專利名稱：轉(zhuǎn)移性前列腺癌的檢測方法
政府權(quán)利申明本發(fā)明是在美國政府通過國立衛(wèi)生研究所進(jìn)行的資助下完成的(基金號CA70893和DK41995)。政府可能在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
激肽釋放酶在特定多肽前體翻譯后加工成其生物活性形式的過程中發(fā)揮作用，腺激肽釋放酶是它的一個(gè)亞群。在人類中，已確定了該家族的三個(gè)成員，它們的某些特性也得到鑒定(Clements，內(nèi)分泌評論，10,343(1989)；Clements，分子細(xì)胞內(nèi)分泌學(xué)，99,1(1994)；Jones等，內(nèi)分泌學(xué)報(bào)，127,481(1992)。hKLK1基因編碼組織激肽釋放酶蛋白質(zhì)hK1,hKLK2基因編碼前列腺特有的腺激肽釋放酶蛋白質(zhì)hK2,hKLK3基因編碼前列腺特有的抗原蛋白質(zhì)hK3(PSA)。mRNA Northern雜交分析表明hK2和PSA主要在人前列腺中表達(dá)，而hK1在胰腺，下頜下腺，腎臟和其它非前列腺組織中表達(dá)(Chapdelaine等，F(xiàn)EBS通信，236,205(1988)；Young等，生物化學(xué)，31,818(1992))。
HKLK2和hKLK3外顯子之間的核苷酸序列同源性為80％，而hKLK2和hKLK1外顯子之間的核酸苷序列的同源性為65％。hK2與PSA推測的氨基酸序列同源性為78％，而hK2與hK1推測的氨基酸序列同源性為57％。此外，hK2推測的氨基酸序列提示hK2可能是一種胰蛋白酶樣蛋白酶，而PSA是一種胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶。
PSA水平被廣泛用作前列腺癌的預(yù)測指標(biāo)。然而，由于血清PSA濃度在前列腺癌(pCa)患者或良性前列腺增生(BPH)患者中均升高，檢測升高的PSA水平并不能區(qū)分這兩種疾病。此外，hK2和PSA的高度同源性對目前用于檢測PSA水平之抗體的特異性提出了疑問。如果循環(huán)中的hK2水平與pCa和BPH無關(guān)，那么由污染有hK2的PSA制劑，或由與hK2同源的PSA區(qū)域產(chǎn)生的抗體，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
雖然目前廣泛認(rèn)為，血清PSA檢測與手指直腸檢查(DRE)的結(jié)合是確定臨床上顯著的和器官范圍限定的前列腺癌最有效的手段，但PSA、DRE和前列腺超聲波檢查只能查出部分前列腺癌。例如，多至40％的經(jīng)手術(shù)治療的前列腺癌患者隨后被發(fā)現(xiàn)是臨床隱性的。此外，尸檢基礎(chǔ)上確定的組織性癌發(fā)生率相比于臨床上顯著的前列腺癌的發(fā)生率要高一些。再則，大約30％據(jù)認(rèn)為是局部前列腺癌的患者中有隱秘(遠(yuǎn)距離)的轉(zhuǎn)移病變(Moreno等，癌癥研究，52,6110(1992))。在這些病人中，80％患者在治療后經(jīng)歷了生化意義上的復(fù)發(fā)，即PSA水平升高，局部復(fù)發(fā)或明顯全身性癥狀的出現(xiàn)或發(fā)病。
對已確知有轉(zhuǎn)移的患者來說，手術(shù)治療并不是一種合適的治療方式。為了評估早期轉(zhuǎn)移而使用的篩查方法往往不能發(fā)現(xiàn)患者中有侵入前列腺包膜和精囊這種局部侵襲病變的一大亞群。當(dāng)用常規(guī)方法尚未檢測到明顯轉(zhuǎn)移灶時(shí)，免疫組織化學(xué)方法可用來鑒定微轉(zhuǎn)移的或循環(huán)中的前列腺腫瘤細(xì)胞。但免疫組織化學(xué)方法繁瑣，對于轉(zhuǎn)移或局部侵染性前列腺癌的早期檢測缺乏所需的靈敏性。
這樣，需要一種能早期檢測具有轉(zhuǎn)移潛力的前列腺癌細(xì)胞的方法。此外，需要一種能在對患者治療之前確定前列腺癌發(fā)生期的方法，特別需要一種既能獨(dú)立發(fā)揮作用又能與PSA結(jié)合應(yīng)用的前列腺癌標(biāo)志。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用來檢測hK2 DNA的一種診斷方法，其中生理樣品中前列腺癌細(xì)胞的存在可以與該樣品中hK2 RNA的檢測發(fā)生關(guān)聯(lián)。因?yàn)閔K2的表達(dá)是前列腺組織所特有的，所以理論上講，在未發(fā)生局部侵襲或轉(zhuǎn)移病變時(shí)，或在所有前列腺組織(良性和惡性)均已被消除或破壞時(shí)，在體液的細(xì)胞中或非前列腺組織中不應(yīng)檢測到hK2的表達(dá)。本方法包括，由人類生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)生一定量的DNA，使得到的DNA與眾多的寡核苷酸引物相接觸，優(yōu)選至少兩種寡核苷酸引物，其中至少一種是hK2特異的寡核苷酸，通過一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生一定量的擴(kuò)增hK2 DNA。優(yōu)選的擴(kuò)增反應(yīng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。隨后檢測是否存在擴(kuò)增的hK2 DNA。如下文所述，經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增后，血細(xì)胞中hK2 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與前列腺癌相關(guān)，也就是說67％的前列腺癌患者表達(dá)hK2,17％的患者表達(dá)PSA,17％的患者同時(shí)表達(dá)hK2和PSA。優(yōu)選地，用于檢測的樣品來源于人類組織，如前列腺，前列腺包膜，精囊，骨髓或淋巴結(jié)，另一類優(yōu)選的用于檢測的樣品來源于人類含有細(xì)胞的生理液體，如血，血清或精液。
此處所用的“擴(kuò)增的hK2 DNA”是指經(jīng)過一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)后樣品中的hK2 DNA，其數(shù)量比擴(kuò)增前同一樣品中hK2 DNA的量多10倍，優(yōu)選104倍，更優(yōu)選106倍。
此處所用的“hK2特異的寡核苷酸或hK2特異的引物”指的是一段DNA序列，該序列與SEQ ID NO:4中不同于編碼hK3的核苷酸序列(23號序列)的區(qū)域之間具有至少80％左右的序列同一性或同源性，優(yōu)選至少90％左右，更優(yōu)選至少95％左右。本發(fā)明的寡核苷酸或引物至少有7-50個(gè)左右的核苷酸，優(yōu)選至少10-40個(gè)左右的核苷酸，更優(yōu)選至少15-35個(gè)左右的核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明寡核苷酸引物的3’端至少有7個(gè)核苷酸與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6存在至少80％左右，更優(yōu)選至少85％左右，還要優(yōu)選至少90％左右相同。本發(fā)明的寡核苷酸可能還含有與hK2核酸序列無關(guān)的序列，如可能編碼限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的序列。本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的hK2特異寡核苷酸包括SEQ IDNO:14，本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的hK2特異寡核苷酸包括SEQ ID NO:17，本發(fā)明又一個(gè)優(yōu)選的hK2特異的寡核苷酸序列包括SEQ ID NO:18。
本發(fā)明一種優(yōu)選的診斷方法是結(jié)合hK2轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR檢測和其它前列腺癌相關(guān)基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR檢測。兩種或多種基因產(chǎn)物的聯(lián)合檢測使診斷更加準(zhǔn)確，能提供更多的腫瘤分類信息。聯(lián)合檢測也有利于區(qū)分具有侵襲性生長潛力的細(xì)胞和更具惰性的細(xì)胞。本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案是將hK2 RNA的RT-PCR檢測與PSA RNA的RT-PCR檢測結(jié)合起來。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測hK2 RNA的診斷方法。該方法包括從來源于人的生理樣品中提取RNA，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，將該DNA與一定量的至少兩種能有效擴(kuò)增DNA的寡核苷酸相結(jié)合，以產(chǎn)生一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，其中至少有一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸。隨后檢測是否存在擴(kuò)增的hK2 DNA。擴(kuò)增的hK2 DNA的存在指示此人患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
體液或非前列腺組織中hK2 RNA的存在，或hK2 RNA的水平隨時(shí)間升高，可能合理地指示了存在以前未被診斷出的轉(zhuǎn)移性病變。轉(zhuǎn)移性病變的早期檢測為考慮可供選擇的治療方案提供了領(lǐng)先時(shí)間，其中包括那些在外科手術(shù)階段可能還不存在，而在以后被發(fā)展的治療方案。這樣，本發(fā)明提供了一種監(jiān)測前列腺癌發(fā)展的方法。
這個(gè)方法包括，將來源于前列腺癌患者的生理樣品中的RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，將一定量的該DNA與一定量的、可有效擴(kuò)增該DNA的至少兩種寡核苷酸(其中至少一種是hK2特異的寡核苷酸)相結(jié)合，以產(chǎn)生一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，定性檢測或定量測定擴(kuò)增的hK2 DNA。至少在以后的某一時(shí)間點(diǎn)，取另一份樣品，對擴(kuò)增的hK2 DNA進(jìn)行定性或定量檢測。然后，對至少在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)得到的hK2 DNA的擴(kuò)增量進(jìn)行比較。
并且提供了對人類前列腺癌進(jìn)行病理分期的方法。這種方法包括，將來源于前列腺癌患者的生理樣品的RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，將一定量的該DNA與一定量的、可有效擴(kuò)增該DNA的至少兩種寡核苷酸(其中至少一種是hK2特異的寡核苷酸)結(jié)合，以產(chǎn)生一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，然后定性檢測或定量測定擴(kuò)增的hK2 DNA。擴(kuò)增hK2 DNA的存在或數(shù)量是前列腺癌病理期的一個(gè)指標(biāo)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是為包括激素療法在內(nèi)的治療性干預(yù)提供一種監(jiān)測方案。例如，因?yàn)閔K2的表達(dá)是雄激素依賴性的，故hK2 DNA在外周血、其它身體組織或體液中的水平可以作為間歇性雄激素治療或雄激素刺激實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)，其中使患者在雄激素刺激實(shí)驗(yàn)中暫時(shí)處于一種雄激素過多狀態(tài)，以刺激任何尚存的前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生一定水平的hK2，從而檢測到這些細(xì)胞的存在。參見T.K.Takayama等，腫瘤學(xué)討論，21,542-553(1994)及其引用的文獻(xiàn)。優(yōu)選地，在激素治療過程中周期性監(jiān)測hK2水平。在治療開始前或治療結(jié)束后對hK2水平進(jìn)行周期性測定可能非常有益。
并且提供了一種對懷疑有hK2 RNA的生理樣品進(jìn)行hK2 RNA檢測的診斷試劑盒。該試劑盒包括含有下述的包裝(a)已知量的第一種hK2特異的寡核苷酸，該寡核苷酸至少包括7-50個(gè)左右的核苷酸，該寡核苷酸與SEQ ID NO:4至少有80％左右相同；(b)已知量的第二種hK2特異的寡核苷酸，該寡核苷酸至少包括7-50個(gè)左右的核苷酸，該寡核苷酸與互補(bǔ)于SEQ ID NO:4的核苷酸序列至少有80％左右相同。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含SEQ ID NO:22的一種經(jīng)分離、純化的肽，它的有生物活性的亞基或它的有生物活性的變體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含SEQ ID NO:26的一種經(jīng)分離、純化的肽，它的有生物活性的亞基或它的有生物活性的變體。還提供了能與包含本發(fā)明上述肽的蛋白質(zhì)或多肽特異反應(yīng)的一種經(jīng)分離、純化的抗體或抗體制劑。
此處所用的本發(fā)明肽的“有生物活性的亞基”一詞，優(yōu)選指具有SEQ ID NO:22的肽的亞基，該亞基至少有具SEQ ID NO:22之肽的活性的10％左右的活性，優(yōu)選至少50％左右的活性，更優(yōu)選至少90％左右的活性。本發(fā)明肽活性的測定可以采用本領(lǐng)域內(nèi)通曉的方法，包括但不局限于該肽在施用到如山羊、兔、綿羊或小鼠等生物體中時(shí)其引發(fā)序列特異性免疫響應(yīng)的能力。
此處所用的本發(fā)明肽“有生物活性的變體”一詞，優(yōu)選指與SEQ IDNO:22至少有80％左右相同或同源，優(yōu)選至少有90％左右相同或同源，更優(yōu)選至少有95％左右相同或同源的肽。本發(fā)明肽的有生物活性的變體至少有具SEQ ID NO:22之肽的10％左右生物活性，優(yōu)選至少具有50％左右活性，更優(yōu)選至少具有90％左右活性。本發(fā)明肽變體的活性可由上述方法測定。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測或測定人類非前列腺組織樣品中轉(zhuǎn)移性前列腺癌的方法。該方法包括將一定量的試劑與哺乳動(dòng)物組織樣品中的細(xì)胞混合形成一種包括試劑和細(xì)胞的二價(jià)復(fù)合物，該試劑只與hK2多肽結(jié)合而不與hK3結(jié)合。對樣本中形成的復(fù)合物進(jìn)行定性檢測和定量測定。該復(fù)合物的存在或數(shù)量是微轉(zhuǎn)移前列腺癌存在的指征。此處所用的“微轉(zhuǎn)移”是指局部侵襲性病變，通常包括前列腺包膜或精囊的侵襲，或隱性病變。此方法中一種優(yōu)選的試劑是抗體?！翱贵w”一詞包括人和動(dòng)物的單克隆抗體，多克隆抗體制劑，以及抗體片段和合成抗體，包括重組抗體和嵌合抗體，其又包括人源化抗體，抗同種型抗體及其衍生物。為制備只與hK2而不與hK3結(jié)合的抗體，可以用分離的hK2多肽，分離的hK2肽、以及它們的變體或亞基來制備抗體群。隨后這些抗體被用作檢測和定量測定來源于骨髓、淋巴結(jié)等組織樣品和諸如來源于含有細(xì)胞的生理液體的細(xì)胞樣品中hK2多肽(或蛋白質(zhì))的直接或競爭實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
附圖簡述附

圖1描述了成熟的野生型hK2(SEQ ID NO:1)和hK3(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。
附圖2描述了野生型pphK2(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，phK2(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和hK2(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的氨基酸序列和對應(yīng)的核酸序列。217號密碼子(GCT，丙氨酸)以粗體和下劃線標(biāo)出。
附圖3是pGT表達(dá)載體--pGThK2和pGThK2v217的簡圖。
附圖4是phK2v217純化的色譜圖。(A)轉(zhuǎn)染有編碼pphK2v217載體的AV12細(xì)胞培養(yǎng)7天的消耗培養(yǎng)基的DEAE色譜圖。將消耗培養(yǎng)基樣品在pH8的重碳酸鹽緩沖液中上樣，采用鹽梯度洗脫。以實(shí)線表示A280的洗脫曲線，虛線表示每個(gè)柱洗脫級分一部分的ELISA結(jié)果，即用兔抗pphK2抗體對干燥于微滴定板上的每一柱級分進(jìn)行顯色。(B)匯集DEAE級分的疏水作用曲線。匯集(A)中DEAE層析洗脫物的第24-30號級分，濃縮，上樣到1.2M硫酸鈉中的疏水作用柱(HIC)中，并以逐漸降低的鹽濃度梯度洗脫。實(shí)線表示洗脫曲線(A280)，虛線表示每個(gè)洗脫級分一部分的ELISA測試結(jié)果，以兔抗hK2抗體對干燥于微滴定板上的每個(gè)級分進(jìn)行顯色。(C)將(B)中22分鐘峰的含有hK2的級分濃縮后上樣到pharmacia S12大小排阻柱中，收集洗脫級分進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS/PAGE)分析，其中19.4分鐘的洗脫峰表現(xiàn)為SDS/PAGE均一。
附圖5表示純化的hK2和PSA的SDS/PAGE分析。將加入(R)或未加入(N)1％β-巰基乙醇的1.5毫克已純化的phK2v217或PSA煮沸，然后在4-20％的凝膠上進(jìn)行SDS/PAGE，用銀染法使蛋白質(zhì)條帶顯色。
