專利名稱：成纖維細胞生長因子同系物的制作方法
相關(guān)申請的參考本申請和1996年10月16日申請的臨時申請60/028 646相關(guān)。在35U.S.C.§119(e)(1)下，本申請權(quán)利要求書受益于所述臨時申請。
背景技術(shù)：
成纖維細胞生長因子(FGF)家族包括至少9個不同的成員(Basilico等，Adv.Cancer Res.59115-165，1992和Fernig等，Prog.GrowthFactor Res.5(4)353-377，1994)，它們一般作為廣譜細胞類型的促有絲分裂劑。例如堿性FGF(即FGF-2)體外對內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞是促有絲分裂的，并且一般用于中胚層或神經(jīng)外胚層起源的細胞，包括心肌和骨骼肌細胞(Gospodarowicz等，J.Cell.Biol.70395-405，1976；Gospodarowicz等，J.Cell.Biol.89568-578，1981和Kardami，J.Mol.Cell.Biochem.92124-134，1990)。在體內(nèi)已證明bFGF在鳥類心臟的發(fā)育中起作用(Sugi等，生物學(xué)發(fā)展，168567-574，1995和Mima等，美國國家科學(xué)院院報92467-471，1995)，并在狗中誘導(dǎo)冠狀側(cè)枝的發(fā)育(Lazarous等，循環(huán)，941074-1082，1996)。此外，證明FGF家族的許多成員具有非促有絲分裂的活性。與酸性和/或堿性FGF相關(guān)的非增生性活性包括增加組織纖溶酶的激活物的內(nèi)皮釋放、促進細胞外基質(zhì)的合成、對內(nèi)皮細胞的趨化性、在心肌細胞中誘導(dǎo)胎兒收縮基因的表達(Parker等，臨床研究雜志85507-514，1990)并增強對垂體激素的反應(yīng)性(Baird等，細胞生理學(xué)雜志5101-106，1987)。
FGF家族的幾個成員沒有信號序列(aFGF、bFGF和可能的FGF-9)，因此預(yù)期不能分泌。此外FGF家族的幾個成員具有遷移到細胞核的能力(Friesel等，美國實驗生物學(xué)會聯(lián)合會9919-925，1995)。根據(jù)結(jié)構(gòu)的相似性，F(xiàn)GF家族的所有成員都結(jié)合肝素。結(jié)構(gòu)的同源性貫穿物種間，表明它們結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的保守(Ornitz等，生物化學(xué)雜志271(25)15292-15297，1996)有四個已知的細胞外FGF受體(FGFR)，它們都是酪氨酸激酶。一般情況下，F(xiàn)GF家族成員與所有已知的FGFR結(jié)合，然而特異的FGF與具有更高親和度的特異受體結(jié)合。FGF家族內(nèi)特異性的另一形式是胚胎發(fā)育過程中配體和它們的受體的空間及時間表達。證據(jù)表明由于它們的肝素結(jié)合親和性限制了從釋放位點的擴散，F(xiàn)GFs最有可能只能以自分泌和/或旁分泌的方式作用(Flaumenhaft等，細胞生物學(xué)雜志，111(4)1651-1659，1990)。堿性FGF缺少信號序列，因而只限制于旁分泌或自分泌的作用方式。已推測堿性FGF在細胞內(nèi)儲藏，一旦組織損傷就釋放出來。已表明堿性FGF具有兩個不同于肝素結(jié)合位點的受體結(jié)合區(qū)域(Abraham等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志5(10)2523-2528，1986。)已證明FGFR-3在骨骼生長中起作用。FGFR-3純合隱性小鼠(-/-)導(dǎo)致出生后骨骼異常(Colvin等，Nature Genet.12309-397，1996和Deng等，細胞84911-921，1996)。突變表型表明在正常小鼠中，F(xiàn)GFR-3在調(diào)控骨生長面區(qū)域軟骨細胞分裂中起作用(Goldfarb，細胞因子和生長因子評論7(4)311-325，1996)。骨生長面中FGFR-3的配體還未得到鑒定。
盡管已鑒定了四種FGFR，并表明四種都有功能性剪接變體，但新FGF受體存在的可能是有希望的。例如還未鑒定FGF-8a同種型的受體(MacArthur等，病毒學(xué)雜志，69(4)2501-2507，1995)。
FGF-8是最初作為雄激素誘導(dǎo)的促有絲分裂劑從乳腺癌細胞分離的FGF家族的一員。已定位在人染色體10q25-q26(White等，基因組30109-111，1995)。FGF-8參與胚胎四肢發(fā)育(Vogel等，發(fā)育，1221737-1750，1996和Tanaka等，Current Biology 5(6)594-597，1995)。胚胎發(fā)育過程中FGF-8在心臟、泌尿生殖和神經(jīng)組織中的表達表明它在這些組織的發(fā)育中起作用(Crossley等，發(fā)育121439-451，1995)。有一些證據(jù)表明尖頭并指(趾)畸形，以尖頭和有蹼的手指或腳趾為特征的先天疾病，與FGF-8的點突變有關(guān)(White等，1995，ibid)。
與其它已知只具有三個外顯子的FGF相比，F(xiàn)GF-8有五個外顯子。FGF-8的頭三個外顯子對應(yīng)于其它FGF的第一個外顯子(MacArthur等，發(fā)育1213603-3613，1995)。與產(chǎn)生8個FGF-8同種型的鼠基因相比，對應(yīng)FGF-8的人基因編碼四個N-末端區(qū)域有差異的同種型FGF同種型a、b、e和f；(Crossley等，1995，ibid.)。人FGF-8a和FGF-8b與鼠蛋白有100％同源性，F(xiàn)GF-8e和FGF-8f蛋白在人和小鼠之間具有98％的同源性(Gemel等，基因組35253-257，1996)。
在美國，心臟病是死亡的主要原因，達到總死亡的30％。在美國每年因心肌梗死(MI)有750000人入院，超過5百萬人被診斷為冠心病。MI的危險因素包括糖尿病、高血壓、身體肥胖、吸煙、血漿中高水平的低密度脂蛋白或遺傳性易患病的體質(zhì)。
心臟增生是心肌細胞增殖的增加，并已表明在人和大鼠中隨正常老化(Olivetti等，J.Am.Coll.Cardiol.24(1)140-9，1994和Anversa等，循環(huán)研究67871-885，1990)及在大鼠兒茶酚胺誘導(dǎo)的心肌病(Deisher等，美國心血管病理雜志5(1)79-88，1994)中發(fā)生。肌細胞的增加是起源于一些前體細胞，還是進一步終未分化細胞類型增殖的結(jié)果仍在爭論中。
然而，因為梗死和其它心肌壞死的原因是不可修復(fù)的，所以心臟增生的正常機制不能補償大量的肌細胞死亡，仍需要能夠促進增生并最終使心臟功能復(fù)原的外源因子。
骨重建是動力學(xué)過程，由此來保持組織物質(zhì)和骨骼結(jié)構(gòu)。此過程是骨再吸收和骨形成之間的平衡，并認為兩種細胞類型起重要作用。這些細胞是成骨細胞和破骨細胞。成骨細胞合成和儲存基質(zhì)以形成新骨。成骨細胞和破骨細胞的活性受許多因子，系統(tǒng)的和局部的，包括生長因子的調(diào)節(jié)。
盡管局部和系統(tǒng)因子之間的相互作用還未完全闡明，但一致認為生長因子在正常骨骼重建和骨折修復(fù)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。在骨中已鑒定的一些生長因子包括IGF-I、IGF-II、TGF-β1、TGF-β2、bFGF、aFGF、PDGF和骨形態(tài)發(fā)生蛋白的家族(Baylink等，骨無機物研究雜志8(增刊2)S565-S572，1993)。
當骨再吸收超過骨形成時，在骨中產(chǎn)生凈丟失，骨折的傾向增加。骨形成減少與老化與某些病理狀態(tài)相關(guān)。單在美國，每年大約有1.5百萬歸因于骨疏松的骨折。這些骨折對患者生活質(zhì)量的影響是巨大的。在美國除去長期護理費用，健康治療系統(tǒng)的相關(guān)費用估計每年是5-10億美元。
生長因子影響骨重建的其它治療應(yīng)用包括例如治療需要成骨細胞增殖而愈合的損傷如骨折和刺激間質(zhì)細胞增殖及膜內(nèi)骨的合成，這些已證明為骨折修復(fù)的表現(xiàn)(Joyce等，第36屆年會，矯形研究學(xué)會，2月5-8日，1990年，New Orleans，LA)。
本發(fā)明提供這樣的用于這些和其它用途的多肽，這些用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員可從本文所述的顯而易見。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供編碼成纖維細胞生長因子(FGF)同系物多肽的分離的多核苷酸分子，選自a)包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位變體；c)編碼與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基的氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ ID NO6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子。
在一實施方案中，分離的多核苷酸分子包含如SEQ ID NO1的1位至621位核苷酸所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO6的1位至621位核苷酸所示的核苷酸序列。
在另一實施方案中，分離的多核苷酸分子包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供含有下列可操作連接元件的表達載體轉(zhuǎn)錄啟動子；DNA片段，選自a)包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位變體；c)編碼與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基的氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ IDNO6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；及轉(zhuǎn)錄終止子。
另一本發(fā)明提供已導(dǎo)入表達載體的培養(yǎng)細胞，表達載體包含下列可操作連接元件轉(zhuǎn)錄啟動子；DNA片段，選自a)包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位變體；c)編碼與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基的氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ ID NO6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；及轉(zhuǎn)錄終止子，其中所述細胞表達DNA片段編碼的多肽。
