gòu)建的cDNA可以在合適的限制性酶位點(diǎn)之間連接起來(lái)并插入表達(dá)載體例如pCOS1或pCHO1，以構(gòu)建包括編碼嵌合抗體Lλ鏈cDNA的表達(dá)載體。
(ii-b)包括編碼嵌合Lκ鏈cDNA的表達(dá)載體的構(gòu)建當(dāng)包含編碼鼠L鏈V區(qū)的cDNA的表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，可以用PCR法將合適的堿基序列導(dǎo)入所述cDNA。例如，可以用特別設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR，例如，使得所述cDNA在其5’末端具有識(shí)別合適限制性酶的識(shí)別序列和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄效能的Kozak共有序列的PCR引物，以及使得所述cDNA具有識(shí)別合適限制性酶的3’端識(shí)別序列，由此將合適的堿基序列導(dǎo)入所述cDNA的PCR引物。
連接于編碼鼠L鏈V區(qū)DNA的編碼人Lκ鏈C區(qū)的DNA可以從，例如，含基因組DNA的HEF-PM1k-gk構(gòu)建(參見(jiàn)WO92/19759)。
可以用PCR法將合適限制性酶的識(shí)別序列導(dǎo)入編碼Lκ鏈C的區(qū)DNA的5’和3’末端，上述構(gòu)建的編碼鼠L鏈V區(qū)的DNA可以與編碼Lκ鏈C區(qū)的DNA彼此連接并插入表達(dá)載體例如pCOS1或pCHO1，以構(gòu)建包括編碼嵌合抗體Lκ鏈cDNA的表達(dá)載體。
3.人源化抗體的制備(1)人抗體同源物的篩選為制備鼠單克隆抗體的CDR接支到人抗體上的人源化抗體，期望鼠單克隆抗體的FR和人抗體的FR之間存在高度同源性。因此，對(duì)鼠抗人PTHrP單克隆抗體H和L鏈的V區(qū)和應(yīng)用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)描述過(guò)結(jié)構(gòu)的所有已知的抗體的V區(qū)進(jìn)行了比較。同時(shí)也比較了它們和Kabat等分類的人抗體亞群(HSG人亞群)的抗體FR的長(zhǎng)度、氨基酸同源性等Kabat，E.A.等美國(guó)健康和人類服務(wù)部，美國(guó)政府印刷局，1991。
按照Kabat等對(duì)HSG的分類人H鏈V區(qū)可以分為HSGI到III，鼠抗人PTHrP單克隆抗體H鏈V區(qū)與HSGIII的共有序列具有82.7％的同源性。另一方面，按照Kabat等對(duì)HSG的分類人Lλ鏈C區(qū)可以分為HSGI到VI，鼠抗人PTHrP單克隆抗體Lλ鏈V區(qū)與屬于任何亞群的人Lλ鏈V區(qū)的共有序列不具有高度同源性。
當(dāng)鼠抗人PTHrP單克隆抗體人源化時(shí)，期望使用的人H鏈V區(qū)屬于HSGIII并具有最高度同源性，或者具有相應(yīng)規(guī)范FR結(jié)構(gòu)的人H鏈V區(qū)(ChothiaC等，分子生物學(xué)雜志，196，901-917，1987)作為人H鏈V區(qū)，用來(lái)構(gòu)建人源化抗體。另外，因?yàn)槿薒λ鏈V區(qū)亞群不具有最高度同源性的共有序列，構(gòu)建人源化抗體時(shí)期望使用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的具有高度同源性的人抗體Lλ鏈V區(qū)。
(2)編碼人源化抗體V區(qū)的DNA的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)編碼人源化抗體V區(qū)的DNA的第一步是選擇人抗體V區(qū)作為設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明中，與鼠抗體V區(qū)FR的同源性高于80％的人抗體V區(qū)的FR可以用于人源化抗體。作為基本上相同F(xiàn)R的框架，H鏈V區(qū)FR可以包括來(lái)源于亞群III的FR，例如S31679NBRF-PDB，Cuisinier A.M.等，歐洲免疫雜志，23，110-118，1993。另外，作為基本上相同F(xiàn)R的框架，L鏈V區(qū)的FR可以包括例如，來(lái)源于人抗體HSU03868(GEN-BANK，Deftos M.等，Scand.免疫雜志，39，95-103，1994)的FR1、FR2、和FR3以及來(lái)源于人抗體S25755(NBRF-PDB)的FR4。
人抗體S31679從人胎肝的cDNA文庫(kù)克隆，而人抗體HSU03868作為編碼人Lλ鏈V區(qū)的新的基因克隆。
(3)包含人源化抗體V區(qū)多肽的制備本發(fā)明的人源化抗體中，所述抗體的C區(qū)和V區(qū)的框架區(qū)來(lái)源于人，V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)來(lái)源于鼠(

圖1)。按照本發(fā)明可以用PCR法通過(guò)稱為CDR接支的方式得到包含人源化抗體V區(qū)的多肽，只要人抗體的DNA片段可以用作模版。“CDR移植”指一種方法，其中制備編碼來(lái)源于鼠的CDR的DNA片段，并用其替換作為模版的人抗體的CDR。
如果沒(méi)有提供用作模版的人抗體的DNA片段，可以用DNA合成儀合成數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的堿基序列，并可以用PCR法制備編碼人源化抗體V區(qū)的DNA。另外，當(dāng)數(shù)據(jù)庫(kù)中僅登記了一種氨基酸序列，可以根據(jù)Kabat，E.A.等(美國(guó)健康和人類服務(wù)部，美國(guó)政府印刷局，1991)報(bào)道的抗體慣用密碼子的知識(shí)從氨基酸序列推斷全部堿基序列。這種堿基序列在DNA合成儀上合成，然后用PCR法制備人源化抗體V區(qū)的DNA，并導(dǎo)入合適宿主，隨后在其中表達(dá)以制備需要的多肽。
當(dāng)存在作為模版的人抗體DNA片段時(shí)，通過(guò)PCR法的CDR移植的一般程序描述如下。
(i)CDR移植假設(shè)編碼V區(qū)的DNA包括編碼如圖2所示按順序互相連接的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的DNA。
首先，合成來(lái)源于鼠的對(duì)應(yīng)于相應(yīng)CDR的DNA片段。CDR1到3在以前克隆的鼠H和L鏈V區(qū)的堿基序列基礎(chǔ)上合成。合成的移植引物B和E，其中應(yīng)該具有沿有義鏈方向與鼠CDR1和人抗體FR2雜交的序列，移植引物E應(yīng)該具有沿反義鏈方向與CDR1和人抗體FR1雜交的引物(如圖2(1))。同樣，合成移植引物C和F以及引物D和G。另外，也分別合成了可以與FR1的上游區(qū)和FR4下游區(qū)雜交的稱為“外部引物”并相應(yīng)地表示為圖2(1)的A和H的合適引物?？梢园凑找阎绦蚍蛛x和提取所述移植引物Sambrook，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)出版社，1989。
然后，用移植引物E和外部引物A，移植引物B和F，移植引物C和G以及移植引物D和外部引物H進(jìn)行第一次PCR，分別形成A-E、B-F、C-G和D-H片段(如圖2(2))。
因?yàn)樵O(shè)計(jì)的移植引物B的上游區(qū)和部分移植引物E的下游區(qū)相互重疊(移植引物C和F以及D和G也同樣)，這些片段可以在合適溫度條件下反應(yīng)分別與互補(bǔ)序列退火，然后通過(guò)PCR組合從A到H長(zhǎng)度的DNA。獲得編碼V區(qū)的DNA片段后，可以加入外部引物A和H，并且進(jìn)行第二次PCR以生產(chǎn)編碼人源化抗體V區(qū)的DNA，該人源化抗體FR1到4來(lái)源于人，CDR1到3來(lái)源于鼠。然后，所述DNA可以導(dǎo)入合適的宿主以表達(dá)生產(chǎn)需要的多肽(圖2(3))。
(ii)DNA和編碼人源化H鏈V區(qū)的表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明中，作為人源化抗體模版的編碼人抗體H鏈V區(qū)DNA的全堿基序列可以通過(guò)DNA合成儀合成，并通過(guò)PCR法構(gòu)建，即使所述DNA不能從天然來(lái)源獲得。
鼠抗人PTHrP單克隆抗體的H鏈V區(qū)與屬于人亞群III的S31679高度同源。為了使用這一人抗體作為模版構(gòu)建編碼人源化H鏈V區(qū)的DNA，使用了例如SEQ ID NO23-26所示的四種引物。引物MBC1HGP1(SEQ ID NO23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO24)具有有義DNA序列，引物MBC1HGP2(SEQ ID NO25)和MBC1HGP4(SEQ ID NO26)具有反義DNA序列。其中將每種引物設(shè)計(jì)為每一末端都具有15到21堿基對(duì)的互補(bǔ)序列。
外部引物MBC1HVS1(SEQ ID NO27)和MBC1HVR1(SEQID NO28)具有分別和MBC1HGP1和MBC1HGP4同源的序列，并且分別具有合適限制性酶的識(shí)別序列。通過(guò)PCR法，四種引物被組裝起來(lái)合成全長(zhǎng)cDNA，并且加入外部引物以擴(kuò)增DNA?！巴ㄟ^(guò)PCR法組裝”涉及MBC1HGP1和MBC1HGP2或MBC1HGP3和MBC1HGP4通過(guò)它們的互補(bǔ)序列退火以合成MBC1HGP1-MBC1HGP3片段和MBC1HGP2-MBC1HGP4片段，每一片段再次通過(guò)互補(bǔ)序列退火合成編碼人源化H鏈V區(qū)的全長(zhǎng)DNA。
人抗體H鏈C區(qū)可以是任何人H鏈C區(qū)，例如，人H鏈的Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。
編碼上述構(gòu)建的人源化抗體H鏈V區(qū)的DNA可以連接到任何人抗體H鏈C區(qū)的DNA上，例如，人H鏈Cγ1區(qū)。如同“嵌合抗體H鏈的制備”一節(jié)所提到的，H鏈V區(qū)的DNA可以用合適的限制性酶處理然后連接到編碼人H鏈V區(qū)的DNA上使之處于表達(dá)調(diào)控區(qū)的控制下例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)，以制備包含編碼人源化H鏈V區(qū)和人H鏈V區(qū)的DNA的表達(dá)載體。
(iii)DNA和編碼人源化L鏈V區(qū)表達(dá)載體的的構(gòu)建本發(fā)明中，用作模板的編碼人抗體L鏈V區(qū)DNA的全部堿基序列可以用DNA合成儀合成，用PCR法構(gòu)建，即使不象編碼H鏈V區(qū)的DNA那樣L鏈V區(qū)的DNA可獲得。
為了構(gòu)建用作與鼠抗人PTHrP單克隆抗體L鏈V區(qū)有最高同源性的人抗體SU03868的模板的人源化L鏈V區(qū)的DNA，使用了如SEQ IDNO29-32所示的四種引物。引物MBC1LGP1(SEQ ID NO29)和MBC1LGP3(SEQ ID NO30)具有有義DNA序列，引物MBC1LGP2(SEQ ID NO31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO32)具有反義DNA序列。其中每種引物的每一末端都設(shè)計(jì)具有15到21堿基對(duì)的互補(bǔ)序列。
外部引物MBC1LVS1(SEQ ID NO33)和MBC1LVR1(SEQID NO34)分別具有和MBC1LGP1和MBC1LGP4同源的序列，并且分別具有相應(yīng)的合適限制性酶的識(shí)別序列。通過(guò)PCR法，四種引物被組裝起來(lái)合成全長(zhǎng)DNA，并且加入外部引物以擴(kuò)增DNA?！巴ㄟ^(guò)PCR法組裝”涉及MBC1LGP1和MBC1LGP3或MBC1LGP2和MBC1LGP4通過(guò)它們的互補(bǔ)序列退火以合成MBC1LGP1-MBC1LGP3片段和MBC1LGP2-MBC1LGP4片段，每一片段再次通過(guò)互補(bǔ)序列退火合成編碼人源化H鏈V區(qū)的全長(zhǎng)DNA。
人抗體L鏈C區(qū)可以是任何人L鏈C區(qū)，例如，人L鏈的Cλ或Cκ。
將編碼上述構(gòu)建的人源化抗體L鏈V區(qū)的DNA可以連接到任何人抗體L鏈C區(qū)的DNA上，例如，人L鏈Cλ區(qū)。L鏈V區(qū)的DNA可以用合適的限制性酶處理然后連接到編碼人Lλ鏈C區(qū)的DNA上處于表達(dá)調(diào)控區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制下，以制備包含人源化L鏈V區(qū)和人Lλ鏈C區(qū)DNA的表達(dá)載體。
如果包含人源化抗體V區(qū)的多肽可以如上述制備，就不必清楚是否所述多肽具有抗體活性，例如對(duì)其抗原的結(jié)合或中和活性。尤其對(duì)于L鏈，因?yàn)槭罂谷薖THrP單克隆抗體L鏈V區(qū)來(lái)源于非常罕見(jiàn)的Vλx基因，就有必要將它和人源化H鏈結(jié)合并在動(dòng)物細(xì)胞例如COS7中表達(dá)來(lái)研究其是否存在活性。
雜交V區(qū)的構(gòu)建(Ohtomo，T.等，分子免疫學(xué)，32，407-416，1995)和證實(shí)可以作為說(shuō)明人源化抗體V區(qū)FR有助于人源化抗體的結(jié)合和中和活性的有效方法。為了闡明應(yīng)該突變本發(fā)明人源化抗體L鏈V區(qū)中的氨基酸以賦予其活性，構(gòu)建了人源化抗體FR區(qū)片段與來(lái)源于鼠的FR區(qū)片段重組的DNA，并評(píng)價(jià)每一區(qū)的人源化作用。
如圖3所示，制備了具有包含來(lái)源于人抗體FR1和FR2和來(lái)源于鼠抗體FR3和FR4的重組V區(qū)多肽的抗體(例如，具有稱作為“雜合抗體”重組片段的抗體)，僅FR1來(lái)源于人的雜合抗體，以及僅FR2來(lái)源于人的雜合抗體。編碼這些雜合抗體的每種DNA分別被導(dǎo)入表達(dá)載體，短暫表達(dá)人源化抗體以研究是否存在抗體活性。
通過(guò)這種方法，本發(fā)明人研究了包含L鏈V區(qū)的多肽的抗原結(jié)合和中和活性，最后發(fā)現(xiàn)存在于FR2和FR3中的某些氨基酸被替換。
發(fā)現(xiàn)存在于FR2和FR3區(qū)對(duì)活性有貢獻(xiàn)的氨基酸后，本發(fā)明人進(jìn)一步闡述了FR2區(qū)的第36、45、49位的氨基酸和FR3區(qū)第87位氨基酸(抗體氨基酸的編號(hào)由Kabat，E A.等確定(美國(guó)健康和人類服務(wù)部，美國(guó)政府印刷局，1991))對(duì)活性有貢獻(xiàn)。
因此，本發(fā)明制備了V區(qū)的某個(gè)或某些氨基酸被突變(例如替換)的多肽。
首先，通過(guò)前述CDR移植法制備包括具有導(dǎo)入了氨基酸序列的某個(gè)或某些氨基酸突變V區(qū)的多肽作為基礎(chǔ)。這種基礎(chǔ)多肽包含SEQ IDNO47所示的氨基酸序列，并稱之為“a型”(表1中的a)。
然后，以a型為基礎(chǔ)，制備FR的一個(gè)或一些氨基酸突變的多種變異片段。
可以通過(guò)設(shè)計(jì)編碼導(dǎo)致產(chǎn)生需要突變的氨基酸的寡聚核苷酸引物(誘變引物)并用所述引物進(jìn)行PCR來(lái)導(dǎo)入突變。
因此，可以制備V區(qū)(b到t型)FR2和FR3的特定氨基酸被突變的多肽(表1中的b到t)。
表1FR1 CDR11 2 312345678901234567890123456789012345MBC H.PEPEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMS*** * * *S31679 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHhMBC1-H.pep ------------------------------SYGMSFR2 CDR24 5 667890123456789012A3456789012345MBC H.PEPWIRQTPDKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKG* * * *S31679 WVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGhMBC1-H.pep --------------TISSGGSYTYYPDSVKGFR3 CDR3 FR47 89 10 1167890123456789012ABC345678901234567890A1234567890123MBC H.PEPRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMFYCARQTTMTYFAYWGQGTLVTVSA** **** *S31679 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESRGDY WGQGTLVTVSShMBC1-H.pep --------------------------------QTTMTYFAY-----------
FR1CDR1FR2CDR21 2 3 4 5123456789012345678901234567A890123456789012345678901234ABCD56MBC L.PEPQLVLTQSSS-ASFSLGASAKLTCTLSSQHSTYTIEWYQQQPLKPPKYVMDLKQDGSHSTGD** * ** * * * *HSU03868 QLVLTQSPS-ASASLGASVKLTCTLSSGHSSYAIAWHQQQPEKGPRYLMKLNSDGSHSKGDhMBC1-L.pep -----------------------TLSSQHSTYTIE---------------LKQDGSHSTGDa-------------------------------------------------------------b-------------------------------------------P-----D-----------c-------------------------------------------------------------d-------------------------------------------------------------e-------------------------------------------P-----D-----------f-------------------------------------------------------------g------------------------------------Y------------------------h------------------------------------Y------------------------i------------------------------------Y--------K---------------j------------------------------------Y--------K---D-----------k------------------------------------Y--------K-V-------------l------------------------------------Y--------K-V-D-----------m------------------------------------Y------------D-----------n------------------------------------Y----------V-------------o------------------------------------Y----------V-D-----------p------------------------------------Y--------K---------------q------------------------------------Y--------K---D-----------r------------------------------------Y------------D-----------s------------------------------------Y--------K-V-D-----------t------------------------------------Y----------V-D-----------
FR3 CDR3 FR46 7 8 910 11789012345678901234567890123456789012345ABCD67890123456A7890MBC L.PEPGIPDRFSGSSSGADRYLSISNIQPEDEAMYICGVGDTIKEQFVYVFGGGTKVTVLGQP* * ** ** *HSU03868 GIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCQTWGTGIhMBC1-L.pep --------------------------------GVGDTIKEQFVYV------L------a---------------------------------------------------L------b---------------------------------------------------L------c-----------------------P---------------------------L------d------------------------------I--------------------L------e------------------------------I--------------------L------f-----------------------P------I--------------------L------g---------------------------------------------------L------h------------------------------I--------------------L------i---------------------------------------------------L------j---------------------------------------------------L------k---------------------------------------------------L------l---------------------------------------------------L------m---------------------------------------------------L------n---------------------------------------------------L------o---------------------------------------------------L------p------------------------------I--------------- ------L------q------------------------------I--------------------L------r------------------------------I--------------------L------s------------------------------I--------------------L------t------------------------------I--------------------L------
編碼上述構(gòu)建的人源化抗體L鏈V區(qū)每種類型的DNA可以連接到任何人抗體L鏈C區(qū)的DNA上，例如人L鏈Cλ區(qū)。因此用合適的限制性酶處理它，并連接到編碼人Lλ鏈C區(qū)的DNA上以在表達(dá)調(diào)控序列例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)的控制下，以構(gòu)建包含編碼人源化L鏈V區(qū)每種類型的DNA和編碼人源化Lλ鏈C區(qū)DNA的表達(dá)載體。
以前構(gòu)建的編碼人源化抗體H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA以及編碼人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA也可以導(dǎo)入單一表達(dá)載體例如WO94/11523公開(kāi)的載體，所述載體可以用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的宿主可以在體內(nèi)或體外培養(yǎng)以制備需要的人源化抗體。
4.嵌合抗體和人源化抗體的制備為制備嵌合或人源化抗體，應(yīng)該制備上述的兩種表達(dá)載體。因此，對(duì)于嵌合抗體，構(gòu)建了包含在表達(dá)調(diào)控區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)控制下編碼鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA的表達(dá)載體，以及包含在表達(dá)調(diào)控區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)控制下編碼鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA的表達(dá)載體。對(duì)于人源化抗體，構(gòu)建了包含在表達(dá)調(diào)控區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)控制下編碼人源化H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)DNA的表達(dá)載體，以及包含在表達(dá)調(diào)控區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子系統(tǒng)控制下編碼人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)DNA的表達(dá)載體。
然后用這些表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞體內(nèi)或體外培養(yǎng)以制備嵌合或人源化抗體(參見(jiàn)，例如，WO91/16928)。
或者，編碼H鏈V區(qū)和C區(qū)的DNA和編碼L鏈V區(qū)和C區(qū)的DNA可以連接到單一載體上并轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞以制備抗體。因此，在嵌合抗體的表達(dá)中，編碼存在于克隆cDNA中的鼠引導(dǎo)序列、鼠H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA，以及編碼鼠引導(dǎo)序列、鼠L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA被導(dǎo)入單一表達(dá)載體例如WO94/11523所公開(kāi)的載體。在人源化抗體的表達(dá)中，編碼人源化H鏈V區(qū)和人H鏈C區(qū)的DNA，以及編碼人源化L鏈V區(qū)和人L鏈C區(qū)的DNA被導(dǎo)入單一表達(dá)載體例如WO94/11523所公開(kāi)的載體。這樣的一種載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化宿主在體內(nèi)或體外培養(yǎng)以制備感興趣的嵌合或人源化抗體。
這樣通過(guò)培養(yǎng)用編碼所述嵌合或人源化抗體的DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體制備的感興趣的嵌合或人源化抗體可以從細(xì)胞內(nèi)部或外部分離出來(lái)并純化為單體。
本發(fā)明的感興趣的嵌合或人源化抗體可以使用蛋白A瓊脂糖柱分離和純化，但也可以使用常規(guī)蛋白的分離純化方法，因此該步驟沒(méi)有限制。例如，可以非強(qiáng)制性選擇或組合各種色譜法、超濾、鹽析和透析方法以分離和純化嵌合或人源化抗體。
可以使用任何表達(dá)系統(tǒng)制備本發(fā)明的抗人PTHrP嵌合或人源化抗體。例如，真核細(xì)胞包括動(dòng)物細(xì)胞例如已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、霉菌和真菌細(xì)胞、以及酵母細(xì)胞；原核細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞例如大腸埃希氏桿菌細(xì)胞。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如COS或CHO細(xì)胞中表達(dá)。