附圖6描述了phK2v217的伴刀豆球蛋白質(zhì)A染色結(jié)果。箭頭指示phK2的預(yù)期位置。分別用ZCE(一種抗CEA的單克隆抗體)和牛血清白蛋白(BSA)作為糖基化和非糖基化蛋白的例子，phK2泳道在預(yù)期位置出現(xiàn)了一個(gè)條帶表明該蛋白質(zhì)是糖基化蛋白。
附圖7表示通過胰蛋白酶切割使hK2v217前體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為成熟蛋白質(zhì)。在37℃,pH8的100mM硼酸鹽緩沖液條件下，將胰蛋白酶(1％w/w)和phK2v217共同溫育10分鐘，然后進(jìn)行HIC/HPLC檢測。破折線表示胰蛋白酶溫育前的phK2v217曲線，實(shí)線表示胰蛋白酶溫育后phK2的圖形曲線。將兩曲線疊加以進(jìn)行比較。用蛋白質(zhì)N端測序法確定兩種蛋白質(zhì)形式的相同性。
附圖8描述了用單克隆抗體(mAb)hK1G586.1對精液的Western雜交結(jié)果。將處理過的精液1∶1稀釋于PBS中，10000xg離心20分鐘。上清在8-25％的凝膠上進(jìn)行SDS/PAGE，采用Pharmacia的Phast System電泳系統(tǒng)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與經(jīng)G-蛋白質(zhì)純化的HK1G586.1抗體(1μg/ml)共同溫育，隨后加入羊抗鼠IgG-HRT(1∶1000)。印跡用Amersham的ECL檢測系統(tǒng)顯色。
附圖9表示了hK2在AV12細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間曲線。將AV12-hK2細(xì)胞27號克隆培養(yǎng)至約60-70％長滿度，用HBSS沖洗細(xì)胞，加入無血清的HH4培養(yǎng)基。每日回收消耗培養(yǎng)基，濃縮后上樣于12％的膠上進(jìn)行SDS/PAGE。將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移后，用單克隆抗體HK1D106.4或HK1G464.3進(jìn)行探查。HK1D106.4能檢測phK2和hK2(1∶1000),HK1G464.3能檢測phK2(1∶1000)。隨后加羊抗鼠抗體IgG-HRP(1∶500)。按操作手冊說明，以Amersham公司的ECL系統(tǒng)對印跡顯色。以純化的phK2v217和hK2v217作對照，箭頭指示處為hK2的位置。
附圖10表示經(jīng)轉(zhuǎn)染的AV12細(xì)胞中表達(dá)hK2變體的時(shí)間曲線。長至約60-70％融合的AV12-hK2v217細(xì)胞用HBSS沖洗后，加入無血清的HH4培養(yǎng)基。每日收獲消耗培養(yǎng)基，濃縮后上樣于12％的膠上進(jìn)行SDS/PAGE。蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移后，以單克隆抗體HK1D106.4和HK1G464.3進(jìn)行探查。以羊抗鼠IgG-HRP(1∶500)作為二抗，按操作手冊，用ECL(Amersham)對印跡顯色。用純化的phK2v217和hK2v217作對照。箭頭指示hK2的位置。
附圖11是hK2表達(dá)和細(xì)胞活力的時(shí)間曲線。AV12-hK2細(xì)胞27號克隆長至60-70％融合，用HBSS沖洗，加入無血清的HH4培養(yǎng)基。每天收獲消耗培養(yǎng)基，以HK1D106.4或HK1G464.3作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，經(jīng)ELISA反應(yīng)測定hK2的濃度。用OPD(Sigma.St.Louis,MO)進(jìn)行顯色反應(yīng)。用臺(tái)盼蘭排除法每日計(jì)數(shù)存活細(xì)胞。
附圖12描述了PC3和DU145細(xì)胞中hK2的表達(dá)。轉(zhuǎn)染有pGThK2的PC3和DU145細(xì)胞長至約60-70％融合，洗滌后重懸于無血清的HH4培養(yǎng)基中。重懸3天后收集轉(zhuǎn)染有pGThK2的DU145細(xì)胞的消耗培養(yǎng)基，重懸5天后收集轉(zhuǎn)染有pGThK2的PC3細(xì)胞的消耗培養(yǎng)基。消耗培養(yǎng)基濃縮后上樣于12％的膠上進(jìn)行SDS/PAGE電泳。如上述方法，在蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移后用HK1D106.4和HK1G464.3作為探針進(jìn)行探查。用純化的phK2v217和hK2v217作對照。箭頭指示hK2的位置。
圖13描述了在經(jīng)過選擇的含有hK2的AV12細(xì)胞克隆中hK2的表達(dá)。含有hK2的AV12細(xì)胞的第10,27,31和32號克隆長至約60-70％融合，用HBSS沖洗，然后加入無血清的HH4培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天后收集消耗培養(yǎng)基，濃縮并上樣于12％的凝膠上進(jìn)行SDS/PAGE電泳。蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，并以HK1D106.4或HK1G464.3作為探針進(jìn)行探查。以羊抗鼠IgG-HRP(1∶500)作為二抗，按照操作說明用ECL(Amersham)對印跡顯色。以純化的phK2v217和hK2v217作為對照，箭頭指示hK2的位置。
圖14描述了在經(jīng)過篩選的AV12-hK2v217克隆中phK2v217的表達(dá)。AV12第2,3,4,45和48號克隆的細(xì)胞長至約60-70％融合，用HBSS沖洗，加入無血清的HH4培養(yǎng)基。加入無血清培養(yǎng)基7天后收集消耗培養(yǎng)基，濃縮后上樣于12％的凝膠中進(jìn)行SDS/PAGE電泳。蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，以HK1D106.4或HK1G464.3作探針進(jìn)行探查。以羊抗鼠IgG-HRP(1∶500)作為二抗，根據(jù)操作說明，用ECL(Amersham)對印跡顯色。用純化的phK2v217和hK2v217作對照。箭頭指示hK2的位置。
圖15描述了hK2v217,hK2和PSA對hK2中210-236位殘基的酰胺水解特異性。0.63mM合成肽在37℃下用1μg/ml hK2,40μg/ml hK2v217或100μg/ml PSA消化過夜，以RP-HPLC分離消化產(chǎn)物，將各峰標(biāo)準(zhǔn)化以比較切割的性質(zhì)方面。
附圖16描述了hK2和PSA對不同肽底物的特異性?？招募^指示被PSA切割的肽鍵，實(shí)心箭頭表示被hK2切割的肽鍵。1號肽表示hK2中210-236位氨基酸殘基，2號肽表示血管緊張素原1-14位氨基酸殘基(即腎素底物十肽)，3號肽表示phK2中-7-+7位氨基酸殘基，4號肽表示hK2中41-56位氨基酸殘基，5號肽表示氧化型胰島素β鏈的氨基酸序列，6號肽表示PMSA中196-213位氨基酸殘基。
附圖17描述了phK2v217能被hK2激活，但不能被hK2v217激活。phK2v217含有前體蛋白質(zhì)的前導(dǎo)肽序列VPLIQSR，該序列在hK2v217中不存在。A表示與1％(重量比)hK2共同溫育的phK2v217。B為對照，其中phK2v217與40％(重量比)hK2v217共同溫育6個(gè)小時(shí)。
附圖18描述了與蛋白酶抑制劑共同溫育的hK2的Western印跡分析。將每個(gè)樣品在8-25％的梯度SDS/PAGE中分離，轉(zhuǎn)膜并用HK1G586.1進(jìn)行探查。37℃下，將hK2與下列抑制劑共同溫育4個(gè)小時(shí)1泳道，抗胰凝乳蛋白酶(ACT)；2泳道，α2抗纖溶酶；3泳道，抗凝血酶Ⅲ；4泳道，α1蛋白酶抑制劑(抗胰蛋白酶)；5泳道，α2巨球蛋白；1泳道和2泳道顯示了推測分子量為90-100KD的一種共價(jià)復(fù)合物。絲氨酸蛋白酶抑制劑的濃度為20μM，巨球蛋白為2.8μM,hK2為0.175μM。5泳道顯示了較大分子量的復(fù)合物，它們代表的是hK2與α2巨球蛋白的共價(jià)復(fù)合物。
附圖19描述了hK2在人血清中形成復(fù)合物的情況。將hK2和PSA的Western印跡與人血清共同溫育。以HK1G586.1探測hK2樣品，以PSM773抗PSA單克隆抗體探測PSA樣品。1泳道至6泳道含有hK2樣品，7泳道和8泳道為PSA樣品。1泳道代表hK2對照，2泳道為與ACT共同溫育4小時(shí)的hK2,3泳道為不加蛋白酶的血清對照，4泳道含有與血清共同溫育15分鐘的hK2,5泳道為與血清共同溫育4小時(shí)的hK2,6泳道為與純化的α2巨球蛋白共同溫育4小時(shí)的hK2,7泳道為與血清共同溫育4小時(shí)的PSA,8泳道含有與純化的α-2巨球蛋白共同溫育4小時(shí)的PSA。
圖20描述了單克隆抗體HK1G586在未經(jīng)治療的人前列腺中的免疫反應(yīng)性(n=257)。
圖21描述了單克隆抗體HK1G586在經(jīng)雄激素饑餓治療的人前列腺中的免疫反應(yīng)性(n=7)。
圖22描述了(A)在從稀釋于全血的LNCaP細(xì)胞提取的RNA中，對PSA和hK2的mRNA進(jìn)行RT-PCR檢測，(B)在從以下病人的全血細(xì)胞提取的RNA中，對PSA和hK2的mRNA進(jìn)行RT-PCR檢測17號病人，31歲，男性對照；21號病人，58歲，臨床階段B；24號病人，83歲，已知有轉(zhuǎn)移病變(D2)；26號病人，75歲，病理階段C(+邊緣)；28號病人，57歲，病理階段C(+邊緣)；49號病人，64歲，病理階段C(+精囊)；59號病人，31歲，男性對照；60號病人，73歲，已知有轉(zhuǎn)移病變。
發(fā)明詳述hK2和PSA在氨基酸序列上的高度同源性，以及hK2和PSA兩者的表達(dá)基本局限于前列腺細(xì)胞的事實(shí)，提示檢測hK2和PSA在組織樣品中的存在或測定其含量，或檢測在包含有細(xì)胞的生理液體(如血液)或組織樣品(如淋巴結(jié))中hK2轉(zhuǎn)錄物的水平，有助于診斷和監(jiān)測前列腺癌(pCa)。定義此處所用的“hK2多肽”一詞包括重組的前hK2多肽原，前hK2多肽和成熟的hK2多肽，成熟的hK2多肽包含圖1(SEQ ID NO:1)中氨基酸序列，以及與SEQ ID NO:1中基本同源于hK3的區(qū)域(即圖1中未被線條標(biāo)出的區(qū)域)有至少90％同源性的“變體”多肽。本發(fā)明變體hK2多肽相對于相應(yīng)的野生型多肽具有至少一個(gè)氨基酸的替換。一種優(yōu)選的hK2變體多肽包括SEQ ID NO:8，即217位氨基酸上由纈氨酸取代丙氨酸。hK2多肽的抗原性與圖1中成熟的hK2分子相同，也就是說所述多肽也可被能與其特異結(jié)合但不能與hK3(或hK1)交叉反應(yīng)的抗體所定義。優(yōu)選所述抗體能與也存在于圖1成熟hK2分子中的抗原位點(diǎn)或表位相互反應(yīng)。
系列列號08/096,946(目前是美國專利No.5,516,639)中詳述了可用于定義共同抗原功能的抗體，即體內(nèi)制備的針對hK2亞基41-56的多克隆抗血清。
“分離的hK2核酸序列”是指含有7個(gè)以上，優(yōu)選15個(gè)以上，更優(yōu)選20或更多個(gè)連續(xù)核苷酸堿基的RNA或DNA，所述RNA或DNA互補(bǔ)于天然hK2多肽RNA或DNA的非編碼鏈或編碼鏈，或能與它們雜交并能在嚴(yán)格條件下保持穩(wěn)定結(jié)合。優(yōu)選地，分離的核酸編碼一種有生物活性的hK2多肽，其變體或其亞基。hK2多肽的生物活性能通過本領(lǐng)域所通曉的方法檢測，包括但不局限于與hK2多肽特異性抗體反應(yīng)的能力，切割hK2特異底物的能力(參見實(shí)施例7)，或與血清蛋白質(zhì)結(jié)合的能力(參見實(shí)施例9)。hK2變體多肽或其亞基，或hK2多肽的亞基具有含SEQ ID NO:1氨基酸序列的hK2多肽之生物活性的至少10％左右，優(yōu)選至少50％左右，更優(yōu)選至少90％左右。
所以，分離的DNA或RNA是指這些核酸至少?zèng)]有在其天然來源中與其正常連接的核酸的污染，優(yōu)選基本上沒有任何其它哺乳動(dòng)物的DNA或RNA?！爸辽贌o正常連接的核酸的污染”包括將目的核酸序列重新導(dǎo)入其來源或天然細(xì)胞中、但位于染色體的不同位置或其兩側(cè)連接有來源細(xì)胞中通常不存在的核酸序列這種情形。一個(gè)分離的hK2核酸的例子是所編碼的有生物活性的hK2多肽與如前所述的hK2肽中同源于hK3的同源區(qū)域(圖1)至少有90％的序列相同的RNA或DNA。用于hK2多肽的“分離、純化的”在以下的方法學(xué)討論中得到定義。
此處所用的“重組核酸”一詞，即“重組DNA”，是指從任何適當(dāng)?shù)慕M織來源衍生或分離得到的核酸，即DNA，其可以隨后在體外化學(xué)法改變，然后導(dǎo)入目的宿主細(xì)胞，如來源于動(dòng)物、植物、昆蟲、酵母、真菌或細(xì)菌的細(xì)胞中。從某一來源“衍生”得到的重組DNA的例子是被確定為編碼hK2或其片段或變體之有用片段的DNA序列，其可以基本純凈的方式進(jìn)行化學(xué)合成。從某一來源“分離”的這種DNA的一個(gè)例子可以是一種有用的DNA序列，該DNA序列通過化學(xué)方法(如利用限制性內(nèi)切酶)切割或從所述來源中取出來，以使得可通過遺傳工程方法(如擴(kuò)增)進(jìn)一步加工以用于本發(fā)明。
這樣，“重組DNA”包括完全合成的DNA序列，半合成的DNA序列，從生物來源分離的DNA序列，來源于導(dǎo)入RNA的DNA序列以及它們的混合物。一般來講，重組DNA序列并不是作為DNA受體的宿主靶細(xì)胞中的原有成份，或者它位于其基因組中但不表達(dá)或不是高表達(dá)。
此處所用的“嵌合體”是指一個(gè)載體包含來源于至少兩個(gè)不同種的DNA，或包含同一種來源的DNA，但卻以該種中在天然或野生型狀態(tài)下不存在的一種方式連接在一起。
“調(diào)控序列”是指在某一特定宿主生物體中表達(dá)一個(gè)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。適用于原核細(xì)胞的調(diào)控序列例如有啟動(dòng)子，可選擇地包括操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞可利用啟動(dòng)子，多聚腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。
“可操作連接”是指將核酸置于與另一核酸序列有功能關(guān)系的位置。例如，如果編碼前序列或分泌前導(dǎo)肽的DNA序列以參與多肽的分泌的前體蛋白質(zhì)形式表達(dá)，則其即是可操作地與該多膚的DNA連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則是與該序列可操作地聯(lián)接；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)所處位置便于翻譯，則是與編碼序列可操作地連接。一般來講，“可操作連接”是指連接的DNA序列是連續(xù)的，如在分泌性的前導(dǎo)肽中，序列連續(xù)并處于閱讀框中。然而，增強(qiáng)子并不需要處于連續(xù)的位置上。在合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行連接而完成連接。如果不存在這樣的位點(diǎn)，按照常規(guī)方法利用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭進(jìn)行。
“Southern分析”或“Southern雜交”是以一個(gè)已知的并被標(biāo)記的寡核苷酸或DNA片段，通過雜交手段確定在DNA或含有DNA的組合物的限制性酶切產(chǎn)物中存在某些DNA序列的一種方法。Southern雜交通常包括在瓊脂糖凝膠中電泳分離DNA消化產(chǎn)物，電泳分離后變性DNA，將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其它合適的支持膜上，按照Sambrook等(出處同前)9.37-9.52節(jié)所述的方法，用放射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記或酶標(biāo)記的探針進(jìn)行分析。
“Northern雜交”或“Northern分析”是用來確定能與已知探針，如寡核苷酸，DNA片段，cDNA或其片段，或RNA片段雜交的RNA序列的一種方法。探針被放射性同位素(如32p)，或生物素，或酶所標(biāo)記。待分析的RNA通常在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其它合適膜上，采用本領(lǐng)域所通曉的方法對其進(jìn)行雜交，如Sambrook等(出處同前)7.39-7.52節(jié)所述方法。
“嚴(yán)格條件”是指(1)低離子強(qiáng)度和高洗膜溫度，如0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉(SSC),0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，溫度50℃，或(2)在雜交過程中使用變性劑，如甲酰胺，如50％甲酰胺/0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5),750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，溫度42℃。另一個(gè)例子是50％甲酰胺，5xSSC(0.75M氯化鈉，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1％焦磷酸鈉，5xDenhardt溶液，經(jīng)超聲波處理的鮭精DNA(50μg/ml),0.1％十二烷基硫酸鈉，10％硫酸葡聚糖，溫度42℃，洗滌在42℃于0.2xSSC和0.1％SDS中進(jìn)行。參見Sambrook等(出處同前)中的其它嚴(yán)格條件舉例。表達(dá)盒或表達(dá)載體包含可操作地連接了在宿主細(xì)胞中有功能之啟動(dòng)子的編碼hK2之重組DNA序列的表達(dá)盒或載體可以是環(huán)狀或線性，單鏈或雙鏈。一般來講，表達(dá)盒或表達(dá)載體是一種嵌合DNA，如質(zhì)粒DNA，其含有編碼區(qū)及兩側(cè)的調(diào)控區(qū)，該調(diào)控區(qū)可促進(jìn)重組DNA在產(chǎn)生的細(xì)胞系中表達(dá)。例如，表達(dá)盒自身可能含有一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子，或能利用已存在于被轉(zhuǎn)化的目的基因組中的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子包括CMV啟動(dòng)子，SV40晚期啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR(長末端重復(fù)元件)。除了作為hK2或其部分的轉(zhuǎn)錄單位的重組DNA序列外，一部分重組DNA可能不被轉(zhuǎn)錄，起到調(diào)節(jié)或結(jié)構(gòu)作用。