另一方面，本發(fā)明提供合成FGF同系物多肽的方法，包括培養(yǎng)已導(dǎo)入表達載體的細胞，表達載體包含下列可操作連接元件轉(zhuǎn)錄啟動子；DNA片段，選自a)包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位變體；c)編碼與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基的氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ IDNO6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；及轉(zhuǎn)錄終止子，其中所述細胞表達DNA片段編碼的FGF同系物多肽；并回收FGF同系物多肽。
另一方面，本發(fā)明提供分離的FGF同系物多肽，選自a)包含如SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至175位(甲硫氨酸)殘基所示的氨基酸序列的多肽分子；b)(a)的等位變體；和c)與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至175位(甲硫氨酸)氨基酸殘基至少60％相同的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明提供分離的FGF同系物多肽，選自a)包含如SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至196位(賴氨酸)殘基所示的氨基酸序列的多肽分子；b)(a)的等位變體；和c)與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至196位(賴氨酸)氨基酸殘基至少60％相同的多肽分子。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供分離的FGF同系物多肽，選自a)包含如SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)殘基所示的氨基酸序列的多肽分子；b)(a)的等位變體；和c)與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基至少60％相同的多肽分子。
在其它實施方案中，本發(fā)明進一步提供包含信號序列的FGF同系物多肽。
在另一實施方案中，本發(fā)明進一步提供包含如SEQ ID NO2的1位(甲硫氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基所示的信號序列的FGF同系物多肽。
本發(fā)明也提供了與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的純化的FGF同系物多肽的藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明提供與包含如SEQ ID NO2的1位(甲硫氨酸)至207位(丙氨酸)殘基所示的氨基酸序列的多肽分子表位結(jié)合的抗體。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供與包含如SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至196位(賴氨酸)殘基所示的氨基酸序列的多肽分子結(jié)合的抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供促進肌細胞或肌細胞前期細胞增殖的方法，包括向需要其的哺乳動物以足夠在所述哺乳動物中使肌細胞或肌細胞前期細胞數(shù)量臨床上顯著增加的量施用FGF同系物多肽。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了促進肌細胞或肌細胞前期細胞增殖的方法，其中肌細胞或肌細胞前期細胞是心肌細胞或心肌細胞前期細胞。
在另一方面，本發(fā)明提供離體刺激肌細胞前期細胞或肌細胞的方法，包括與缺少FGF同系物多肽時培養(yǎng)的心臟組織肌細胞前期細胞或肌細胞相比，在存在FGF同系物多肽時將心臟組織細胞與足以使培養(yǎng)的心臟組織細胞中肌細胞前期細胞或肌細胞數(shù)量增加的用量的FGF同系物多肽一起培養(yǎng)。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了離體刺激肌細胞前期細胞或肌細胞的方法，其中肌細胞或肌細胞前期細胞是心肌細胞或心肌細胞前期細胞。
在另一方面，本發(fā)明提供了將藥劑或藥物選擇性轉(zhuǎn)移至心臟組織的方法，包括將含有FGF同系物多肽的第一個分子與含有藥劑或藥物的第二個分子連接以形成嵌合體；并且將此嵌合體施用給心臟組織。附圖簡述

圖1和圖2說明人成纖維細胞生長因子同源因子1(FHF-1)、人肌細胞活化因子(FGF-10)、成纖維細胞生長因子同源因子4(FHF-4)、人成纖維細胞生長因子同源因子2(FHF-2)、人成纖維細胞生長因子同源因子3(FHF-3)、人FGF-4、人FGF-6、人FGF-2(堿性)、人FGF-1(酸性)、人角質(zhì)化細胞生長因子2(KGF-2)、人角質(zhì)化細胞生長因子前體(FGF-7)、人zFGF-5、人FGF-8、人FGF-5、人FGF-9和人FGF-3的多序列比較?！?”表示保守氨基酸；“”表示保守的氨基酸置換；而“·”表示更不嚴謹?shù)谋Ｊ氐陌被嶂脫Q。
圖3是家族內(nèi)相似性矩陣，說明人FGF-5、人FGF-6、人FGF-7、人FGF-8、人FGF-9、人zFGF-5、人FGF-10、人FGF-1、人FHF-1、人FGF-2、人FHF-2、人FHF-4、人FGF-3、人KGF-2、人FHF-3和人FGF-4之間的相同百分率。發(fā)明詳述術(shù)語“ortholog”(或“種同系物”)表示從一個種獲得的蛋白或多肽，它與不同種來源的相似多肽或蛋白有同源性。
術(shù)語“paralog”表示來自給定物種的多肽或蛋白，它與來自相同種的不同多肽和蛋白有同源性。
術(shù)語“等位變體”表示占據(jù)相同染色體位點的基因的兩種或多種可互換形式的任一種。等位變體通過突變自然產(chǎn)生，并在種群內(nèi)導(dǎo)致表型多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽中沒有變化)或編碼含有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語等位變體此處也用于表示由基因的等位變體編碼的蛋白。
術(shù)語“表達載體”表示線性或環(huán)狀DNA分子，包含與提供用于轉(zhuǎn)錄的其它片段可操作連接的編碼目的多肽的片段。這樣的其它片段可以包括啟動子和終止子序列，并且可以選擇性包括一個或多個復(fù)制起點、一個或多個選擇性標記、增強子、多聚腺苷酸信號等。表達載體一般起源于質(zhì)粒或病毒DNA，或可以含有兩者的元件。
術(shù)語“分離的”，當用于多核苷酸分子時，表示多核苷酸已從其天然的遺傳環(huán)境中取出，因而不含有其它外源或不需要的編碼序列，并且是適合于遺傳工程蛋白合成系統(tǒng)中使用的形式。如此分離的分子是那些與其天然環(huán)境分開的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含有正常與它們結(jié)合的其它基因，但可以包含天然存在的5′和3′非翻譯區(qū)如啟動子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定很明顯是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)之一(見例如Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。當用于蛋白時，術(shù)語“分離的”表示發(fā)現(xiàn)蛋白處于非天然環(huán)境的狀態(tài)，如從血液和動物組織分離。以優(yōu)選的形式，分離蛋白基本上不含其它蛋白，尤其是動物起源的其它蛋白。優(yōu)選提供高度純化形式，即大于95％純度，更優(yōu)選地大于99％純度的蛋白。
術(shù)語“可操作連接的”當用于DNA片段時表示對片段進行安排使它們的功能與預(yù)期目的相協(xié)調(diào)，如轉(zhuǎn)錄在啟動子起始并延伸通過編碼片段至終止子。
術(shù)語“多核苷酸”指從5′末端讀至3′末端的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈和雙鏈多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，可以從天然來源中分離、體外合成或從天然和合成分子的組合制備。
術(shù)語“多核苷酸分子的互補”表示與參考序列相比具有互補堿基序列和反方向的多核苷酸分子。如序列5’ATGCACGGG 3’與5’CCCGTGCAT3’互補。
術(shù)語“簡并核苷酸序列”表示包含一個或多個簡并密碼子的核苷酸序列(與編碼多肽的參考多核苷酸分子相比)。簡并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即GAU和GAC三聯(lián)體都編碼Asp)。
術(shù)語“啟動子”表示含有提供RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列的基因部分。啟動子序列一般，但并不總是，位于基因的5’非編碼區(qū)。
術(shù)語“分泌信號序列”表示編碼作為更大多肽的組成部分指導(dǎo)更大的多肽通過合成此多肽的細胞分泌通路的多肽(“分泌肽”)的DNA序列。在通過分泌通路傳遞的過程中通常對更大的多肽進行切割以除去分泌肽。