可以使用用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的任何常規(guī)啟動(dòng)子。例如，人細(xì)胞巨大病毒(HCMV)即早期啟動(dòng)子是優(yōu)選使用的。含HCMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體的例子包括來(lái)源于pSV2neo的HCMV-VH-HCγ1和HCMV-VL-HCK(WO92/19759)。
另外，本發(fā)明可以使用的用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒(SV)40，以及來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子，例如人多肽鏈延長(zhǎng)因子-1α(HEF-1α)。例如，按照Mulligan等的方法(自然，277，108，1979)可以方便地使用SV40啟動(dòng)子；按照Mizushima等的方法(核酸研究，18，5322，1990)可以方便地使用啟動(dòng)子HEF-1α。
本發(fā)明可用的復(fù)制起點(diǎn)包括來(lái)源于SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳突淋瘤病毒(BPV)的復(fù)制起點(diǎn)。另外表達(dá)載體可以包含磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3’)II或I(neo)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因或二氫葉酸還原酶(DHFR)基因作為增加宿主細(xì)胞系統(tǒng)中基因拷貝數(shù)的選擇性標(biāo)識(shí)物。
5.嵌合抗體和人源化抗體的抗原結(jié)合和中和活性的評(píng)價(jià)(1)抗體濃度的確定得到的純化抗體的濃度可以用ELISA法確定。
按照以下方式制備測(cè)定抗體濃度的ELISA平板制備的濃度為例如1μg/毫升的山羊抗人IgG抗體100μl固定在用于ELISA的96孔平板的每個(gè)孔中(例如，Maxisorp，NUNC)。用200μl稀釋緩沖液隔斷后(例如，50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％吐溫20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)，pH7.2)，每孔加入逐步稀釋的有嵌合、雜合或人源化抗體表達(dá)的COS-7或CHO細(xì)胞上清液，或者純化的嵌合、雜合或人源化抗體，加入100μl堿式磷酸酶結(jié)合山羊抗人IgG抗體，然后加入1毫克/毫升基礎(chǔ)溶液(Sigma 104，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)，隨后用微平板讀數(shù)儀(Bio Rad)測(cè)定405nm處的吸收值。純化的HuIgG1λ(結(jié)合位點(diǎn))可以用作濃度測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)品。
(2)抗原結(jié)合能力的確定確定抗原結(jié)合能力的ELISA平板按照下述方式制備制備的濃度為1μg/毫升的人PTHrP(1-34)100μl固定在用于ELISA的96孔平板的每個(gè)孔中。用200μl稀釋緩沖液隔斷后，每孔加入逐步稀釋的有嵌合、雜合或人源化抗體表達(dá)的COS-7或CHO細(xì)胞上清液中，或者純化的嵌合、雜合或人源化抗體中，加入100μl堿式磷酸酶結(jié)合山羊抗人IgG抗體，然后加入1毫克/毫升基礎(chǔ)溶液(Sigma 104，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)，隨后用微平板讀數(shù)儀(Bio Rad)測(cè)定405mn處的吸收值。
(3)中和活性的確定可以通過(guò)例如大鼠骨肉瘤細(xì)胞系ROS17/2.8-5細(xì)胞確定鼠、嵌合和人源化抗體的中和活性(Sato，K等，內(nèi)分泌學(xué)公報(bào)，116，113-120，1987)。因此，用4mM氫化可的松刺激ROS17/2.8-5細(xì)胞以誘導(dǎo)PTH/PTHrP受體。cAMP降解酶與1mM異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，SIGMA)抑制。待測(cè)定中和活性的鼠、嵌合或人源化抗體與等量PTHrP(1-34)混合，得到的每種抗體和PTHrP(1-34)的混合物分別加入平板的各個(gè)孔中。可以通過(guò)測(cè)量大鼠骨肉瘤細(xì)胞系ROS17/2.8-5細(xì)胞由于用PTHrP刺激導(dǎo)致cAMP產(chǎn)生的數(shù)量評(píng)估鼠、嵌合或人源化抗體的中和活性。
(4)PTHrP和抗PTHrP抗體之間相互作用的動(dòng)力學(xué)分析本發(fā)明可以用多種方法和程序分析PTHrP和抗PTHrP之間相互作用的動(dòng)力學(xué)。特別是，可以通過(guò)Scatchard分析法和稱為BIACORE的表面胞質(zhì)團(tuán)共振傳感器(Pharmacia Biotech研究開(kāi)發(fā))測(cè)定解離常數(shù)、解離率常數(shù)和結(jié)合率常數(shù)。稱為BIACORE的表面胞質(zhì)團(tuán)共振傳感器分析將在后文作為一個(gè)實(shí)施例描述。
BIACORE的基本結(jié)構(gòu)包括光源、棱鏡、檢測(cè)器和微通道。操作中，配基固定在盒式傳感器頂部，被分析物注射入傳感器。當(dāng)它們之間存在親和力時(shí)，即可光學(xué)測(cè)定結(jié)合量。
檢測(cè)原理是稱為表面胞質(zhì)團(tuán)共振現(xiàn)象。即，入射光照射到玻璃盒金屬膜之間的表面，以至發(fā)生全反射，某一角度的入射光用于刺激表面胞質(zhì)團(tuán)，隨后衰減。角度隨著與金屬膜(傳感器)接觸溶劑濃度的變化而改變。BIACORE即檢測(cè)這種改變。
BIACORE中，這種變化稱為共振信號(hào)(SPR信號(hào))，0.1度的改變?yōu)?000RU(共振單位)。1000RU對(duì)應(yīng)約1納克蛋白結(jié)合到表面積為1mm2的金薄層傳感器上的變化。對(duì)于蛋白，50RU(50pg)的變化就完全可以檢測(cè)得到。
檢測(cè)信號(hào)由附在BIACORE上的計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化成結(jié)合曲線，其被稱為傳感圖，該圖由計(jì)算機(jī)即時(shí)顯示Natsume，T.等(1995)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，13，563-569；Karlsson，R.等(1991)免疫方法學(xué)雜志145，229-240。
本發(fā)明抗PTHrP抗體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，即解離常數(shù)(KD)、解離率常數(shù)(Kdiss)和結(jié)合率常數(shù)(Kass)可以通過(guò)上述BIACORE方法測(cè)定。
考慮到中和活性，本發(fā)明的抗PTHrP抗體最好具有盡可能小的解離常數(shù)(KD值)。本發(fā)明的抗PTHrP抗體優(yōu)選KD值為1.86×10-7或更低，更優(yōu)選的是1.8×10-8或更低，最優(yōu)選的是3.58×10-10或更低。
KD值通過(guò)兩個(gè)參數(shù)確定，解離率常數(shù)(Kdiss)和結(jié)合率常數(shù)(Kass)(KD＝Kdiss/Kass)。因此可以看到，當(dāng)Kdiss值較小而Kass值較大時(shí)KD值較小。
尤其，本發(fā)明的抗PTHrP抗體Kdiss值可以為1.22×10-1[1/Sec]或更低。Kdiss值優(yōu)選1.22×10-2[1/Sec]或更低，更優(yōu)選3.16×10-4[1/Sec]或更低，最優(yōu)選2.32×10-4[1/Sec]或更低。
另一方面，Kass值可以為6.55×104[1/M.Sec]或更高。Kass值優(yōu)選6.55×105[1/M.Sec]或更高，更優(yōu)選0.883×106[1/M.Sec]或更高，最優(yōu)選1.03×106[1/M.Sec]或更高。
并且還優(yōu)選的Kdiss值為1.22×10-1[1/Sec]和Kass值可以為6.55×104[1/M.Sec]或更高的抗PTHrP抗體。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明的抗PTHrP抗體的KD值范圍為1.02×10-11到1.86×10-7[M]，優(yōu)選1.02×10-10到1.86×10-8[M]，更優(yōu)選1.34×10-10到3.58×10-10[M]，最優(yōu)選2.25×10-10到3.58×10-10[M]。
Kdiss值在7.38×10-6到1.22×10-1[1/Sec]之間，優(yōu)選7.38×10-5到1.22×10-2[1/Sec]，更優(yōu)選1.66×10-4到3.16×10-4[1/Sec]，最優(yōu)選1.66×10-4到2.32×10-4[1/Sec]之間。
Kass值在6.55×104到1.24×107[1/M.Sec]之間，優(yōu)選6.55×105到1.24×106[1/M.Sec]，更優(yōu)選7.23×105到1.03×106[1/M.Sec]，最優(yōu)選0.883×106到1.03×106[1/M.Sec]之間。
這些KD、Kdiss和Kass值可以通過(guò)Scatchard分析或表面胞質(zhì)團(tuán)共振傳感器例如BIACORE，并且最好是BIACORE測(cè)定。
6.含抗PTHrP抗體或人源化抗體作為有效成分的藥劑組合物和高鈣血癥抑制劑。
可以通過(guò)給表現(xiàn)高鈣血癥的動(dòng)物使用抗PTHrP抗體或人源化抗體給藥并測(cè)定高鈣血癥指標(biāo)來(lái)確定人源化抗體抗PTHrP的治療作用。表現(xiàn)高鈣血癥的動(dòng)物或高鈣血癥病人中，通常觀察到低磷酸鹽血癥；本發(fā)明的抗體也可以用于改善低磷酸鹽血癥。
本發(fā)明使用的抗體是抗PTHrP抗體，包括具有解離常數(shù)、解離率常數(shù)和結(jié)合率常數(shù)的抗PTHrP人抗體、嵌合抗體和靈長(zhǎng)類化或人源化抗體。該抗體通過(guò)與PTHrP結(jié)合而中和了PTHrP活性，該抗體特別優(yōu)選，人源化#23-57-137-1抗體。人源化#23-57-137-1抗體的制備方法將在實(shí)施例1到3中描述。
本發(fā)明使用的抗體可以通過(guò)常規(guī)純化方法例如鹽析、應(yīng)用HPLC等的凝膠過(guò)濾、和使用蛋白A柱等的親合色譜的組合得到高度純化的純品。因此可以通過(guò)常規(guī)免疫方法例如放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA，ELISA)或免疫熒光分析確定純化抗體對(duì)PTHrP識(shí)別的高精確性。
可以使用的表現(xiàn)高鈣血癥的動(dòng)物包括將產(chǎn)生PTHrP的腫瘤細(xì)胞移植到免疫功能降低或缺乏的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中而制備的模型動(dòng)物。移植的腫瘤細(xì)胞最好來(lái)源于人類，包括，例如，人胰腺癌PAN-7。植入腫瘤細(xì)胞的免疫功能低下或缺乏的動(dòng)物包括裸鼠和SCID鼠。
可以通過(guò)觀察血液中的鈣濃度，體重的降低，或者隨流逝時(shí)間運(yùn)動(dòng)程度的減少以及測(cè)定改善程度評(píng)價(jià)對(duì)高鈣血癥的抑制作用。
含本發(fā)明抗PTHrP抗體或抗PTHrP人源化抗體作為有效成分的藥劑組合物和高鈣血癥抑制劑可以非腸道系統(tǒng)給藥或局部給藥。例如，可以選擇靜脈注射包括滴注、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、或皮下注射。可以根據(jù)病人的年齡和疾病狀況選擇合適的給藥方式。有效的單劑量可以從每公斤體重0.01到1000毫克范圍內(nèi)選擇。或者，給藥劑量為5到10000毫克/體重，優(yōu)選50到1000毫克/體積。
含本發(fā)明抗PTHrP抗體或抗PTHrP人源化抗體作為有效成分的藥劑組合物和高鈣血癥抑制劑可以根據(jù)給藥途徑進(jìn)一步包括藥物學(xué)可接收載體和/或添加劑。這種載體和添加劑的例子可以包括水、藥物學(xué)可接收的有機(jī)溶劑、膠原、聚丙烯醇、聚丙烯吡咯烷酮、羧丙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、二甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和可以作為藥物添加劑的表面活性劑。使用的添加劑可以選擇上述之一或組合，單不限于此。
本發(fā)明抗體可以廣泛用于高鈣血癥相關(guān)的各種癌癥(惡性腫瘤)。這些癌癥沒(méi)有特別限制，不僅包括單一癌癥而且包括許多癌癥的并發(fā)。癌癥還包括例如胰腺、肺、咽、喉、齒齦、食道、胃、膽管、乳腺、腎、膀胱、子宮和前列腺癌，以及惡性淋巴瘤。
附圖簡(jiǎn)介圖1為本發(fā)明抗體的圖示說(shuō)明；圖2為CDR-移植的圖示說(shuō)明；圖3為確定FR和V區(qū)CDR的說(shuō)明；圖4為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖5為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖6為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖7為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖8為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖9為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖10為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖11為抗體的抗原結(jié)合活性的測(cè)量結(jié)果顯示圖；圖12為人源化抗體的中和活性顯示圖；圖13為人源化抗體的中和活性顯示圖；圖14為人源化抗體的中和活性顯示圖；圖15為本發(fā)明抗體對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物治療效果的說(shuō)明圖；圖16為本發(fā)明抗體對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物治療效果的說(shuō)明圖；圖17為本發(fā)明抗體對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物治療效果的說(shuō)明圖；圖18為本發(fā)明抗體對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物治療效果的說(shuō)明圖；圖19為說(shuō)明PTHrP固定到傳感器頂部的傳感圖；圖20為本發(fā)明抗體動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果圖；圖21為本發(fā)明抗體動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果圖；
圖22為本發(fā)明抗體動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果圖；圖23為本發(fā)明抗體動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果圖；圖24為本發(fā)明抗體動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果圖；圖25為本發(fā)明人源化抗體對(duì)局部磷酸鹽分泌影響的測(cè)定結(jié)果圖；圖26為本發(fā)明人源化抗體對(duì)血漿磷濃度影響的測(cè)定結(jié)果圖；圖27為使用本發(fā)明抗PTHrP抗體給藥后高鈣血癥模型鼠臨床表觀癥狀的照片(活動(dòng)物的形態(tài))；圖28為使用本發(fā)明抗PTHrP抗體給藥后高鈣血癥模型鼠臨床表觀癥狀的照片(活動(dòng)物的形態(tài))；圖29為與使用生理鹽水給藥的對(duì)照模型動(dòng)物相比高鈣血癥模型動(dòng)物使用本發(fā)明抗PTHrP抗體給藥后一段時(shí)間的活性變化圖。
圖30為與使用生理鹽水給藥的對(duì)照模型動(dòng)物相比高鈣血癥模型動(dòng)物使用本發(fā)明抗PTHrP抗體給藥后一段時(shí)間的體溫變化圖。
圖31為與使用生理鹽水給藥的對(duì)照模型動(dòng)物相比高鈣血癥模型動(dòng)物使用本發(fā)明抗PTHrP抗體給藥后一段時(shí)間的血液pH變化圖。
實(shí)施例下文將參考下列實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)該構(gòu)成本發(fā)明范圍的限制。參考實(shí)施例1產(chǎn)生抗-PTHrP(1-34)鼠單克隆抗體的雜交瘤的制備能夠產(chǎn)生抗人PTHrP(1-34)、#23-57-154和#23-57-137-1單克隆抗體的雜交瘤按照Kanji Sato等報(bào)道的方法制備(Sato，K.等，BoneMiner.研究雜志，8，849-860，1993)。
使用的免疫原是PTHrP(1-34)(Peninsula)，用碳二亞胺(Dojinn)將所述PTHrP鍵合到載體蛋白，甲狀腺球蛋白上。透析甲狀腺球蛋白鍵合PTHrP(1-34)獲得蛋白濃度為2μg/毫升的溶液。得到的溶液與弗氏佐劑(Difco)以1∶1的比例混合得到乳劑。該乳劑以100μg/只鼠的劑量分別對(duì)16只雌鼠BALB/C背部皮下注射或腹膜內(nèi)注射以免疫接種鼠。注射11次。關(guān)于佐劑，第一次免疫注射時(shí)使用弗氏完全佐劑，隨后的免疫注射中使用弗氏不完全佐劑。
以下列方式測(cè)定每只免疫接種鼠血清中的抗體滴度。
從每只鼠尾靜脈取血，然后離心該血樣獲得血清。血清用RIA緩沖液稀釋，與125I-標(biāo)記的PTHrP(1-34)混合，然后測(cè)定其結(jié)合活性。已經(jīng)確定具有令人滿意的高抗體滴度的鼠以50μg/只鼠的劑量腹膜內(nèi)注射無(wú)載體蛋白的PTHrP(1-34)作為最后免疫接種。
最后免疫接種后三天，處死鼠，切除它們的脾。然后，按照已知的常規(guī)方法用50％聚乙二醇4000使脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3×63Ag8U.1進(jìn)行細(xì)胞融合。如此制備的融合細(xì)胞在96孔的平板中以2×104/孔的量在85個(gè)孔中培養(yǎng)。感興趣的雜交瘤通過(guò)HAT培養(yǎng)如下述進(jìn)行篩選。
用固相RIA法確定HAT培養(yǎng)基中觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)的孔的培養(yǎng)物上清液中PTHrP-識(shí)別抗體的存在來(lái)篩選雜交瘤。從明確具有識(shí)別PTHrP-抗體結(jié)合能力的孔中收集雜交瘤。獲得的雜交瘤懸浮于含15％FCS并添加OPI-補(bǔ)充物(Sigma)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，隨后采用限制稀釋法勻化雜交瘤，因此獲得兩種雜交瘤克隆類型，#23-57-154和#23-57-137-1，均對(duì)PTHrP(1-34)表現(xiàn)強(qiáng)結(jié)合能力。
指定為“鼠-鼠雜交瘤#23-57-137-1”的雜交瘤克隆#23-57-137-1已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款于1996年8月15日保藏在國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)所，科學(xué)和技術(shù)所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，登記號(hào)為FERM BP-5631。實(shí)施例1
編碼鼠抗人PTHrP(1-34)單克隆抗體V區(qū)DNA的克隆編碼上述從#23-57-137-1獲得的鼠抗人PTHrP(1-34)單克隆抗體V區(qū)的DNA，按照下列方式進(jìn)行克隆。
(1)mRNA的制備從雜交瘤#23-57-137-1用Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech)如下述制備mRNA。
上述獲得的雜交瘤#23-57-137-1細(xì)胞用提取緩沖液完全勻化，用低聚(dT)-纖維素旋轉(zhuǎn)柱按照試劑盒生產(chǎn)商規(guī)定的程序從其中提取mRNA。提取溶液用乙醇沉淀獲得作為沉淀的mRNA。mRNA沉淀溶解于洗脫緩沖液。
(2)編碼鼠H鏈V區(qū)基因的eDNA的制備和擴(kuò)增(i)#23-57-137-1抗體H鏈V區(qū)的cDNA的克隆編碼抗人PTHrP鼠單克隆抗體H鏈V區(qū)的DNA通過(guò)5’-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。該方法用5’-AmpliFINDER RACE試劑盒(CLONETECH)按照生產(chǎn)商的程序進(jìn)行。該方法中，用于合成cDNA的引物是MHC2引物(SEQ ID NO1)，其可與鼠H鏈C區(qū)雜交。作為cDNA合成模板的2μg上述獲得的mRNA與10pmoles MHC2引物混合。得到的混合物與逆轉(zhuǎn)錄酶在52℃反應(yīng)30分鐘以制備與mRNA互補(bǔ)的cDNA。
產(chǎn)物與6N NaOH混合以水解其中的mRNA(65℃反應(yīng)30分鐘)，然后乙醇沉淀分離作為沉淀的cDNA。如此分離到的cDNA與T4 RNA連接酶在37℃反應(yīng)6小時(shí)另外室溫反應(yīng)16小時(shí)，以使cDNA連接到Ampli FINDER Anchor(SEQ ID NO42)的5’末端上。使用了錨引物(SEQ ID NO2)和MHC-Gl引物(SEQ ID NO3)作為PCR法擴(kuò)增cDNA的引物(S.T.Jones等，生物技術(shù)，9，88，1991)。
該方法中使用的PCR溶液(50μl)包括10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，0.25mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1.5mM MgCl2，2.5單位TaKaRa Taq(Takara Shuzo)，10pmoles錨引物，和1μl MHC-GI引物和Ampli FINDER Anchor引物連接其上的cDNA反應(yīng)混合物，并且該混合物用50μl礦物油液封。用熱循環(huán)儀480J型(Perkin Elmer)進(jìn)行PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，循環(huán)溫度為94℃45秒；60℃45秒；72℃2分鐘。
(ii)#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)的cDNA的克隆編碼抗人PTHrP鼠單克隆抗體L鏈V區(qū)的DNA通過(guò)5’-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。該方法用5’-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clonetech)按照生產(chǎn)商的程序進(jìn)行。該方法中，低聚-dT引物用作合成cDNA的引物。2μg上述mRNA(作為cDNA合成模板)與低聚-dT引物混合。得到的混合物與逆轉(zhuǎn)錄酶在52℃反應(yīng)30分鐘以制備cDNA。產(chǎn)物與6N NaOH混合以水解其中的RNA(65℃反應(yīng)30分鐘)，得到的混合物用乙醇沉淀分離作為沉淀的cDNA。如此合成的cDNA與T4 RNA連接酶在37℃反應(yīng)6小時(shí)另外室溫反應(yīng)16小時(shí)，以使cDNA連接到Ampli FINDER Anchor的5’末端上。
在鼠L鏈λ鏈C區(qū)保守序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)PCR引物MLC(SEQ IDNO4)，然后用394 DNA/RNA合成儀(ABI)合成。用于合成引物的PCR溶液(100μl)包括10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，0.25mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1.5mM MgCl2，2.5單位AmpliTaq，(Perkin Elmer)，50pmoles錨引物(SEQ ID NO2)，和1μlMLC(SEQID NO4)引物和Ampli FINDER錨引物連接其上的cDNA反應(yīng)混合物，上面覆蓋50μl礦物油。用熱循環(huán)儀480J型(Perkin Elmer)進(jìn)行PCR反應(yīng)35循環(huán)，溫度循環(huán)為94℃45秒；60℃45秒；72℃2分鐘。
(3)PCR產(chǎn)物的純化和裂解成片段上述PCR法擴(kuò)增的每種DNA片段用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.產(chǎn)品)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。分別從凝膠上切下長(zhǎng)度約為550堿基對(duì)DNA片段的每種H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的瓊脂糖凝膠片段。獲得的每種凝膠組份用GENECLEANII試劑盒(BIO 101)按照生產(chǎn)商提供的程序純化其中的DNA。純化的DNA用乙醇從溶液中沉淀出來(lái)，然后溶解于含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的20μl溶液中。這樣制備的DNA溶液1μl用限制性酶XmaI(New England Biolabs)于37℃消化1小時(shí)，另外用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)于37℃消化1小時(shí)。消化混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集DNA。
按照這種方式使得獲得的編碼鼠H鏈V區(qū)的DNA和編碼鼠L鏈V區(qū)的DNA都具有5’末端EcoRI識(shí)別序列和3’末端XmaI識(shí)別序列。
每一種包含編碼鼠H鏈V區(qū)DNA和編碼鼠L鏈V區(qū)DNA的EcoRI-XmaI DNA片段分別與事先用EcoRI和XmaI消化的pUC19載體使用DNA連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo)按照生產(chǎn)商推薦的程序于16℃反應(yīng)1小時(shí)，以彼此連接。獲得的連接混合物(10μl)加入100μl含大腸桿菌JM109(Nippon Gene)感受態(tài)細(xì)胞的溶液。冰上靜置細(xì)胞混合物15分鐘，42℃靜置1分鐘，然后再于冰上靜止1分鐘。產(chǎn)物與300μlSOC培養(yǎng)基混合(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook，等，Cold SpringHarbor Laborarory Press，1989)，于37℃保溫30分鐘。得到的細(xì)胞溶液接種到添加100或50μg/毫升氨芐青霉素，0.1mM IPTG和20μg/毫升X-gal的LB或2xYT瓊脂培養(yǎng)基上(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook，等，Cold Spring Harbor Laborarory Press，1989)，然后于37℃保溫過(guò)夜。按照這種方式，即可制備大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。
該轉(zhuǎn)化體在含100或50μg/毫升氨芐青霉素的2毫升LB或2xYT培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后用質(zhì)粒提取儀PI-100∑(Kurabou)或QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片制備質(zhì)粒DNA。確定獲得的質(zhì)粒DNA的序列。