導(dǎo)入細(xì)胞中的表達(dá)盒或表達(dá)載體通常還包括一個(gè)選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因，或者兩者都有，以方便從被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群中確定和篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。另外，選擇標(biāo)記可能負(fù)載于另一段DNA中，用于共轉(zhuǎn)化過程。選擇標(biāo)記或報(bào)告基因兩側(cè)都可能有合適的調(diào)控序列以使其在宿主細(xì)胞中表達(dá)。在本領(lǐng)域中熟知各種有效選擇標(biāo)記包括，例如抗生素和除草劑抗性基因，如neo,hpt,dhfr,bar,aroA等，參見Lundquist等人(美國專利NO.5,554,798)的表1。
報(bào)告基因可用于鑒定潛在的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或評價(jià)調(diào)控序列的功能。編碼容易分析的蛋白質(zhì)的報(bào)告基因在本領(lǐng)域是通曉的。一般來講，報(bào)告基因是在受體組織或生物體中不存在或不表達(dá)的基因，用一些容易檢測的特性(如酶活性)能顯示其編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)。優(yōu)選的基因包括來源于大腸桿菌Tn9中的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)，大腸桿菌uidA位點(diǎn)的β-葡糖醛酸酶基因(gus)，熒火蟲Photinus pyralis來源的熒光素酶基因。分析報(bào)告基因的表達(dá)可在DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后的適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行。
其它在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的元件，如內(nèi)含子，增強(qiáng)子，多聚腺苷酸化序列等，也可能成為重組DNA的一部分。這些元件在DNA發(fā)揮功能中不一定是必要元件，但可能通過影響轉(zhuǎn)錄、mRNA的穩(wěn)定性等提高DNA的表達(dá)。可按需要將這些元件引入DNA中以期轉(zhuǎn)化DNA在細(xì)胞中獲得最優(yōu)效果。
常用的構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化目的細(xì)胞的重組DNA的方法在本領(lǐng)域是通曉的。可用同樣的組合物和構(gòu)建方法建立本文有用的DNA。例如，J.Sambrook編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第二版，1989)提供了合適的構(gòu)建方法。轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并回收hK2重組多肽采用轉(zhuǎn)染能容易地將包括有編碼hK2多肽之重組DNA的表達(dá)盒或表達(dá)載體導(dǎo)入目的細(xì)胞，如C.Chen等人在分子細(xì)胞生物學(xué)7,2745(1987)中優(yōu)化的磷酸鈣沉淀法。轉(zhuǎn)染也可用商品化試劑盒(如BRL公司提供)通過脂轉(zhuǎn)染法進(jìn)行。
合適于表達(dá)hK2多肽的宿主細(xì)胞來源于多細(xì)胞生物。這些細(xì)胞有復(fù)雜的加工和糖基化活性。原則上講，任何高等真核細(xì)胞培養(yǎng)物，無論其來源于脊椎動(dòng)物或無脊椎動(dòng)物，均可用于本發(fā)明中。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定了眾多的桿狀病毒株，突變型和相應(yīng)的允許昆蟲宿主細(xì)胞，如草地夜蛾(毛蟲)，埃及伊蟻(蚊子)，白紋伊蚊(蚊子)，黑腹果蠅(果蠅)和家蠶。參見Luckow等，生物/技術(shù)，6,47(1988)；Miller等，遺傳工程，J.K.Settow等編，第8卷(PlerumPublishing,1986),pp.277-279；Maeda等，自然，315，592(1985)。許多用于轉(zhuǎn)染的病毒株可公開得到，如苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-1突變株和家蠶NPV的Bm-5株，這些病毒優(yōu)選可用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。
當(dāng)hK2多肽在非人類來源的重組細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，hK2多肽就完全不含人類來源的蛋白質(zhì)或多膚。然而，必須從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽中純化hK2多膚以得到基本同質(zhì)于hK2多肽的制劑。例如，可通過離心培養(yǎng)基或裂解物除去細(xì)胞碎片，然后分離膜及可溶性蛋白質(zhì)部分?？梢詮目扇苄缘鞍踪|(zhì)級分中純化hK2多肽，如有必要，可以從裂解培養(yǎng)物的膜級分中進(jìn)行純化。隨后可從污染的可溶蛋白質(zhì)或多肽中純化hK2多肽，可采用的方法有免疫親和或離子交換柱分離，乙醇沉淀，反相HPLC，硅膠層析或陰離子交換樹脂層析(如DEAE)，層析聚焦，SDS-PAGE，硫酸銨沉淀，凝膠過濾(如利用Sephadex G-75)，或配體親和層析。
一旦從所得轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中分離出來，就很容易制備hK2多肽的衍生物和變體。如采用本領(lǐng)域所通曉的將羧基或前體轉(zhuǎn)化成酰胺的方法，也可以制備本發(fā)明hK2多肽的酰胺。C末端羧基酰胺化的一種優(yōu)選方法是從固相支持物上用合適的胺裂解多肽，或者在醇存在的條件下進(jìn)行裂解，生成酯，隨后用合適的胺進(jìn)行氨基分解作用。
制備hK2多膚的羧基鹽可按常規(guī)方法將肽與一或多當(dāng)量的目的堿混合而進(jìn)行，所述堿例如是金屬氫氧化物堿(如氫氧化鈉)，金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽(如碳酸鈉或碳酸氫鈉)；或胺基堿，如三乙胺，三乙醇胺等。
本多肽氨基的N-?；苌锏闹苽淇赏ㄟ^用N-?；Ｗo(hù)的氨基酸進(jìn)行最后的縮合反應(yīng)，或使保護(hù)或未保護(hù)的肽?；瘉硗瓿?。制備O-?；苌锟赏ㄟ^例如使自由羥基肽或肽樹脂的?；瘉硗瓿伞煞N?；刹捎贸Ｒ?guī)的?；噭﹣硗瓿桑珲；u化物，酐，酰基咪唑等。如需要，O-?；蚇-?；赏瑫r(shí)進(jìn)行。另外，圖1中hK2的內(nèi)部氨基酸序列可在指定位置進(jìn)行1個(gè)或2個(gè)保守氨基酸的替代(包括用D型而非L型氨基酸進(jìn)行替代)而得以修飾。
為制備多肽的酸化鹽，可向多肽中加入一或多當(dāng)量的無機(jī)酸或有機(jī)酸(如鹽酸)而進(jìn)行。多肽的羧基酯也可按本領(lǐng)域所通曉的常用方法進(jìn)行。hK2多肽變體已經(jīng)認(rèn)識(shí)到hK2多肽變體相對于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3或SEQID NO:5至少有1個(gè)氨基酸的替換，如相對SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:8在217位有由丙氨酸到纈氨酸的替換。特別地，氨基酸的替換以一種相對保守的方式進(jìn)行。在表1中，這種保守替換顯示在典型替換標(biāo)題下，更優(yōu)選的替換示于優(yōu)選替換的標(biāo)題下。在引入替換后，篩查產(chǎn)物的生物活性，如產(chǎn)生hK2特異抗體的能力，或與hK2特異抗體(即只與hK2結(jié)合而不與hK3(PSA)結(jié)合的抗體)特異反應(yīng)的能力。
表1原始?xì)埢?典型替換 優(yōu)選替換丙氨酸(A) 纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸 纈氨酸精氨酸(R) 賴氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺賴氨酸天冬酰胺(N) 谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸 谷氨酰胺天冬氨酸(D) 谷氨酸谷氨酸半胱氨酸(C) 絲氨酸絲氨酸谷氨酰胺(Q) 天冬酰胺 天冬酰胺谷氨酸(E) 天冬氨酸 天冬氨酸甘氨酸(G) 脯氨酸 脯氨酸組氨酸(H) 天冬酰胺，谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸 精氨酸異亮氨酸(I) 亮氨酸，纈氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，正亮氨酸 亮氨酸亮氨酸(L) 正亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，用硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸異亮氨酸賴氨酸(K) 精氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺 精氨酸甲硫氨酸(M) 亮氨酸，苯丙氨酸，異亮氨酸 亮氨酸苯丙氨酸(F) 亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，丙氨酸亮氨酸脯氨酸(P) 甘氨酸 甘氨酸絲氨酸(S) 蘇氨酸 蘇氨酸蘇氨酸(T) 絲氨酸 絲氨酸色氨酸(W) 酪氨酸 酪氨酸酪氨酸(Y) 色氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，絲氨酸苯丙氨酸纈氨酸(V) 異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸， 亮氨酸丙氨酸 正亮氨酸本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸替換，一般選用那些不會(huì)顯著改變它們在維持下述方面的替換(a)多肽骨架在替換區(qū)域的結(jié)構(gòu)，如片層或螺旋構(gòu)象；(b)分子在目標(biāo)位點(diǎn)的電荷和疏水性；(c)側(cè)鏈的大小。根據(jù)側(cè)鏈的性質(zhì)將天然存在的氨基酸分為以下幾組(1)疏水性正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；(2)中性親水性半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸；(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸；(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；(5)影響鏈走向的殘基甘氨酸，脯氨酸；(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
本發(fā)明也包括非保守替換的hK2變體。非保守替換包括上述組之一中的一個(gè)成員改變?yōu)榱硪唤M中的成員。將氨基酸替換引入本發(fā)明中DNA分子是按本領(lǐng)域所通曉的方法進(jìn)行的。重組hK2多肽的用途一旦分離出來，即可將hK2多肽及其有抗原活性的變體，衍生物和片段用于對來源于懷疑含hK2或抗hK2抗體之生物材料的樣品進(jìn)行hK2分析，如美國專利No5,516,639中所述。例如，通過如一或多個(gè)放射性標(biāo)記的肽殘基，可以將hK2多肽標(biāo)記上可檢測的標(biāo)志，用于和內(nèi)源的hK2競爭結(jié)合抗hK2抗體，即作為“俘獲抗原”與生理液體樣品中的抗hK2抗體結(jié)合，通過多種競爭免疫測定方式同hK2競爭與可固定的抗hK2抗體的結(jié)合，步驟如下(a)提供一定量的可附著于固體表面的抗hK2抗體；(b)混合含有hK2的生理樣品和已知量的帶有可檢測標(biāo)記的hK2多肽，以形成混合樣本；(c)將所述抗體和所述混合樣本充分作用，使抗體和hK2間發(fā)生免疫反應(yīng)，生成一種抗體-hK2復(fù)合物，以及在抗體與所述標(biāo)記多膚之間發(fā)生免疫反應(yīng)以形成抗體-標(biāo)記多肽復(fù)合物。
(d)從混合樣本中分離與hK2結(jié)合的抗體及與標(biāo)記多肽結(jié)合的抗體；(e)檢測或測定與附著于固體表面的抗體結(jié)合的標(biāo)記多肽以及仍存在于混合樣本中的標(biāo)記多肽的存在或量；(f)從步驟(e)的結(jié)果確定樣品中hK2的存在或數(shù)量。
在可通過競爭抑制免疫分析檢測樣品中內(nèi)源hK2的另一種方法中，向含有未知量內(nèi)源hK2的樣品中加入已知量的抗hK2抗體。選擇加入抗體的量，使其比全部結(jié)合樣品中估計(jì)存在的hK2(如在一個(gè)前列腺癌患者同樣數(shù)量的樣品材料中可能存在的量)所需的量少一些。然后，將標(biāo)記有可檢測標(biāo)記的已知量的本發(fā)明中hK2多肽或其亞基加入其中。如果內(nèi)源性hK2存在于樣品中，那么很少一些抗體與標(biāo)記的hK2多肽結(jié)合，這樣它就會(huì)以游離態(tài)存在于溶液中；如果樣品中無內(nèi)源性hK2，那么加入的標(biāo)記多肽就會(huì)與抗hK2抗體反應(yīng)形成二價(jià)復(fù)合物。隨后以抗哺乳動(dòng)物(綿羊，山羊，小鼠等)的IgG抗體使二價(jià)的抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來。沉淀物(三價(jià)復(fù)合物)中放射活性或其它標(biāo)記量與樣品中內(nèi)源性hK2的量成反比。例如，沉淀中放射活性的降低意味著內(nèi)源性hK2的存在。
除了在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和家畜中制備多克隆抗體或抗血清的常規(guī)方法外，可以利用已知的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備抗hK2多肽的單克隆抗體。一般來講，這一方法包括制備可產(chǎn)生抗體的融合細(xì)胞系，如初級脾細(xì)胞與相容的骨髓瘤連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系的融合，通過細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)或轉(zhuǎn)入骨髓瘤細(xì)胞來源動(dòng)物或相容動(dòng)物品系中培養(yǎng)，使融合細(xì)胞生長。與接種動(dòng)物產(chǎn)生的抗體相比，此種抗體有較多優(yōu)勢，例如它們有很好的特異性，靈敏性，并在免疫化學(xué)上相對較“純”。這些抗體的免疫活性片段如F(ab)片段以及部分人源化的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。嵌合和修飾抗體嵌合抗體包括從一種免疫球蛋白來源的可變區(qū)與另一種免疫球蛋白來源的恒定區(qū)之間的融合?？勺儏^(qū)通常來源于另一個(gè)種的免疫球蛋白，也許是人。這一技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。參見例如歐洲專利申請EP-A-0125 023(Cabilly/Genetech)和EP-A-0120694以及美國專利No4,816,567。這些文獻(xiàn)中公開了用重組DNA方法制備免疫球蛋白類分子的變體。
另一種制備嵌合或修飾抗體的途徑是將單克隆抗體的可變區(qū)與另一非免疫球蛋白分子連接，產(chǎn)生嵌合分子衍生物(參見WO86/01533,Neuberger and Rabbits/Celltech)。另一種方法是制備一種嵌合免疫球蛋白，使其在不同的可變區(qū)具有不同的特異性(參見EP68763A)。還有一種方法是向編碼單克隆抗體的DNA中引入一個(gè)突變，在不改變其基本特異性的情況下改變它的某些性質(zhì)。這可以通過定點(diǎn)誘變或本領(lǐng)域內(nèi)所通曉的其它技術(shù)完成。
Winter專利申請EP-A-0239400揭示了利用重組DNA技術(shù)(“CDR移植”)制備有所改變的衍生化抗體的方法，即用不同特異性的免疫球蛋白的補(bǔ)體決定區(qū)替代免疫球蛋白可變區(qū)的補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)。這樣，與構(gòu)架區(qū)域的改變相結(jié)合，CDR移植技術(shù)可以使抗體人源化。
也可以在缺乏天然免疫系統(tǒng)的小鼠體內(nèi)重建人類的免疫系統(tǒng)，然后免疫該小鼠以產(chǎn)生對免疫原特異的人類抗體，從而制備人抗體。
包含對感興趣抗原特異的嚙齒類抗體CDR區(qū)域的人源化抗體，更有可能不被人類免疫系統(tǒng)識(shí)別為異己。因此，具有相同結(jié)合特異性的人源化抗體，如HK1G464，可能在人類基因治療和/或診斷中有特異的用途。