術(shù)語“受體”表示與生物活性分子(即配體)結(jié)合并在細胞上調(diào)節(jié)配體效應(yīng)的細胞相關(guān)蛋白。膜結(jié)合受體的特征在于多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包括細胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一般參與信號傳導(dǎo)的細胞內(nèi)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域。配體和受體結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變，引起效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)其它分子間的相互作用。此相互作用繼而引起細胞代謝的變化。和受體-配體相互作用相關(guān)的代謝事件包括基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化作用、去磷酸化作用、環(huán)AMP合成的增加、細胞鈣的動員、膜脂的動員、細胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。大多數(shù)核受體也表現(xiàn)為多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包括氨基末端、反式激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一般情況下，受體可以是膜結(jié)合的、細胞質(zhì)或核的；單體的(如促甲狀腺激素受體、β-腎上腺素能受體)或多聚體的(如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、促紅細胞生成素受體和IL-6受體。
術(shù)語“互補/反互補對”表示在適宜條件下形成非共價連接、穩(wěn)定對的非相同組分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白鏈霉素)是互補/反互補對的典型成員。其它典型互補/反互補對包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或抗原決定基)對、正義/反義多核苷酸對等。在需要互補/反互補對隨后解離的地方，互補/反互補對優(yōu)選地具有小于109M-1結(jié)合親和性。
本發(fā)明部分基于編碼與FGF-8同源的成纖維細胞生長因子(FGF)同系物多肽的新DNA序列的發(fā)現(xiàn)。對應(yīng)于此新DNA的mRNA的組織分布分析表明其表達在胎兒心臟組織和成人心臟組織中最高，接下來在胎兒肺、骨骼肌、平滑肌組織如小腸、結(jié)腸和氣管中有明顯但降低的表達水平。FGF同系物多肽已命名為zFGF-5。
通過檢索生長因子的EST數(shù)據(jù)庫，初步鑒定了本發(fā)明的新zFGF-5多肽。發(fā)現(xiàn)了一個單獨EST序列并預(yù)測與FGF家族相關(guān)。由全長cDNA編碼的新FGF同系物多肽含有具結(jié)構(gòu)式CXFXEX{6}Y的模式，其中X是任意氨基酸，X{}是大于1的X氨基酸的數(shù)目。此結(jié)構(gòu)域在FGF家族所有已知成員中存在并且是這些蛋白特有的。
zFGF-5cDNA的核苷酸序列描述于SEQ ID NO1，所推測的氨基酸序列描述于SEQ ID NO2。當將SEQ ID NO2的28位(Glu)至181位(Gln)氨基酸殘基與FGF-8的相應(yīng)區(qū)域比較時(見圖1和2)，匹配的和推測的氨基酸序列有大約56％的相同性。
此處描述的多核苷酸編碼的新多肽含有在FGF家族所有成員中都存在的CXFXE{6}Y結(jié)構(gòu)域。CXFXE{6}Y結(jié)構(gòu)域是高度保守的。具有CXFXEX{6}Y結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸序列包括人成纖維細胞生長因子同源因子1(FHF-1；Smallwood等，美國國家科學(xué)院院報939850-9857，1996)、人肌細胞活化因子(FGF-10；HSU76381，GENBANK標識符，http//www.nebi.nlm.nih.gov/)、人成纖維細胞生長因子同源因子4(FHF-4；Smallwood等，1996，ibid.)、人成纖維細胞生長因子同源因子2(FHF-2；Smallwood等，1996，ibid.)、人成纖維細胞生長因子同源因子3(FHF-3；Smallwood等，1996，ibid.)、人FGF-4(Basilico等，腫瘤研究進展59115-165，1992)、人FGF-6(Basilico等，1992，ibid.)、人FGF-2(堿性；Basilico等，1992，ibid.)人FGF-1(酸性；Basilico等，1992，ibid.)人角質(zhì)形成細胞生長因子2(KGF-2；HSU67918 GENBANK標識符，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、人角質(zhì)形成細胞生長因子前體(FGF-7；Basilico等，1992，ibid.)人zFGF-5、人FGF-8(Gemel等，基因組35253-257，1996)、人FGF-5(Basilico等，1992，ibid.)、人FGF-9(Miyamoto等，分子細胞生物學(xué)134251-4259，1993)和人FGF-3(Basilico等，1992，ibid.)編碼zFGF-5多肽的cDNA(SEQ ID NO1)的分析揭示了編碼207個氨基酸的開放閱讀框架(SEQ ID NO2)，此開放閱讀框架包含180個氨基酸(SEQ ID NO2的28位至207位殘基)的成熟多肽。zFGF-5和其它已知的FGFs的多重序列對比揭示對應(yīng)于SEQ ID NO2的127位(Cys)至138位(Tyr)氨基酸殘基的有高百分率相同性的一段，并顯示于圖中。幾個FGF家族的成員不含有信號序列。
FGF家族成員的特征在于肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已在SEQ ID NO2的148位(Gly)至169位(Gln)氨基酸殘基的區(qū)域中鑒定了推測的zFGF-5肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。推測一旦FGF配體與細胞表面肝素硫酸蛋白聚糖結(jié)合，就啟動受體介導(dǎo)的信號。根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)和功能，可以將許多FGF家族成員放入兩個相關(guān)家族之一。aFGF和bFGF含有由兩個可變長度內(nèi)含子分開的三個外顯子。FGF-8含有五個外顯子，頭三個對應(yīng)于aFGF和bFGF的第一個外顯子。所有已知FGF家族成員得到剪接形成單一多肽。
SEQ ID NO6是簡并多核苷酸序列，包含能編碼SEQ ID NO2的zFGF-5多肽(氨基酸1或28至207)的所有多核苷酸。因此，本發(fā)明包括SEQ ID NO6的1位或82位至621位編碼zFGF-5多肽的核苷酸。本發(fā)明也包括編碼成熟zFGF-5分子的如上述與SEQ ID NO1相關(guān)從ESQID NO6相似區(qū)域形成的片段和融合體，其中SEQ ID NO6的82位至621位核苷酸對應(yīng)于SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸。
SEQ ID NO6中的符號總結(jié)在下面的表1中。
表1核苷酸 分辨率 互補分辨率AA TTCC GGGG CCTT AAR A|G Y C|TY C|T R A|GM A|C K G|TK G|T M A|CS C|G S C|GC|G A|T W A|TH A|C|TD A|G|TB C|G|TV A|C|GV A|C|GB C|G|TD A|G|TH A|C|TN A|C|G|T N A|C|G|T在下面表2中列出了SEQ ID NO6中所使用的簡并密碼子，包括對于給定氨基酸的所有可能的密碼子。
表2氨基酸字母密碼子 簡并密碼子Cys C TGC TGT TGYSer S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSNThr T ACA ACC ACG ACT ACNPro P CCA CCC CCG CCT CCNAla A GCA GCC GCG GCT GCNGly G GGA GGC GGG GGT GGNAsn N AAC AAT AAYAsp D GAC GAT GAYGlu E GAA GAG GARGln Q CAA CAG CARHis H CAC CAT CAYArg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGNLys K AAA AAG AARMet M ATG ATGIle I ATA ATC ATT ATHLeu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTNVal V GTA GTC GTG GTT GTNPhe F TTC TTT TTYTyr Y TAC TAT TAYTrp W TGG TGGTer . TAA TAG TGA TRRAsn|AspB RAYGlu|GlnZ SARAny X NNNGap - ---本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解在確定簡并密碼子，代表編碼每一氨基酸的所有可能密碼子時引入的某些錯讀。例如，絲氨酸(WSN)的簡并密碼子在某些情況下編碼精氨酸(AGR)，精氨酸(MGN)的簡并密碼子在某些情況下編碼絲氨酸(AGY)。相似的關(guān)系在編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼之間也存在。因此，簡并序列所包含的某些多核苷酸可能有一些不正確的氨基酸，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考SEQ ID NO2的氨基酸序列可以容易地鑒定這些錯誤的序列。
zFGF-5中高度保守的氨基酸可以用作鑒定新家族成員的工具?？梢允褂帽Ｊ氐腃XFXEX{6}Y結(jié)構(gòu)域EST數(shù)據(jù)庫中的鑒定新家族成員。在另一方法中使用多核苷酸探針和雜交方法，從許多組織來源得到的RNA可以用于制備cDNA文庫中探測這些文庫中新的家族成員。具體地，可以使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴增從對應(yīng)于SEQ IDNO2的127位(Cys)至138位(Tyr)氨基酸殘基的序列設(shè)計的編碼高簡并DNA引物的序列。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，分離的多核苷酸將作為探針，并在嚴格條件下與SEQ ID NO1的相似大小的區(qū)域或與其互補的序列雜交。一般來說，在規(guī)定的離子強度和pH下，嚴格條件選擇為比特異序列的熱熔點(Tm)低約5℃。Tm是50％的靶序列和完全匹配的探針雜交時的溫度(在規(guī)定的離子強度和pH下)。典型的嚴格條件是pH7時鹽濃度是至少約0.02M，并且溫度是至少約60℃如前面所指出，本發(fā)明的分離的多核苷酸包括DNA和RNA。分離DNA和RNA的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。一般優(yōu)選從心臟組織中分離RNA，盡管使用來自其它組織的RNA或分離基因組DNA也可以制備DNA。使用鹽酸胍抽提接著通過CsCl梯度離心分離可以制備總RNA(Chirgwin等，生物化學(xué)，1852-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(美國國家科學(xué)院院報，691408-1412，1972)從總RNA制備Poly(A)+RNA。使用已知的方法從Poly(A)+RNA制備互補DNA(cDNA)。然后通過例如雜交或PCR鑒定和分離編碼zFGF-5多肽的多核苷酸。