(4)編碼鼠抗體V區(qū)的cDNA序列承載于質(zhì)粒上的編碼區(qū)cDNA序列用染料終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)由DNA測(cè)序儀373A(ABI；Perkin-Elmer)確定。這是通過(guò)使用M13引物M4(Takara Shuzo)(SEQ ID NO5)和M13引物RV(Takara Shuzo)(SEQ ID NO6)確定兩個(gè)方向上堿基序列的DNA測(cè)序方法。
獲得的包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)的cDNA和編碼鼠L鏈V區(qū)cDNA的質(zhì)粒分別被指定為“MBC1H04”和“MBC1L24”。編碼鼠#23-57-137-1抗體H鏈V區(qū)的DNA序列和L鏈V區(qū)的DNA序列(包括相應(yīng)的氨基酸序列)(分別承載于質(zhì)粒MBC1H04和質(zhì)粒MBC1L24)分別如SEQ ID NO57和65所示。H鏈V區(qū)片段和L鏈V區(qū)片段的多肽都從SEQ ID NO57和65所示DNA序列的第58個(gè)堿基(編碼谷氨酰胺)開(kāi)始翻譯。H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO46和45所示。
具有質(zhì)粒MBC1H04的大腸桿菌和具有質(zhì)粒MBC1L24的大腸桿菌分別被指定為“大腸桿菌JM109(MBC1H04)”和“大腸桿菌JM109(MBC1L24)”。這些大腸桿菌株系已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款于1996年8月15日保藏在國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)所，科學(xué)和技術(shù)所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大腸桿菌JM109(MBC1H04)的登記號(hào)為FERM BP-5628，大腸桿菌JM109(MBC1L24)的登記號(hào)為FERM BP-5627。
(5)抗人PTHrP鼠單克隆抗體#23-57-137-1 CDR的確定H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的一般結(jié)構(gòu)彼此相似。即，兩者都有通過(guò)三個(gè)高可變區(qū)(即，互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))連接四個(gè)框架區(qū)的結(jié)構(gòu)。框架區(qū)的氨基酸序列相對(duì)保守，而CDR區(qū)的氨基酸序列表現(xiàn)相當(dāng)高的誘變性(Kabat，E A.等，“具有免疫活性的蛋白序列”，美國(guó)健康和人服務(wù)部門(mén)，1983)。
基于上述事實(shí)，可以參考Kabat，E.A.等建立的抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)檢索鼠單克隆抗體V區(qū)氨基酸序列的同源性確定CDR。
L鏈V區(qū)中CDR1-3的氨基酸序列分別如SEQ ID NO59-61所示，H鏈V區(qū)中CDR1-3的氨基酸序列分別如SEQ ID NO62-64所示。
表2

實(shí)施例2嵌合抗體的構(gòu)建(1)嵌合抗體H鏈的構(gòu)建(i)H鏈V區(qū)的構(gòu)建編碼鼠H鏈V區(qū)的克隆cDNA用PCR法修飾，以將其連接到攜帶人H鏈V區(qū)Cγ1基因組DNA的表達(dá)載體上。使用的下游側(cè)端引物MBC1-S1(SEQ ID NO7)設(shè)計(jì)為可以與編碼V區(qū)引導(dǎo)序列5’-末端區(qū)的DNA雜交，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)和HindIII-識(shí)別序列。使用的上游引物MBC1-a(SEQ ID NO8)設(shè)計(jì)為可以與編碼J區(qū)3’-末端區(qū)的DNA雜交，并具有接合供體序列和BamHI-識(shí)別序列。使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)并添加緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用的PCR溶液(50μl)包括0.07μg的質(zhì)粒MBC1H04作為模版DNA的，50pmole的MBC1-a和50pmole的MBC1-S1作為引物，添加到緩沖液中2.5U的TaKaRa ExTaq和0.25mM的dNTP，液面用50μl礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)進(jìn)行30次循環(huán)，溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃2分鐘。PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA片段使用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.產(chǎn)品)通過(guò)瓊脂糖電泳分離。
然后，除下含長(zhǎng)度為437堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖凝膠片段，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒商介紹的方法純化DNA片段。純化的DNA通過(guò)乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。得到的DNA溶液一微升用限制性酶BamHI和HindIII(Takara Shuzo)于37℃消化1小時(shí)。消化混合物用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集DNA。
獲得的包含編碼鼠H鏈V區(qū)DNA的HindIII-BamHI DNA片段亞克隆到用HindIII和BamHI消化過(guò)的pUC19載體。得到的質(zhì)粒使用M13引物M4和M13引物RV作為引物，和染料終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)通過(guò)DNA測(cè)序儀373A(Perkin-Elmer)測(cè)序。包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)的正確堿基序列的DNA并具有5’末端區(qū)的HindIII識(shí)別序列和Kozak序列以及3’末端區(qū)的BamHI識(shí)別序列的質(zhì)粒被指定為“MBC1H/pUC19”。
(ii)用于制備鼠-人嵌合H鏈cDNA型的H鏈V區(qū)的構(gòu)建上述步驟構(gòu)建的編碼鼠H鏈V區(qū)的DNA用PCR法修飾，以使其連接到人H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA上。設(shè)計(jì)了用于修飾H鏈V區(qū)的反向引物MBC1HVS2(SEQ ID NO9)以便用甘氨酸替代編碼V區(qū)引導(dǎo)序列前面部分序列的第二個(gè)氨基酸(即，天冬氨酸)，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)及HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列。同時(shí)設(shè)計(jì)了用于修飾H鏈V區(qū)的正向引物MBC1HVR2(SEQ ID NO10)以便可與編碼J區(qū)3’末端區(qū)的DNA序列和編碼C區(qū)5’末端區(qū)的DNA雜交，并具有ApaI-和SmaI-識(shí)別序列。
使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)及所附的緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用的PCR溶液(50μl)包括0.6μg的質(zhì)粒MBC1H/pUC19作為模版DNA，50pmole的MBC1HVS2和50pmole的MBC1HVR2作為引物，緩沖液中的2.5U的TaKaRa Ex Taq和0.25mM的dNTP，液面用50μl礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)進(jìn)行30次循環(huán)，溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA片段使用1％SeaKem GTG瓊脂糖(FMC Bio.產(chǎn)品)通過(guò)瓊脂糖電泳分離。然后，切下含長(zhǎng)度為456堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖凝膠片段，用GENECLEANII試劑盒(BIO101)按照試劑盒商介紹的方法純化其中的DNA片段。純化的DNA乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
得到的DNA溶液一微升用限制性酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo)于37℃消化1小時(shí)。消化混合溶液用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集DNA。獲得的包含編碼鼠H鏈V區(qū)DNA的EcoRI-SmaI DNA片段亞克隆到用EcoRI和SmaI消化過(guò)的質(zhì)粒pUC19載體上。得到的質(zhì)粒使用M13引物M4和M13引物RV作為引物，和染料終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)通過(guò)DNA測(cè)序儀373A(Perkin-Elmer)測(cè)序。包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)的正確堿基序列的DNA并具有5’末端區(qū)HindIII識(shí)別序列和Kozak序列以及3’末端區(qū)ApaI和SmaI識(shí)別序列的質(zhì)粒被指定為“MBC1Hv/pUC19”。
(iii)嵌合抗體H鏈表達(dá)載體的構(gòu)建包含人抗體H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA按照如下方法制備。
從將編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體H鏈C區(qū)IgGl的基因組DNA的表達(dá)載體DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f(見(jiàn)WO92/19759)和編碼人源化PM1抗體L鏈V區(qū)和人抗體L鏈κ鏈C區(qū)的基因組DNA的表達(dá)載體RV1-PM1a(見(jiàn)WO92/19759)導(dǎo)入的CHO細(xì)胞中制備mRNA。通過(guò)獲得的mRNA，用RT-PCR法克隆包含人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA，然后亞克隆到質(zhì)粒pUC19的HindIII-BamHI位點(diǎn)。確定亞克隆質(zhì)粒的DNA序列，具有正確堿基序列的質(zhì)粒被指定為“pRVh-PM1f-cDNA”。
制備了具有SV40啟動(dòng)子和DHFR基因之間HindIII位點(diǎn)缺失和EF-1α啟動(dòng)子和人源化PM1抗體H鏈V區(qū)之間EcoRI位點(diǎn)缺失的表達(dá)載體，用于構(gòu)建包含人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA的表達(dá)載體。
獲得的質(zhì)粒pRVh-PM1f-cDNA用BamHI消化，用Klenow片段使末端平齊化，進(jìn)一步用HindIII消化，從而獲得平端HindIII-BamHI片段。這種平端HindIII-BamHI片段分別連接到上述已經(jīng)用HindIII和BamHI消化的HindIII位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)缺失的表達(dá)載體DHFR-ΔE-RVh-PM-l-f上以構(gòu)建包含編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA的表達(dá)載體RVh-PM1f-cDNA。
包含編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA的表達(dá)載體RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化，從其中收集包含H鏈V區(qū)的DNA片段。得到的DNA片段導(dǎo)入上述用ApaI和BamHI消化過(guò)的質(zhì)粒MBC1Hv/pUC19中。如此制備的質(zhì)粒被指定為“MBC1HcDNA/pUC19”。這種質(zhì)粒是分別包含編碼鼠抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA的質(zhì)粒，并具有5’端EcoRI-和HindIII-識(shí)別序列以及3’端BamHI-識(shí)別序列。
質(zhì)粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得編碼嵌合抗體H鏈的DNA。得到的DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化的表達(dá)載體pCOS1中。這樣獲得的編碼嵌合抗體的表達(dá)載體指定為“MBC1HcDNA/pCOS1”。其中，用EcoRI和SamI消化使HEF-PMh-gγ1(見(jiàn)W092/19759)抗體基因缺失，然后將它連接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo)上，以構(gòu)建表達(dá)載體pCOS1。
為制備在CHO細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒，質(zhì)粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得編碼嵌合抗體H鏈的DNA，然后其被導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化的表達(dá)質(zhì)粒pCHO1中。這樣獲得的編碼嵌合抗體的表達(dá)質(zhì)粒指定為“MBC1HcDNA/pCHO1”。其中，用EcoRI和SamI消化使DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(見(jiàn)WO92/19759)抗體基因缺失，然后將它連接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo)上，以構(gòu)建表達(dá)載體pCHO1。
(2)人L鏈C區(qū)的構(gòu)建(i)克隆載體的制備為構(gòu)建包含人L鏈C區(qū)的pUC19載體，制備了HindIII位點(diǎn)缺失的pUC19載體。2μg的pUC19載體用20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)反應(yīng)液于37℃消化1小時(shí)。得到的消化混合液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集感興趣的DNA。
收集到的DNA在50μl包含50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM NaCl，0.5mM dNTP和6U Klenow片段(GIBCOBRL)的反應(yīng)液中室溫反應(yīng)20分鐘以鈍化DNA末端。這種反應(yīng)混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀收集載體DNA。
這樣收集到的載體DNA在10μl包含50mM Tris-HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，1mM ATP，1mM DTT，5％(v/v)聚乙二醇-8000，和0.5U T4DNA連接酶(GIBCOBRL)的反應(yīng)液中16℃反應(yīng)2小時(shí)以使載體DNA自主連接。5μl反應(yīng)液加入100μl包含感受態(tài)大腸桿菌JM109(Nippon Gene)細(xì)胞的溶液中，得到的溶液冰上靜置30分鐘，42℃反應(yīng)1分鐘，進(jìn)一步置于冰上1分鐘。反應(yīng)溶液中加入了500毫升SOC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1小時(shí)。得到的溶液在表面添加X(jué)-gal和IPTG的2xYT瓊脂培養(yǎng)基(包含50μg/毫升的氨芐青霉素)上鋪板(分子克??；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook，等，Cold Spri納克Harbor Laboratory Press，1989)，然后37℃培養(yǎng)過(guò)夜，由此獲得轉(zhuǎn)化體。
轉(zhuǎn)化體在包含50μg/毫升的氨芐青霉素的2xYT瓊脂培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。從培養(yǎng)基的細(xì)胞碎片用質(zhì)粒Mini試劑盒(QIAGEN)按照試劑盒上的介紹純化質(zhì)粒DNA。純化的質(zhì)粒用HindIII消化。明確具有HindIII位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒指定為“pUC19ΔHindIII”。
(ii)編碼人L鏈λ鏈C區(qū)DNA的構(gòu)建已經(jīng)知道人抗體L鏈λ鏈C區(qū)具有至少四種同種型包括Mcg+Ke+Oz-，Mcg-Ke-Oz-，Mcg-Ke-Oz+和Mcg-Ke+Oz-(P.Dariavach，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，84，9074-9078，1987)?；贓MBL數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與#23-57-137-1鼠L鏈λ鏈C區(qū)同源的人抗體L鏈λ鏈C區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人抗體L鏈λ鏈的同種型Mcg+Ke+Oz-(登記號(hào)為X57819)(P.Dariavach，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，84，9074-9078，1987)表現(xiàn)與#23-57-137-1鼠L鏈λ鏈C區(qū)最高的同源性，氨基酸序列為64.4％的同源性，DNA序列為73.4％的同源性。
然后，用PCR法構(gòu)建編碼人抗體L鏈λ鏈C區(qū)的DNA。下列使用的每種引物均通過(guò)394DNA/RNA合成儀(ABI)合成。合成的引物HLAMB1(SEQ ID NO11)和HLAMB3(SEQ ID NO13)均具有有義DNA序列，引物HLAMB2(SEQ ID NO12)和HLAMB4(SEQ ID NO14)均具有反義DNA序列，每種引物的兩個(gè)末端均包含長(zhǎng)度為20-23堿基對(duì)的互補(bǔ)序列。
外部引物HLAMBS(SEQ ID NO15)和HLAMBR(SEQ IDNO16)分別具有與引物HLAMB1和HLAMB4互補(bǔ)的序列，并分別包含EcoRI-，HindIII-和BlnI-識(shí)別序列和EcoRI-識(shí)別序列。第一次PCR反應(yīng)中進(jìn)行了HLAMB1-HLAMB2和HLAMB3-HLAMB4反應(yīng)。反應(yīng)完成后，這兩種生成物等量混合，然后進(jìn)入第二次PCR反應(yīng)。反應(yīng)物中加入外部引物HLAMBS和HLAMBR。反應(yīng)混合物進(jìn)行第三PCR反應(yīng)用于擴(kuò)增全長(zhǎng)DNA。
PCR反應(yīng)用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)按照生產(chǎn)商的程序進(jìn)行。第一次PCR反應(yīng)中，使用了100μl包含5pmole HLAMB1，0.5pmoleHLAMB2和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反應(yīng)液或者包含0.5pmole HLAMB3，5pmole HLAMB4和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反應(yīng)液，液面用50μl礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)進(jìn)行5次，溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘。第二次PCR反應(yīng)中，使用每種反應(yīng)液50μl混合，液面用50μl礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)的3個(gè)循環(huán)利用，溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘進(jìn)行。第三次PCR反應(yīng)中，反應(yīng)液加入外部引物HLAMBS和HLAMBR各50pmole，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，利用溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘。
第三次PCR反應(yīng)獲得的DNA片段用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(NuSieve GTG Agarose，F(xiàn)MC)進(jìn)行電泳，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒上介紹的程序從凝膠收集和純化。
這樣獲得的DNA片段在20μl包含50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mMDTT，100mMNaCl，和8U EcoRI(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃反應(yīng)1小時(shí)。消化液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀由此獲得DNA。收集DNA并溶解于8μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
0.8μg的質(zhì)粒pUC19ΔHindIII用EeoRI按照上述同樣方式消化。消化液用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀，獲得消化的質(zhì)粒pUC19ΔHindIII。這樣消化獲得的質(zhì)粒在50μl包含50mM Tris-HCl(pH9.0)，1mM MgCl2，和堿性磷酸酶(大腸桿菌C75；Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃反應(yīng)30分鐘以使質(zhì)粒脫磷酸化(即，BAP-處理)。反應(yīng)液用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀獲得DNA。這樣獲得的DNA溶解于10μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
這樣制備的BAP-處理的質(zhì)粒pUC19ΔHindIII 1μl與4μl上述PCR反應(yīng)獲得的DNA混合，利用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)將二者連接起來(lái)。得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，JM109細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升含50μg/毫升氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)純化細(xì)胞中的質(zhì)粒。
對(duì)于上述質(zhì)粒，確定了克隆DNA的序列。確定DNA序列時(shí)，使用了373A DNA測(cè)序儀(ABI)和引物“M13引物M4”和“M13引物RV”(Takara Shuzo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆DNA中具有長(zhǎng)度為12堿基對(duì)的缺失部分。包含該DNA的質(zhì)粒指定為“CλΔ/pUC19”。然后，為了彌補(bǔ)這一部分，重新合成了引物、HCLMS(SEQ ID NO17)和HCLMR(SEQ ID NO18)，并且通過(guò)PCR法重新構(gòu)建了正確的DNA。
用包含缺失DNA的質(zhì)粒cλΔ/pUC19作為模版以及引物HLAMBS和HCLMS或引物HCLMS和HLAMB4進(jìn)行了第一次PCR反應(yīng)。分別純化每一個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。在第二次PCR反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物彼此混合。產(chǎn)物中加入外部引物HLAMBS和HLAMB4，隨后進(jìn)行第三次PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增全長(zhǎng)DNA。
第一次PCR反應(yīng)中，使用了100μl包含0.1μgcλΔ/pUC19作為模版，各50pmole引物HLAMBS和HCLMR或者各50pmole引物HCLMS和HLAMB4，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反應(yīng)液，液面用50μl礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中利用溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘。
PCR產(chǎn)物，HLAMBS-HCLMR(236堿基對(duì))和HCLMS-HLAMB4(147堿基對(duì))用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離DNA片段。然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化DNA片段。第二次PCR反應(yīng)中，使用了20μl包含40納克純化的DNA片段和1U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反應(yīng)液，液面用25μl礦物油覆蓋，以溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘進(jìn)行5個(gè)循環(huán)。
第三次PCR反應(yīng)中，使用了100μl包含2μl第二次PCR反應(yīng)得到的反應(yīng)液，外部引物HLAMBS和HLAMB4各50pmole，以及5U TaKaRaEx Taq(Takara Shuzo)的反應(yīng)液，液面用50μl礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中利用溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘，由此得到長(zhǎng)度為357堿基對(duì)的DNA片段(第三次PCR產(chǎn)物)。用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段。用GENECLEANII試劑盒(BIO101)收集和純化產(chǎn)生的DNA片段。
0.1μg這樣獲得的DNA片段用EcoRI消化，然后亞克隆到預(yù)先用BAP處理過(guò)的質(zhì)粒pUC19ΔHindIII中。得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化體。這樣制備的轉(zhuǎn)化體在2毫升含50μg/毫升氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒。
用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo)在373A DNA測(cè)序儀(ABI)確定了如此獲得的質(zhì)粒的DNA序列。明確具有無(wú)任何缺失的正確DNA序列的質(zhì)粒指定為“Cλ/pUC19”。