操作和/或改變?nèi)魏我阎贵w或編碼該抗體的基因，以產(chǎn)生衍生抗體的技術(shù)，為本領(lǐng)域所通曉。利用逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測hK2特異的轉(zhuǎn)錄物為了檢測編碼hK2的RNA轉(zhuǎn)錄物，從懷疑有hK2 RNA的細(xì)胞樣品中分離RNA，如從人前列腺組織中分離總RNA。可采用本領(lǐng)域通曉的方法分離RNA，如利用TRIZOLTM試劑(GIBCO-BRL/Life Techno1ies)?？衫肙ligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中的引物從分離的RNA中制備第一鏈cDNA，產(chǎn)生的cDNA第一鏈隨后在PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增。
“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或PCR是指擴(kuò)增大量選定的核酸片段、DNA和/或RNA的過程或技術(shù)，這一技術(shù)在美國專利No4,683,195中被詳細(xì)敘述。通常，根據(jù)感興趣區(qū)域兩端或兩側(cè)的序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物。這些引物與待擴(kuò)增模板的相對鏈在序列上相同或相似?？捎肞CR擴(kuò)增特異的RNA序列，總基因組DNA來源的特異DNA序列，從總細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA，噬菌體或質(zhì)粒序列等。一般參見Mullis等，水生生物學(xué)冷泉港研討會(huì)，51,263(1987)；Erlich等，PCR技術(shù)(StocktonPress,NY,1989)。這樣，用PCR對特定核酸序列進(jìn)行的擴(kuò)增依賴于含有保守核苷酸序列的寡核苷酸或引物，可由相關(guān)基因或蛋白質(zhì)序列如與哺乳動(dòng)物hK2基因的序列比較推斷出該保守序列。例如，制備一條預(yù)計(jì)可與編碼hK2多肽之DNA的反義鏈退火的引物，和一條預(yù)計(jì)可與正義鏈退火的引物。
通常，分離的RNA在反轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng)中與一個(gè)引物配合，產(chǎn)生單鏈cDNA。O1igo-dT，隨機(jī)序列寡核苷酸以及序列特異的寡核苷酸均可在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中用作引物。參見Sambrook等(出處同前)。隨后用序列特異引物擴(kuò)增單鏈cDNA產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。
為檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，通常對反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或其它簡易分離技術(shù)，并檢測hK2特異的擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在。檢測擴(kuò)增的hK2DNA也可通過下述方法進(jìn)行將片段從膠中切割或洗脫下來(例如，參見Lawn等，核酸研究，9,6103(1981),Goeddel，核酸研究，8,4057(1980))，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到合適載體(如pCR Ⅱ載體，Invitrogen)的克隆位點(diǎn)，測定克隆插入片段的序列，并將該DNA序列與hK2的已知序列進(jìn)行比較。另外，也可用hK2特異的寡核苷酸探針通過例如Southern雜交檢測hK2的擴(kuò)增DNA，或與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)比較擴(kuò)增DNA的電泳遷移率。
參照下述詳細(xì)描述的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1材料與方法哺乳動(dòng)物hK2表達(dá)載體的構(gòu)建采用一對hK2特異的寡核苷酸引物(5’ACGCGGATCCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCT 3’；SEQ ID NO:9和5’ACAGCTGCAGTTTACTAGAGGTAGGGGTGGGAC 3’；SEQ ID NO:10).從人BPH組織的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)合成一長約為820bp的cDNA，如圖2所示，該cDNA編碼整個(gè)前原h(huán)K2(pphK2)，相對于pphK2轉(zhuǎn)錄物起始位點(diǎn)的第40-858位核苷酸。此cDNA的5’和3’端(相對于pphK2的正義鏈)的兩側(cè)分別有BamHⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)序列。隨后，cDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，BamHⅠ和PstⅠ酶切消化。經(jīng)消化的cDNA與經(jīng)BamHⅠ-Pstl酶切的pVL1393質(zhì)粒載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HB101菌株中。篩選含有pphK2 cDNA/pVL1393質(zhì)粒載體的大腸桿菌，測定其含有pphK2的插入片段的序列。在大腸桿菌中大量培養(yǎng)質(zhì)粒pphK2 cDNA/pVL1393并用CsC1梯度超速離心純化。
依據(jù)布達(dá)佩斯條款，于1994年5月2日將含有質(zhì)粒pphK2/pVL1393的大腸桿菌HB101保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，分配的登記號為ATCC69614。
以含有pphK2的質(zhì)粒pVL1393(由Young博士贈(zèng)送，Mayo Clinic)為模板，利用引物A(5’ATATGGATCCATATGTCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTCCA3’)(SEQ ID NO:11)和B(5’ATATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT3’)(SEQ ID NO:12)通過PCR擴(kuò)增，得到代表全部pphK2編碼區(qū)的0.8Kb片段(圖2)。將PCR產(chǎn)物插入TA-克隆抗體(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)中并測定整個(gè)插入片段的DNA序列。
為了得到哺乳動(dòng)物hK2表達(dá)載體，將含有hK2的插入片段從相應(yīng)的TA克隆中分離出來并插入到pGT-d質(zhì)粒(Berg等，核酸研究，20,54-85,1992)(由Brian Grinnell贈(zèng)送，Lilly)中的BclⅠ位點(diǎn)位于GBMT啟動(dòng)子調(diào)控下。將來源于相應(yīng)TA載體的0.8Kb野生型hK2插入片段分別克隆到質(zhì)粒pLNSX和pLNCX中(Miller等，生物技術(shù)，9,980(1989))，從而得到哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體PLNS-hK2和PLNC-hK2。插入片段在所有哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的方向由DNA測序鑒定。重組克隆的產(chǎn)生AV12-664(ATCC CRL-9595)是來源于經(jīng)腺病毒誘導(dǎo)的敘利亞倉鼠的一個(gè)細(xì)胞系，Du145細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充了10％胎牛血清(D10F)的DMEM(高葡萄糖)培養(yǎng)基中，PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清MEM培養(yǎng)基中。用磷酸鈣法(Maniatis等，出處同前，1989)將hK2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到AV12細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染3天后，將細(xì)胞重懸于D10F+200nM氨甲喋呤(MTX)中。2-3周后分離抗藥的細(xì)胞克隆，收集消耗培養(yǎng)基進(jìn)行Western分析。用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)將hK2哺乳動(dòng)物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到PC3和Du145中，在含有400μg/ml G418的培養(yǎng)基中篩選得到PC3-hK2和DU145-hK2克隆。蛋白質(zhì)的純化與測序?qū)V12-hK2克隆培養(yǎng)在D10F+200nM MTX培養(yǎng)基中，細(xì)胞長至約60％融合時(shí)，用Hanks平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，并將其重懸于無血清的HH4培養(yǎng)基中。加入無血清的消耗培養(yǎng)基7天后收集消耗培養(yǎng)基并貯存于-20℃。為了純化蛋白質(zhì)，將無血清的消耗培養(yǎng)基濃縮，換成pH8的50mM碳酸氫鈉溶液。樣品經(jīng)0.2μ濾器過濾后直接泵入TSK DEAE-5PW HPLC柱，21mm×150mm，流速為5ml/分鐘。緩沖液A中含有pH7.9的50mM碳酸氫鈉，緩沖液B含有50mM碳酸氫鈉和0.5M氯化鈉，pH7.6。用如下梯度洗脫得到洗脫曲線0-50％的緩沖液B35分鐘，第35-40分鐘為50-100％的緩沖液B,100％緩沖液B無梯度洗脫5分鐘，然后用緩沖液A進(jìn)行重新平衡。流速一直保持5ml/分鐘。在以上步驟中，可用硼酸鹽緩沖液代替碳酸氫鹽緩沖液，并不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。
采用干燥ELISA法(如下)，用兔抗pphK2抗體檢測DEAE級分中hK2的存在(Saedi等，分子細(xì)胞內(nèi)分泌學(xué)，109,237(1995))。匯集有hK2活性的各級分，用膜(10KD截留分子量)經(jīng)超濾將其濃縮至約5-8ml，加入固體硫酸銨至終濃度1.2M。樣品上樣至PolyLC聚丙烯天門冬酰胺柱，孔徑1000A,4.6mmX200mm，以通過疏水作用層析(HIC)分離蛋白質(zhì)。緩沖液A含有20mM磷酸鈉，1.2M硫酸鈉，pH6.3；緩沖液B含有50mM磷酸鈉，5％異丙醇，pH7.4。洗脫梯度是0-20％緩沖液B5分鐘，第5-20分鐘為20-55％緩沖液B，第20-23分鐘為55％緩沖液B無梯度洗脫，第23-25分鐘為55-100％的緩沖液B洗脫，再100％緩沖液B無梯度洗脫2分鐘，然后緩沖液A重平衡，流速1ml/分鐘。含有hK2的HIC洗脫峰在約50％的緩沖液B中洗脫下來，經(jīng)Centricon-10(Amicon)(截留分子量10KD)超濾重復(fù)濃縮后換成50mM(pH8)的硼酸鹽緩沖液中。用SDS-PAGE和Western雜交分析測定其純度。用于估計(jì)hK2v217濃度的消光系數(shù)為1.84A280=1mg/ml。
某些情況下，含有hK2的HIC峰進(jìn)一步用10/30 Pharmacia S12柱經(jīng)大小排阻層析(SEC)進(jìn)行純化。在這種純化中，含有hK2的HIC峰如上述超濾而濃縮至小于1ml，然后上樣到經(jīng)100mM pH7的乙酸銨或pH8的硼酸鈉緩沖液平衡的大小排阻層析柱上。流速為0.7ml/分鐘，隨后將hK2峰超濾濃縮。將從大小排阻層析柱中收集到的于乙酸銨中的峰經(jīng)冷凍干燥除去緩沖液，再重溶于水中。取一部分樣品于112℃真空狀態(tài)下在氣態(tài)的6N鹽酸中水解20小時(shí)，再重溶于0.1N鹽酸中，用Hewlett Packard Amino quant氨基酸分析儀分析，用OPA對伯胺進(jìn)行氨基酸柱前衍生化作用，用MOC對仲胺進(jìn)行氨基酸柱前衍生化作用。
用HK1G586.1(如下)親和樹脂對hK2進(jìn)行親和層析純化。按照Schneider(生物化學(xué)雜志，257,10766(1982))的方法將HK1G586.1單克隆抗體(mAb)與Pharmacia GammaBind Plus Sepharose(cat.No.17-0886)結(jié)合，簡述如下將HK1G586.1單克隆抗體與樹脂在4℃條件下旋轉(zhuǎn)攪拌過夜。對樹脂離心(500xg 5分鐘，4℃)，用0.2M三乙醇胺(pH8.2)洗滌樹脂2次。室溫(22℃)條件下，在新配制的交聯(lián)劑(0.2M三乙醇胺，pH8.2中的25mM dimethyl pimelimidatedihydrochloride)中將胺基交聯(lián)45分鐘。在20mM pH8.2的乙醇胺中室溫下淬滅樹脂5分鐘，后用1M氯化鈉、0.1M的磷酸根，pH7.0洗滌2次，再用磷酸緩沖鹽溶液洗滌樹脂2次，于4℃保存于0.05％NaN3中備用。
采用Applied Biosystems Model 477a脈沖液相測序儀對蛋白質(zhì)和肽進(jìn)行測序。477a型測序儀應(yīng)用自動(dòng)Edman降解化學(xué)，使氨基酸從N末端順序釋放，隨后形成PTH衍生物并由反相HPLC進(jìn)行色譜分析。將肽樣品上樣于測序儀經(jīng)biobrene處理的玻璃纖維濾膜支持物上，全蛋白質(zhì)樣品上樣于經(jīng)biobrene處理的濾膜上，或上樣于已預(yù)先激活的Porton濾膜上(Beckman,Fullerton,CA)，測序儀下來的樣品印跡首先在Novex系統(tǒng)(Novex,San Diego,CA)中以微凝膠進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)至Problot PVDF膜上，以考馬斯亮藍(lán)顯色，切下適當(dāng)條帶后直接從PVDF膜上測序。單克隆抗體的制備第一天將于完全福氏佐劑(CFA)中的50μl phK2腹膜內(nèi)注射A/J小鼠，第14天腹膜內(nèi)注射于不完全福氏佐劑中的phK2 25μg，并在第28天腹膜內(nèi)注射溶于PBS的phK2 25μg。融合3天前，以10μg溶于PBS的phK2靜脈內(nèi)強(qiáng)化小鼠免疫。殺死小鼠后，由脾臟制得單細(xì)胞懸液。將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞P3.653融合，以ELISA篩選克隆化雜交瘤細(xì)胞，并依據(jù)其對hK2v217上清和phK2v217上清的反應(yīng)性以及與PSA的最小反應(yīng)性進(jìn)行選擇。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)得到2個(gè)克隆HK1G464和HK1G586，用FACstar脈沖細(xì)胞分選儀將單個(gè)雜交瘤細(xì)胞分配到小鼠脾飼養(yǎng)層上進(jìn)行亞克隆。亞克隆HK1G464.3和HK1G586.1被用于進(jìn)一步分析。
除了免疫原為hK2v217，用明礬代替CFA和IFA，用BALB/C小鼠代替A/J小鼠外，采用與上述相同的步驟進(jìn)行另外一種融合，得到克隆HK1H247。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，將雜交瘤克隆HK1G464.3,HK1G586.1,HK1H247,HK1A523和HKD106.4保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號分別為HB11983,HB12026,HB12162,HB11876和HB11937。hK2肽免疫原的單克隆和多克隆抗體的制備將于完全福氏佐劑(CFA)中的100μg KLH偶聯(lián)肽皮下接種綿羊和山羊，間隔3周，用于不完全福氏佐劑(IFA)中的100μg肽加強(qiáng)免疫。
為制備肽免疫原的單克隆抗體，將100μg于完全福氏佐劑(CFA)中的KLH偶聯(lián)的肽皮下接種免疫Balb/c小鼠，間隔三周，用于不完全福氏佐劑中的100μg肽加強(qiáng)免疫?；蛘?，用50μg偶聯(lián)了KLH的肽腹膜內(nèi)注射免疫A/J小鼠二次，對陽性滴度的小鼠用25μg偶聯(lián)劑靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫一次。
在前三次免疫后，免疫注射后6-10天取動(dòng)物血對抗體進(jìn)行測試。將肽固定于0.25英寸聚苯乙烯小珠上(Clifton,Clifton Heights,PA)，平均每一個(gè)小珠與1μg牛血清白蛋白偶聯(lián)的肽在pH9.6的碳酸鹽緩沖液中4℃溫育過夜。用含有0.1％吐溫20的0.01M磷酸緩沖鹽溶液，pH7.4(PBS)洗滌小珠3次，用1％脫脂奶粉和1％BSA進(jìn)行封閉。將小珠與250μl 1∶100,1∶1000或1∶10000稀釋度的動(dòng)物血清共同溫育18小時(shí)。洗滌3次后，每小珠同與辣根過氧化物酶(Cappel-OrganonTeknica Corp.,Durham,Nc)偶聯(lián)的250μl兔抗綿羊，兔抗小鼠或兔抗山羊抗體，以150rpm在水平培養(yǎng)器上溫育3小時(shí)。以鄰苯二胺為底物，用分光光度計(jì)定量檢測酶信號。以未免疫的血清作陰性對照，并以對照讀數(shù)的倍數(shù)來表示免疫血清的測量值。
將從呈陽性血清滴度的小鼠脾中分離的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。用上述方法對這些細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體進(jìn)行篩選。用有限稀釋法對陽性克隆進(jìn)行亞克隆和再篩選。將單克隆雜交瘤注射到原初小鼠的腹腔內(nèi)以產(chǎn)生腹水。