本發(fā)明進一步提供來自其它物種的相似多肽和多核苷酸(Orthologs或Paralogs)。尤其感興趣的是來自其它哺乳物種包括小鼠、大鼠、豬、羊、牛、狗、貓、馬和其它靈長類蛋白的zFGF-5多肽。人序列的Paralog的鑒定尤其令人感興趣，因為盡管已鑒定了小鼠FGF-8的8個Paralog，但僅有4個人Paralogs是已知的。使用本發(fā)明提供的信息和組合物結(jié)合傳統(tǒng)克隆技術(shù)可以克隆人Paralog或人蛋白的物種同系物。例如使用從表達此蛋白的組織或細胞類型獲得的mRNA可以克隆cDNA。通過用從此處公開的序列設(shè)計的探針探測Northern印跡可以鑒定mRNA的適當來源。然后從陽性組織或細胞系的mRNA制備文庫。然后可以一系列通過方法如通過用完整或部分人cDNA或用基于公開序列的一套或多套簡并探針探查來分離編碼的cDNA。用從此處公開的序列設(shè)計的引物，使用聚合酶鏈反應(yīng)或PCR(Mullis，美國專利4 683 202)也可以克隆cDNA。在其它方法中，可以使用cDNA文庫轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，用抗zFGF-5的抗體檢測目的cDNA的表達。相似的技術(shù)也可以應(yīng)用于基因組克隆的分離。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列代表人zFGF-5基因的單一等位基因和多肽，預(yù)期會發(fā)生等位變體和選擇性的剪接。根據(jù)標準方法通過探查來自不同個體的cDNA或基因組文庫可以克隆等位變體。顯示于SEQ ID NO1的DNA序列的等位變體，包括那些含有沉默突變的變體和那些突變導(dǎo)致氨基酸序列變化的變體，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，SEQ ID NO2的等位變體的蛋白也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明也提供了與SEQ ID NO2的多肽及它們的物種同系物/ortholog基本上同源的分離的zFGF-5多肽。術(shù)語“基本上同源”此處用于表示與SEQ ID NO2所示的序列或它們的Ortholog或Paralog有50％、優(yōu)選60％、更優(yōu)選至少80％序列相同的多肽。這樣的多肽與SEQ ID NO2或其Ortholog或Paralog將更優(yōu)選至少90％相同，并且最優(yōu)選95％或更多的相同。通過傳統(tǒng)的方法確定序列相同百分率。見例如Altschul等，Bull.Math.Bio.，48603-616，1986和Henikoff和Henikoff，美國國家科學(xué)院院報，8910915-10919，1992。簡單地說，使用缺口開放補償(gap opening penaty)10、缺口延伸補償(gapextension penalty)1比較兩個氨基酸序列以最優(yōu)化序列匹配，3并且Henikoff和Henikoff(ibid.)的“blosum 62”評分矩陣在表3中表示(用標準單字母符號表示氨基酸)。然后按以下公式計算相同百分率
表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R -1 5N -2 0 6D -2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q -1 1 0 0 -3 5E -1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4使用上述比率用相似方法測定多核苷酸分子的序列相同性。
基本上同源的蛋白和多肽以一個或多個氨基酸置換、刪除或添加為特征。優(yōu)選次要性質(zhì)的這些改變，即保守氨基酸的置換(見表4)和不顯著影響蛋白或多肽折疊或活性的其它置換；小的刪除，一般1至30個氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸如氨基末端甲硫氨酸殘基、長達20-25個殘基的小接頭肽或有助于純化的小延伸(親和標簽)如多組氨酸臂、蛋白質(zhì)A(Nilsson等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志，41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法1983，1991)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Smith和Jahnson，基因，6731，1988)、麥芽糖結(jié)合蛋白(Kellerman和Ferenci，酶學(xué)方法，90459-463，1982；Guan等，基因6721-30，1987)或其它抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。見Ford等，蛋白表達和純化，295-107，1991，在此引用作為參考。編碼親和標簽的DNA可以從商業(yè)供應(yīng)商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New Engl and Biolabs，Beverly，MA)獲得。
表4保守的氨基酸替換堿性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的谷氨酸天冬氨酸極性的谷氨酰胺天冬酰胺疏水的亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸除了20個標準氨基酸，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以含有非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括但不限于反-3-甲基脯氨酸、2，4-甲烷脯氨酸、順-4-羥脯氨酸、反-4-羥脯氨酸、N-甲基-甘氨酸、別-蘇氨酸，甲基蘇氨酸，羥乙基-半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氫吡啶羧酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙氨、4-重氮苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸。將非天然存在的氨基酸殘基摻入蛋白的幾種方法在本領(lǐng)域中已知。例如，可以使用其中使用化學(xué)氨?；种苩RNA抑制無義突變的體外系統(tǒng)。合成氨基酸和氨酰tRNA的方法在本領(lǐng)域中已知。在含有大腸桿菌S30提取液和商業(yè)可獲得的酶及其它試劑的無細胞體系中進行含有無義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯。通過層析純化蛋白。見例如Robertson等，J.Am.Chem.Soc.1132722，1991；Ellman等，酶學(xué)方法202301，1991；Chung等，科學(xué)259806-09，1993；和Chung等，美國國家科學(xué)院院報9010145-49，1993)。在第二種方法中，通過微注射突變的mRNA和化學(xué)氨?；种苩RNA在非洲爪蟾卵母細胞中進行翻譯(Turcatti等，生物化學(xué)雜志27119991-98，1996)。在第三種方法中，在不含要置換的天然氨基酸和含有所需要非天然存在的氨基酸(如2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙氨酸、4-重氮苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌細胞。將非天然存在的氨基酸在其天然對應(yīng)物位置摻入蛋白中。見Koide等，生物化學(xué)，337470-76，1994。通過體外化學(xué)修飾可以將天然存在的氨基酸殘基轉(zhuǎn)換成非天然存在的種類?；瘜W(xué)修飾可以與定點誘變結(jié)合以進一步擴展替換的范圍(Wynn和Richards，蛋白質(zhì)科學(xué)，2395-403，1993)。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法如定點誘變或丙氨酸掃描誘變，可以鑒定本發(fā)明zFGF-5多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，科學(xué)，2441081-1085，1989)。在后一種技術(shù)中，在分子的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并檢測生成的突變分子的生物學(xué)活性(如心肌細胞或成纖維細胞的增殖或骨形成的刺激作用)以鑒定對分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。也見Hilton等，生物化學(xué)雜志，2714699-4708，1996。通過結(jié)構(gòu)的物理分析，如通過這些技術(shù)即核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標記并結(jié)合推測的接觸位點氨基酸的突變也可以鑒定配體-受體相互作用位點。見例如de vos等，科學(xué)，255306-312，1992；Smith等，分子生物學(xué)雜志224899-904，1992；Wlodaver等，F(xiàn)EBS Lett.30959-64，1992。也可以從相關(guān)FGF的同源性分析推斷必需氨基酸的性質(zhì)，并顯示在圖1和2中。
zFGF-5氨基酸序列的分析揭示了多肽C-末端處的二堿性位點[氨基酸殘基196-197(賴氨酸-精氨酸)]。已證明包含顯示于SEQ IDNO2的28位(Glu)至196位(Lys)氨基酸殘基的氨基酸序列的C-末端截短的多肽具有生物學(xué)活性。二堿性氨基酸如Arg-X-X-Arg(其中X是任何氨基酸殘基)、Arg*Arg或Lys-Arg可由幾個酶包括但不限于凝血酶和羧肽酶切割。因此，在二堿性氨基酸殘基，尤其是在SEQ IDNO2的196和197位氨基酸殘基(分別是Lys和Arg)的二堿性殘基處進行保守的改變在權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
根據(jù)FGF家族的分析，包含SEQ ID NO2的28位(Glu)至175位(Met)氨基酸殘基的C-末端截短分子可以有生物學(xué)活性。分子內(nèi)二硫鍵預(yù)期存在于SEQ ID NO2的109位(Cys)和129位(Cys)氨基酸殘基之間。