(iii)編碼人L鏈κ鏈C區(qū)DNA的構(gòu)建用PCR法從質(zhì)粒HEF-PM1k-gk(WO92/19759)克隆了編碼L鏈κ鏈C區(qū)的DNA片段。正向引物HKAPS(SEQ ID NO19)EcoRI-和HindIII-以及BlnI-識(shí)別序列，反向引物HKAPA(SEQ ID NO20)設(shè)計(jì)為包含設(shè)計(jì)為包含EcoRI-識(shí)別序列，二者均使用394 DNA/RNA合成儀(ABI)合成。
用100μl包含0.1μg質(zhì)粒HEF-PMlk-gk作為模版，各50pmole引物HKAPS和HKAPA，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)的反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，液面覆蓋50μl礦物油。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中利用了溫度循環(huán)為94℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘，由此得到長(zhǎng)度為360堿基對(duì)的DNA片段。DNA片段用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)收集和純化。
這樣獲得的DNA片段用EcoRI消化，然后克隆到已經(jīng)用BAP處理過(guò)的質(zhì)粒pUC19ΔHindIII中。得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，JM109細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化體。這樣制備的轉(zhuǎn)化體在2毫升含50μg/毫升氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒。
純化的質(zhì)粒DNA用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo)在373A DNA測(cè)序儀(ABI)測(cè)序。明確具有正確堿基序列的質(zhì)粒指定為“Cκ/pUC19”。
(3)嵌合抗體L鏈表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建了嵌合#23-57-137-1抗體L鏈表達(dá)載體。編碼#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)的DNA連接到各個(gè)質(zhì)粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19人抗體C區(qū)之前的HindIII和BlnI位點(diǎn)，由此得到包含編碼嵌合#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)和L鏈λ或κ鏈C區(qū)DNA的pUC19載體。然后用EcoRI消化每種得到的載體以便切出編碼嵌合抗體L鏈的DNA，該DNA亞克隆到HEF表達(dá)載體中。
用PCR法從質(zhì)粒MBC1L24克隆編碼#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)的DNA。用394DNA/RNA合成儀(ABI)單獨(dú)合成引物。使用的反向引物MBCCHL1(SEQ ID NO21)設(shè)計(jì)為包含HindIII-識(shí)別序列和Kozak序列(Kozak，M等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)，正向引物MBCCHL3(SEQ ID NO22)設(shè)計(jì)為包含BgIII-和RcoRI-識(shí)別序列。
用100μl包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.1μg MBC1L24，引物MBCCHL1和MBCCHL3各50pmole，以及1μl AmpliTaq(PERKIN ELMER)的反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，液面覆蓋50μl礦物油。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中利用溫度循環(huán)為94℃45秒；60℃45秒；72℃2分鐘。
用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離出長(zhǎng)度為444堿基對(duì)的DNA片段，然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)收集和純化。純化的DNA片段溶解于20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。1μl PCR產(chǎn)物在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和8U EcoRI(TakaraShuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。消化液用苯酚氯仿提取，隨后用乙醇沉淀收集沉淀DNA。如此獲得的DNA溶解于8μl包含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
1μg的質(zhì)粒pUC19用HindIII和EcoRI按照上述同樣方式消化。然后用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀收集消化的質(zhì)粒。產(chǎn)物用BAP(即，堿性磷酸鹽(大腸桿菌C75；Takara Shuzo))處理，然后用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀獲得DNA。這樣獲得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-處理的質(zhì)粒pUC19 1μl與4μl上述PCR產(chǎn)物混合，用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)將二者連接起來(lái)。得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞(Nippon Gene)，以上述同樣的方式形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在含50μg/毫升氨芐青霉素的2xYT瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)純化細(xì)胞碎片中的質(zhì)粒。DNA測(cè)序后，明確具有正確DNA序列的質(zhì)粒指定為“CHL/pUC19”。
各1μg質(zhì)粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19分別在20μl包含20mMTris-HCl(pH8.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2U BlnI(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。消化液用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀，由此獲得DNA。DNA用BAP在37℃處理30分鐘，然后用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀。產(chǎn)物溶解于10μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
8μg包含編碼#23-57-137-1 L鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒CHL/pUC19用HindIII和BlnI以上述同樣方式消化。利用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳獲得長(zhǎng)度為409堿基對(duì)的DNA片段，然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化該DNA片段。DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
4μl L鏈V區(qū)的DNA分別亞克隆到1μl BAP-處理的質(zhì)粒Cλ/pUC19或Cκ/pUC19上，然后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，JM109細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在3毫升含50μg/毫升氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)分離和純化細(xì)胞碎片中的質(zhì)粒。由此制備的質(zhì)粒分別指定為“MBC1L(λ)/pUC19”和“MBC1L(κ)/pUC19”。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19分別用EcoRI消化，然后用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳。用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中分離和純化長(zhǎng)度743堿基對(duì)的DNA片段，并將該DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
2.7μg的表達(dá)載體，質(zhì)粒HEF-PM1k-gk用EcoRI消化，然后用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀，由此獲得DNA片段。DNA片段用BAP處理，然后用1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳。用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中分離和純化到長(zhǎng)度為6561堿基對(duì)的DNA片段。該DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
這樣制備的HEF載體用BAP處理，2μlBAP-處理的HEF載體與3μl質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19的EcoRI片段混合，以使彼此連接。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，JM109細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升含50μg/毫升氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)純化細(xì)胞碎片中的質(zhì)粒。
這樣純化的質(zhì)粒DNA在20μl包含20mMTris-HCl(pH8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2U PvuI(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。在這一消化反應(yīng)中，推測(cè)如果上述DNA片段正向插入載體，則得到5104/2195堿基對(duì)的消化片段，如果上述DNA片段反向插入載體，則得到4387/2926堿基對(duì)的消化片段?；谶@種推測(cè)，正向插入片段的質(zhì)粒分別指定為“MBC1L(λ)/neo”和“MBC1L(κ)/neo”。
(4)COS-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染上述制備的表達(dá)質(zhì)粒分別用COS-7細(xì)胞短暫表達(dá)以便評(píng)價(jià)嵌合抗體對(duì)抗原的結(jié)合和中和活性。
通過(guò)Gene Pulser(Bio Rad)電穿孔將質(zhì)粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(λ)/neo或者質(zhì)粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(κ)/neo結(jié)合進(jìn)行嵌合抗體的短暫表達(dá)以便將這些質(zhì)粒DNA的組合物共轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。即，共轉(zhuǎn)染到0.8毫升細(xì)胞懸浮液中，其中COS-7細(xì)胞懸浮于PBS(-)，濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升，并加入每種質(zhì)粒DNA各10μl。得到的溶液應(yīng)用1500V和2μF靜電容量的脈沖進(jìn)行電穿孔。室溫恢復(fù)10分鐘后，細(xì)胞懸浮于包含2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中，然后用10cm的培養(yǎng)皿在CO2培養(yǎng)箱種培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，離心除去細(xì)胞碎片，以此作為ELISA分析的樣品。
該程序中，嵌合抗體從COS-7細(xì)胞上清液中的純化通過(guò)AffiGelProtein A MAPSII試劑盒(Bio Rad)按照試劑盒上介紹的方法進(jìn)行。
(5)ELISA分析(i)抗體濃度的確定確定抗體濃度的ELISA平板如下制備。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每個(gè)孔都用100μl包含包被緩沖液(0.1MNaHCO3，0.02％NaN3)中制備的濃度為1μg/毫升的山羊抗人IgG抗體(TAGO)的溶液包被，然后用200μl稀釋緩沖液[50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH7.2]隔斷。每孔加入其中嵌合抗體得以表達(dá)的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者逐步稀釋的純化嵌合抗體。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl堿性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗體(TAGO)。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的基質(zhì)溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(BioRad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。純化的HuIgG1λ(結(jié)合位點(diǎn))用作該測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品。
(ii)抗原結(jié)合能力的確定確定抗原結(jié)合能力的ELISA平板如下制備。用于ELISA分析的96孔平板的每個(gè)孔都用100μl包含包被緩沖液中制備的濃度為1μg/毫升的人PTHrP(1-34)(肽研究所)的溶液包被，然后用200μl稀釋緩沖液隔斷。每孔加入其中嵌合抗體得以表達(dá)的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者逐步稀釋的純化嵌合抗體。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl堿性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗體(TAGO)溶液。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的基質(zhì)溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(BioRad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)嵌合抗體具有對(duì)人PTHrP(1-34)的結(jié)合能力，也具有克隆的鼠抗體V區(qū)(圖4)的正確結(jié)構(gòu)。還發(fā)現(xiàn)L鏈C區(qū)有λ鏈的嵌合抗體和L鏈C區(qū)有κ鏈的嵌合抗體對(duì)PTHrP(1-34)的結(jié)合能力沒(méi)有差異。因此，通過(guò)人源化抗體L鏈λ鏈構(gòu)建了人源化抗體L鏈C區(qū)。
(6)CHO穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的建立為了建立產(chǎn)生嵌合抗體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，上述表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞(DXB11)。
嵌合抗體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的建立通過(guò)CHO細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒、質(zhì)粒MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(λ)/neo結(jié)合或者CHO細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒、MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(κ)/neo結(jié)合實(shí)現(xiàn)。這些質(zhì)粒組合體通過(guò)Gene Pulser(Bio Rad)電穿孔L分別共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。每種表達(dá)載體用限制性酶PvuI切開(kāi)成為線型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取并用乙醇沉淀收集。這樣制備的質(zhì)粒DNA分別電穿孔。質(zhì)粒DNA各10μg加入0.8毫升包含CHO細(xì)胞(濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升)的PBS(-)細(xì)胞懸浮液中。得到的混合液應(yīng)用靜電容量為1500V和2μF的脈沖進(jìn)行電穿孔。室溫恢復(fù)10分鐘后，電穿孔的細(xì)胞懸浮于添加10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培養(yǎng)基中。得到的懸浮液用三個(gè)96孔平板(Falcon)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)當(dāng)天，培養(yǎng)基用選擇性培養(yǎng)基[添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(G418Sulfate；GIBCO)無(wú)核糖核苷或脫氧核糖核苷的MEM-α培養(yǎng)基]替換。從培養(yǎng)基中選擇導(dǎo)入抗體基因的細(xì)胞。新鮮培養(yǎng)基替換選擇性培養(yǎng)基后，顯微鏡下觀察開(kāi)始培養(yǎng)之前的細(xì)胞和培養(yǎng)2周后的細(xì)胞。當(dāng)觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，用上述ELISA分析法確定產(chǎn)生的抗體量。選擇性收集產(chǎn)生大量抗體的細(xì)胞。
已建立抗體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體在搖瓶中用添加2％Ultra Low IgG胎牛血清，無(wú)核糖核苷或脫氧核糖核苷的MEM培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng)。培養(yǎng)第3到4天，收集培養(yǎng)基上清液，然后用孔徑為0.2μm(Millipore)的濾器過(guò)濾以除去其中的細(xì)胞碎片。
隨后，用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millipore)上按照其上介紹的方法純化CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的嵌合抗體。純化的嵌合抗體作為確定中和活性和檢驗(yàn)對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物的效能的樣品。純化嵌合抗體抗原的濃度和結(jié)合活性用同樣的ELISA系統(tǒng)確定。實(shí)施例3人源化抗體的構(gòu)建(1)人源化抗體H鏈的構(gòu)建(i)人源化H鏈V區(qū)的構(gòu)建通過(guò)PCR法用CDR-移植技術(shù)制備人源化#23-57-137-1抗體H鏈。為制備具有來(lái)源于人抗體S31679(NMRF-PDB；Cuisinier，A.M.等，歐洲免疫雜志，23，110-118，1993)FR的人源化#23-57-137-1抗體H鏈(“a”型)使用了下列六種類型PCR引物CDR-移植引物MBC1HGP1(SEQ ID NO23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO24)(均包含有義DNA序列)以及MBCHGP2(SEQ ID NO25)和MBC1HGP4(SEQ ID NO26)(均包含反義DNA序列)，它們的每個(gè)末端均包含長(zhǎng)度為15-21堿基對(duì)的互補(bǔ)序列；以及外部引物MBC1HVS1(SEQ ID NO27)和MBC1HVR1(SEQ ID NO28)，它們分別具有與CDR-移植引物MBC1HGP1和MBC1HGP4的同源性。
CDR-移植引物MBC1HGP1、MBCHGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4按照下列方式用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)分離，并用壓碎浸泡法(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)從凝膠片段中提取。
每種CDR-移植引物各1nmole用6％變性聚丙烯酰胺凝膠分離得到DNA片段。用UV照射硅膠薄層平板從產(chǎn)物DNA片段中鑒定需要長(zhǎng)度的DNA片段，然后用壓碎浸泡法收集。產(chǎn)物溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。用TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液(100μl)包含上述CDR-移植引物MBC1HGP1、MBCHGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4各1μl，0.25mM dNTP和2.5U TaKaRaExTaq的緩沖液。PCR反應(yīng)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，其中利用溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。外部引物MBC1HVS1和MBC1HVR1各50pmole加入反應(yīng)混合物。利用這種反應(yīng)混合物再用同樣的溫度循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)另外30個(gè)循環(huán)。這樣擴(kuò)增得到的DNA片段用4％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠電泳分離。
切下包含長(zhǎng)度為421堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖片段，用GENECLEANII試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法純化DNA片段。純化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。獲得的PCR反應(yīng)混合物用于將DNA片段亞克隆到預(yù)先用BanHI和HindIII消化的質(zhì)粒pUC19上；隨后確定得到質(zhì)粒的堿基序列。具有正確序列的質(zhì)粒指定為“hMBCHv/pUC19”。
(ii)用于人源化H鏈cDNA的H鏈V區(qū)的構(gòu)建為了連接到人源化H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA上，上述步驟構(gòu)建的人源化H鏈V區(qū)的DNA用PCR法修飾。該方法中，使用的反向引物MBC1HVS2設(shè)計(jì)為可以與編碼V區(qū)引導(dǎo)序列5’-末端區(qū)的序列雜交并攜帶Kozak共有序列(Kozak等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)以及HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列。用于修飾H鏈V區(qū)DNA的正向引物MBC1HVR2設(shè)計(jì)為可以與編碼J區(qū)3’-末端區(qū)的DNA序列和編碼C區(qū)5’-末端區(qū)的DNA序列雜交并攜帶ApaI-和SamI-識(shí)別序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)進(jìn)行PCR反應(yīng)，隨其應(yīng)用了緩沖液。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液為包含0.4μg hMBCHv/pUC19作為DNA模版，MBC1HVS2和MBC1HVR2各50pmole作為引物，2.5U TaKaRaEx Taq和緩沖液中的0.25mM dNTP。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中利用溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。這樣由PCR法擴(kuò)增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠電泳分離。
切下長(zhǎng)度為456堿基對(duì)的DNA片段，用GENECLEANII試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法從中純化DNA片段。純化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。獲得的PCR反應(yīng)混合物用于DNA片段亞克隆到預(yù)先用EcoRI和SamI消化的質(zhì)粒pUC19上；隨后確定得到質(zhì)粒的堿基序列。由此制備的包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)的DNA和也包含5’-末端區(qū)HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列和Kozak序列以及3’-末端區(qū)ApaI-和SamI-識(shí)別序列的質(zhì)粒DNA指定為“hMBC1Hv/pUC19”。
(2)人源化抗體H鏈表達(dá)載體的構(gòu)建包含hPM1抗體H鏈的cDNA序列的質(zhì)粒RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化以獲得包含H鏈C區(qū)堿基序列的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用ApaI和BamHI消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Hv/pUC19上。由此制備的質(zhì)粒指定為“hMBC1HcDNA/pUC19”。該質(zhì)粒包含編碼人源化#23-57-137-1抗體H鏈V區(qū)的DNA和編碼人H鏈C區(qū)Cγ1的DNA并具有5’-末端區(qū)HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列以及3’-末端區(qū)BamHI-識(shí)別序列。質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19中包含的人源化H鏈“a”型的堿基序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO58和SEQ ID NO56所示。