為了純化單克隆和多克隆抗血清，首先用飽和硫酸銨沉淀及超凝膠ACA-34柱進(jìn)行分子大小層析而對抗血清進(jìn)行IgG分離。利用通過將肽經(jīng)溴化氰偶聯(lián)于Sepharose 4B而制成的柱進(jìn)一步親和層析純化多克隆抗體。用酸性PBS(pH2.45)將純化抗體從柱上洗脫下來。ELISA分析應(yīng)用干燥ELISA分析測定這些克隆的無血清消耗培養(yǎng)基中的hK2和hK2純化過程中收集級分中的hK2。37℃下，用50μl消耗培養(yǎng)基或柱級分覆蓋微滴定板(Becton Dickinson Labware,NJ)過夜。用含0.1％吐溫20的PBS(PBST)沖洗各孔，并用50μl一抗溫育1小時(shí)。用PBST再次沖洗培養(yǎng)孔，加入偶聯(lián)有辣根過氧化物酶(1∶500,JacksonImmunosearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)的50μl羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG-Fc抗體在37℃溫育1小時(shí)。用PBST沖洗培養(yǎng)孔，與鄰苯二胺二氫氯化物(OPD,Sigma,MO)溫育5分鐘，用ELISA讀數(shù)儀(Biotek Instruments,Inc.,EL310型，VT)測定顯色反應(yīng)在A490的讀數(shù)。所有樣品均分析二次，以轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒的AV12細(xì)胞的消耗培養(yǎng)基作陰性對照。
在液相ELISA中，可用生物素化的phK2v217,hK2v217和PSA對抗體進(jìn)行測試。按照Sensabaugh和Blake(泌尿?qū)W雜志，144,1523(1994))的方法純化PSA。將稀釋于50μl緩沖液A(8.82mM檸檬酸，82.1mM磷酸鈉(二價(jià)堿)，10％牛血清白蛋白，0.1％甘露糖醇，0.1％Nonidet P-40,pH7.0)中的20ng生物素化的hK2v217或phK2v217，或者稀釋于含10％馬血清(HS)的PBS中的0.25ng生物素化PSA與50μl雜交瘤上清，陰性對照上清(即，對于phK2v217和hK2v217，為無關(guān)的雜交瘤上清，對于PSA，為無關(guān)的溶于馬血清中的20μg/ml純化單克隆抗體)，或陽性對照上清(即，對于PSA為20μg/ml溶于馬血清中的純化單克隆抗體PSM773(抗PSA)，或?qū)τ趐hK2v217和hK2v217為雜交瘤HK1D104(抗hK2)的上清)共同溫育。一種抗hCG的單克隆抗體HC0514在PSA分析中用作陰性對照，在hK2分析中，一種抗tau的單克隆抗體ZTG085用作陰性對照。
將這些抗體和抗原的混合物在鏈親和素包被的微滴定板(Labsystems,Helsinki,Finland)中溫育1小時(shí)，不斷振蕩。用300μl含有0.1％吐溫20的PBS(PBST)沖洗滴定板三次，與1∶10000稀釋于HS的100μl辣根過氧化物酶偶聯(lián)的γ特異性山羊抗鼠IgG抗體(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.,Westgrove,PA)振蕩溫育1小時(shí)。第二次用PBST沖洗后，加入100μl于50mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，0.03％高硼酸鈉，pH5.0(SigmaChemical,St.Louis,MO)中的1mg/ml鄰苯二胺，振蕩顯色30分鐘。加入50μl 4N硫酸終止反應(yīng)。用微滴定板讀數(shù)計(jì)測量490nm和540nm處的光吸收以確定顏色強(qiáng)度。490nm吸收值超過2.6時(shí)用540nm處的讀數(shù)來修正。樣品測量值為平均數(shù)±三次測量的標(biāo)準(zhǔn)差，對照值為二次測量的平均數(shù)。Western雜交分析采用標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行Western雜交分析。用Centricon10(AmiconInc.,Beverly,MA)將無血清的消耗培養(yǎng)基濃縮10倍，在12％的凝膠中進(jìn)行SDS/PAGE電泳(Bio-Rad Inc,Melville,NY)。為了分析目的，用Pharmacia PhastSystem在8-25％梯度膠上進(jìn)行SDS/PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，4℃條件下用PBS中的2％脫脂奶粉封閉過夜。雜交膜經(jīng)沖洗后與一抗(1∶1000稀釋的腹水，或者1μg/ml純化的單克隆抗體或多克隆抗體)在22℃下溫育1小時(shí)，然后沖洗雜交膜并與二抗(1∶500稀釋的偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的山羊抗鼠抗體或偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體，JacksonImmunosearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)溫育。用DAB(Sigma,St.Louis,MO)和雙氧水，或按操作手冊使用ECL系統(tǒng)(Amersham,Buckinghamshire,England)使雜交條帶顯色，從而檢測免疫反應(yīng)性條帶。共價(jià)復(fù)合物的形成為測試共價(jià)化合物的形成，將0.175μM的hK2與20μM的抑制劑在pH8條件下溫育于100mM硼酸鹽緩沖液中。測試的抑制劑包括1-抗胰凝乳蛋白酶，1-抗胰蛋白酶，1-抗纖溶酶，抗凝血酶和2-巨球蛋白。向5μl hK2(10μg/ml)中加入制備于100mM硼酸鹽緩沖液中的計(jì)算量抑制劑，如有必要，可將每份樣品的總體積調(diào)整到10μl。樣品在37℃溫育3小時(shí)，加入1.5μl含35％β-巰基乙醇的7xPhastSystem SDS樣品緩沖液，水浴煮樣品3分鐘。在樣品進(jìn)行SDS/PAGE和Western雜交前將樣品1∶4稀釋于SDS樣品緩沖液中。肽底物的蛋白質(zhì)水解為了檢測hK2切割肽底物的能力，將肽以10mg/ml的濃度溶于二甲基亞砜(DMSO)中，然后用100mM pH8的硼酸鹽緩沖液進(jìn)行1∶10稀釋，該緩沖液中含有PSA,hK2或胰蛋白酶。典型的實(shí)驗(yàn)步驟如下將1μl肽加入7μl 100mM硼酸鹽緩沖液中，隨后加入2μl hK2(10μg/ml)，PSA(500μg/ml)，或胰蛋白酶(0.5μg/ml)。通常樣品在37℃溫育16小時(shí)。
用100μl 0.2％TFA/水失活樣品，直接上樣于Vydac C-18反相柱中，該柱與配置有AS100自動(dòng)上樣器、雙1350泵和Biodimension掃描式UV-VIS探頭的Biorad Model 800HPLC連接。溶液A為0.1％TFA/水，溶液B為含有0.1％TFA的乙腈。樣品在90％的溶劑A中上樣，10分鐘內(nèi)，梯度變?yōu)?0％的溶劑B。同時(shí)在220nm和280nm處監(jiān)測吸收值。
以真空離心或冷凍干燥濃縮HPLC收集下來的峰，隨后上樣到氨基酸測序儀中以確定各個(gè)片段。有時(shí)將10μl的滅活樣品直接上樣到測序膜上，并且，因?yàn)樾蛄惺且阎模释ㄟ^每個(gè)循環(huán)中氨基酸的分布來確定切割位點(diǎn)。用生色底物進(jìn)行蛋白酶分析對硝基苯胺衍生化底物水解的檢測是以配有可編程和熱穩(wěn)定的7室托架的HP8452A UV-VIS分光光度計(jì)進(jìn)行的。在溫育于37℃的100mM硼酸鈉溶液pH8中進(jìn)行測試，測定其在405nm的吸收強(qiáng)度增加值。甲氧基琥珀酰-精氨酸-脯氨酸-酪氨酸-對硝基苯胺(MeO-Suc-R-P-Y-pNA)和H-D-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-對硝基苯胺(P-F-R-pNA)在測試中的濃度為1mM。
采用標(biāo)準(zhǔn)FastMoc化學(xué)的ABI 431A型肽合成儀合成圖16中所列的除2號和5號以外所有的肽，2號為血管緊張肽原和5號氧化型胰島素β鏈，均購自Sigma。用質(zhì)譜儀通過ES/MS確定每一合成肽鏈的分子量，并用上述ABI 477a型測序儀證實(shí)肽序列。phK2v217向hK2v217的轉(zhuǎn)化將于50mM硼酸鈉中的100-400μg/ml phK2v217樣品在37℃下與1％(重量比)胰蛋白酶或hK2共同溫育。監(jiān)測從前體蛋白質(zhì)向成熟蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，這是通過取1-2μg的hK2v217起始材料稀釋于100μl HIC緩沖液中，如上所述用HIC-HPLC將2種形式分開而進(jìn)行的。除如圖17B所示將數(shù)量有可比性的這兩種形式同時(shí)溫育外，以同樣方式進(jìn)行hK2v217和phK2v217的溫育。實(shí)例2哺乳動(dòng)物細(xì)胞中hK2v217的表達(dá)與純化為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)hK2，用PCR方法擴(kuò)增hK2(pphK2)(圖2)的全部編碼序列0.8Kb片段，亞克隆到PCRII(TA)載體中并分離到幾個(gè)克隆。測定其中幾個(gè)克隆的整個(gè)pphK2插入片段的核苷酸序列，以檢測可能由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的突變。
選出二個(gè)克隆作進(jìn)一步分析，其中克隆TA-hK2含有野生型hK2插入片段，另一個(gè)克隆TA-hK2v217含有突變的hK2插入片段。TA-hK2v217在hK2的650位密碼子含有一個(gè)C到T的替換，導(dǎo)致hK2 217位的氨基酸殘基發(fā)生丙氨酸(GCT)到纈氨酸(GTT)的保守型替換(圖2)。為了得到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，將TA-hK2和TA-hK2v217的pphK2插入片段亞克隆到PGT-d質(zhì)粒中，使它們處于GBMT啟動(dòng)子的控制之下，從而得到pGThK2和pGThK2v217質(zhì)粒(圖3)。GBMT啟動(dòng)子包含幾個(gè)調(diào)控序列，并能被腺病毒Ela蛋白質(zhì)激活(Berg等，出處同前，(1992))。
為了檢測pphK2v217基因產(chǎn)物能否在哺乳細(xì)胞中表達(dá)，將質(zhì)粒pGThK2v217轉(zhuǎn)染到AV12-664細(xì)胞中。該細(xì)胞系來源于受12型腺病毒感染的敘利亞倉鼠產(chǎn)生的腫瘤，能表達(dá)腺病毒Ela蛋白質(zhì)。Ela蛋白質(zhì)激活GBMT啟動(dòng)子，從而使其控制下的基因開始表達(dá)。2-3周后，分離抗MTX的細(xì)胞克隆，用Western雜交分析其消耗培養(yǎng)基。鑒定了幾個(gè)能向培養(yǎng)基中分泌一種能與抗pphK2抗血清起免疫反應(yīng)的多肽的克隆。其中一個(gè)克隆(AV12-pGThK2v217#2)被選出來做進(jìn)一步的鑒定和蛋白質(zhì)純化。
為了純化hK2多肽，收集AV12-pGThK2v217細(xì)胞2號克隆培養(yǎng)7天后的無血清消耗培養(yǎng)基，濃縮，并進(jìn)行陰離子交換層析(圖4A)。經(jīng)ELISA分析確定有hK2活性的峰在0.2M NaCl梯度附近洗脫下來(虛線)。ELISA測試與同樣級分的SDS/PAGE中出現(xiàn)一條約34KD的蛋白質(zhì)條帶這一結(jié)果相符。
收集陰離子交換柱下來的hK2陽性級分，進(jìn)行疏水作用層析(HIC)(圖4B)。A280的主要部分不停留在HIC柱中。主峰停留在HIC中，該峰在22分鐘洗脫下來，并在ELISA測試中顯示了最高的活性(圖4C中虛線)。SDS/PAGE也能看到一條約34KD的主要蛋白質(zhì)帶。經(jīng)SEC對從HIC中下來的22分鐘洗脫峰進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，一般80-90％的蛋白質(zhì)A280在19.4分鐘時(shí)被洗脫下來，保留時(shí)間與大約34KD的蛋白質(zhì)相符(圖4C)。SEC僅有的另一蛋白質(zhì)峰在16.7分鐘時(shí)被洗脫，對應(yīng)于以前純化步驟中觀察到的大約70KD的蛋白質(zhì)。
為進(jìn)一步確定純化的蛋白質(zhì)，將大約2.5μg的該蛋白質(zhì)加到自動(dòng)N端分析儀上，得到如下序列結(jié)果Val-Pro-Leu-Ile-Gln-Ser-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Trp-Glu-。Edman降解中順序釋放的氨基酸曲線未見明顯的競爭序列。由PSA類推得出，此蛋白質(zhì)是phK2v217，因?yàn)橐阎墒霵SA的序列(由精液中分離)開始為Ile-Val-Gly-，而pPSA和phK2被認(rèn)為在N末端有7個(gè)額外的氨基酸(圖2)。對這個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸分析結(jié)果與phK2v217推測的序列一致。分離此phK2多肽并純化得到毫克級樣品。實(shí)施例3phK2v217的鑒定和hK2v217的生成為了測定實(shí)施例2中純化方案的效果，將1.5μg純化的phK2v217在有或者沒有β-巰基乙醇(BME)的條件下進(jìn)行SDS/PAGE電泳，并用銀染處理凝膠，結(jié)果顯示樣品中phK2v217的純度為95％左右(圖5)，同時(shí)顯示無BME時(shí)，phK2v217以30KD左右泳動(dòng)，而在有BME時(shí)，以34KD左右泳動(dòng)。這一情況與從精液中純化的PSA的觀察結(jié)果一致(圖5)。
從cDNA序列推測的hK2氨基酸序列顯示，在78位殘基(N-M-S)處存在一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。為確定這一位點(diǎn)是否糖基化，將phK2v217進(jìn)行SDS/PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與地高辛配基(DIG)偶聯(lián)的凝集素反應(yīng)，隨后加用辣根過氧化物所標(biāo)記的抗DIG抗體反應(yīng)。
在圖6(1泳道)中，伴刀豆球蛋白質(zhì)A(ConA)對2μg phK2的染色提示蛋白質(zhì)中存在兩個(gè)非取代的或2-0-取代的α-甘露糖殘基，2泳道為ConA染色的陽性對照糖蛋白-單克隆抗體ZCE025，該單克隆抗體的重鏈(50KD)和輕鏈(25KD)均有以甘露糖為核心的N聯(lián)寡糖。3泳道顯示非糖基化蛋白(BSA)不與ConA凝集素反應(yīng)。phK2v217也與RCA(Galbl-4GlcNAc特異性，和AAA(α(1-6)聯(lián)巖藻糖特異性)起反應(yīng)。這種凝集素反應(yīng)形式與復(fù)合N聯(lián)寡糖的存在相符。phK2v217中的寡糖也含有唾液酸，因?yàn)镾NA(唾液酸α(2-6)連接于半乳糖)和MAA(唾液酸α(2-6)連接于半乳糖)均能與phK2v217反應(yīng)。
hK2的前體區(qū)序列為VPLIQSR，在此前體序列中的精氨酸羧基端酶切能將phK2轉(zhuǎn)化成hK2。設(shè)計(jì)溫和的胰蛋白酶消化使其在純化的phK2v217這一位點(diǎn)將肽鍵水解。將phK2v217與1％胰蛋白酶一起溫育，用HIC-HPLC監(jiān)測此轉(zhuǎn)化過程(圖7)。這一步驟使phK2v217完全轉(zhuǎn)化為hK2v217。將確認(rèn)為是hK2v217的峰進(jìn)行N-末端測序，證明其序列為IVGGWE，該序列正是hK2成熟形式的N端序列。未檢測到除上述序列外的其它序列，說明胰蛋白酶的溫和水解沒有產(chǎn)生任何明顯水平的非特異性切割。經(jīng)胰蛋白酶處理的樣品在SDS/PAGE中發(fā)現(xiàn)遷移率有很小的但可辯別的增加，與分子量上存在826道爾頓(前肽分子量)的很小減少相符。實(shí)施例4hK2特異抗體的制備以phK2v217和hK2v217作免疫原來產(chǎn)生針對hK2的單克隆抗體。以對hK2v217或phK2v217的高反應(yīng)性和對PSA的最小反應(yīng)性為標(biāo)準(zhǔn)篩選雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞中得到的單克隆抗體代表如表2所示。以phK2v217免疫產(chǎn)生HK1G586.1單克隆抗體和HK1G464.3單克隆抗體。HK1G586.1是hK2特異的，因?yàn)樗茏R(shí)別phK2v217和hK2v217，但不識(shí)別PSA。另一方面，HK1G464是phK2特異的，因?yàn)樗鼉H識(shí)別phK2v217，而不識(shí)別hK2v217或PSA。
表2針對hK2v217和phK2v217產(chǎn)生的各種單克隆抗體的特異性A．針對phK2v217產(chǎn)生的單克隆抗體
>
B.針對hK2v217產(chǎn)生的單克隆抗體
以hK2v217免疫產(chǎn)生單克隆抗體HK1H247。這一抗體是hK2特異的，因?yàn)樗鼉H識(shí)別hK2v217而不識(shí)別phK2v217或PSA。這些結(jié)果顯示phK2v217和hK2v217是產(chǎn)生對不同hK2形式有特異性的單克隆抗體的有效免疫原。
用Western雜交來分析HK1G586是否識(shí)別精液中的hK2(圖8)。這一單克隆抗體識(shí)別約22KD,33KD和85KD處的hK2免疫反應(yīng)條帶。最近Deperthes等，生物化學(xué)及生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，1245,311(1995)也報(bào)導(dǎo)了在精液中相似的hK2免疫反應(yīng)模式。這一結(jié)果表明針對hK2v217的單克隆抗體能識(shí)別精液中的天然hK2。針對hK2v217或phK2v217產(chǎn)生的所有抗體均識(shí)別hK2的相應(yīng)形式，這表明hK2和phK2在免疫學(xué)上分別類似于hK2v217或phK2v217(見下述)。