根據(jù)與FGF-1和FGF-2晶體結(jié)構(gòu)的同源性比較(Eriksson等，Prot.Sci.，21274，1993)，zFGF-5β鏈結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與SEQ IDNO2的56-59、64-69、73-76、85-92、96-102、106-111、115-119、128-134、138-144、149-155和173-177位氨基酸殘基有關(guān)。通過整個zFGF-5多肽的定點誘變鑒定對于zFGF-5與受體結(jié)合關(guān)鍵的氨基酸。更具體地，使用zFGF-5多肽中對應(yīng)于在酸性FGF(FGF1)和堿性FGF(FGF2)中鑒定為對于這些FGFs與它們的受體結(jié)合關(guān)鍵的氨基酸的定點誘變可以鑒定它們(Blaber等，生物化學(xué)352086-2094，1996)。這些氨基酸包括人FGF2中的Tyr33，Arg53，Asn110，Tyr112，Lys119，Trp123，Leu149和Met151以及人FGF1中的Tyr30，Arg50，Asn107，Tyr109，Lys116，Trp122，Leu148和Leu150，如圖1和圖2中所示。如圖1和圖2中所示，zFGF-5中相應(yīng)的氨基酸是Tyr58，Gly77，Asn136，Tyr138，Lys145，Trp149，Met175和Arg177。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會認識到FGF家族的其它成員全部或部分與zFGF-5有結(jié)構(gòu)或生化相似性，可以替換做這些分析。這些區(qū)域?qū)Ψ肿拥纳飳W(xué)功能是重要的。
用已知的誘變和篩選的方法，如那些由Reidhaar-Olson和Sauer(科學(xué)，24153-57，1988)或Bowie和Sauer(美國國家科學(xué)院院報，862152-2156，1989)所公開的方法，可以制備和檢測多個氨基酸的替換。簡要地說，這些作者公開了在多肽上同時隨時選取兩個或多個位置、選擇有功能的多肽和對誘突的多肽測序以確定每個位置允許置換的范圍的方法。可以使用的其它方法包括噬菌體展示(如Lowman等，生物化學(xué)3010832-10837，1991；Ladner等，美國專利號5223409；Huse，WIPO公開WO 92/06204)和定區(qū)域誘變(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA，7127，1988)。
如上面所公開的誘變方法可以和高效率、自動篩選方法結(jié)合以在宿主細胞中檢測克隆的、誘變的多肽的活性?？梢詮乃拗骷毎谢厥站幋a活性多肽(如細胞增殖)的誘變的DNA分子并用現(xiàn)代儀器快速測序。這些方法允許目的多肽中單個氨基酸重要性的快速測定，并可以應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
使用上面討論的方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以鑒定和/或制備與SEQ ID NO2的28位(Glu)至196位(Lys)殘基或28位(Glu)至207位(Ala)殘基、其等位變體或其生物活性片段基本上同源的許多多肽，并保留野生型蛋白的增殖特性。這些多肽也可以包括如上充分公開的其它多肽片段。
本發(fā)明的多肽，包括全長蛋白、其片段和融合蛋白，可以根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)在遺傳工程宿主細胞中合成。合適的宿主細胞可以是用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并在培養(yǎng)中生長的那些細胞類型，包括細菌、真菌細胞和培養(yǎng)的高等真核細胞。優(yōu)選真核細胞，尤其是多細胞生物的培養(yǎng)細胞。操作克隆的DNA分子和將外源DNA引入許多宿主細胞的技術(shù)由Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989和Ausubel等(編輯)，分子生物學(xué)常用方法，JohnWiley和Sons，Inc.，紐約，1987公開，在此引用作為參考。
總的來說，編碼本發(fā)明的zFGF-5多肽的DNA序列可操作地與其表達所需的其它基因元件上，一般包括表達載體內(nèi)轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子連接。載體一般也將含有一個或多個選擇標記及一個或多個復(fù)制起點，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到在某些系統(tǒng)內(nèi)也可以在分開的載體上提供選標記以及通過整合進宿主細胞基因組提供外源DNA的復(fù)制。啟動子、終止子、選擇性標記、載體和其它元件的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)水平內(nèi)的常規(guī)設(shè)計。許多這樣的元件在文獻中得到描述并可通過商業(yè)供應(yīng)商得到。
為了將zFGF-5多肽導(dǎo)入宿主細胞分泌途徑，在表達載體中提供分泌信號序列(也已知為前導(dǎo)序列、早前肽或前肽)。分泌信號序列可以是天然序列或是包含來自另一分泌蛋白(如t-PA和a-早前分泌引導(dǎo)區(qū))或從頭合成的信號序列的嵌合體。分泌信號序列以正確的閱讀框架與zFGF-5 DNA序列連接。分泌信號序列一般定位于編碼目的多肽的DNA序列的5’端，盡管某些信號序列可以定位于目的DNA序列的別處(見如Welch等，美國專利號5,037,743；Holl and等，美國專利號5,143,830)。
公開了一個可以用于克隆編碼任何目的多肽，包括多肽融合體的DNA獨特受體質(zhì)粒。此受體質(zhì)粒在制備雙鏈環(huán)形DNA分子的方法中有用。此方法包括如下步驟(a)提供編碼目的多肽的雙鏈供體片段；(b)提供有鈍的第一和第二末端并含有在釀酒酵母中有功能的選擇性標記和復(fù)制序列的雙鏈線性受體質(zhì)粒，其中受體質(zhì)?；旧喜缓幋a目的多肽的DNA；(c)提供第一個雙鏈DNA接頭，包含在序列上與受體質(zhì)粒第一區(qū)域相同的第一片段和在序列上與供體DNA片段第一區(qū)域相同的第二片段，其中第一個接頭的第一和第二片段長至少10bp；(d)提供第二個雙鏈DNA接頭，包含在序列上與受體質(zhì)粒第二區(qū)域相同的第一片段和在序列上與供體DNA片段的第二區(qū)域相同的第二片段，其中第二個接頭的第一和第二片段至少10bp；和(e)在釀酒酵母宿主細胞內(nèi)結(jié)合供體DNA片段、受體質(zhì)粒、第一DNA接頭和第二DNA衍接頭，由此通過供體DNA、受體質(zhì)粒和接頭的同源重組使供體DNA片段與受體質(zhì)粒連接以形成閉環(huán)質(zhì)粒。受體質(zhì)粒進一步包含鄰近第一末端的轉(zhuǎn)錄啟動子和在閉環(huán)質(zhì)粒內(nèi)與轉(zhuǎn)錄啟動子可操作地連接的供體DNA片段。受體質(zhì)粒進一步包含編碼前導(dǎo)肽的DNA片段和/或編碼肽標鑒的一個或多個DNA片段，將它們定位使得這些DNA片段在閉環(huán)質(zhì)粒內(nèi)與供體DNA片段可操作地連接。在優(yōu)選的實施方案中，受體質(zhì)粒進一步包括(a)啟動子、編碼前導(dǎo)肽的DNA片段和編碼第一肽標鑒的DNA區(qū)段，其中編碼前導(dǎo)肽的DNA片段定位于啟動子和編碼鄰近受體質(zhì)粒的第一末端的第一肽標鑒的DNA片段之間，其中啟動子、編碼前導(dǎo)肽的DNA片段可編碼第一肽標鑒的DNA片段是可操作連接的；(b)鄰近受體質(zhì)粒的第二末端的編碼第二肽標鑒的DNA片段。
公開了制備雙鏈環(huán)形DNA分子的方法，包括如下步驟，(a)提供許多重疊的雙鏈DNA供體片段，它們加在一起編碼目的多肽；(b)提供具有鈍的第一和第二末端敢并含有在釀酒酵母中有功能的選擇性標記和復(fù)制序列的雙鏈線性受體質(zhì)粒，其中受體質(zhì)?；旧喜缓幋a目的多肽的DNA；(c)提供第一個雙鏈DNA接頭，包含在序列上與受體質(zhì)粒第一區(qū)域相同的第一片段和在序列上與供體DNA片段之一的第一區(qū)域相同的第二片段，其中第一衍接頭的第一和第二片段長至少10bp；(d)提供第二個雙鏈DNA接頭，包含在序列上與受體質(zhì)粒第二區(qū)域相同的第一片段和在序列上與供體DNA片段的第二區(qū)域相同的第二片段，其中第二個接頭的第一和第二片段長至少10bp；和(e)在釀酒酵母宿主細胞內(nèi)結(jié)合供體DNA片段、受體質(zhì)粒、第一DNA接頭和第二DNA接頭，由此通過同源重組使供體DNA片段與受體質(zhì)粒連接以形成含有編碼目的多肽的區(qū)域的閉環(huán)質(zhì)位。受體質(zhì)粒進一步包含如上所述的一個或多個轉(zhuǎn)錄啟動子、編碼前導(dǎo)肽的DNA片段和一個或多個編碼肽標鑒的DNA片段。
真菌細胞，包括酵母細胞和具體地酵母屬或畢赤酵母屬的細胞，是合成zFGF-5片段或多肽融合體的宿主的特別優(yōu)選的細胞。
其它用外源DNA轉(zhuǎn)化酵母細胞以及從其生產(chǎn)重組多肽的方法公開于例如Kawasaki，美國專利號4599311；Kawasaki等，美國專利號4931372；Brake，美國專利號4870008；Welch等，美國專利號5 037743；和Murray等，美國專利號4845075，此處引用作為參考。通過由選擇性標記，通常是抗藥性或在缺少特定營養(yǎng)(如亮氨酸)時生長的能力確定的表型來選擇轉(zhuǎn)化的細胞。在酵母中使用的可選擇的優(yōu)選載體系統(tǒng)是由Kawasaki等，(美國專利號4931373)公開的POT1載體系統(tǒng)，它允許通過在含葡萄糖的培養(yǎng)基上的生長選擇轉(zhuǎn)化的細胞。在酵母中使用的合適啟動子和終止子包括那些來自糖酵解基因(見如Kawasaki，美國專利號4 599 311；Kingsman等，美國專利號4 615 974；和Bitter，美國專利號4 977 092，此處引用作為參考)和醇脫氫酶基因的啟動子和終止子。也見美國專利號4990446；5063154；5139936和4661454，此處引用作為參考。用于其它酵母包括多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母和Candida maltosa的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)以知。一個特別優(yōu)選的系統(tǒng)使用甲醇畢赤酵母。(見PCT申請WO 9717450)。對另一轉(zhuǎn)化系統(tǒng)見例如Gleeson等，遺傳微生物學(xué)雜志，1323459-3465，1986和Cregg，美國專利號4 882279。根據(jù)Mcknight等，美國專利號4 935349的方法可以使用曲霉屬細胞，此處引用作為參考。轉(zhuǎn)化Acremonium chrysogenum的方法由Sumino等，美國專利號5162228公開，此處引用作為參考。轉(zhuǎn)化脈孢菌的方法由Lambowitz，美國專利號4486533公開，此處引用作為參考。