質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得包含編碼H鏈堿基序列的DNA片段。將該DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化過(guò)的表達(dá)質(zhì)粒pCOS1上。獲得的人源化抗體的表達(dá)質(zhì)粒指定為“hMBC1HcDNA/pCOS1”。
為制備在CHO細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒，質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得包含編碼H鏈DNA的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化過(guò)的表達(dá)載體pCHO1上。由此獲得的人源化抗體的表達(dá)質(zhì)粒指定為“hMBC1HcDNA/pCHO1”。
(3)L鏈雜合可變區(qū)的構(gòu)建(i)FR1、2/FR3、4雜合抗體的制備構(gòu)建了編碼其中FR區(qū)與人源化抗體和鼠(嵌合)抗體FR區(qū)重組的L鏈的DNA，并評(píng)價(jià)了該區(qū)人源化作用的適宜性。該步驟中，包含來(lái)源于人抗體的FR1和FR2以及來(lái)源于鼠抗體的FR3和FR4的抗體利用存在于CDRZ中的AflII限制性位點(diǎn)制備。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/neo和hMBC1L(λ)/neo各10μg在100μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA和10U Afl II(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。反應(yīng)液用2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化長(zhǎng)度為6282堿基對(duì)的DNA片段(稱為“c1”)和長(zhǎng)度為1022堿基對(duì)的DNA片段(稱為“h1”)。
獲得的c1和h1片段各1μg用BAP處理。用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀收集DNA片段，然后溶于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-處理的c1和h1 DNA片段各1μl分別與4μl h2和c2 DNA片段混合，以使彼此連接(4℃過(guò)夜)。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升包含50μg/毫升胺芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒。
純化的質(zhì)粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，2U ApaLI(Takara Shuzo)，和8U BamHI(Takara Shuzo)或HindIII(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。該步驟中，基于這樣的設(shè)想鑒定了質(zhì)粒，即如果c1-h2片段正確連接到質(zhì)粒上，該連接獲得5560/124/498堿基對(duì)的ApaLI消化片段或者7134/269堿基對(duì)的BamHI/HindIII消化片段。
編碼人FR1、2/鼠FR3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體指定為“h/mMBC1L(λ)/neo”。另一方面，沒(méi)有獲得h1-c1的克隆。因此，在pUC載體上進(jìn)行了重組，隨后克隆到HEF載體上。其中，用做模版的是包含編碼無(wú)氨基酸替換的人源化抗體L鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19，和包含編碼FR3中第91位(即，按照Kabat定義的87號(hào)氨基酸)酪氨酸由異亮氨酸取代的人源化抗體L鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒hMBC1Ldλ/pUC19。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19、hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19各10微升在30μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA，16U HindIII和4U AflII的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。反應(yīng)液用2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19中收集和純化下面DNA片段長(zhǎng)度為215堿基對(duì)的DNA片段(稱為“c2”)或者分別從質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19中收集和純化長(zhǎng)度為3218堿基對(duì)的DNA片段(分別稱為“ha1”和“hd1”)。
每種ha1’和hd1’片段分別連接到c2’片段上，然后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升包含50μg/毫升胺芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒。得到的包含ha1’片段和hd1’片段的質(zhì)粒DNA分別指定為“m/hMBC1Laλ/pUC19”和“m/hMBC1Ldλ/pUC 19”。
質(zhì)粒m/hMBC1Laλ/pUC19和m/hMBC1Ldλ/pUC19分別用EcoRI消化。2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化長(zhǎng)度為743堿基對(duì)的DNA片段。產(chǎn)物溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
獲得的DNA片段4μl與上述BAP-處理的HEF載體1μl混合以彼此連接。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升包含50μg/毫升胺芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒DNA。
純化的質(zhì)粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，8U HindIII(Takara Shuzo)和2UPvuI(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。該步驟中，基于這樣的設(shè)想鑒定了質(zhì)粒DNA，即如果DNA片段正向插入質(zhì)粒，該連接反應(yīng)得到5104/2195堿基對(duì)的消化片段，而如果DNA片段反向插入質(zhì)粒，該連接反應(yīng)得到4378/2926堿基對(duì)的消化片段。由此獲得的質(zhì)粒是編碼鼠FR1、2/人FR3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體分別指定為表達(dá)載體“m/hMBC1Laλ/neo”和“m/hMBC1Ldλ/neo”。
(ii)FR1/FR2雜合抗體的制備按照上述同樣的方式利用存在于CDR1中SnaBI限制性位點(diǎn)制備FR1/FR2雜合抗體。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/neo和mMBC1L(λ)/neo各10μg在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.9)，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl，0.01％(w/v)BSA，和6U SnaBI(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。得到反應(yīng)液進(jìn)一步在50μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，100mM KCl，0.01％(w/v)BSA，和6U PvuI的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。
得到的反應(yīng)液用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化長(zhǎng)度為4955堿基對(duì)和2349堿基對(duì)的DNA片段。從質(zhì)粒MBC1L(λ)/neo中獲得的DNA片段指定為“m1”(4955堿基對(duì))和“m2”(2349堿基對(duì))，從質(zhì)粒h/mMBC1L(λ)/neo中獲得的DNA片段指定為“hm1”(4955堿基對(duì))和“hm2”(2349堿基對(duì))。獲得的每種DNA片段均溶于20μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
m1和hm1片段各1μl分別連接到hm2和m2片段各4μl上，然后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。獲得的轉(zhuǎn)化體在2毫升包含50μg/毫升氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒DNA。
純化的質(zhì)粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mM DTT，和8U ApaI(Takara Shuzo)或者2U ApalI(Takara Shuzo)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。
基于下述設(shè)想鑒定了由此制備的質(zhì)粒(m1-hm2和hm1-m2)，即如果每種DNA片段以正確方向連接到質(zhì)粒上，用ApaI和ApaLI消化的質(zhì)粒(m1-hm2)將分別得到7304堿基對(duì)的消化片段和5560/1246/498堿基對(duì)的消化片段，用ApaI和ApaLI消化的質(zhì)粒(hm1-m2)將分別得到6538/766堿基對(duì)的片段和3535/2025/1246/498堿基對(duì)的片段。
編碼人FR1/鼠FR2、3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體指定為“hmmMBC1L(λ)/neo”，編碼鼠FR1/人FR2/鼠FR3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體指定為“mhmMBC1L(λ)/neo”。
(4)人源化抗體L鏈的構(gòu)建通過(guò)PCR法用CDR-移植技術(shù)制備了人源化#23-57-137-1抗體L鏈。即，包含來(lái)源于人抗體HSU03868(GEN-BANK，Deftos M.等，Scan.免疫學(xué)雜志，39，95-103，1994)FR1、FR2、FR3以及來(lái)源于人抗體S25755(NBRF-PDB)FR4的人源化#23-57-137-1抗體L鏈(“a”型)用下述六種類型的PCR引物制備具有有義DNA序列的CDR-移植引物MBC1LGP1(SEQ IDNO29)和MBC1LGP3(SEQ ID NO30)，具有反義DNA序列的CDR-移植引物MBC1LGP2(SEQ ID NO31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO32)，所有這些CDR-移植引物的每個(gè)末端都具有15-21堿基對(duì)的互補(bǔ)序列；以及分別與CDR-移植引物MBC1LGP1和MBC1LGP4同源的外部引物MBC1LVS1(SEQ ID NO33)和MBC1LVR1(SEQ ID NO34)。
CDR-移植引物MBC1LGP1、MBCLGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠分離(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，并用壓碎浸泡法從凝膠片段中提取(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
每種CDR-移植引物各1nmole用6％變性聚丙烯酰胺凝膠分離。UV射線照射的硅膠薄層平板鑒定需要長(zhǎng)度的DNA片段，然后用壓碎浸泡法從中收集。產(chǎn)物溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液(100μl)包含CDR-移植引物MBC1LGP1、MBCLGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4各1μl，0.25mM dNTP，緩沖液中的2.5U TaKaRa Ex Taq。PCR反應(yīng)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，其中利用了溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。反應(yīng)混合物中加入外部引物MBC1LVS和MBC1LVR1各50pmole。利用這種反應(yīng)混合物再用同樣的溫度循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)另外30個(gè)循環(huán)。這樣擴(kuò)增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠電泳分離。
切下包含長(zhǎng)度為421堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖片段，用GENECLEANII試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法純化DNA片段。由此制備的PCR反應(yīng)混合物用于DNA片段亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化的質(zhì)粒pUC19上。確定得到質(zhì)粒的DNA序列。由此制備的質(zhì)粒指定為“hMBCL/pUC19”。然而發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒CDR4的第104位氨基酸(按照Kabat確定的96號(hào)氨基酸)由精氨酸取代。為了將這個(gè)氨基酸校正為酪氨酸，設(shè)計(jì)和合成了引物MBC1LGP10R(SEQID NO35)。然后用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)和緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液(100μl)包含0.6μg的質(zhì)粒hMBCL/pUC19為模版DNA，引物MBC1LVS1和MBC1LVR1各50pmole，2.5UTaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)，和緩沖液中的0.25mM dNTP，液面覆蓋礦物油。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中利用溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。這樣擴(kuò)增得到的DNA片段用3％NuSieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠電泳分離。
切下長(zhǎng)度為421堿基對(duì)的DNA片段，用GENECLEANII試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法純化DNA片段。由此制備的PCR反應(yīng)混合物用于該DNA片段亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化的質(zhì)粒pUC19上。
用M13引物M4和M13引物RV確定該質(zhì)粒的DNA序列。結(jié)果確定該質(zhì)粒具有正確的序列。然后該質(zhì)粒用HindIII和BlnI消化，用1％的瓊脂糖凝膠電泳從中分離到416堿基對(duì)的DNA片段。DNA片段用GENECLEANII試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法純化。然后導(dǎo)入預(yù)先用HindIII和BlnI消化的質(zhì)粒Cλ/pUC上。得到的質(zhì)粒指定為“hMBC1Laλ/pUC19”。該質(zhì)粒用EcoRI消化，得到編碼人源化L鏈的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1以至人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。這樣獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Laλ/pCOS1”。人源化L鏈“a”型的DNA序列(包括對(duì)應(yīng)氨基酸序列)如SEQ ID NO66所示?！癮”型的氨基酸序列如SEQ ID NO47所示。
“b”型通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。設(shè)計(jì)“b”型是為了用脯氨酸替換43位的甘氨酸(Kabat定義的43號(hào)氨基酸)并用天冬氨酸替換49位的賴氨酸(Kabat定義的49號(hào)氨基酸)。用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突變引物MBC1LGP5R(SEQ ID NO36)和引物MBC1LVS1進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，消化片段亞克隆到pUC19的BamHI-HindIII位點(diǎn)。測(cè)序后，獲得的質(zhì)粒DNA用HindIII和AflII消化，產(chǎn)生的消化片段連接到預(yù)先用HindIII和AflII消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19上。
由此獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lbλ/pUC19”。該質(zhì)粒DNA用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈DNA的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lbλ/pCOS1”。
“c”型通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。設(shè)計(jì)“c”型是為了用脯氨酸替換84位的絲氨酸(Kabat定義的80號(hào)氨基酸)。用質(zhì)粒hMBClLaλ/pUC19作模版，用突變引物MBC1LGP6S(SEQ ID NO37)和引物M13引物RV進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化過(guò)的pUC19上。測(cè)序后，獲得的質(zhì)粒DNA用BstPI和Aor51HI消化，產(chǎn)生的DNA片段連接到預(yù)先用BstPI和Aor51HI消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19上。由此獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lcλ/pUC19”。該質(zhì)粒DNA用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈序列的DNA片段。該序列導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lcλ/pCOS1”“d”、“e”、“f”型也通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。設(shè)計(jì)“d”、“e”、“f”型是為了在91位分別用“a”、“b”、“c”型的異亮氨酸替換酪氨酸(Kabat定義的87號(hào)氨基酸)。分別用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pCOS1作為“d”型的模版，質(zhì)粒hMBC1Lbλ/pUC19作為“e”型的模版，質(zhì)粒hMBC1Lcλ/pUC19作為“f”型的模版，用突變引物MBC1LGP11R(SEQ ID NO38)和引物M-S1(SEQ ID NO44)分別進(jìn)行“d”、“e”、“f”各型的PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化過(guò)的pUC19上。測(cè)序后，質(zhì)粒用HindIII和BlnI消化，產(chǎn)生的消化片段連接到預(yù)先用HindIII和BlnI消化過(guò)的質(zhì)粒Cλ/pUC19上。
由此獲得的質(zhì)粒分別指定為“hMBC1Ldλ/pUC19”、“hMBC1Leλ/pUC19”和“hMBC1Lfλ/pUC19”。每種質(zhì)粒用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈DNA的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于該質(zhì)粒EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒分別指定為“hMBC1Ldλ/pCOS1”，“hMBC1Leλ/pCOS1”和“hMBC1Lfλ/pCOS1”。
“g”、“h”型也通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。設(shè)計(jì)“g”、“h”型是為了在36位分別用“a”和“d”型的酪氨酸替換組氨酸(Kabat定義的36號(hào)氨基酸)。用突變引物MBC1LGP9R(SEQ IDNO39)和引物M13引物RV，并用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用M13引物M4作為引物以及質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作為模版再次進(jìn)行另一個(gè)PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用HindIII和BlnI消化，然后繼代克隆到預(yù)先用HindIII和BlnI消化過(guò)的質(zhì)粒Cλ/pUC19上。用該質(zhì)粒作為模版，用引物MBC1LGP13R(SEQ ID NO40)和MBC1LVS1再次進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得的PCR片段用ApaI和HindIII消化，然后分別導(dǎo)入預(yù)先用ApaI和HindIII消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19上。確定獲得的質(zhì)粒的DNA序列。明確含有正確序列的質(zhì)粒分別指定為“hMBC1Lgλ/pUC19”和“hMBC1Lhλ/pUC19”。每種質(zhì)粒用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈序列的序列。該序列導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒分別指定為“hMBC1Lgλ/pCOS1”和“hMBC1Lhλ/pCOS1”。
“i”、“j”、“k”、“l(fā)”、“m”、“n”、“o”型也通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。用突變引物MBC1LGP14S(SEQ IDNO41)和引物V1RV(λ)(SEQ ID NO43)，并用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)。產(chǎn)生的DNA片段用ApaI和BlnI消化，然后亞克隆到預(yù)先用ApaI和BlnI消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Lgλ/pUC19上。確定獲得的質(zhì)粒的堿基序列，對(duì)應(yīng)每種類型導(dǎo)入突變的克隆。由此獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lxλ/pUC19(x=i，j，k，l，m，n或o)”。該質(zhì)粒用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈序列的序列。該序列導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lxλ/pCOS1(x=i，j，k，l，m，n或o)”?！癹”、“l(fā)”、“m”、和“o”型的DNA序列(包括對(duì)應(yīng)的氨基酸序列)分別如SEQ ID NO67、68、69和70所示。這些類型的氨基酸序列分別如SEQ ID NO48、49、50和51所示。
“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型分別是“i”、“j”、“m”、“l(fā)”和“o”型的87位酪氨酸被異亮氨酸替代的修飾型。這些類型按照下列方式利用FR3中的Aor51MI限制性位點(diǎn)用“i”、“j”、“m”、“l(fā)”或“o”型替換“h”型制備。從表達(dá)質(zhì)粒hMBClLxλ/pCOSl(x=i，j，m，l，或o)中缺失包含CDR3的Aor51HI限制性片段(514堿基對(duì))、部分FR3和全部FR4。包含CDR3的Aor51HI限制性片段(514堿基對(duì))、部分FR3和全部FR4連接到表達(dá)質(zhì)粒的缺失部分上，從而用異亮氨酸替換了91位的酪氨酸(Kabat定義的87號(hào)氨基酸)。確定產(chǎn)生的質(zhì)粒的DNA序列，選擇91位酪氨酸(Kabat定義的87號(hào)氨基酸)被異亮氨酸替換的各種“i”、“j”、“m”、“l(fā)”或“o”型克隆。對(duì)應(yīng)于“i”、“j”、“m”、“l(fā)”或“o”型的類型分別指定為“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型，這些類型的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝p，q，s，r或t)”?！皅”、“r”、“s”和“t”型的DNA序列(包括對(duì)應(yīng)的氨基酸序列)分別如SEQ ID NO71、72、73、74所示。這些類型的氨基酸序列分別如SEQ ID NO52、53、54、55所示。
質(zhì)粒hMBC1Lqλ/pCOS1用HindIII和EcoRI消化，然后亞克隆到預(yù)先用HindIII和EcoRI消化的質(zhì)粒pUC19上。獲得的質(zhì)粒指定為“hMBC1Lqλ/pUC19”。
每種人源化L鏈類型中取代氨基酸的位置如表3所示。
表3序列表中取代氨基酸的位置(按照Kabat定義的氨基酸編號(hào))型36434547498087ab P Dc Pd Ie P D If P Ig Yh Y Ii Y Kj Y K Dk Y K Vl Y K V Dm Y Dn Y Vo Y V Dp Y K Iq Y K D Ir Y D Is Y K V D It Y V D I
上表3中，大寫(xiě)字母代表下列氨基酸Y酪氨酸；P脯氨酸；K賴氨酸；V纈氨酸；D天冬氨酸；I異亮氨酸。
包含質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19的大腸桿菌株系和包含質(zhì)粒hMBC1Lqλ/pUC19的大腸桿菌株系分別指定為“大腸桿菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)”和“大腸桿菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)”，它們已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款于1996年8月15日保藏在國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)所，科學(xué)和技術(shù)所代理，日本(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大腸桿菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)的登記號(hào)為FERM BP-5629，大腸桿菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)的登記號(hào)為FERM BP-5630。