為了制備其它的抗hK2抗體，對人類激肽釋放酶基因各成員的一級序列進(jìn)行了比較，并用計(jì)算機(jī)輔助分析抗原性和疏水性。根據(jù)比較結(jié)果，選出了幾個(gè)hK2寡肽序列。被選取的hK2肽分別對應(yīng)于成熟hK2氨基酸殘基的8-26位(SEQ ID NO:19),15-26位(SEQ ID NO:26),41-56位(SEQ ID NO:20),43-66位(SEQ ID NO:24),153-167位(SEQID NO:21),17-71(SEQ ID NO:22)和210-235(SEQ ID NO:25)。合成對應(yīng)于17-71位氨基酸的肽以增加產(chǎn)生識(shí)別天然hK2形式的抗體的可能性。在Mayo Clinic/Foundation蛋白質(zhì)中心試驗(yàn)室合成并以HPLC純化諸肽。將肽分別與匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)和BSA偶聯(lián)以作為免疫原和分析試劑。以KLH-hK2免疫綿羊、山羊和小鼠以生成多克隆抗體(綿羊?yàn)镾EQ ID NO:20和21，山羊?yàn)镾EQ ID NO:19、20、21、24、25、26)和單克隆抗體(小鼠，為SEQ ID NO:19、20、21、24、25和26)。將17-71肽(SEQ ID NO:22)氧化以在其26位和42位半胱氨酸之間產(chǎn)生分子內(nèi)二硫鍵，用來免疫山羊和小鼠，以分別制備多克隆抗體和單克隆抗體。
首先用hK2 41-56肽親和層析柱純化來自綿羊的hK2 41-56抗體，然后用于Western雜交分析。該抗體能識(shí)別重組hK2。hK2 41-56抗體對hK2的檢測可被過量加入的hK2 41-56肽所消除，但卻不能被PSA41-56肽消除。并且抗hK2 41-56肽的單克隆抗體在Western分析中對hK2蛋白質(zhì)高度特異。
抗hK2 153-167肽的抗血清(綿羊)識(shí)別重組的hK2。這些結(jié)果顯示，針對肽41-56和肽153-167的抗體與hK2多肽的2個(gè)不同表位反應(yīng)。
抗hK2 210-235位氨基酸殘基的抗血清表現(xiàn)了最高的免疫反應(yīng)性。
hK2 17-71肽與PSA對應(yīng)區(qū)域同源性為69％，針對hK2 17-71肽的山羊抗血清識(shí)別重組hK2蛋白但不識(shí)別PSA。
針對細(xì)菌表達(dá)的重組hK2蛋白質(zhì)的兔抗血清能識(shí)別PSA和hK2，其在用雄激素處理的LNCaP細(xì)胞的濃縮培養(yǎng)基中檢測到一對蛋白質(zhì)條帶，而在未經(jīng)雄激素處理的LNCaP細(xì)胞的培養(yǎng)基中則未檢測到免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)，說明這些免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)是由雄激素誘導(dǎo)的。并且，LNCaP培養(yǎng)基中上面一條帶是PSA相關(guān)蛋白質(zhì)，因?yàn)镻SA特異性抗血清(兔抗PSA抗血清，針對細(xì)菌表達(dá)的重組PSA產(chǎn)生的)主要檢測到該條帶。因?yàn)閷K2有單一特異性的抗hK2 41-56肽的小鼠單克隆抗體(HK1A523)識(shí)別LNCaP培養(yǎng)基中下面一條帶，這說明它是hK2相關(guān)蛋白質(zhì)。通過對這兩條帶中每一蛋白質(zhì)N-末端氨基酸的序列分析也確定了這一結(jié)果。
用hK2 41-56肽的單克隆抗體(HK1A523)對石蠟包埋的人前列腺組織切片的組織化學(xué)染色結(jié)果(見實(shí)施例10)顯示，如PSA一樣，hK2產(chǎn)生于上皮細(xì)胞中，而在基質(zhì)細(xì)胞中不產(chǎn)生。并且，免疫染色對前列腺組織中hK2蛋白是特異的，因?yàn)槠渌M織中hK2檢測均為陰性。實(shí)施例5hK2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)野生型hK2(hK2)，將pGThK2(圖3)轉(zhuǎn)染到AV12細(xì)胞中。用HK1D106.4(一種針對對應(yīng)于hK2 17-71位氨基酸殘基的多肽產(chǎn)生的hK2特異性單克隆抗體)，通過Western分析鑒定了幾個(gè)表達(dá)hK2多肽的克隆。AV12-hK2 27號克隆(AV1-hK2)因其較高的hK2表達(dá)水平而被選出來做進(jìn)一步的分析。轉(zhuǎn)染空載體(pGTD)的細(xì)胞與HK1D106.4沒有反應(yīng)性。
用HK1D106.4單克隆抗體進(jìn)行ELISA測試表明，在培養(yǎng)7天的AV12-hK2無血清消耗培養(yǎng)基中存在濃度為0.5-1μg/ml的hK2多肽。利用與從AV12-hK2v217中純化phK2v217的相同方法，從AV2-hK2培養(yǎng)7天的消耗培養(yǎng)基中純化hK2多肽。得到的純化hK2多肽產(chǎn)率較低，并且多肽對純化過程不穩(wěn)定。
將經(jīng)過上述方法部分純化的hK2多肽進(jìn)行SDS/PAGE電泳，電轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行N末端氨基酸測序。分析表明AV12-hK2培養(yǎng)7天的消耗培養(yǎng)基中hK2多肽的N末端序列為IVGGWECEK。由Edman降解步驟順序釋放的氨基酸圖譜未見明顯的競爭序列。與PSA比較得知，該序列對應(yīng)于成熟的hK2(hK2)。蛋白質(zhì)的氨基酸分析也表明與hK2相符。
該發(fā)現(xiàn)表明，在AV12-phK2v217培養(yǎng)7天的無血清消耗培養(yǎng)基中，phK2v217是主要成份，而在AV12-hK2培養(yǎng)7天的無血清消耗培養(yǎng)基中，hK2是主要成分。為了檢測AV12-hK2培養(yǎng)1天的無血清培養(yǎng)基中hK2的存在形式，用HK1G586.1單克隆抗體對其進(jìn)行親和層析以部分純化。將34KD的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜后進(jìn)行N末端分析，得到序列為VPLIQSRIVGG。由Edman降解步驟順序釋放的氨基酸圖譜未見明顯的競爭序列。與PSA比較得知，這個(gè)序列對應(yīng)于phK2。這揭示，在AV12-hK2和AV12-hK2v217細(xì)胞中，hK2多肽均是以前體形式被分泌的。然而phK2v217穩(wěn)定，不轉(zhuǎn)化成hK2v217，而phK2不穩(wěn)定，容易在細(xì)胞外轉(zhuǎn)化成hK2。實(shí)施例6hK2的生物合成為進(jìn)一步研究hK2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生物合成，每天收集AV12-hK2細(xì)胞27號克隆的無血清消耗培養(yǎng)基，連續(xù)8天，濃縮后進(jìn)行SDS/PAGE電泳，進(jìn)行時(shí)間分析。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用HK1D106.4或HK1G464.3單克隆抗體探測(圖9)。如圖9所示，HK1D106.4識(shí)別phK2和hK2兩種多肽，而HK1G464.3僅識(shí)別phK2，因?yàn)槠浔砦晃挥趆K2的-7-+7區(qū)域。以HK1D1.064單克隆抗體檢測時(shí)，hK2多肽(約34KD)的表達(dá)在第3天達(dá)到最高，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。培養(yǎng)4天后，能檢測到另外兩條以約70KD和約90KD遷移的免疫反應(yīng)條帶。
另一方面，將同樣樣品轉(zhuǎn)膜并用HK1G464.3進(jìn)行探測時(shí)，到第4天時(shí)能檢測到hK2水平逐漸降低。到第8天，只有非常低水平的hK2存在于消耗培養(yǎng)基中。這一結(jié)果表明AV12-hK2細(xì)胞將phK2分泌到培養(yǎng)基中，并在胞外逐漸轉(zhuǎn)化為hK2。奇怪的是，用HK1G464.3探測時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)70KD和90KD這兩條帶，說明這些條帶或是hK2的同型寡聚體，或是與另一未知蛋白質(zhì)共價(jià)復(fù)合的hK2。雖然目前尚未確定這些條帶的身份，但它們可以作為消耗培養(yǎng)基中hK2的存在標(biāo)志。圖9中，用純化的phK2v217和hK2v217蛋白做對照。
為研究hK2v217在AV12細(xì)胞中的生物合成，對AV12-hK2v217細(xì)胞2號克隆作了一個(gè)類似的時(shí)間研究。如圖10所示，以HK1D106.4單克隆抗體探測，hK2v217多肽的表達(dá)在第3天達(dá)到最高，第4天后無大的變化。以HK1G464.3單克隆抗體作探針探測該印跡時(shí)獲得類似的結(jié)果(圖10)。這些結(jié)果顯示，AV12-pGThK2v217細(xì)胞2號克隆從第1天開始表達(dá)phK2v217，至少在隨后的8天中持續(xù)表達(dá)，這種蛋白質(zhì)并不轉(zhuǎn)化為成熟形式。這些結(jié)果與phK2的結(jié)果不同，如果在培養(yǎng)基中保留8天，phK2會(huì)轉(zhuǎn)化成hK2，這就說明了phK2v217在37℃培養(yǎng)基中8天內(nèi)是穩(wěn)定的。
為研究細(xì)胞外phK2向hK2的轉(zhuǎn)化是否與培養(yǎng)物中AV12-hK2細(xì)胞27號克隆的活力相關(guān)，用臺(tái)盼蘭排除法對27號克隆細(xì)胞計(jì)數(shù)。用HK1D106.4和HK1G464.3兩種單克隆抗體對消耗培養(yǎng)基中hK2的表達(dá)進(jìn)行ELISA檢測。如圖11所示，培養(yǎng)物中存活細(xì)胞的數(shù)量在第3天時(shí)最高，達(dá)到3800萬，隨后逐漸減少。到第8天，存活細(xì)胞減少到1000萬。phK2的表達(dá)(以HK1G464.3檢測)也在第3天達(dá)到最高，并隨后逐漸減少。
另一方面，hK2的表達(dá)(HK1D106.4檢測)在第3天達(dá)到峰值，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。這一結(jié)果表明AV12-hK2細(xì)胞分泌phK2，到第4天時(shí)，一部分phK2在胞外被逐漸轉(zhuǎn)化成hK2。此外，結(jié)果顯示phK2向hK2的轉(zhuǎn)化與細(xì)胞活力的降低明顯相關(guān)，表明由死亡細(xì)胞釋放的胞外蛋白酶可能是這一轉(zhuǎn)化的因素之一。細(xì)胞最有活力時(shí)hK2的表達(dá)最高。hK2的減少平行于細(xì)胞活力的降低，表明hK2是由這些細(xì)胞分泌的，而不是在這些細(xì)胞死亡和裂解后才釋放出來。同時(shí)，hK2的升高與phK2的降低相對應(yīng)，說明隨著時(shí)間的發(fā)展，hK2的前體形式被自動(dòng)轉(zhuǎn)化為成熟形式。
為檢測hK2在前列腺癌細(xì)胞中的生物合成，使hK2在DU145和PC3細(xì)胞系中表達(dá)。將編碼pphK2的DNA克隆到pLNCX和pLNSX質(zhì)粒(Miller和Rosman，生物技術(shù)，7,980(1989))中，使其分別在CMV和SV40啟動(dòng)子的控制之下，分別得到pLNC-hK2和pLNS-hK2質(zhì)粒。將這兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC3和DU145細(xì)胞中，并在含G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。用ELISA和Western雜交的方法篩選高水平表達(dá)hK2的克隆(PC3-hK2和DU145-hK2)。
為了評價(jià)hK2和phK2在培養(yǎng)基中的表達(dá)水平，利用單克隆抗體HK1D106.4(hK2特異)和HK1G464.3(phK2特異)，對PC3-hK2和DU145-hK2細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行Western雜交(圖12)。結(jié)果顯示phK2存在于DU145-hK2和PC3-hK2的消耗培養(yǎng)基中，表明前列腺癌細(xì)胞中hK2是以phK2形式分泌的，并在胞外轉(zhuǎn)化成成熟形式。這個(gè)發(fā)現(xiàn)證實(shí)了以前由AV12細(xì)胞得到的結(jié)果。甚至培養(yǎng)7天后，PC3-hK2細(xì)胞的消耗培養(yǎng)基中phK2仍為優(yōu)勢成分，而從第1天開始，hK2即為DU145-hK2細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中的優(yōu)勢成分。這可能是因?yàn)镈U145消耗培養(yǎng)基中存在豐富的胞外蛋白酶。
為了檢測以上結(jié)果是否僅局限于1個(gè)克隆，檢測了另外3個(gè)獨(dú)立分離的AV12-hK2克隆和另外4個(gè)獨(dú)立分離的AV12-hK2v217克隆中hK2多肽的表達(dá)。在第7天收集這些克隆的無血清培養(yǎng)基，利用HK1D106.4(HK2特異)和HK1G464(phK2特異)單克隆抗體為探針，對hK2的表達(dá)進(jìn)行Western分析(圖13和14)。在所有AV12-hK2克隆中，HK1D106.4單克隆抗體不僅檢測到主要的34KD條帶(hK2)，也檢測到指示hK2存在的70KD和90KD條帶(圖13)。HK1G464.3在所有AV12-hK2克隆中檢測到非常低水平的phK2(圖14)。這一結(jié)果表明，所有AV12-hK2細(xì)胞克隆的消耗培養(yǎng)基中主要存在hK2，驗(yàn)證了在AV12-hK2細(xì)胞27號克隆中建立的生物合成機(jī)制。對AV12-hK2v217克隆做同樣分析(圖14)，結(jié)果表明這些克隆第7天的消耗培養(yǎng)基中僅有phK2v217的存在，驗(yàn)證了我們在AV12-hK2v217克隆中的發(fā)現(xiàn)。
綜上所述，以上結(jié)果表明hK2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以前體形式表達(dá)，并在胞外被尚不知道的酶轉(zhuǎn)化為成熟形式。這些結(jié)果也表明phK2可能存在于生物液體中，因此能作為pCa和BPH的一個(gè)有用診斷指標(biāo)。實(shí)施例7hK2和hK2v217的酶活性和特異性將少量hK2純化到足以用來分析其酶活性和底物特異性的純度，通過測定hK2對肽的對硝基苯胺衍生物的生色性酰胺水解活性來檢測hK2的一般活性(表3)。以A405的吸收測定這些底物的蛋白水解質(zhì)消化中釋放的對硝基苯胺。以底物甲氧基琥珀酰-精氨酸-脯氨酸-酪氨酸-對硝基苯胺(MeO-Suc-R-P-Y-pNA)來測定胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶的活性，該酶的切割位點(diǎn)在苯丙氨酸。該底物以前被用于檢測PSA的活性(Christensson等，歐洲生物化學(xué)雜志，194,755(1990))。底物H-D-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-對硝基苯胺(P-F-R-pNA)是胰蛋白酶樣蛋白酶特異的，該酶切割位點(diǎn)在精氨酸(R)。
hK2對P-F-R-pNA底物的總活性比hK2v217高10倍，但兩者均未表現(xiàn)對胰凝乳蛋白酶底物MeO-Suc-R-P-Y-pNA的水解能力。試驗(yàn)其它含有胰蛋白酶樣切割位點(diǎn)(賴氨酸、精氨酸)的可比底物，發(fā)現(xiàn)hK2水解P-F-R-pNA底物的速率最高，這些發(fā)現(xiàn)表明hK2有胰蛋白酶樣活性。
表3hK2、hK2v217、PSA和胰蛋白酶對生色底物的酰胺水解活性
使用肽底物和N末端氨基酸序列分析儀以確定被水解的肽鍵，從而對hK2和hK2v217的特異性進(jìn)行詳細(xì)分析。圖15顯示了對多肽CALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAAN的酰胺水解活性，該多肽含有胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶兩種酶的潛在切點(diǎn)。hK2v217在胰蛋白酶位點(diǎn)(R-K)和胰凝乳蛋白酶位點(diǎn)(Y-R)均可切割，且其在胰蛋白酶位點(diǎn)的切割與其在胰凝乳蛋白酶位點(diǎn)的切割比為2∶1。作為這些實(shí)驗(yàn)的對照，也將phK2v217與該肽共同溫育，并未發(fā)現(xiàn)酰胺水解活性。hK2對該肽底物表現(xiàn)了與hK2v217不同的特異性。沒有發(fā)現(xiàn)hK2對這個(gè)底物有胰凝乳蛋白酶樣特異性，其活性全部在胰蛋白酶樣位點(diǎn)(R-K)。該多肽中其它賴氨酸殘基均未被水解，說明hK2的特異性只在精氨酸殘基。
作為對照，將胰蛋白酶也用于對這個(gè)底物的研究，胰蛋白酶切割除K-P鍵(已知不是胰蛋白酶的合適切割位點(diǎn))外的所有賴氨酸(K)和精氨酸(R)位點(diǎn)。對210-236底物(圖16,1號肽)的R-K位點(diǎn)，胰蛋白酶的切割速度大約比hK2快4倍，比hK2v217快大約4000倍。胰蛋白酶不切割胰凝乳蛋白酶樣位點(diǎn)。PSA主要切割Y-R鍵。也發(fā)現(xiàn)PSA有較弱的對R-K鍵的胰蛋白酶樣活性(圖15)，這與以前發(fā)現(xiàn)PSA對生色底物(表2)有較弱胰蛋白酶樣活性的結(jié)果相符。
也將其它幾種肽底物與hK2和PSA共同溫育(圖16)。在所有試驗(yàn)肽中，hK2僅對某些精氨酸有特異性，PSA主要對某些酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)殘基有特異性。圖16中只有1號肽被hK2v217切割，在圖15的色譜圖中有詳細(xì)說明。實(shí)施例8hK2對phK2v217的激活圖16中3號肽的序列對應(yīng)于phK2的-7-+7位的氨基酸殘基。該區(qū)包含前肽VPLIQSR，已發(fā)現(xiàn)這是phK2v217多肽的N末端前導(dǎo)肽。如上所述，hK2能夠切割這個(gè)肽并釋放前肽區(qū)域，而hK2v217則不能。為了描述hK2是否能切割天然底物的這個(gè)前肽區(qū)域，對它將phK2v217轉(zhuǎn)化成hK2v217的能力進(jìn)行了監(jiān)測。將phK2v217與1％hK2共同溫育，用HIC-HPLC方法監(jiān)測轉(zhuǎn)化過程(圖17A)。結(jié)果顯示hK2能夠?qū)hK2v217轉(zhuǎn)化為hK2v217，但它的轉(zhuǎn)化速率比胰蛋白酶慢近30倍。當(dāng)phK2v217和40％hK2v217共同溫育時(shí)，即使經(jīng)過6個(gè)小時(shí)，兩種hK2形式的比例也沒有變化(圖17B)。這個(gè)結(jié)果證實(shí)了以前對該肽底物的觀察，還表明，即使對于天然底物，只有hK2能切割hK2的前肽區(qū)域，而hK2v217則不能。