在本發(fā)明內(nèi)培養(yǎng)的哺乳動物細胞也是優(yōu)選的宿主。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物宿主細胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，細胞，14725，1978；Corsaro和Pearson，體細胞遺傳學(xué)，7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒學(xué)，52456，1973)、電穿孔(Neumann等，歐洲分子生物學(xué)雜志，1841-845，1982)，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等編輯，分子生物學(xué)常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，紐約，1987)和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等，焦點，1573，1993；Ciccarone等，焦點，1580，1993)，此處引用作為參考。在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中重組多肽的合成公開于Levinson等，美國專利號4713339；Hagen等，美國專利號4 784 950；Polmiter等，美國專利號4579821；和Ringold，美國專利號4656134，此處引用作為參考。優(yōu)選的培養(yǎng)哺乳動物細胞包括COS-1(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL1650)、COS-7(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL 1651)、BHK570(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL 10314)、293(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL 1573；Graham等，遺傳病毒學(xué)雜志，3659-72，1977)和中國倉鼠卵巢細胞系(如CHO-K1，美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL 61)。其余合適的細胞系在本領(lǐng)域內(nèi)公知，并可以從公共保藏處如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryl and獲得。一般優(yōu)選強轉(zhuǎn)錄啟動子，例如來自SV-40或巨細胞病毒的啟動子。見例如，美國專利號4956288。其它合適的啟動子包括那些來自金屬硫蛋白基因(美國專利號4579821和4601978，此處引用作為參考引入)的啟動子以及腺病毒主要晚期啟動子。
一般使用藥物選擇來選擇已插入外源DNA的培養(yǎng)的哺乳動物細胞。這些細胞通常稱作“轉(zhuǎn)染子”。在選擇性藥物存在時培養(yǎng)的并能夠?qū)⒛康幕騻鬟f給子代的細胞稱為“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子”。優(yōu)選的選擇性標記是編碼對抗生素新霉有抗性的基因。在新霉素型藥物如G-418等存在時進行選擇。選擇系統(tǒng)也可以用于增加目的基因的表達水平，稱之為“擴增”的過程。通過在低水平選擇藥物存在時培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子，然后增加選擇性藥物的量以選擇合成高水平導(dǎo)入基因產(chǎn)物的細胞來進行擴增。優(yōu)選的可擴增的選擇性標記是賦于對氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶。也可以使用其它藥物抗性基因(如潮霉素抗性、多藥抗性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。
也可以使用其它更高等的真核細胞作為宿主，包括昆蟲細胞、植物細胞和鳥類細胞。昆蟲細胞的轉(zhuǎn)化和其中外源多肽的合成公開于Guarino等，美國專利號5162222；Bang等，美國專利號4775624；和WIPO公開WO 94/06463，此處引用作為參考。發(fā)根農(nóng)桿菌作為在植物細胞中表達基因的載體已在Sinkar等，生物科學(xué)雜志(Bangalore)，1147-58，1987中綜述。
根據(jù)傳統(tǒng)方法，在含有營養(yǎng)物以及選擇的宿主細胞生長所需的其它成份的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。許多合適的培養(yǎng)基，包括規(guī)定的培養(yǎng)基和復(fù)雜培養(yǎng)基在本領(lǐng)域內(nèi)公知并且一般包含碳源、氮源、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。如果需要，培養(yǎng)基也可以含有諸如生長因子或血清的成份。生長培養(yǎng)基一般將對含有外加DNA的細胞進行選擇，例如通過藥物選擇或缺失必需營養(yǎng)物，而這些可以由表達載體所攜帶的或共轉(zhuǎn)染進宿主細胞的選擇性標記來補償。
使用分級分離和/或傳統(tǒng)純化方法及介質(zhì)可以純化表達的重組zFGF-5多肽(或嵌合的zFGF-5多肽)。硫酸銨沉淀和酸或離液劑抽提物可以用作分級分離的樣品。典型的純化步驟可以包括羥基磷灰石層析、大小排阻層析、FPLC和反相高效液相層析。合適的陰離子交換介質(zhì)包括衍生葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、特殊性能硅石等。優(yōu)選的是PEI、DEAE、QAE和Q衍生物，尤其優(yōu)選的是帶有DEAE快速流動Sepharose的(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的層析介質(zhì)包括那些用苯基、丁基或辛基衍生化的那些介質(zhì)，如苯基-SepharoseFF(Pharmacia)、東洋珍珠丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose瓊脂糖(Pharmacia)等；或聚丙烯樹脂如Amberchrom CG71(Toso Haas)等。合適的固體支持物包括玻璃珠、硅基樹脂、纖維素樹脂、瓊脂糖珠、交聯(lián)瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯(lián)聚丙烯酰胺樹脂等，它們在所用的條件下是不可溶的。這些支持物可以用反應(yīng)性基團進行修飾，使蛋白可以通過氨基、羧基、硫氫基、羥基和/或碳水化合物組分結(jié)合。偶聯(lián)化學(xué)法的例子包括溴化氰活化、N-羥琥珀酰胺活化、環(huán)氧化物活化、巰基活化、酰肼活化及對碳二亞胺偶聯(lián)化合物的羧基和氨基衍生物。這些和其它固體介質(zhì)在本領(lǐng)域內(nèi)公知并廣泛應(yīng)用，并可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得。將受體多肽與支持物介質(zhì)結(jié)合的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。特定方法的選擇是一種常規(guī)設(shè)計，部分決定于所選支持物的特性。見例如親和層析原理和方法，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
利用其肝素連接特性也可以分離本發(fā)明的多肽。作為綜述，見Burgess等，生物化學(xué)年鑒，58575-606，1989。通過肝素-Sepharose親和層析(Gospodaroicz等，美國國家科學(xué)院院報，816963-6967，1984)，并用氯化鈉線性梯度洗脫[Ron等，生物化學(xué)雜志，268(4)2984-2988，1993；層析原理和方法，77-80頁，PharmaciaLKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1993；in“固定親和配體技術(shù)”，Hermanson等編輯165-167頁，Academic Press，San Diego，1992；Kjellen等，生物化學(xué)年鑒，60443-474，1991；和Ke等，蛋白實驗純化，3(6)496-507，1992.]可以將FGF家族成員純化至顯著均質(zhì)。
其它純化方法包括用固定金屬離子吸附(IMAC)層析來純化富集組氨酸的蛋白。簡單地說，首先用二價金屬離子使凝膠帶電以形成螯合物(E.Sulkowski，生物化學(xué)趨勢，31-7，1985)。依靠所使用的金屬離子，富集組氨酸的蛋白以不同的親和力吸附在此基質(zhì)上，并通過競爭性洗脫、降低pH值或使用強螯合劑來洗脫。其它純化方法包括通過凝集素親和層析和離子交換層析的糖基化蛋白的純化(酶學(xué)方法，182卷，“蛋白純化指南”，M.Deutscher(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，1990，529-39頁)。此外，可以構(gòu)建目的多肽和親和標簽(如多聚組氨酸、麥芽糖結(jié)合蛋白、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)的融合體以利于純化。
也可以有利地使用蛋白重折疊(和選擇性地重氧化)方法。優(yōu)選純化蛋白至＞80％純度，更優(yōu)選至＞90％純度，甚至更優(yōu)選＞95％，尤其優(yōu)選的是藥物純化狀態(tài)，就污染的大分子，尤其是其它蛋白和核酸來說，純度＞99.9％，沒有感染和致熱因子。優(yōu)選地，純化的蛋白基本上不含其它蛋白，尤其是動物來源的其它蛋白。