(5)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞為確定雜合抗體和人源化#23-57-137-1抗體的抗原結(jié)合活性和中和活性，上述表達(dá)質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中短暫表達(dá)。為短暫表達(dá)雜合抗體L鏈，下列各質(zhì)粒的組合用Gene Pulser(Bio Rad)通過(guò)電穿孔共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞hMBC1HcDNA/pCOS1和h/mMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Laλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Ldλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和hmmMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和mhmMBC1L(λ)/neo。即，各質(zhì)粒DNA10微克加λ0.8毫升COS-7細(xì)胞懸浮于PBS(-)濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液。得到的溶液應(yīng)用靜電容量為1500V和25μF的脈沖。室溫恢復(fù)10分鐘，電穿孔處理的細(xì)胞懸浮于添加2％Ultra LowIgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中，然后用10cm的培養(yǎng)皿在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，并離心除去細(xì)胞碎片。產(chǎn)物作為ELISA分析的樣品。
為實(shí)現(xiàn)人源化#23-57-137-1抗體的短暫表達(dá)，各質(zhì)粒組合hMBC1HcDNA/pCOS1或hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝a-t)以上述雜合抗體同樣的方式用Gene Pulser(Bio Rad)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。獲得的培養(yǎng)上清液作為ELISA分析的樣品。
其中，COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的雜合抗體或人源化抗體用AffiGel Protein A MAPSII試劑盒(Bio Rad)按照試劑盒上指示的方法進(jìn)行純化。
(6)ELISA分析(i)抗體濃度的確定確定抗體濃度的ELISA平板如下制備。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每個(gè)孔都用100μl添加1μg/毫升的山羊抗人IgG抗體(TAGO)的包被緩沖液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3)包被，然后用200μl稀釋緩沖液[50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％Tween20，0.02％NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH7.2]隔斷。每孔加入表達(dá)雜合抗體或人源化抗體的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者逐步稀釋的純化雜合抗體或人源化抗體溶液。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl堿性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗體(TAGO)。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的基質(zhì)溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(Bio Rad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。純化的HuIgGlλ(結(jié)合位點(diǎn))用作抗體濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品。
(ii)抗原結(jié)合能力的確定確定抗原結(jié)合能力的ELISA平板如下制備。用于ELISA(Maxisorp，NUNC)的96孔平板的每個(gè)孔均用100μl添加1μg/毫升人PTHrP(1-34)的包被緩沖液包被，然后用200μl稀釋緩沖液隔斷。每孔加入雜合抗體或人源化抗體得以表達(dá)的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者逐步稀釋的純化雜合抗體或人源化抗體溶液。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl堿性磷酸酶偶合山羊抗人IgG抗體(TAGO)。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的基質(zhì)溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(BioRad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。
(7)活性的確定(i)人源化H鏈的評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)包含人源化H鏈“a”型和嵌合L鏈的抗體表現(xiàn)與嵌合抗體(見(jiàn)圖5)同樣水平的PTHrP結(jié)合活性。該結(jié)果表明“a”型成功地實(shí)現(xiàn)了H鏈V區(qū)的人源化。因此，人源化H鏈“a”型用做下列實(shí)驗(yàn)中的人源化抗體H鏈。
(ii)雜合抗體的活性(ii-a)FR1、2/FR3、4雜合抗體當(dāng)L鏈為h/mMBC1Ld(λ)時(shí)，抗體不表現(xiàn)抗原結(jié)合活性。然而，當(dāng)雜合抗體的L鏈為m/hMBC1Laλ或m/hMBC1Ldλ時(shí)，抗體表現(xiàn)與嵌合#23-57-137-1抗體同樣水平的抗原結(jié)合活性(圖6)。這些結(jié)果表明FR3和FR4適于人源化抗體，但FR1和FR2存在需要的一些氨基酸殘基被替換。
(ii-b)FR1/FR2雜合抗體當(dāng)雜合抗體的L鏈為mhmMBC1L(λ)時(shí)，抗體不表現(xiàn)抗原結(jié)合活性。然而，當(dāng)雜合抗體的L鏈為hmmMBC1L(λ)時(shí)，抗體表現(xiàn)與嵌合#23-57-137-1抗體同樣水平的抗原結(jié)合活性(圖7)。這些結(jié)果表明FR1適于人源化抗體，但FR2存在需要的一些氨基酸殘基被替換。
(iii)人源化抗體的活性確定了每種“a”型到“t”型用做L鏈的人源化抗體的抗原結(jié)合活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有“j”，“l(fā)”，“m”，“o”，“q”，“r”，“s”和“t”型L鏈的人源化抗體表現(xiàn)與嵌合抗體同樣水平的PTHrP-結(jié)合活性(圖8-11)。
(8)CHO穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系的建立為建立人源化抗體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，上述表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞(DXB11)。
采用下列質(zhì)粒的組合作為CHO細(xì)胞的表達(dá)載體建立了人源化抗體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lmλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lqλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lrλ/pCOS1。質(zhì)粒用Gene Pulser(Bio Rad)通過(guò)電穿孔共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。隨后，每種表達(dá)載體用限制性酶PvuI裂解獲得線型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀。制備的DNA分別如下述進(jìn)行電穿孔。即，每種質(zhì)粒DNA各10微克加入0.8毫升包括COS-7細(xì)胞懸浮于PBS(-)濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液。得到的混合物應(yīng)用靜電容量為1500V和25μF的脈沖?；謴?fù)室溫10分鐘，電穿孔處理的細(xì)胞懸浮于添加10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培養(yǎng)基(GIBCO)中，然后用96孔平板(Falcon)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)當(dāng)天，用添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(硫酸G418；GIBCO)但無(wú)核糖核苷和脫氧核糖核苷的MEM-α選擇培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。從培養(yǎng)基中篩選導(dǎo)入抗體基因的細(xì)胞。用新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基后，培養(yǎng)之前和之后兩周，顯微觀察細(xì)胞。當(dāng)觀察到滿意的細(xì)胞生長(zhǎng)后，用如上述確定抗體濃度的常規(guī)ELISA分析法確定細(xì)胞產(chǎn)生的抗體量。選擇性收集大量產(chǎn)生抗體的那些細(xì)胞。
用添加2％Ultra Low IgG胎牛血清，無(wú)核糖核苷或脫氧核糖核苷的MEM-α培養(yǎng)基在搖瓶中大規(guī)模培養(yǎng)這樣建立的抗體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)后第3天和第4天收集培養(yǎng)基上清液，并用0.2μm的濾器(Millipore)過(guò)濾以除去其中的細(xì)胞碎片。CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的人源化抗體用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millopore)上按照包括于其中的指導(dǎo)進(jìn)行純化。該人源化抗體用做確定中和活性和檢查對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物藥理效能的樣品。用上述ELISA系統(tǒng)確定純化的人源化抗體的濃度和抗原結(jié)合活性。實(shí)施例4中和活性的確定鼠抗體、嵌合抗體和人源化抗體的中和活性的測(cè)定通過(guò)大鼠骨髓瘤細(xì)胞系ROS17/2.8-5細(xì)胞進(jìn)行。在CO2培養(yǎng)箱中，將ROS17/2.8-5細(xì)胞培養(yǎng)在添加10％胎牛血清(GIBCO)的Ham’s F-12培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度為104個(gè)細(xì)胞/100μl/孔，將ROS17/2.8-5細(xì)胞接種到用96孔平板的每孔中培養(yǎng)1天。培養(yǎng)基用添加4mM氫化可的松和10％胎牛血清的Ham’sF-12培養(yǎng)基(GIBCO)更換。培養(yǎng)三到四天后，培養(yǎng)細(xì)胞用260μl Ham’sF-12培養(yǎng)基(GIBCO)沖洗，然后其中加入80μl添加1mM異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，SIGMA)、10％胎牛血清和10mM HEPES的Ham’s F-12培養(yǎng)基。得到的混合物于37℃保溫30分鐘。
用于檢測(cè)中和活性的鼠抗體、嵌合抗體和人源化抗體預(yù)先按照下列各組逐步稀釋[10μg/毫升，3.3μg/毫升，1.1μg/毫升和0.37μg/毫升]，[10μg/毫升，2μg/毫升，0.5μg/毫升和0.01μg/毫升]和[10μg/毫升，5μg/毫升，1.25μg/毫升，0.63μg/毫升和0.31μg/毫升]。每種稀釋的抗體樣品溶液與等量4納克/毫升PTHrP(1-34)混合。80μl得到的混合溶液加入各孔。每種抗體的終濃度為上述抗體濃度的四分之一，因此PTHrP(1-34)的濃度成為1納克/毫升。室溫處理十分鐘后，除去培養(yǎng)上清液，殘留物用PBS沖洗三次。從產(chǎn)物中用10μl 0.3％HCl-95％乙醇提取細(xì)胞中的cAMP，然后水蒸汽吸收器蒸發(fā)除去HCl-乙醇。殘留物溶解于120μl吸附到cAMP EIA試劑盒(CAYMAN CHEMICAL’S)的EIA緩沖液中以提取其中的cAMP。用cAMP EIA試劑盒(CAYMAN CHEMICAL’S)按照其中指示的方法確定cAMP的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在具有與嵌合抗體表現(xiàn)同樣水平抗原結(jié)合活性的L鏈型的人源化抗體中，具有在91位酪氨酸被異亮氨酸取代的“q”，“r”，“s”和“t”型L鏈人源化抗體表現(xiàn)與嵌合抗體最接近的中和活性，尤其L鏈為“q”型的人源化抗體表現(xiàn)最強(qiáng)的中和活性(圖12-14)。實(shí)施例5對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物藥理效能的檢測(cè)(1)用高鈣血癥模型動(dòng)物(人腫瘤移植的裸鼠)，分別檢測(cè)了具有“m”，“r”和“q”型L鏈的抗PTHrP嵌合抗體和人源化抗體對(duì)高鈣血癥的治療效能。
移植人胰腺癌PAN-7的裸鼠[從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)]用做高鈣血癥模型動(dòng)物。已知移植人胰腺癌PAN-7的裸鼠隨腫瘤體積的增加表現(xiàn)血鈣濃度的增加，并形成與體重和自發(fā)活性(例如)降低有關(guān)的高鈣血癥。該實(shí)施例中，本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體對(duì)人胰腺癌PAN-7誘導(dǎo)的高鈣血癥治療效能通過(guò)受測(cè)動(dòng)物的體重和血鈣濃度測(cè)定而檢測(cè)。
利用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)體內(nèi)移植人胰腺癌PAN-7。為評(píng)價(jià)藥理效能，購(gòu)買(mǎi)了5周大的雄性BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)，然后使它們適應(yīng)一周，這樣，六周大的鼠用于上述評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。制備高鈣血癥模型鼠并將它們按照下列方式分組。切下人胰腺癌PAN-7，并精切成3mm的立方體。得到的腫瘤塊移植到鼠皮瓣下，每只鼠移植一塊。移植后兩或三周，當(dāng)確定每只鼠的腫瘤體積都足夠大時(shí)，將鼠按照腫瘤體積、血鈣濃度、和體重平均分組，這樣鼠被用做高鈣血癥模型動(dòng)物。
對(duì)高鈣血癥治療效能的檢測(cè)如下進(jìn)行。具有“m”或“r”型L鏈的抗PTHrP嵌合抗體或人源化抗體給上述每只高鈣血癥模型鼠的尾靜脈分別以單劑量10或30μg/鼠給藥。具有“q”型L鏈的人源化抗體單劑量給上述每只高鈣血癥模型鼠的尾靜脈以劑量20或60μg/鼠給藥。給藥后第1天、第4天、第7天和第11天分別測(cè)量每只鼠的血鈣濃度和體重以評(píng)價(jià)抗體的治療效能。腫瘤體積通過(guò)測(cè)量腫瘤的最大直徑(a mm)和最小直徑(b mm)并且按照Galant’s計(jì)算式[ab2/2]計(jì)算兩次測(cè)量值確定。血鈣濃度用血細(xì)胞比容管從每只鼠眼眶取血，并加到643自動(dòng)Ca2+/pH分析儀(CIBA-CORNING)測(cè)定全血鈣離子濃度作為血鈣濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有“m”，“r”和“q”型L鏈的嵌合抗體和人源化抗體對(duì)受試體給藥導(dǎo)致體重和血鈣濃度的變化迅速改善以及延長(zhǎng)期滯留的增加。該結(jié)果表明本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體可用于治療高鈣血癥相關(guān)惡性腫瘤(見(jiàn)圖15和16)。實(shí)施例6對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物藥理效能的檢測(cè)(2)利用高鈣血癥模型動(dòng)物(人腫瘤移植的裸鼠)如下述檢測(cè)了具有“q”型L鏈的抗PTHrP嵌合抗體和人源化抗體對(duì)高鈣血癥的治療效能。
對(duì)高鈣血癥的治療效能如下檢測(cè)。具有“q”型L鏈的抗PTHrP嵌合抗體或人源化抗體的單劑量給上述每只高鈣血癥模型鼠的尾靜脈以劑量10或30μg/鼠給藥。給藥后第1天、第3天、第7天和第11天分別測(cè)量每只鼠的血鈣濃度和體重以評(píng)價(jià)抗體的治療效能。用血細(xì)胞比容管從每只鼠眼眶取血，并用643自動(dòng)Ca2+/pH分析儀(CIBA-CORNING)測(cè)定全血鈣離子濃度作為血鈣濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有“q”型L鏈的嵌合抗體和人源化抗體對(duì)攜帶人胰腺癌PAN-7的高鈣血癥模型動(dòng)物給藥導(dǎo)致受體體重和血鈣濃度的迅速改善以及延長(zhǎng)期保留的增加。該結(jié)果表明本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體是治療高鈣血癥相關(guān)惡性腫瘤的有效藥物(見(jiàn)圖17)。實(shí)施例7對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物藥理效能的檢測(cè)(3)通過(guò)高鈣血癥模型動(dòng)物(人肺癌LC-6移植的裸鼠)，檢測(cè)了具有“q”型L鏈的抗PTHrP嵌合抗體和人源化抗體對(duì)高鈣血癥的治療效能。
該實(shí)驗(yàn)中，移植了人肺癌LC-6移植的裸鼠(購(gòu)買(mǎi)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)用作高鈣血癥模型動(dòng)物。移植了已知人肺癌LC-6移植的裸鼠傾向于隨腫瘤體積的增加表現(xiàn)血鈣濃度隨之增加，并形成與體重和自發(fā)活性有關(guān)的高鈣血癥。
該實(shí)施例中，通過(guò)測(cè)量受試動(dòng)物體重和血鈣濃度來(lái)檢測(cè)本發(fā)明嵌合抗體和人源化抗體對(duì)人肺癌LC-6誘導(dǎo)的高鈣血癥的治療效能。
用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)體內(nèi)移植人肺癌株系LC-6。購(gòu)買(mǎi)了5周大的雄性BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Charles River)用于評(píng)價(jià)藥理效能，然后使它們適應(yīng)一周，因此該實(shí)驗(yàn)使用了六周大的鼠。
制備高鈣血癥模型鼠并將它們按照下列方式分組。切下移植的人肺癌LC-6，并精切成3mm的立方體。得到的腫瘤塊皮下移植到鼠皮瓣下，每只鼠移植一塊。移植后兩或三周，當(dāng)確定每只鼠的腫瘤體積都足夠大時(shí)，將鼠按照腫瘤體積、血鈣濃度、和體重平均分組，這樣處理的鼠被用做高鈣血癥模型動(dòng)物。
對(duì)高鈣血癥治療效能進(jìn)行如下檢測(cè)。單劑量的具有“q”型L鏈抗PTHrP的嵌合抗體或人源化抗體給上述每只高鈣血癥模型鼠的尾靜脈分別以10或30μg/鼠劑量給藥。給藥后第1天、第3天、第6天和第10天分別測(cè)量每只鼠的血鈣濃度和體重以評(píng)價(jià)抗體的治療效能。血鈣濃度用血細(xì)胞比容管從每只鼠眼眶取血，并用643自動(dòng)Ca2+/pH分析儀(CIBA-CORNING)測(cè)定全血鈣離子濃度作為血鈣濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有“q”型L鏈的嵌合抗體和人源化抗體對(duì)攜帶人肺癌LC-6的高鈣血癥模型動(dòng)物給藥導(dǎo)致受體體重和血鈣濃度的迅速改善以及延長(zhǎng)期保留的增加。該結(jié)果表明本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體是治療高鈣血癥相關(guān)惡性腫瘤的有效藥物(見(jiàn)圖18)。實(shí)施例8利用BIACORE分析PTHrP和抗-PTHrP抗體之間相互作用的動(dòng)力學(xué)該實(shí)驗(yàn)中，利用BIACORE分析抗原-抗體相互作用的動(dòng)力學(xué)。PTHrP(1-34+Cys)用做抗原，其C-末端特異地吸附到傳感器頂端。各種濃度的純化抗體用做被分析物。從獲得的傳感圖計(jì)算動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(結(jié)合率常數(shù)“kass”和解離率常數(shù)“kdiss”)。動(dòng)力學(xué)分析中參考了文獻(xiàn)“基于新型生物傳感器的分析體系的單克隆抗體-抗原相互作用的動(dòng)力學(xué)分析”，Karlsson，R等，(1991)，免疫學(xué)方法雜志，145，p.229-240。
(1)PTHrP(1-34+C)固定到傳感器頂端PTHrP(1-34+C)吸附到傳感器頂端CM5(Pharmacia)。
使用HBS(10mM HEPES，pH7.4；0.15M NaCl；3.4mM EDTA；0.005％表面活性劑P20)作為流動(dòng)緩沖液，流速5μl/分鐘。注射100μl0.05M N-羥基丁二酰亞胺(NHS)/0.2M N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和100μl 80mM 2-(2-吡啶二硫)乙酰胺(PDEA)/0.1M硼酸鹽緩沖液(pH8.5)，激活傳感器頂端CM5上羧甲基葡聚糖的羰基，另外注射10μl 5μg/毫升的PTHrP(1-34+C)/10mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)，使得所述羰基特異吸附到PTHrP(1-34+C)C-末端的半胱氨酸殘基上。隨后，注射100μl 50mM(L)-半胱胺酸/1M NaCl/0.1M甲酸鈉緩沖液(pH4.3)以封閉過(guò)量的活化基團(tuán)。隨后，注射10μl 0.1M甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.5)和10μl 10mMHCl以沖洗具有非共價(jià)結(jié)合的基質(zhì)。固定的PTHrP(1-34+C)的量為226.4RU(共振單位)(圖19)。
(2)免疫接種的PTHrP(1-34+C)和純化的鼠抗PTHrP抗體之間的相互作用使用HBS作為流動(dòng)緩沖液，流速為20μl/分鐘。將抗體生成雜交瘤注射到Balb/c鼠的腹腔，兩周后收集腹水，加樣到用于純化抗體的蛋白A柱。純化的#23-57-137-1抗體指定為“MBC”，純化的3F5抗體指定為“3F5”。這些抗體用HBS稀釋到1.25,2.5,5,10和20μg/毫升一系列濃度。
分析中，注射40μl抗體溶液兩分鐘以得到結(jié)合相，然后注射HBS兩分鐘以得到解離相。完全解離后，注射10μl 10mM HCl恢復(fù)傳感器頂端。結(jié)合-解離-恢復(fù)作為一個(gè)循環(huán)，注射各種抗體溶液獲得傳感圖進(jìn)行分析。
(3)固定化PTHrP(1-34+C)和純化的人源化抗PTHrP抗體之間的相互作用使用HBS作為流動(dòng)緩沖液，流速為20μl/分鐘?？贵w由CHO細(xì)胞制備，用蛋白A柱純化。純化的嵌合抗體指定為“chMBC”，純化的m和q型人源化抗體分別指定為“hMBCm”和“hMBCq”，這些抗體用HBS稀釋到1.25，2.5，5，10和20μg/毫升一系列濃度。
分析中，注射40μl抗體溶液兩分鐘以得到結(jié)合相，然后注射HBS兩分鐘以得到解離相。完全解離后，注射10μl 10mM HCl恢復(fù)傳感器頂端。結(jié)合-解離-恢復(fù)作為一個(gè)循環(huán)，注射各種抗體溶液獲得傳感圖進(jìn)行分析。
(4)相互作用的動(dòng)力學(xué)分析記錄感興趣的數(shù)據(jù)，通過(guò)覆蓋感興趣的反應(yīng)區(qū)比較反應(yīng)模式(圖20-24)。在附圖20-24各圖中，從上到下的連續(xù)線表示抗體濃度為1.25，2.5，5，10和20μg/毫升的數(shù)據(jù)。另外，通過(guò)特別為BIACORE設(shè)計(jì)的分析軟件“BIAevaluation 2.1”(Pharmacia)進(jìn)行相互作用的動(dòng)力學(xué)分析，其能夠通過(guò)曲線切割計(jì)算動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(結(jié)合率常數(shù)“kass”和解離率常數(shù)“kdiss”)(表4和5)。
表4MBC和3F5的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

表5嵌合抗體和人源化抗體的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

該實(shí)驗(yàn)中，為確定結(jié)合率常數(shù)，使用了分析模型4(BIAevaluation2.1軟件手冊(cè)，A1-A5)。實(shí)施例9惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型中磷分泌的抑制惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥(HHM)是PTHrP出現(xiàn)而導(dǎo)致的疾病，己知PTHrP加速骨重吸收和腎臟及輸尿管對(duì)鈣的重吸收，導(dǎo)致形成高鈣血癥。另一方面，就磷而言，PTHrP抑制腎臟和輸尿管對(duì)磷的重吸收，導(dǎo)致形成排泄作用，因此臨床HHM病人經(jīng)常形成低磷血癥。其中，利用惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型鼠檢測(cè)了人源化抗-PTHrP抗體對(duì)腎臟磷排泄的影響。
移植人肺癌LC-6的裸大鼠(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi))用做模型動(dòng)物。已知皮下移植人肺癌LC-6的裸大鼠傾向于血鈣濃度增加及腫瘤體積的增大，結(jié)果，大鼠形成與，例如體重和自發(fā)活性降低，有關(guān)的高鈣血癥。利用這種動(dòng)物模型，基于下述磷酸鹽部分排泄的腎清除率法檢測(cè)了本發(fā)明的人源化抗PTHrP抗體對(duì)腎臟磷排泄的影響。
利用BALB/c-nu/nu裸大鼠(Nippon Kurea)進(jìn)行體內(nèi)人肺癌LC-6的移植。購(gòu)買(mǎi)五周大的雄性F344N/Jcl-rnu裸大鼠(Nippon Kurea)，使它們適應(yīng)一周，這些六周大的大鼠用于評(píng)價(jià)藥理效能。
惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型動(dòng)物如下制備。切下移植的人肺癌LC-6，精切成3mm的立方塊。得到的腫瘤塊皮下移植到鼠皮瓣下，每鼠一塊。移植后約三十天，確定每只鼠的腫瘤體積已經(jīng)足夠大(3000mm3)，基于血鈣濃度和體重選擇可以用作惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型動(dòng)物的大鼠。
腎清除率法檢查磷排泄如下進(jìn)行。