這些結(jié)果綜合表明，即使延長溫育時(shí)間，phK2v217和hK2v217也是穩(wěn)定的。與hK2v217相比，hK2具有更高的蛋白水解活性和更高的特異性，特別是具有對hK2前體形式的特異性，圖15中對前體肽的活性和圖17中對phK2v217的活性均證實(shí)了這種特異性。
這些結(jié)果證實(shí)hK2和hK2v217在酶活性方面有顯著差異，并可能有助于解釋從培養(yǎng)基中純化hK2時(shí)的低產(chǎn)率(與phK2v217相比)。如在其它活性蛋白酶中見到的一樣，高純度的hK2制劑可能因?yàn)樽陨硭舛环€(wěn)定。這些結(jié)果進(jìn)一步提示，除了免疫試驗(yàn)以外，還可用對hK2特異底物的酶活性監(jiān)測體液中這種蛋白質(zhì)的水平。實(shí)施例9與hK2形成抑制劑復(fù)合物PSA能與α2巨球蛋白(MG)，絲氨酸蛋白酶抑制劑抗胰凝乳蛋白酶(ACT)形成復(fù)合物。為了研究hK2復(fù)合物的形成，將其與人血漿中常見的一系列蛋白酶(ACT,α2-抗纖溶酶，抗凝血因子Ⅲ和α1-抗胰蛋白酶(Trayis和Salvesen，生物化學(xué)年度回顧，52,655(1983))一起溫育，并對混合物進(jìn)行Western雜交分析(圖18)。在還原條件下，hK2與這些絲氨酸蛋白酶抑制劑形成的任何共價(jià)復(fù)合物都得到大約80-100KD的條帶。
ACT和α2-抗纖溶酶與hK2形成顯著的復(fù)合物(圖18,1泳道和2泳道)，抗凝血因子Ⅲ(3泳道)與α1-抗胰蛋白酶(α1蛋白酶抑制劑，4泳道)不與hK2形成可檢測的復(fù)合物。血漿蛋白質(zhì)的一種主要成分MG能迅速與hK2復(fù)合(5泳道)，該復(fù)合物對應(yīng)的分子量為200KD和120KD左右，當(dāng)PSA與經(jīng)純化的MG共同溫育時(shí)也能形成這樣的復(fù)合物(圖18,8泳道，見下述)。非常有趣的是，雖然α1-抗胰蛋白酶這種蛋白質(zhì)能抑制許多胰蛋白酶樣蛋白酶(Loebermann等，分子生物學(xué)雜志，177,531(1984)；Carrell和Trayis,TIBS,10,20,(1985))，但hK2不能與它形成復(fù)合物。
hK2與α2抗纖溶酶形成復(fù)合物并不奇怪，因?yàn)棣?抗纖溶酶在其抑制劑活性位點(diǎn)含有精氨酸殘基(Hunt和Dayhoff，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊，95,864(1980)；Chardra等，生物化學(xué)，22,5055(1983)；Potempa等，科學(xué)，241,699(1985)；Shieh等，生物化學(xué)雜志，264,13420(1989)；Mast等，生物化學(xué)，30,1723(1991))。然而hK2與ACT形成復(fù)合物卻是在意料之外，因?yàn)锳CT在其抑制劑活性位點(diǎn)有一個(gè)亮氨酸。雖然圖16和表2表明PSA和hK2具有完全不同的蛋白水解特異性，但它們在結(jié)構(gòu)上的相似性顯然影響了它們與常見抑制劑形成復(fù)合物的性質(zhì)。
Western雜交(圖18)顯示，加到人類女性血清中的hK2能迅速與MG形成復(fù)合物。1泳道和3泳道是分別僅有hK2和血清的對照。2泳道為與ACT共同溫育的hK2，顯示出90KD的hK2-ACT復(fù)合物及殘余hK2。4泳道和5泳道分別為加入血清中15分鐘和1小時(shí)的hK2。6泳道是與經(jīng)純化的MG溫育4小時(shí)的hK2。7泳道是加入血清中15分鐘的PSA,8泳道是與經(jīng)純化的MG溫育4小時(shí)的PSA。
結(jié)果表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)把hK2或PSA加到人血清中時(shí)，MG是主要與hK2或PSA形成復(fù)合物的成份。因?yàn)橐阎谇傲邢偌膊』颊叩难逯蠵SA與ACT形成復(fù)合物，人們確信血清中存在的hK2也會(huì)形成一定水平的ACT復(fù)合物。討論目前尚不知道PSA或hK2在體內(nèi)的蛋白質(zhì)加工和分泌機(jī)制。本發(fā)明的結(jié)果表明，AV12-hK2、DU145-hK2和PC3-hK2細(xì)胞均能分泌phK2，說明正常情況下，hK2是以phK2形式分泌的，此前體肽在胞外被切割。這提示phK2存在于生物液體中，因此可用于診斷pCa或BPH的一個(gè)有效指標(biāo)。
突變型hK2(hK2v217)和野生型hK2都能從AV12細(xì)胞中純化得到。如同在其它蛋白酶中發(fā)現(xiàn)的一樣，可能由于其自身催化的能力，hK2對使用的純化過程非常不穩(wěn)定，使純化足夠量的hK2或phK2以用作免疫原和標(biāo)準(zhǔn)品非常困難。相反，phK2v217高度穩(wěn)定，可被胰蛋白酶消化，生成也很穩(wěn)定的hK2v217。純化的phK2v217和hK2v217為產(chǎn)生hK2和phK2特異性單克隆抗體提供了免疫原。實(shí)施例10單克隆抗體586對前列腺組織的免疫反應(yīng)性以HK1523對正常前列腺組織進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)染色出現(xiàn)在上皮細(xì)胞而非基質(zhì)細(xì)胞。并且，hK2的表達(dá)是前列腺特異的，因?yàn)槠渌M織，如腎臟和胰腺不能著色。為了確定hK2是否在前列腺組織中表達(dá)，如果是，是否和前列腺癌相關(guān)，取得264個(gè)前列腺全切除樣品進(jìn)行比較分析，其中257個(gè)樣品來源于未受治療的患者(圖20)，7個(gè)樣品來自經(jīng)雄激素饑餓治療的病人(圖21)。分析每個(gè)樣品中良性上皮細(xì)胞區(qū)、高度前列腺上皮內(nèi)肉瘤區(qū)(PIN)和腺癌細(xì)胞區(qū)hK2的胞質(zhì)表達(dá)。
將前列腺組織稱重，三維測量并記錄。頂端和底端各切去4-5mm后以3mm連續(xù)切塊。剩余前列腺從腺體頂端到精囊尖端，垂直于腺體長軸用刀以4-5mm間距連續(xù)切塊。制成橫切片，用蘇木精-伊紅染色。每個(gè)前列腺全切除的癌患者選一張既包括癌組織又包括良性組織的切片，采用本領(lǐng)域通曉的技術(shù)固定于10％中性福爾馬林緩沖液中并用石蠟包埋。
將載玻片上的組織切片先浸入二甲苯再浸入95％乙醇中脫蠟。為了封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片在甲醇/雙氧水中溫育10分鐘，然后自來水沖洗。隨后將切片置于pH6.0的10mM檸檬酸鹽緩沖液中，蒸汽處理30分鐘。切片冷卻5分鐘后，冷自來水流水沖洗。切片與5％山羊血清溫育10分鐘以封閉非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，然后溫和晾干切片。
將一抗(0.5μg/ml的hK1G586或PSM773)加到切片上，室溫靜置30分鐘，然后用自來水沖洗切片，隨后將切片與生物素標(biāo)記的兔抗鼠抗體溫育1小時(shí)，自來水沖洗。將切片與過氧化物酶偶聯(lián)的鏈親和素(1∶500)溫育30分鐘，然后自來水沖洗。隨后，將切片與3-氨基-9-乙基卡巴腙(ABC)生色劑溶液溫育15分鐘，再自來水沖洗。然后將切片用無汞蘇木精復(fù)染1分鐘，流水沖洗5分鐘。用水溶性粘片劑(甘油明膠)將切片固定。對良性上皮細(xì)胞、高度PIN和腺癌計(jì)數(shù)染色細(xì)胞，其中按10％進(jìn)制從0％到100％進(jìn)行分類。
良性萎縮腺體的染色最低，特別是炎癥區(qū)域幾乎沒有免疫反應(yīng)性，無明顯萎縮的增生腺泡或良性腺泡有中度到強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性，通常在核上方的分泌性腔細(xì)胞層中呈顆粒狀分布，常延伸到腔表面。尿道和viva montanum的尿道上皮不著色，盡管下邊的腺體常常顯示免疫反應(yīng)性?；?xì)胞常為陰性。
有高度PIN的標(biāo)本在整個(gè)胞質(zhì)中、多數(shù)情況下在胞質(zhì)頂端的小泡中顯示出強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性。在不同類型的PIN中免疫反應(yīng)性并無明顯差別，只是在Cribiform類型中，中央部分的強(qiáng)度通常比邊緣部分淺。
實(shí)際上所有癌標(biāo)本中均有強(qiáng)烈的胞質(zhì)反應(yīng)。含有較多胞質(zhì)泡的細(xì)胞著色較淺，包括指環(huán)狀細(xì)胞和粘蛋白區(qū)域，其它胞質(zhì)均強(qiáng)烈染色。最強(qiáng)烈的染色出現(xiàn)在最高等級的腺癌中(Gleason四級)，其在所有病例中均表現(xiàn)免疫反應(yīng)性。有Cribiform癌的病灶類似于CribiformPIN，相似之處在于邊緣染色較中心強(qiáng)。邊緣在域或癌發(fā)展的前沿常有強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性。
在7個(gè)經(jīng)過雄激素饑餓療法治療患者的樣品中，大多數(shù)良性萎縮性腺泡中無免疫反應(yīng)性或較弱，雖然PIN和腺癌有時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的胞質(zhì)染色。
以單克隆抗體HK1G586對良性上皮、高度PIN和腺癌進(jìn)行染色，其細(xì)胞染色計(jì)數(shù)匯總于表4中。對其配對分析，即良性與PIN配對，良性與癌配對，PIN與癌配對可揭示各類之間的顯著差異(P＜0.001,Spearman Rank Correlation)。
表4與hk1G586的免疫反應(yīng)性
這樣，前列腺組織中胞質(zhì)hK2表達(dá)的增加與前列腺增生和前列腺癌相關(guān)。雖然因?yàn)闃悠份^少，來源于經(jīng)雄激素饑餓療法治療的患者的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不太顯著，但與未治療病人相比，這些患者在良性上皮、高度PIN和腺癌中hK2的表達(dá)均有所減少。所以，前列腺中hK2表達(dá)的上升是高度PIN和前列腺癌的一個(gè)新指標(biāo)。實(shí)施例11前列腺癌細(xì)胞中hK2 RNA的RT-PCR檢測因?yàn)榇蠖鄶?shù)前列腺癌是隱性的，所以從組織活檢樣品中(如前列腺包膜、骨髓或淋巴結(jié))或生理液體(如血液、血清或精液)檢測表達(dá)hK2的細(xì)胞就非常有效。這種檢測方法優(yōu)選地可以從大量不表達(dá)hK2的細(xì)胞中檢測出表達(dá)hK2的單個(gè)細(xì)胞。優(yōu)選地，該方法能從包括至少約104個(gè)細(xì)胞的樣品中檢測出表達(dá)hK2的單個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選地為從包括至少106左右個(gè)細(xì)胞，或更優(yōu)選為107左右個(gè)細(xì)胞的樣品中檢測出表達(dá)hK2的單個(gè)細(xì)胞。為了提供這樣一種錄敏的檢測方法，應(yīng)用了hK2轉(zhuǎn)錄物特異的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。
A．LNCaP細(xì)胞系為了測定用RT-PCR方法檢測hK2特異性轉(zhuǎn)錄物的靈敏性，將表達(dá)人PSA和hK2的LNCaP細(xì)胞系系列稀釋于黃色層細(xì)胞中。黃色層細(xì)胞由正常男性或女性的全血中分離得到。在檸檬酸鹽-右旋葡萄糖管中收集5-7ml靜脈血，4℃下，將樣本在1000xg離心15分鐘。從細(xì)胞團(tuán)的頂部回收黃色層細(xì)胞。
以每分鐘1500轉(zhuǎn)，將黃色層細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞混合物離心5分鐘，然后從沉淀的細(xì)胞團(tuán)中提取RNA。采用酸酚-氯仿-異硫氰酸胍方法分離RNA(Chomczynski等，分析化學(xué)，162,156,1987，)用氯仿-T醇(4∶1，體積比)進(jìn)一步抽提RNA以除去殘留血紅素，血紅素會(huì)抑制逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。然后用無RNA酶的DNA酶處理分離的RNA。
為制備cDNA的第一鏈，將一份含有1μg總RNA的樣品加入到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，該逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含100pmol PSA特異的寡核苷酸引物(5’TCATCTCTGTATCC 3’,SEQ ID NO:13)或100pmol hK2特異的寡核苷酸引物(5’GAGTAAGCTCTA 3’,SEQ ID NO:14)，和Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL)。將終體積調(diào)至25μl(50mM Tris-鹽酸，pH8.3,75mM氯化鉀，3mM氯化鎂，10mM二硫蘇糖醇，0.5mM每種dNTP，以及800單位Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)。將反應(yīng)在42℃溫育15分鐘，然后95℃加熱15秒使酶熱滅活。
為擴(kuò)增PSA第一鏈cDNA，以PSA特異的引物對，將由PSA特異寡核苷酸引發(fā)的第一鏈cDNA 10μl在PCR(0.2mM每種dNTP,0.5單位AmpliTaq聚合酶，50mM氯化鉀，10mM Tris-鹽酸，pH8.3,1.5mM氯化鎂，0.1％(w/v)明膠)中進(jìn)行擴(kuò)增。PSA的PCR擴(kuò)增利用了50pmol的PSA-1(5’GATGACTCCAGCCACGACCT 3’,SEQ ID NO:1 5)和50pmol的PSA-2(5’CACAGACACCCCATCCTATC 3’,SEQ ID NO:16)。為了擴(kuò)增hK2的第一鏈cDNA，以hK2特異的引物對將由hK2特異寡核苷酸引發(fā)的第一鏈cDNA在PCR(0.2mM每種DNTP,0.5U AmpliTaq聚合酶，50mM KCl,10mMTris-HCl,pH8.3,1.5mM MgCl2,0.1％(w/v)明膠)中進(jìn)行擴(kuò)增。hK2的PCR擴(kuò)增利用了50pmol hK2-1(5’GAGGGTTGTGTACAGTCATGGAT3’,SEQID NO:17)和50pmol hK2-2(5’ACACACTGAAGACTCCTGGGGCG 3’,SEQID NO:18)。
所用的循環(huán)參數(shù)如下35-40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃，1分鐘；58℃(PSA)或60℃(hK2),90秒；72℃,90秒。最后一個(gè)循環(huán)為72℃ 10分鐘。取反應(yīng)樣品在1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴乙錠染色后在紫外燈下觀察。將部分?jǐn)U增產(chǎn)物從凝膠中切下來，并亞克隆到pCRⅡ載體(Invitrogen,San Diego,CA)中以供測序。
PSA特異的PCR擴(kuò)增出一條710bp的產(chǎn)物，hK2特異的PCR擴(kuò)增出一條405bp的產(chǎn)物。稀釋分析結(jié)果表明，分別在106和107個(gè)白細(xì)胞中可有效檢測到單個(gè)LNCaP細(xì)胞所表達(dá)的PSA或hK2 RNA(圖22A)。非常出人意外的是RT-PCR檢測LNCaP來源的hK2轉(zhuǎn)錄物比LNCaP來源的PSA轉(zhuǎn)錄物要高10倍稀釋度。B．前列腺癌患者用RT-PCR分析來自6個(gè)前列腺癌患者和2個(gè)正常男性的血樣。按前述方法，從8個(gè)男性中取得黃色層細(xì)胞并提取RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。在6個(gè)前列腺癌患者中，包括1個(gè)臨床B期前列腺癌患者，2個(gè)已知發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者(臨床D2期)，和3個(gè)病理C期患者。病理A-C期的前列腺癌是局部形式的前列腺癌，病理D1期前列腺癌已擴(kuò)散到淋巴結(jié)(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，病理D2期是全身性前列腺癌(全身性轉(zhuǎn)移)。關(guān)于前列腺癌病理期的詳細(xì)內(nèi)容，參見Moreno等(癌癥研究，52,6110(1992))，Deguchi等(癌癥研究53,5350(1993))和Katz等(泌尿?qū)W，43,765(1994))。
結(jié)果顯示67％的前列腺癌患者表達(dá)hK2,17％表達(dá)PSA,17％既表達(dá)hK2也表達(dá)PSA。在正常對照組中，無可檢測水平的PSA或hK2 RNA。
這樣，hK2 RNA的檢測可以作為前列腺癌微轉(zhuǎn)移早期檢測的一個(gè)有效標(biāo)志。
本發(fā)明并不局限于所顯示和所敘述的細(xì)節(jié)，因?yàn)樵诒景l(fā)明權(quán)利要求所述的發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)，可以做很多修改和變化。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Mayo Foundation for Medical Education andResarch,and Hybritech Incorporated(ⅱ)發(fā)明名稱轉(zhuǎn)移性前列腺癌的檢測方法(ⅲ)序列數(shù)26(ⅳ)通信地址(A)地址Schwegman,Lundberg,Woessner和Kluth,P.A.