zFGF-5多肽或其片段也可以通過化學(xué)合成制備。zFGF-5多肽可以是單體或多聚體；糖基化或非糖基化；pegylated或non-pegylated；可以包含或不包含起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明分子的活性可以使用許多測定法測定，例如根據(jù)成年心臟中的組織特異性測定心臟細胞的新生或增生(即增殖)。其它可能與本發(fā)明多肽相關(guān)的活性包括直接或間接通過其它生長因子的內(nèi)皮細胞、心肌細胞、成纖維細胞、骨骼肌細胞的增殖；作用為內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和/或吞噬細胞的趨化因子；骨生成因子；和擴大間充質(zhì)干細胞和前體細胞群體的因子。
使用培養(yǎng)的心臟細胞或體內(nèi)通過給適當?shù)膭游锬Ｐ褪┯帽景l(fā)明的分子來測定增殖。一般來說，增殖效應(yīng)可以看作細胞數(shù)目的增加，因而可以包括細胞程序性死亡的抑制和有絲分裂的發(fā)生。培養(yǎng)的細胞包括來源于原代培養(yǎng)的心臟成纖維細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞。建立的細胞系包括NIH373成纖維細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1658)、CHH-1 chum心臟細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1680)、H9c2大鼠心肌細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1446)、Shionogi乳房癌細胞(Tanaka等，美國國家科學(xué)院院報，898928-8932，1992)和LNCap.FGC腺癌細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1740)。測定細胞增殖的分析法在本領(lǐng)域內(nèi)公知。例如，測定增殖的實驗包括諸如對中性紅染料的化學(xué)敏感性(Cavanaugh等，研究的新藥物，8347-354，1990，此處引用作為參考)、放射性標記核苷酸的摻入(Cook等，分析生物化學(xué)，1791-7，1989，此處引用作為參考)、增殖細胞的DNA中5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU)的摻入(Porstmann等，免疫學(xué)方法雜志，82169-179，1985，此處引用作為參考)、四氮唑鹽的使用(Mosmann，免疫學(xué)方法雜志，6555-63，1983；Alley等，腫瘤研究，48589-601，1988；Marshall等，生長調(diào)節(jié)，569-84，1995；和Scudiero等，腫瘤研究，484827-4833，1988；此處此用作為參考)的實驗。
分化是漸進的和動力學(xué)的過程，開始于多潛能干細胞并結(jié)束于終末分化的細胞。未定型于細胞譜系能再生的多潛能干細胞表達一套分化標記，當定型于細胞譜系時這些分化標記丟失。前期細胞表達一套分化標記，當細胞進入通向成熟細胞譜系途徑時這些分化標記可以或可以不繼續(xù)表達。由成熟細胞專門表達的分化標記一般是功能特性如細胞產(chǎn)物、產(chǎn)生細胞產(chǎn)物的酶和受體。細胞群體分化階段由細胞群體中存在的標記的鑒定來監(jiān)控。據(jù)認為肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成纖維細胞和網(wǎng)狀細胞起源于共同的間充質(zhì)干細胞(Owen等，Ciba Fdn.Symp.，13642-1988)。間充質(zhì)干細胞的標記還未得到很好鑒定(Owen等，細胞科學(xué)雜志87731-738，1987)，所以經(jīng)常在祖細胞和成熟細胞階段進行鑒定。已推測但并未證明早期心肌祖細胞(經(jīng)常稱作心肌干細胞)在成年心臟中的存在。本發(fā)明的新多肽對于研究體內(nèi)和離體分離間充質(zhì)干細胞和心肌細胞前期細胞是有用的。
有證據(jù)表明刺激特異細胞類型進入通向終末分化或脫分化途徑的因子影響起源于共同前體或干細胞的整個細胞群體。因此本發(fā)明包括刺激肌細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和內(nèi)皮細胞的抑制或增殖。通過對它們共同前體/干細胞的影響，本發(fā)明的分子雖然促進心肌細胞的增殖或分化時，卻可以抑制脂肪細胞的增殖或分化。因此，本發(fā)明的分子已用于抑制軟骨肉瘤、動脈粥樣硬化、再狹窄和肥胖。
測定分化的實驗包括測定與組織階段特異表達相關(guān)的細胞表面標記、酶活性、功能活性或形態(tài)學(xué)改變(Watt，美國實驗生物學(xué)會聯(lián)合會，5281-284，1991；Francis，分化5763-75。1994；Raes，動物細胞生物技術(shù)生物加工進展，161-171，1989；在此所有這些作為參考)。
體內(nèi)評估心臟新生或增生的實驗包括用本發(fā)明的分子處理新生和成熟大鼠。測量動物心臟功能如心率、血壓和心輸出量以測定左心室的功能。死后估計心臟改善的方法包括增加的心臟重量、核/細胞質(zhì)體積、測定增殖細胞核抗原(PCNA)對細胞質(zhì)肌動蛋白的水平的心臟組織切片染色(Quaini等，循環(huán)研究751050-1063，1994和Reiss等，美國國家科學(xué)院院報938630-8635，1996)。
體內(nèi)測定骨形成率改變的方法包括進行骨組織學(xué)(見Recker，R.編輯，骨組織形態(tài)測量學(xué)技術(shù)和解釋，Boca RatonCRC出版公司，1983)和定量計算的X射線斷層術(shù)(QCT；Ferretti，J.骨17353S-364S，1995；Orphanoludakis等，放射學(xué)研究14122-130，1979和Dur and等，醫(yī)學(xué)物理19569-573，1992)。離體測定骨形成改變的實驗可以是例如如calavarial實驗(Gowen等，免疫學(xué)雜志1362478-2482，1986)。
就調(diào)控能量平衡而言，尤其當涉及脂肪細胞的代謝、增殖和分化時，zFGF-5多肽調(diào)控對代謝反應(yīng)的影響。這些代謝反應(yīng)包括脂肪形成、糖原異生、糖原分解、脂肪生成、葡萄糖吸收、蛋白合成、產(chǎn)熱、氧利用等。在本領(lǐng)域已知或此處描述的其它方法中，可以通過監(jiān)控一個或多個上述代謝功能來評估哺乳動物能量平衡。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)(實驗或動物模型)來監(jiān)控這些代謝功能，這些在下面得到全面描述。例如，胰島素的糖調(diào)控效應(yīng)主要在肝、骨骼肌和脂肪組織中發(fā)生。在骨骼肌和脂肪組織中，胰島素作用是促進葡萄糖的吸收、儲藏和利用。
存在監(jiān)控上面列舉的所有代謝功能的本領(lǐng)域公知的方法。這樣，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能評估zFGF-5多肽、片段、融合蛋白、抗體、激動劑和拮抗劑的代謝調(diào)節(jié)功能。典型的調(diào)控技術(shù)在下面陳述。
胰島素刺激的脂肪生成可以例如通過測量14C-乙酸鹽在甘油三酯中的摻入(Mackall等生物化學(xué)雜志，2516462-6464，1976)或甘油三酯的積累(Kletzien等，分子藥理學(xué)，41393-398，1992)來監(jiān)控。
在測定胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運的實驗中評估zFGF-5刺激的吸收。將原代脂肪細胞或NIH3T3 L1細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CCL-92.1)放入含1g/L葡萄糖、0.5或1.0％BSA、20mM Hepes和2mM谷氨酰胺的DMEM中。2-5小時培養(yǎng)后，用新鮮的含0.5或1.0BSA、20mMHepes、1mM丙酮酸和2mM谷氨酰胺的無葡萄糖的DMEM換培養(yǎng)基。加入合適濃度的zFGF-5、胰島素或IGF-1或連續(xù)稀釋的待測物質(zhì)，溫育細胞20-30分鐘。加入3H或14C-標記的脫氧葡萄糖至約50 1M終濃度，溫育細胞約10-30分鐘。然后用冷緩沖液(如PBS)快速沖洗細胞，用合適的裂解劑(如1％SDS或1N NaoH)裂解細胞。通過在閃爍計數(shù)器中計數(shù)評估細胞裂解液。減去非特異連接后細胞相關(guān)的放射活性作為葡萄糖轉(zhuǎn)運的測定，非特異連接通過在細胞松弛素b，一種葡萄糖轉(zhuǎn)運的抑制劑中培養(yǎng)細胞來確定。其它方法包括例如由Manchester等，美國生理學(xué)雜志，266(內(nèi)分泌代謝29)E326-E333，1994(胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運)所描述的方法。
使待測細胞與35S-甲硫氨酸以及35S-甲硫氨酸和蛋白合成的推測調(diào)節(jié)劑一起培養(yǎng)后，通過比較35S-硫氨酸標記的蛋白沉淀評估蛋白合成。
按照在B.Stanley，神經(jīng)肽Y和相關(guān)肽生物學(xué)，W.Colmers和C.Wahlestedt(編輯)，Humana Press，Ottawa，1993，457-509頁；C.Billington等，美國生理學(xué)雜志260R321，1991；N.Zarjevski等，內(nèi)分泌，1331753，1993；C.Billington等，美國生理學(xué)雜志266R1765，1994；Heller等，美國生理學(xué)雜志252(4Pt2)R661-7，1987；和Heller等，美國生理學(xué)雜志，245(3)R321-8，1983中所述的評估產(chǎn)熱。可以通過一系列技術(shù)測定的代謝率也是產(chǎn)熱的間接測量。
如Heller等，Pflugers Arch，369(1)55-9，1977所述的評估氧利用。此方法也涉及下丘腦溫度和代謝熱產(chǎn)生的分析。氧利用和熱調(diào)控也已在人體中按照Haskell等，應(yīng)用生理學(xué)雜志51(4)948-54，1981所描述的已得到評估。
zFGF-5多肽也可以用于制備zFGF-5表位、肽或多肽特異結(jié)合與的抗體。制備多克隆和單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)公知的(見如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989；和Hurrell，J.G.R.編輯，單克隆雜交瘤抗體技術(shù)和應(yīng)用，CRC出版社，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L，1982，此處引用作為參考)。多克隆抗體可以從許多溫血動物如馬、牛、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠和大鼠中產(chǎn)生，這一點對本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員是很明顯的。