(1)腎清除法用戊巴比妥(Nembutal，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd)麻醉惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型動(dòng)物，仰臥固定在37℃的保溫墊上，膀胱插入套管以收集尿(聚乙烯管，PE50，NipponBeckton Dickinson)。隨后，在模型動(dòng)物的股靜脈插入灌注管(聚乙烯管，PE50，Nippon BecktonDickinson)，然后用灌注泵(Temfusion注射泵STC-525；TERUMO)通過(guò)灌注管向模型動(dòng)物導(dǎo)入灌注液(0.7％菊粉，5％甘露醇，0.2％戊巴比妥，0.9％氯化鈉)，流速為2毫升/小時(shí)。平衡50分鐘后，通過(guò)套管20分鐘收集尿液5次(即，1期-5期)，得到尿樣。每次收集尿的中間時(shí)間點(diǎn)，用肝素處理的注射器從模型動(dòng)物的右頸靜脈收集約0.25毫升的血樣。
(2)抗體的給藥上述清除率檢測(cè)中，在收集尿液2期剛開(kāi)始的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物靜脈注射人源化抗-PTHrP抗體，劑量為1毫克/毫升/千克。
(3)尿和血中菊粉和磷濃度的確定測(cè)量1期和5期獲得的尿樣的體積，然后測(cè)定它們的菊粉和磷濃度。上述獲得的血樣低溫離心，獲得血漿樣品，用于測(cè)定菊粉和磷濃度。通過(guò)硫酸-蒽酮法(Roe，L等，生物化學(xué)雜志178，839-845，1949)測(cè)定菊粉的濃度，用無(wú)機(jī)磷測(cè)定試劑--Autosera IP(Daiichi PureChemicals)通過(guò)7170型Hitachi自動(dòng)分析儀按照手冊(cè)(Physke-Sabaroh法)測(cè)定磷濃度。
(4)菊粉清除率、磷清除率和磷部分排泄的計(jì)算按照下列公式計(jì)算菊粉清除率(Cin)，磷清除率(Cp)和磷相對(duì)排泄率(FEp)。
菊粉清除率(Cin)的計(jì)算Cin=Uin V/Pin其中Cin代表菊粉清除率(毫升/千克/分鐘)；Uin代表尿中菊粉的濃度(毫克/毫升)；V代表單位時(shí)間尿量(毫升/千克/分鐘)；Pin代表血中菊粉的濃度(毫克/毫升)。
磷清除率(Cp)的計(jì)算Cp=Up V/Pp其中Cp代表磷清除率(毫升/千克/分鐘)；Up代表尿中磷的濃度(毫克/毫升)；V代表單位時(shí)間尿量(毫升/千克/分鐘)；Pp代表血中磷濃度(毫克/毫升)。
磷相對(duì)排泄率(FEp)的計(jì)算FEp=Cp/Cin其中FEp代表磷相對(duì)排泄率；Cin代表菊粉的清除率；Cp代表磷清除率。用四只動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
磷組分排泄率和血液中磷濃度的結(jié)果顯示于圖25和26。
圖25說(shuō)明磷相對(duì)組分排泄率(=磷清除率/菊粉清除率)隨清除時(shí)間(1期=20分鐘)的變化關(guān)系。人源化抗-PTHrP抗體(1毫克/千克)在2期的開(kāi)始給藥(靜注)。
圖26說(shuō)明血漿磷濃度隨清除時(shí)間(1期=20分鐘)的變化關(guān)系。人源化抗-PTHrP抗體(1毫克/千克)在2期的開(kāi)始給藥(靜注)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用抗體給藥后(即，2期和5期)得到的磷組分排泄率與使用抗體前(即，1期)得到的磷相對(duì)排泄率相比明顯被抑制。換句話說(shuō)，發(fā)現(xiàn)對(duì)形成低磷血癥(導(dǎo)致磷加速排泄，F(xiàn)Ep＞0.2)的個(gè)體使用中和抗體給藥，使受體磷的重吸收大致恢復(fù)到正常水平(磷重吸收分?jǐn)?shù)=1-FEp＞0.8％)，結(jié)果觀察到個(gè)體血磷濃度趨向正常。該結(jié)果表明本發(fā)明抗體可以作為治療磷加速排泄和PTHrP導(dǎo)致的低磷血癥的有效治療藥物。
因?yàn)镻THrP是導(dǎo)致惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥的物質(zhì)，預(yù)示PTHrP可能促進(jìn)磷排泄和降低組織中的高能有機(jī)磷。因此，各種與低磷血癥相關(guān)的疾病，例如低磷性佝僂病和低磷性抗維生素D佝僂病，認(rèn)為主要由磷經(jīng)由尿排泄的增加導(dǎo)致，因此本發(fā)明的抗體也會(huì)對(duì)治療這類疾病有效。實(shí)施例10各種惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥的臨床癥狀的改善已知惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥是由于腫瘤產(chǎn)生了PTHrP，并且PTHrP加速骨重吸收以及腎臟和輸尿管對(duì)鈣的重吸收(導(dǎo)致高鈣血癥)而導(dǎo)致。另外，觀察到高鈣血癥病人臨床癥狀惡化，例如不良性能狀態(tài)，意識(shí)低下，系統(tǒng)系不適，飲水習(xí)性，惡心和嘔吐(厭食)。用人腫瘤裸家鼠移植系統(tǒng)和人腫瘤裸鼠移植系統(tǒng)的高鈣血癥模型動(dòng)物檢測(cè)了抗-PTHrP抗體對(duì)這些臨床癥狀的影響。
人肺癌LC-6移植的裸家鼠和裸大鼠(購(gòu)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)作為高該血癥模型動(dòng)物。移植人肺癌LC-6的裸家鼠和裸大鼠傾向于表現(xiàn)血鈣濃度的增加和腫瘤體積的增加，其導(dǎo)致高鈣血癥相關(guān)的體溫和體重降低。
用人肺癌LC-6裸家鼠移植系統(tǒng)檢測(cè)了鼠抗-PTHrP抗體對(duì)惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥一般臨床癥狀的改善作用，結(jié)果用照片顯示。用人肺癌LC-6裸家鼠移植系統(tǒng)檢測(cè)了抗體對(duì)自發(fā)活性和體溫的降低以及厭食的改善作用。
1.高鈣血癥的表觀臨床癥狀的改善利用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Kurea)體內(nèi)移植人肺癌株系LC-6。購(gòu)買(mǎi)五周大的雄性BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Kurea)，使它們適應(yīng)一周，這些六周大的鼠用于評(píng)價(jià)藥理效能。
制備高鈣血癥模型鼠，并將它們按下列方式分組。切下移植的人肺癌LC-6，精切成3mm的立方塊。得到的腫瘤塊皮下方式移植到鼠皮瓣下，每鼠一塊。移植后約二十七天，確定每只鼠的腫瘤體積已經(jīng)足夠大時(shí)，按照鼠的腫瘤體積、血鈣濃度和體重將鼠平均分組，然后鼠用做高鈣血癥模型動(dòng)物。
通過(guò)測(cè)量腫瘤的最大直徑(a mm)和最小直徑(b mm)并且用這兩個(gè)測(cè)量值按照Galant’s計(jì)算式[ab2/2]計(jì)算確定腫瘤體積。
用血細(xì)胞比容管從每只鼠眼眶取血，并用643自動(dòng)Ca2+/pH分析儀(CIBA-CORNING)測(cè)定全血鈣離子濃度作為血鈣濃度。
抗體對(duì)高鈣血癥治療效能的檢測(cè)按照下列方式進(jìn)行。給上述每只高鈣血癥模型動(dòng)物在移植腫瘤后第27,30,34,37天經(jīng)尾靜脈注射鼠抗PTHrP抗體，劑量為每只鼠100μg。磷酸鹽緩沖的生理鹽水代替該抗體按照同樣方式給藥，用于制備對(duì)照。移植腫瘤后第41天，從使用抗體給藥組和對(duì)照組分別選擇一只典型的鼠，連同一只正常鼠拍照。
結(jié)果是，對(duì)于一只移植了人肺癌LC-6的高鈣血癥模型動(dòng)物，雖然使用抗體給藥鼠(如圖27和28的中圖所示)與對(duì)照鼠(如圖27和28的右圖所示)相比具有同樣水平的腫瘤塊，但它們表現(xiàn)與正常鼠(如圖27和28的作圖所示)同樣水平的表觀。該結(jié)果表明抗PTHrP抗體的給藥改善了表觀臨床癥狀(圖27和28)。
2.高鈣血癥相關(guān)自發(fā)活性降低的改善利用BALB/c-nu/nu裸鼠(Nippon Kurea)體內(nèi)移植人肺癌LC-6。購(gòu)買(mǎi)五周大的雄性F344/NJcl-run裸大鼠(Nippon Kurea)，使它們適應(yīng)一周，這些六周大的大鼠用于評(píng)價(jià)藥理效能。
按照下列方式制備高鈣血癥模型動(dòng)物。切下移植的人肺癌LC-6，精切成3mm的立方塊。得到的腫瘤塊皮下方式移植到鼠皮瓣下，每鼠一塊。移植后約三十天，確定每只鼠的腫瘤體積已經(jīng)足夠大時(shí)，按照鼠的腫瘤體積、血鈣濃度和體重將鼠平均分組，然后鼠用做高鈣血癥模型動(dòng)物。
用血細(xì)胞比容管從每只鼠眼眶取血，并用643自動(dòng)Ca2+/pH分析儀(CIBA-CORNING)測(cè)定全血鈣離子濃度作為血鈣濃度。
(1)確定自發(fā)活性的方法用SE型ANIMEX活性計(jì)量器(FARAD，Electronics，Sweden)確定自發(fā)活性，該裝置放置在各單獨(dú)飼養(yǎng)(水和食物)的模型動(dòng)物的聚乙烯籠中的預(yù)測(cè)定位置。該裝置設(shè)計(jì)為測(cè)量每只大鼠的運(yùn)動(dòng)量。通過(guò)這種裝置，運(yùn)動(dòng)量記錄為一定時(shí)間段的次數(shù)。該測(cè)量進(jìn)行13小時(shí)(從某一天晚7點(diǎn)到第二天早8點(diǎn))，結(jié)果記作次/小時(shí)。
(2)抗體的給藥對(duì)上述制備的形成高鈣血癥的每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射人源化抗-PTHrP抗體(劑量為5毫克/0.5毫升/千克)作為對(duì)照。對(duì)另一組大鼠以同樣方式注射鹽水。給藥的抗體鼠和對(duì)照鼠輪流進(jìn)行測(cè)量。
第0(即，給藥抗體的前一天)，2，4，7和14天對(duì)給藥的抗體鼠進(jìn)行測(cè)量，第1，3，5，8和15天對(duì)對(duì)照鼠進(jìn)行測(cè)量。
結(jié)果，檢測(cè)期間對(duì)照大鼠沒(méi)有表現(xiàn)自發(fā)活性的變化或降低，而使用抗體鼠給藥第4天后表現(xiàn)自發(fā)活性的增加(圖29)。
3.高鈣血癥相關(guān)體溫降低的改善人肺癌LC-6的移植和惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型動(dòng)物的制備如上述步驟2同樣的方式進(jìn)行。
(1)體溫測(cè)量方法用戊巴比妥(Nembutal，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)麻醉動(dòng)物，直腸插入溫度傳感器，通過(guò)數(shù)字溫度儀測(cè)量體溫。
(2)抗體的給藥對(duì)上述每只高鈣血癥模型大鼠經(jīng)尾靜脈注射人源化抗-PTHrP抗體，劑量為1毫克/毫升/千克。對(duì)另一些模型大鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水作為對(duì)照。另外，也測(cè)量了沒(méi)有使用抗體給藥的正常大鼠的體溫。分別對(duì)所有使用抗體大鼠、對(duì)照鼠和正常鼠在給藥的第0天(即，給藥當(dāng)天)，1，2天和3天之后測(cè)量體溫。
結(jié)果是，測(cè)量期間正常鼠沒(méi)有表現(xiàn)體溫變化(34.2-34.4℃)，而惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型大鼠比正常大鼠體溫降低約2℃。當(dāng)對(duì)模型大鼠使用人源化抗-PTHrP抗體給藥后，惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型大鼠降低的體溫明顯恢復(fù)到給藥后三天的正常鼠體溫的同樣水平。這些結(jié)果表明本發(fā)明的人源化抗PTHrP抗體對(duì)惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型動(dòng)物體溫降低有明顯的改善作用(圖30)。
4.對(duì)誘導(dǎo)的食物攝取減少的改善人肺癌LC-6的移植和高鈣血癥模型動(dòng)物的制備如上述第2節(jié)描述的同樣方式進(jìn)行。制備的模型動(dòng)物按照血鈣濃度和體重平均分組，這樣的鼠用于下述實(shí)驗(yàn)。
(1)食物攝取的量的測(cè)量檢測(cè)期間，大鼠單獨(dú)放置于新陳代謝籠，飼喂水和食物。對(duì)每只大鼠，攝取量確定為24小時(shí)的食物量(g)(從某一天早9時(shí)到第二天早9時(shí))。測(cè)量第一天早9時(shí)和第二天早9時(shí)的飼料罐總重，計(jì)算二者的重量差以確定食物攝取量。
(2)抗體的給藥對(duì)上述每只高鈣血癥模型大鼠(HHM鼠)經(jīng)尾靜脈注射人源化抗-PTHrP抗體，劑量為5毫克/0.5毫升/千克。對(duì)對(duì)照組每只動(dòng)物以同樣方式經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。對(duì)每只正常大鼠也以同樣方式經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。在第0天(即，給藥前一天到給藥當(dāng)天的時(shí)間段)，第1天(即，給藥當(dāng)天到第二天的時(shí)間段)，第3天(即，給藥后第三天到第四天的時(shí)間段)和第5天(即，給藥后第5天到第6天的時(shí)間段)對(duì)所有使用抗體鼠、對(duì)照鼠和正常大鼠測(cè)量食物攝取量。
結(jié)果是，使用抗體給藥前，高鈣血癥模型大鼠(5-9只大鼠)的攝取量平均為8.11g，而正常大鼠平均為12.06g，這表明高鈣血癥模型大鼠攝取量明顯減少。當(dāng)對(duì)模型大鼠使用人源化抗PTHrP抗體后，給藥抗體后當(dāng)天及其后，雖然對(duì)照大鼠的攝取量沒(méi)有觀察到變化，但是給藥抗體鼠的攝取量恢復(fù)到正常鼠的水平。這些結(jié)果表明本發(fā)明的人源化抗PTHrP抗體對(duì)惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型動(dòng)物攝取量降低有明顯改善作用(表6)。
表6對(duì)攝食的影響

*使用鹽水給藥0.5毫升/千克，經(jīng)尾靜脈；使用抗體給藥5毫克/0.5毫升/千克，經(jīng)尾靜脈。
上述結(jié)果論證了本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體可以作為改善惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥的各種臨床癥狀的有效藥物。
5.高鈣血癥導(dǎo)致的血液pH值降低的改善人肺癌LC-6的移植和惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥模型動(dòng)物的制備如上述第2步同樣的方式進(jìn)行。模型動(dòng)物按照血鈣濃度和體重平均分組。
(1)血液pH的測(cè)定通過(guò)心臟采血技術(shù)用肝素處理的注射器對(duì)每只待檢動(dòng)物采血，然后將取到的血樣應(yīng)用于643Ca2+/pH自動(dòng)分析儀(CIBA-CORNING)以測(cè)定血樣的pH值。
(2)抗體的給藥對(duì)上述每只高鈣血癥模型大鼠(HHM大鼠)經(jīng)尾靜脈注射人源化抗-PTHrP抗體，劑量為5毫克/0.5毫升/千克(n=3)。對(duì)對(duì)照組每只動(dòng)物(n=2)以同樣方式經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。在第0天(即，給藥當(dāng)天)，第1天和第7天對(duì)所有使用抗體大鼠和對(duì)照鼠測(cè)量血液pH值。
結(jié)果是，使用抗體給藥前，高鈣血癥模型大鼠得到的血液pH值約為7.49(而正常大鼠為7.40±0.02)，這意味著模型大鼠明顯形成代謝性堿中毒。當(dāng)對(duì)模型大鼠使用本發(fā)明的人源化抗PTHrP抗體后，雖然對(duì)照大鼠的血液pH值幾乎無(wú)變化，但是使用抗體給藥鼠的血液pH值恢復(fù)到接近使用抗體后七天正常鼠的血液pH值。代謝性堿中毒作為惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥(HHM)的臨床癥狀之一已有報(bào)道，由于腎臟碳酸氫根離子(HCO3-)排泄的抑制導(dǎo)致該癥狀。因?yàn)槭褂帽景l(fā)明的人源化抗-PTHrP抗體可以使高鈣血癥模型動(dòng)物的血液pH值達(dá)到正常，表明該抗體可以改善HHM中發(fā)現(xiàn)的代謝性堿中毒(圖31)。
上述結(jié)果論證了本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體可以作為改善惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥的臨床癥狀的有效藥物。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了抗PTHrP嵌合抗體和人源化抗體。這些抗體對(duì)人具有低抗原性，因此可以作為治療高鈣血癥、低磷血癥等的有效藥物。
序列表(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO1AAATAGCCCT TGACCAGGCA20(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”
(xi)序列描述SEQ ID NO2CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO3CGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG28(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”
(xi)序列描述SEQ ID NO4GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA29(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO5GTTTTCCCAG TCACGAC17(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”
(xi)序列描述SEQ ID NO6CAGGAAACAG CTATGAC17(2)SEQID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO7GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C 31(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”
(xi)序列描述SEQ ID NO8TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA30(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO9GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG36(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”
(xi)序列描述SEQ ID NO10TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G41(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度109個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO11GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC 60CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT109(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度110個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”
(xi)序列描述SEQ ID NO12GGTTTGGTGGTCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCACT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60ACAGCTCCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT 110(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO13GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 60CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG 98(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度106個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO14TGGTGAATTC TTACTATCGAA CATTCTGTAG GGGCCCCTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60CATGCGTGAC CTGGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC106(2)SEQID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO15GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC43(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO16TGTTGAATTC TTACTATGAA20(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO17CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC39(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO18GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA39(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO19GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC 46(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO20TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA34(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO21GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT35(2)SEQIDNO22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO22TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC 48(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度128個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO23GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA 60GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG 120TCCCTGAG 128(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度125個(gè)堿基列(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO24ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC 60ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG 120GACAC 125(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度132個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO25CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC 60CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120CTCCCAGGCT GG 132(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度110個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO26TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG110(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO27GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG30(2)SEQ ID NO28的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO28TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG30(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度133個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO29ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTCGGAGCCT 120CGGTCAAGCT CAC133(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO30AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度128個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO31CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC 60TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC 120GAGGCTCC 128(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度114個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO32CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO33ACAAAGCTTC CACCATG17(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO34CTTGGATCCG GGCTGACCT19(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO35CTTGGATCCGGGCTGACCA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCCGCCGAACA 60CGTACACAAA TTGTTCCTTTA ATTGT 75(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO36AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCCTCT CTG43(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO37ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCCTGAGGA 46(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度111個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO38CTTGGATCC GGGCTGACCTA GGACCGTCAG TTTCGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C 111(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO39CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT 42(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQID NO40CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG26(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明；/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO41GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA35(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO42CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG35(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO43GGCTTGGAGC TCCTCAGA18(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)說(shuō)明/desc＝“合成DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO44GACAGTGGTT CAAAGTTTTT20(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO45Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg65 70 75Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO46Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp80 85 90Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe95 100 105Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala110 115(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度116個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO47Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly110 115(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO48Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO49Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp
50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO50Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO51Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2) SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO52Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO53的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO53Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Mer Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO54的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO54Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO55的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO55Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO56的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO56Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly1 5 10 15Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75Lys Ash Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe95 100 105Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115(2)SEQ ID NO57的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO57ATG AAC TTC GGG CTC ACC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys-15 -10 -5GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu1 5 10GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
15 20 25TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro30 35 40GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser45 50 55TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser60 65 70AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu75 80 85AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr90 95 100ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 405Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val105 110 115TCT GCA 411Ser Ala(2)SEQ ID NO58的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO58ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg-15 -10 -5GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val1 5 10GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly15 20 25TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro30 35 40GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser45 50 55TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser60 65 70AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu75 80 85AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr
90 95 100ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val105 110 115TCC TCA 411Ser Ser(2)SEQ ID NO59的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO59Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala15 10(2)SEQ ID NO60的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO60Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr15(2)SEQ ID NO61的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO61Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr15(2)SEQ ID NO62的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO62Pro Tyr Trp Met Gln1 5(2)SEQ ID NO63的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO63Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO64的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO64Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO65的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNAATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG GTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser1 5 10TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu30 35 40AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT 315Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp75 80 85GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAT GTT TTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO66的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度405個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO66ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln
90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115(2)SEQ ID NO67的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO67ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TGG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO68的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO68ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO69的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO69ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys GGln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO70的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO70ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO71的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO71ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO72的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO72ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO73的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO73ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gin Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO74的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)序列描述SEQ ID NO74ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO75的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO75Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu20 25 30Ile His Thr Ala
權(quán)利要求
1.包含人抗體L鏈C區(qū)和鼠抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白單克隆抗體L鏈V區(qū)的嵌合L鏈。
2.按照權(quán)利要求1的嵌合L鏈，其中L鏈V區(qū)包括如SEQ ID NO45所示的氨基酸序列。
3.按照權(quán)利要求1的嵌合L鏈，其中C區(qū)是Cλ鏈。
4.包含人抗體H鏈C區(qū)和鼠抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白單克隆抗體H鏈V區(qū)的嵌合H鏈。
5.按照權(quán)利要求4的嵌合H鏈，其中H鏈V區(qū)包括如SEQ ID NO46所示的氨基酸序列。
6.按照權(quán)利要求4的嵌合H鏈，其中C區(qū)是Cγ1鏈。
7.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的嵌合單克隆抗體，包含權(quán)利要求1-3之一的嵌合L鏈和權(quán)利要求4-6之一的嵌合H鏈。
8.包含人源化抗體L鏈V區(qū)的多肽，其具有人抗體L鏈V區(qū)的框架區(qū)1-4和鼠抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白單克隆抗體L鏈V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)1-3。
9.按照權(quán)利要求8的多肽，其中互補(bǔ)決定區(qū)1-3分別包括如SEQ IDNO59-61所示的氨基酸序列。
10.按照權(quán)利要求8所示多肽，其中所述框架區(qū)1-3分別來(lái)源于人抗體HSU03868框架區(qū)1-3，所述框架區(qū)4來(lái)源于人抗體S25755的框架區(qū)4。
11.按照權(quán)利要求8的多肽，其中所述框架區(qū)1-3基本上分別與人抗體HSU03868框架區(qū)1-3相同，所述框架區(qū)4基本上與人抗體S25755的框架區(qū)4相同。
12.按照權(quán)利要求8的多肽，其中框架區(qū)按照Kabat定義的36位和49位氨基酸分別為酪氨酸和天冬氨酸。
13.按照權(quán)利要求12的多肽，包括如SEQ ID NO48-51之一所示的氨基酸序列。
14.按照權(quán)利要求8的多肽，其中框架區(qū)按照Kabat定義的45位和87位氨基酸分別為賴氨酸和異亮氨酸。
15.按照權(quán)利要求14的多肽，包括如SEQ ID NO52-55之一所示的氨基酸序列。
16.包含人源化抗體H鏈V區(qū)的多肽，其具有人抗體H鏈V區(qū)的框架區(qū)1-4和抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白鼠單克隆抗體H鏈V區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)1-3。
17.按照權(quán)利要求16的多肽，其中互補(bǔ)決定區(qū)1-3分別包括如SEQID NO62-64所示的氨基酸序列。
18.按照權(quán)利要求16的多肽，其中所述框架區(qū)1-4來(lái)源于人亞群III的人抗體的框架區(qū)1-4。
19.按照權(quán)利要求16的多肽，其中所述框架區(qū)1-4分別來(lái)源于人抗體S31679的框架區(qū)1-4。
20.按照權(quán)利要求16的多肽，其中所述框架區(qū)1-4基本上分別與人抗體S31679的框架區(qū)1-4相同。
21.包含人源化抗體H鏈V區(qū)的多肽，其包括如SEQ ID NO56所示的氨基酸序列。
22.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白人源化抗體的L鏈，包括人抗體L鏈C區(qū)的多肽和權(quán)利要求8-15之一的多肽。
23.按照權(quán)利要求22的人源化抗體L鏈，其中C區(qū)是Cλ鏈，所述框架區(qū)1-3基本上分別與人抗體HSU03868的框架區(qū)1-3相同，所述框架區(qū)4基本上與人抗體S25755的框架區(qū)4相同，互補(bǔ)決定區(qū)1-3分別包括如SEQ ID NO59-61所示的氨基酸序列。
24.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白人源化抗體的H鏈，其包括人抗體H鏈C區(qū)的多肽和權(quán)利要求16-21之一的多肽。
25.按照權(quán)利要求24的人源化抗體H鏈，其中C區(qū)是Cλ1鏈，所述框架區(qū)1-4分別來(lái)源于人抗體HSGIII的框架區(qū)1-4，互補(bǔ)決定區(qū)1-3分別包括如SEQ ID NO62-64所示的氨基酸序列。
26.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的人源化抗體，包括權(quán)利要求22或23的人源化抗體L鏈和權(quán)利要求24或25的人源化抗體H鏈。
27.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的抗體，其解離常數(shù)為1.86×10-7[M]或更低。
28.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的抗體，其解離率常數(shù)為1.22×10- 1[1/Sec]或更低。
29.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的抗體，其結(jié)合率常數(shù)為6.55×104[1/M.Sec]或更高。
30.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的抗體，其解離率常數(shù)為1.22×10- 1[1/Sec]或更低，結(jié)合率常數(shù)為6.55×104[1/M.Sec]或更高。
31.按照權(quán)利要求27的抗體，其中解離常數(shù)通過(guò)表面胞質(zhì)團(tuán)共振傳感器測(cè)定。
32.按照權(quán)利要求28或30的抗體，其中解離率常數(shù)通過(guò)表面胞質(zhì)團(tuán)共振傳感器測(cè)定。
33.按照權(quán)利要求29或30的抗體，其中結(jié)合率常數(shù)通過(guò)表面胞質(zhì)團(tuán)共振傳感器測(cè)定。
34.按照權(quán)利要求27的抗體，其中解離常數(shù)為1.02×10-11-1.86×10-7[M]。
35.按照權(quán)利要求27的抗體，其中解離常數(shù)為1.02×10-10-1.86×10- 8[M]。
36.按照權(quán)利要求27的抗體，其中解離常數(shù)為1.34×10-10-3.58×10- 10[M]。
37.按照權(quán)利要求28的抗體，其中解離率常數(shù)為7.38×10-6-1.22×10-1[1/Sec]。
38.按照權(quán)利要求28的抗體，其中解離率常數(shù)為7.38×10-5-1.22×10-2[1/Sec]。
39.按照權(quán)利要求28的抗體，其中解離率常數(shù)為1.66×10-4-3.16×10-4[1/Sec]。
40.按照權(quán)利要求28的抗體，其中解離率常數(shù)為2.32×10-4[1/Sec]。
41.按照權(quán)利要求29的抗體，其中結(jié)合率常數(shù)為6.55×104-1.24×107[1/M.Sec]。
42.按照權(quán)利要求29的抗體，其中結(jié)合率常數(shù)為6.55×105-1.24×106[1/M.Sec]。
43．按照權(quán)利要求29的抗體，其中結(jié)合率常數(shù)為7.23×105-1.03×106[1/M.Sec]。
44.按照權(quán)利要求29的抗體，其中結(jié)合率常數(shù)為1.03×106[1/M.Sec]。
45.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的抗體，其解離率常數(shù)為2.32×10- 4-3.16×10-4[1/Sec]，結(jié)合率常數(shù)為0.883×106-1.03×106[1/M.Sec]。
46.按照權(quán)利要求27-45之一的抗體，其中抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或靈長(zhǎng)類化抗體。
47.包括編碼抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白鼠單克隆抗體L鏈V區(qū)的堿基序列的DNA。
48.按照權(quán)利要求47的DNA，其中L鏈V區(qū)包括如SEQ ID NO45所示的氨基酸序列。
49.按照權(quán)利要求47的DNA，其中編碼L鏈V區(qū)的堿基序列如SEQ ID NO65所示。
50.包含編碼抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白鼠單克隆抗體H鏈V區(qū)的堿基序列的DNA。
51.按照權(quán)利要求50的DNA，其中H鏈V區(qū)包括如SEQ ID NO46所示的氨基酸序列。
52.按照權(quán)利要求50的DNA，其中編碼H鏈V區(qū)的堿基序列如SEQ ID NO57所示。
53.編碼權(quán)利要求1-3之一的嵌合L鏈的DNA。
54.按照權(quán)利要求53的DNA，其中編碼嵌合L鏈的DNA包括如SEQ ID NO65所示的堿基序列。
55.編碼權(quán)利要求4-6之一的嵌合H鏈的DNA。
56.按照權(quán)利要求55的DNA，其中編碼嵌合H鏈的DNA包括如SEQ ID NO57所示的堿基序列。
57.包含編碼權(quán)利要求8-15之一多肽的堿基序列的DNA。
58.按照權(quán)利要求57的DNA，包括如SEQ ID NO66-74所示之一的堿基序列。
59.包含編碼權(quán)利要求16-21之一多肽的堿基序列的DNA。
60.按照權(quán)利要求59的DNA，包括如SEQ ID NO58所示的堿基序列。
61.編碼權(quán)利要求22或23人源化抗體L鏈的DNA。
62.人源化抗體L鏈的DNA，包括編碼SEQ ID NO47-55所示之一氨基酸序列的堿基序列。
63.按照權(quán)利要求62的DNA，其中人源化抗體L鏈的DNA包括SEQ ID NO66-74所示之一的堿基序列。
64.編碼權(quán)利要求24或25人源化抗體H鏈的DNA。
65.人源化抗體H鏈的DNA，包括編碼SEQ ID NO56所示氨基酸序列的堿基序列。
66.按照權(quán)利要求65的DNA，其中人源化抗體H鏈的DNA包括SEQ ID NO58所示的堿基序列。
67.包含權(quán)利要求47-66之一DNA的重組載體。
68.用權(quán)利要求67的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
69.制備抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白嵌合抗體的方法，包括用包含權(quán)利要求47-49之一，53和54DNA的表達(dá)載體和包含權(quán)利要求50-52，55和56之一DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中收集抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的嵌合抗體。
70.制備抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白嵌合抗體的方法，包括用包含權(quán)利要求57，58和61-63之一DNA的表達(dá)載體和包含權(quán)利要求59，60和64-65之一DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，從得到的培養(yǎng)物中收集抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的嵌合抗體。
71.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的人源化抗體作為有效成分的藥物組合物。
72.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的人源化抗體作為有效成分的高鈣血癥抑制劑。
73.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白的人源化抗體作為有效成分的惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥抑制劑。
74.按照權(quán)利要求73的高鈣血癥抑制劑，其中惡性腫瘤至少選自下述組中的癌癥之一胰腺癌、肺癌、咽癌、喉癌、舌癌、齒齦癌、食道癌、胃癌、膽管癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌和前列腺癌，以及惡性淋巴瘤。
75.包括權(quán)利要求27-46之一抗體作為有效成分的藥物組合物。
76.包括權(quán)利要求27-46之一抗體作為有效成分的高鈣血癥抑制劑。
77.包括權(quán)利要求27-46之一抗體作為有效成分的惡性腫瘤相關(guān)高鈣血癥抑制劑。
78.按照權(quán)利要求77的高鈣血癥抑制劑，其中惡性腫瘤至少選自下述癌癥之一胰腺癌、肺癌、咽癌、喉癌、舌癌、齒齦癌、食道癌、胃癌、膽管癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌和前列腺癌，以及惡性淋巴瘤。
79.抗人副甲狀腺激素相關(guān)蛋白人源化抗體作為有效成分的低磷血癥改善藥物。
80.按照權(quán)利要求79的低磷血癥改善藥物，其中低磷血癥是低磷性佝僂病。
81.按照權(quán)利要求79的低磷血癥改善藥物，其中低磷血癥是低磷性維生素-D抗性佝僂病。
82.權(quán)利要求27-46之一的抗體作為有效成分的低磷血癥改善藥物。
83.按照權(quán)利要求82的低磷血癥改善藥物，其中低磷血癥是低磷性佝僂病。
84.按照權(quán)利要求82的低磷血癥改善藥物，其中低磷血癥是低磷性維生素-D抗性佝僂病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人副甲狀腺激素相關(guān)肽的抗體，編碼該抗體的DNA，包含該DNA的重組載體，該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體，制備該抗體的方法，以及該抗體的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1237983SQ9719972
公開(kāi)日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1997年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月26日
發(fā)明者佐藤功, 若原裕二, 藪田尚弘 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社