(B)街道P.O.Box 2938(C)城市Minneapolis(D)州MN(E)國家美國(F)郵政編碼55402(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件Fast SEQ Version 2.0(ⅵ)本次申請信息(A)申請?zhí)栁粗?B)申請日1997年11月14日(C)分類(ⅶ)在先申請信息(A)申請?zhí)?8/759,354(B)申請日1996年11月14日(A)申請?zhí)朠CT/US96/06167(B)申請日1996年5月2日(A)申請?zhí)?8/622,046(B)申請日1996年3月26日
(A)申請?zhí)?8/427,707(B)遞交日期1995年5月2日(ⅷ)代理機(jī)構(gòu)/代理人信息(A)姓名Embretson,Janet E(B)登記號39,665(C)參考/文檔號545.005WO1(ⅸ)電信聯(lián)系信息(A)電話612-359-3260(B)電傳612-359-3263(C)電報(bào)(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度237個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val15 10 15Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His20 25 30Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln35 40 45Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln50 55 60Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr ASn Met Ser65 70 75 80Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp85 90 95Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val100 105 110Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys115 120 125Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro130 135 140Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys145 150 155 160Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly165 170 175Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185 190Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu195 200 205Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His210 215 220Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Pro225 230 235(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度711個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:ATT GTG GGA GGC TGG GAG TGT GAG AAG CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG 48Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val1 5 10 15GCT GTG TAC AGT CAT GGA TGG GCA CAC TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC 96Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His20 25 30CCC CAG TGG GTG CTC ACA GCT GCC CAT TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG144Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln35 40 45GTC TGG CTG GGT CGG CAC AAC CTG TTT GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG192Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln50 55 60AGG GTC CCT GTC AGC CAC AGC TTC CCA CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC240Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser65 70 75 80CTT CTG AAG CAT CAA AGC CTT AGA CCA GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC288Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp85 90 95CTC ATG CTG CTC CGC CTG TCA GAG CCT GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG336Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val100 105 110AAG GTC CTG GGC CTG CCC ACC CAG GAG CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC384Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys115 120 125TAC GCC TCA GGC TGG GGC AGC ATC GAA CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC432Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro130 135 140AGG AGT CTT CAG TGT GTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT480Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys145 150 155 160GCT AGA GCT TAC TCT GAG AAG GTG ACA GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG528Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly165 170 175CTC TGG ACA GGT GGT AAA GAC ACT TGT GGG GGT GAT TCT GGG GGT CCA576Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185 190CTT GTC TGT AAT GGT GTG CTT CAA GGT ATC ACA TCA TGG GGC CCT GAG624Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu195 200 205CCA TGT GCC CTG CCT GAA AAG CCT GCT GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT672Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His210 215 220TAC CGG AAG TGG ATC AAG GAC ACC ATC GCA GCC AAC CCC711Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Pro225 230 235(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長度261個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly1 5 10 15Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu20 25 30Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala35 40 45His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala50 55 60His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu65 70 75 80Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe85 90 95Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg100 105 110Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu115 120 125Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln130 135 140Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile145 150 155 160Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu165 170 175His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val180 185 190Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr195 200 205Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln210 215 220Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro225 230 235 240Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr245 250 255Ile Ala Ala Asn Pro260(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長度832個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GGATCCAGC ATG TGG GAC CTG GTT CTC TCC ATC GCC TTG TCT GTG GGG 48Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly1 5 10TGC ACT GGT GCC GTG CCC CTC ATC CAG TCT CGG ATT GTG GGA GGC TGG 96Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp15 20 25GAG TGT GAG AAG CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG GCT GTG TAC AGT CAT144Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His30 35 40 45GGA TGG GCA CAC TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC CCC CAG TGG GTG CTC192Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu50 55 60ACA GCT GCC CAT TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG GTC TGG CTG GGT CGG240Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg65 70 75CAC AAC CTG TTT GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG AGG GTC CCT GTC AGC288His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser80 85 90CAC AGC TTC CCA CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC CTT CTG AAG CAT CAA336His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln95 100 105AGC CTT AGA CCA GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC CTC ATG CTG CTC CGC384Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg110 115 120 125CTG TCA GAG CCT GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG AAG GTC CTG GGC CTG432Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu130 135 140CCC ACC CAG GAG CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TGG480Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp145 150 155GGC AGC ATC GAA CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC AGG AGT CTT CAG TGT528Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys160 165 170GTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT GCT AGA GCT TAC TCT576Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser175 180 185GAG AAG GTG ACA GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG CTC TGG ACA GGT GGT624Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly190 195 200 205AAA GAC ACT TGT GGG GGT GAT TCT GGGGGT CCA CTT GTC TGT AAT GGT 672Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly210 215 220GTG CTT CAA GGT ATC ACA TCA TGG GGC CCT GAG CCA TGT GCC CTG CCT720Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro225 230 235GAA AAG CCT GCT GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT TAC CGG AAG TGG ATC768Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile240 245 250AAG GAC ACC ATC GCA GCC AAC CCC TGAGTGCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG 822Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Pro255 260TAAACTGCAG 832(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長度244個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys1 5 10 15His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His20 25 30Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His35 40 45Cys Leu Lys Lys ASh Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe50 55 60Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro65 70 75 80His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro85 90 95Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro100 105 110Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu115 120 125Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu130 135 140Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His145 150 155 160Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr165 170 175Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly195 200 205Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala210 215 220Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile225 230 235 240Ala Ala Asn Pro(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長度766個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..732(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GTG CCC CTC ATC CAG TCT CGG ATT GTG GGA GGC TGG GAG TGT GAG AAG 48Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys1 5 10 15CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG GCT GTG TAC AGT CAT GGA TGG GCA CAC 96His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His20 25 30TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC CCC CAG TGG GTG CTC ACA GCT GCC CAT144Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His35 40 45TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG GTC TGG CTG GGT CGG CAC AAC CTG TTT192Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe50 55 60GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG AGG GTC CCT GTC AGC CAC AGC TTC CCA240Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro65 70 75 80CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC CTT CTG AAG CAT CAA AGC CTT AGA CCA288His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro85 90 95GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC CTC ATG CTG CTC CGC CTG TCA GAG CCT336Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro100 105 110GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG AAG GTC CTG GGC CTG CCC ACC CAG GAG384Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu115 120 125CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TGG GGC AGC ATC GAA432Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu130 135 140CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC AGG AGT CTT CAG TGT GTG AGC CTC CAT480Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His145 150 155 160CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT GCT AGA GCT TAC TCT GAG AAG GTG ACA528Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr165 170 175GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG CTC TGG ACA GGT GGT AAA GAC ACT TGT576Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys180 185 190GGG GGT GAT TCT GGG GGT CCA CTT GTC TGT AAT GGT GTG CTT CAA GGT624Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys AsT Gly Val Leu Gln Gly195 200 205ATC ACA TCA TGG GGC CCT GAG CCA TGT GCC CTG CCT GAA AAG CCT GCT672Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala210 215 220GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT TAC CGG AAG TGG ATC AAG GAC ACC ATC720Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile225 230 235 240GCA GCC AAC CCC TGAGTGCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG TAAA 766Ala Ala Asn Pro(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度237個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val1 5 10 15Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His20 25 30Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val35 40 45Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln50 55 60Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser65 70 75 80Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp85 90 95Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val100 105 110Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys115 120 125Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro130 135 140Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys145 150 155 160Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly165 170 175Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185 190Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu195 200 205Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His210 215 220Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro225 230 235(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長度237個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val1 5 10 15Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His20 25 30Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln35 40 45Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln50 55 60Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser65 70 75 80Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp85 90 95Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val100 105 110Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys115 120 125Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro130 135 140Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys145 150 155 160Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly165 170 175Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185 190Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu195 200 205Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Val Val Tyr Thr Lys Val Val His210 215 220Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Pro225 230 235(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:ACGCGGATCC AGCATGTGGG ACCTGGTTCT CT 32(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:ACAGCTGCAG TTTACTAGAG GTAGGGGTGG GAC 33(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)長度42個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:ATATGGATCC ATATGTCAGC ATGTGGGACC TGGTTCTCTC CA 42(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:ATATGGATCC TCAGGGGTTG GCTGCGATGG T 31(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)長度14個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TCATCTCTGT ATCC 14(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)長度12個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GAGTAAGCTC TA12(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GATGACTCCA GCCACGACCT 20(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CACAGACACC CCATCCTATC20(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:GAGGGTTGTG TACAGTCATG GAT23(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:ACACACTGAA GACTCCTGGG GCG 23(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp1 5 10 15Ala His Cys(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO:21信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:22信息(ⅰ)序列特征(A)長度55個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His1 5 10 15Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln20 25 30Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln35 40 45Arg Val Pro Val Ser His Ser50 55(2)SEQ ID NO:23信息(ⅰ)序列特征(A)長度711個(gè)堿基對(B)類型氨基酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:ATTGTGGGAG GCTGGGAGTG CGAGAAGCAT TCCCAACCCT GGCAGGTGCT TGTGGCCTCT 60CGTGGCAGGG CAGTCTGCGG CGGTGTTCTG GTGCACCCCC AGTGGGTCCT CACAGCTGCC120CACTGCATCA GGAACAAAAG CGTGATCTTG CTGGGTCGGC ACAGCCTGTT TCATCCTGAA180GACACAGGCC AGGTATTTCA GGTCAGCCAC AGCTTCCCAC ACCCGCTCTA CGATATGAGC240CTCCTGAAGA ATCGATTCCT CAGGCCAGGT GATGACTCCA GCCACGACCT CATGCTGCTC300CGCCTGTCAG AGCCTGCCGA GCTCACGGAT GCTGTGAAGG TCATGGACCT GCCCACCCAG360GAGCCAGCAC TGGGGACCAC CTGCTACGCC TCAGGCTGGG GCAGCATTGA ACCAGAGGAG420TTCTTGACCC CAAAGAAACT TCAGTGTGTG GACCTCCATG TTATTTCCAA TGACGTGTGT480GCGCAAGTTC ACCCTCAGAA GGTGACCAAG TTCATGCTGT GTGCTGGACG CTGGACAGGG540GGCAAAAGCA CCTGCTCGGG TGATTCTGGG GGCCCACTTG TCTGTAATGG TGTGCTTCAA600GGTATCACGT CATGGGGCAG TGAACCATGT GCCCTGCCCG AAAGGCCTTC CCTGTACACC660AAGGTGGTGC ATTACCGGAA GTGGATCAAG GACACCATCG TGGCCAACCC C 711(2)SEQ ID NO:24信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu1 5 10 15Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val20(2)SEQ ID NO:25信息(ⅰ)序列特征(A)長度26個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr1 5 10 15Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala20 25(2)SEQ ID NO:26信息(ⅰ)序列特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys1 5 10
權(quán)利要求
1．一種檢測hK2 DNA的診斷方法，包括(a)從包含被懷疑含有hK2 RNA之細(xì)胞的人生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，在能有效地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的條件下，將一定量的該DNA與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸，從而得到一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，其中至少一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸；和(b)檢測擴(kuò)增的hK2 DNA的存在。
2．一種檢測人轉(zhuǎn)移性前列腺癌的方法，包括(a)從包含懷疑含有hK2 RNA之細(xì)胞的人生理樣品來源的RNA經(jīng)逆錄生成DNA，在能有效地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的條件下，將一定量的該DNA與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸，從而得到一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，其中至少一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸；和(b)檢測擴(kuò)增的hK2 DNA的存在，其中hK2 DNA的存在表明所述人體中有轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
3．權(quán)利要求1或2的方法，其中生理樣品是組織樣品。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述組織選自于包括前列腺、前列腺包膜、精囊、骨髓和淋巴結(jié)之組。
5．權(quán)利要求3的方法，其中所述組織是非前列腺組織。
6．權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生理樣品是液體。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述液體選自包含全血、血清和精液之組。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述液體是全血。
9．權(quán)利要求1或2的方法，其中所述擴(kuò)增的hK2 DNA在檢測前進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
10．權(quán)利要求1或2的方法，其中還包括確定擴(kuò)增的hK2 DNA的量。
11．權(quán)利要求1或2的方法，其中還包括(c)在能有效地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增前列腺特異抗原(PSA)DNA而擴(kuò)增hK2 DNA的條件下，將由人生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的DNA另一定量與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸，以產(chǎn)生擴(kuò)增的PSADNA；和(d)檢測擴(kuò)增的PSA DNA的存在。
12．一種檢測hK2 RNA的診斷方法，包括(a)從人類來源的生理樣品中提取RNA；(b)對提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以生成DNA；(c)在能有效地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的條件下，將該DNA與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸以生成一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，其中至少一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸；和(d)檢測擴(kuò)增的hK2 DNA的存在，其中擴(kuò)增hK2 DNA的存在表明人體中有轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品是組織樣品。
14．權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品是生理液體樣品。
15．權(quán)利要求12的方法，其中所述人做過前列腺完全切除術(shù)，hK2DNA的存在表明此人有持續(xù)性前列腺癌。
16．一種監(jiān)測前列腺癌發(fā)展的方法，包括(a)將由前列腺癌患者的生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，在能有效地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的條件下，將一定量的該DNA與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸以產(chǎn)生一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，其中至少一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸；(b)檢測或測定擴(kuò)增hK2 DNA的量；(c)過一段時(shí)間后重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)比較(b)和(c)步驟的結(jié)果，其中hK2 DNA量的增加表示所述人體中前列腺癌在發(fā)展。
17．一種病理確定前列腺癌階段的方法，包括(a)從前列腺癌患者的生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，在能有效地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的條件下，將一定量的該DNA與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸以生成一定量的擴(kuò)增hK2 DNA，其中至少一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸；和(b)檢測擴(kuò)增的hK2 DNA的存在或測定其量的大小，其中擴(kuò)增hK2DNA的存在或數(shù)量指示了前列腺癌的病理階段。
18．權(quán)利要求16或17的方法，其中所述人是前列腺完全切除術(shù)的候選者。
19．權(quán)利要求16的方法，其中(a)步驟的樣品是在病人接受激素治療以前取得的。
20．權(quán)利要求19的方法，其中激素治療指雄激素治療。
21．權(quán)利要求20的方法，其中雄激素治療指雄激素刺激性治療。
22．權(quán)利要求16或17的方法，其中所述樣品是非前列腺組織樣品。
23．權(quán)利要求16或17方法，其中所述樣品是生理液體樣品。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所述液體是全血。
25．檢測懷疑有hK2 RNA的生理樣品中hK2 RNA的一種診斷試劑盒，包括(a)已知量的第一種hK2特異的寡核苷酸，該寡核苷酸含有至少約7-50個(gè)核苷酸，并且該寡核苷酸與SEQ ID NO:4有至少約80％相同，和(b)已知量的第二種hK2特異的寡核苷酸，該寡核苷酸含有至少約7-50個(gè)核苷酸，并且該寡核苷酸與互補(bǔ)于SEQ ID NO:4的核苷酸序列有至少約80％相同。
26．權(quán)利要求25的診斷試劑盒，其中第二種寡核苷酸包含SEQ IDNO:14。
27．權(quán)利要求25的診斷試劑盒，其中第一種寡核苷酸包含SEQ IDNO:17。
28．權(quán)利要求25的診斷試劑盒，其中第二種寡核苷酸包含SEQ IDNO:18。
29．包含SEQ ID NO:22的一種分離、純化的肽，其生物活性亞基，或其生物活性變異體。
30．包含SEQ ID NO:26的一種分離、純化的肽，其生物活性亞基，或其生物活性變異體。
31．一種與包含權(quán)利要求29或30中的肽的蛋白質(zhì)或多肽可發(fā)生特異反應(yīng)的純化抗體。
32．權(quán)利要求31的抗體，它是一種單克隆抗體。
33．一種可產(chǎn)生權(quán)利要求32的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
34．一種包含權(quán)利要求31的抗體的多克隆抗體制劑。
35．一種寡核苷酸，其包含至少約7-50個(gè)核苷酸，并且與具有SEQ IDNO:4的核苷酸序列至少有約80％相同或與其互補(bǔ)。
36．權(quán)利要求35的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:14。
37．權(quán)利要求35的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:17。
38．權(quán)利要求35的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:18。
39．一種在人類非前列腺組織樣品中檢測或確定轉(zhuǎn)移性前列腺癌存在的方法，包括(a)將一定量的可與hK2多肽結(jié)合但不與hK3結(jié)合的一種試劑與人組織樣品的細(xì)胞混合，以形成一種包含該試劑和細(xì)胞的二價(jià)復(fù)合物。(b)檢測或測定樣品中復(fù)合物的存在或量，其中所述復(fù)合物的存在或量為微轉(zhuǎn)移前列腺癌的存在提供了指征。
40．權(quán)利要求39的方法，其中所述試劑是抗體。
41．權(quán)利要求39的方法，其中所述抗體是多克隆抗體群中的一個(gè)成員。
42．權(quán)利要求39的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
通過測定生理樣品中前列腺特異性腺激肽釋放酶hK2多肽式hK2RNA的存在而檢測前列腺癌。
文檔編號C12P21/08GK1238013SQ97199740
公開日1999年12月8日 申請日期1997年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月14日
發(fā)明者D·J·廷達(dá)爾, C·Y·F·尤恩格, D·J·麥克科米克, G·G·克利, M·S·薩狄, A·庫馬爾, H·G·里坦豪斯, R·L·沃爾福特 申請人:梅奧醫(yī)學(xué)教育及研究基金會(huì), 海布里蒂克公司