通過使用佐劑如明礬(氫氧化鋁)或弗氏完全或不完全佐劑可以增加zFGF-5多肽的免疫原性。對免疫有用的多肽也包括融合多肽如與免疫球蛋白多肽或與麥芽糖結(jié)合蛋白的zFGF-5或其部分的融合體。多肽免疫原可以是全長分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原樣的”，為了免疫此部分可以有利地與大分子載體[如Keyhole limpethemocyanin(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破傷風(fēng)類毒素]連接。
如本文所述，術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、親和純化的多克隆抗體、單克隆抗體和抗原結(jié)合片段如F(ab’)2和Fab蛋白水解片段。也包括遺傳工程完整的抗體或片段如嵌合抗體、Fv片段、單鏈抗體等，以及合成的抗原結(jié)合肽和多肽。通過只將非人類CDR嫁接到人框架和穩(wěn)定區(qū)，或通過摻入整個非人可變結(jié)構(gòu)域(通過置換暴露的殘基用人樣表面選擇性“覆蓋”它們，其中結(jié)果是“覆蓋的”抗體)使非人類抗體人類化。在一些例子中，人類化抗體可以在人可變區(qū)域框架區(qū)內(nèi)保留非人殘基以加強正確的結(jié)合特性。通過人類化抗體，可以提高生物半衰期，并且在用于人體時減少不利免疫反應(yīng)的可能。此處對于產(chǎn)生或選擇抗體有用的其它技術(shù)包括體外使淋巴細胞與zFGF-5蛋白或肽接觸以及在噬菌體或類似載體(例如，通過固定的或標記的zFGF-5蛋白或肽的使用)中選擇抗體展示文庫。
如果抗體與zFGF-5多肽用106M-1或更高的、優(yōu)選地107M-1或更高、更優(yōu)選地108M-1或更高、最優(yōu)選109M-1或更高的結(jié)合親和性(Ka)結(jié)合，那么抗體定義為特異性結(jié)合?？贵w結(jié)合親和性很容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)之一(如通過Scatchard分析)得到測定。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多實驗可以用于檢測與zFGF-5蛋白或肽特異結(jié)合的抗體。典型的實驗在抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實驗室出版社，1988中得到具體描述。這些實驗的代表性例子包括共存的免疫電泳、放射免疫試驗、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、點雜交或Western雜交實驗、抑制或競爭實驗、和三明治實驗。此外也可以篩選與野生型/突變型zFGF-5蛋白或肽結(jié)合的抗體。
針對zFGF-5的抗體可以用于標記表達zFGF-5的細胞；將另一蛋白、小分子或化合物靶向心臟組織；通過親和純化分離zFGF-5；用于測定zFGF-5多肽循環(huán)水平的診斷分析；檢測或定量測定可溶的zFGF-5作為潛在病理學(xué)或疾病的標記；采用FACS的分析方法，篩選表達文庫；制備抗基因型抗體；以及作為體外和體內(nèi)阻斷zFGF-5介導(dǎo)的增殖的中和抗體或拮抗劑。合適的直接標簽或標記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光標記、化學(xué)發(fā)光標記、磁粒子等；間接標簽或標記涉及使用生物素-抗生物素蛋白或其它互補/反互補對作為中間體。此處抗體也可以直接或間接與藥物、毒素、放射性核素等等偶聯(lián)，并且將這些偶聯(lián)物用于體內(nèi)診斷或治療應(yīng)用。
本發(fā)明的分子可以用于鑒定和分離參與心肌增生的受體。例如將本發(fā)明的蛋白和肽固定在柱上，并使膜制品流過柱子(固定的親和配體技術(shù)Hermanson等，編輯，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，CA，1992，195-202頁)。也可以對蛋白和肽進行放射性標記(酶學(xué)方法，182卷，“蛋白純化指南”，M.Deutscher編輯，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，1990，721-737)或光親和標記(Brunner等，生物化學(xué)年鑒，62483-514，1993和Fedan等，生物化學(xué)藥理學(xué)，331167-1180，1984)，并可以鑒定特異的細胞表面蛋白。
拮抗劑將對在細胞類型如心臟細胞，包括肌細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞；成骨細胞和軟骨細胞中抑制zFGF-5分子的增殖活性有用。通過篩選在噬菌體(噬菌體顯示)或細菌如大腸桿菌上展示的隨機肽文庫獲得編碼zFGF-5多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因?？梢杂迷S多方法如通過隨機誘變和隨機多核苷酸合成獲得編碼多肽的核苷酸序列。這些隨機肽展示文庫可用于篩選與已知靶分子相互作用的肽，靶分子可以是蛋白或多肽如配體或受體、生物或合成的大分子、或有機或無機物質(zhì)。制備和篩選這樣的隨機肽展示文庫的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)公知(Ladner等，美國專利號5,223,409Ladner等，美國專利號4,946,778；Ladner等，美國專利號5,403,484和Ladner等，美國專利號5,571,698)并且隨機肽展示文庫和篩選這樣文庫的試劑盒可例如從Clontech(Palo Alto，CA)，Invitrogen Inc.(San Diego，CA)，New Engl and Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKBBiotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商業(yè)獲得。可以使用此處公開的zFGF-5序列篩選隨機肽展示文庫以鑒定與zFGF-5結(jié)合的蛋白。這些與zFGF-5多肽相互作用的“結(jié)合蛋白”可以用于標簽細胞；通過親和純化分離同系物多肽；可以直接或間接與藥物、毒素、放射性核素等體外和體內(nèi)。這些結(jié)合蛋白也可用于分析法如篩選表達文庫和中和活性。結(jié)合蛋白也可用于測定多肽循環(huán)水平的診斷分析；檢測或定量測定可溶的多肽作為潛在病理學(xué)或疾病的標記。這些結(jié)合蛋白也可以作用為zFGF-5的“拮抗劑”以阻斷zFGF-5體外和體內(nèi)的結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些抗zFGF-5的結(jié)合蛋白對抑制導(dǎo)致增殖或分化的基因的表達有用。這些抗zFGF-5的結(jié)合蛋白單獨或與其它治療結(jié)合可用于治療例如橫紋肌肉瘤、心臟粘液瘤、成骨細胞起源的骨癌、侏儒癥、關(guān)節(jié)炎、韌帶和軟骨修補。
本發(fā)明的分子將對體外心臟組織細胞如心肌細胞或成肌細胞；骨骼肌細胞或成肌細胞和平滑肌細胞；軟骨細胞；內(nèi)皮細胞；脂肪細胞和成骨細胞的增殖有用。例如，本發(fā)明的分子可用作規(guī)定的細胞培養(yǎng)基成分，并可以單獨或和其它細胞因子和激素結(jié)合使用以替換通常在細胞培養(yǎng)中使用的血清。本發(fā)明的分子在特異促進培養(yǎng)中肌細胞生長和/或發(fā)育中尤其有用，也可以證明在心臟肌細胞增生和再生的研究中有用。
本發(fā)明的多肽、核酸和/或抗體可以用于治療與心肌梗死、充血的心力衰竭、肥大心肌病和擴張心肌病相關(guān)的疾病。本發(fā)明的分子也對限制心臟病發(fā)作后梗死面積、促進血管成形術(shù)或幼脈內(nèi)切除術(shù)后血管發(fā)生和傷口愈合、發(fā)展冠狀側(cè)支循環(huán)、眼中的重新血管化、和不良循環(huán)如糖尿病足潰瘍相關(guān)的并發(fā)癥、使用藥理法冠狀再灌注后的中風(fēng)以及血管再生是有益的其它指征也是有用的。本發(fā)明的分子對通過誘導(dǎo)心肌細胞新生和/或增生、誘導(dǎo)冠狀側(cè)支形成或誘導(dǎo)環(huán)死心肌面積的重塑來促進心臟功能是有用的。本發(fā)明的其它治療用途包括骨骼肌新生和/或增生、腎再生的誘導(dǎo)和/或用于治療系統(tǒng)的和肺動脈高壓。
使用慢性冠狀閉合的模型在兔、狗或豬中測定zFGF-5誘導(dǎo)的冠狀側(cè)支發(fā)育(L和au等，美國心臟雜志29924-931，1995；Sellke等，外科學(xué)120(2)182-188，1996和Lazarous等，1996，ibid.)。在大鼠中使用雙側(cè)頸動脈閉合并測定組織變化以及迷津行為，體內(nèi)檢測zFGF-5對治療中風(fēng)的益處(Gage等，老化的神經(jīng)生物學(xué)9645-655，1988)。使用對系統(tǒng)高血壓自發(fā)的高血壓大鼠(SHR)體內(nèi)檢測zFGF-5治療高血壓的效能(Marche等，藥理學(xué)和生理學(xué)臨床實驗增刊1S114-116，1995)。
本發(fā)明的分子也和于定向?qū)⑺巹┗蛩幬飩鬟f給心臟。例如利用zFGF-5啟動子指導(dǎo)的心臟特異表達，本發(fā)明的分子將對限制到心臟的表達是有用的。例如使用zFGF-5腺病毒discistronic結(jié)構(gòu)可以獲得心臟特異表達(Rothman等，基因治療3919-926，1996)。通過連接zFGF-5多肽至另一蛋白(Franz等，循環(huán)研究73629-638，1993)通過連接含有zFGF-5同系物多肽到第二個藥劑或藥物上形成嵌合體，zFGF-5多肽可用于其它藥劑或藥物限制于心臟組織上。蛋白，例如抗體，可以與本發(fā)明的zFGF-5分子形成嵌合體(Narula等，J.Nucl.Cardiol.，226-34，1995)。藥劑或藥物的例子包括但不限于生物活性多肽、基因、毒素、放射性核素、小分子藥物等。連接可以是直接或間接(如脂質(zhì)體)，可以通過重組方法、化學(xué)鍵合、強非共價相互作用等發(fā)生。
在本發(fā)明的一個實施方案中，包含zFGF-5蛋白的組合物可以用作治療試劑以加強成骨細胞介導(dǎo)的骨形成。組合物和使用本發(fā)明組合物的方法可用于促進骨缺損和缺失的修補，例如發(fā)生在閉合、開放和不結(jié)合骨折中的骨缺損和缺失；用于促進整形外科學(xué)中骨愈合；促進骨向內(nèi)生長進入非粘合假關(guān)節(jié)和牙移植物內(nèi)；用于治療牙周疾病和缺損；在內(nèi)脫位骨生成過程中增加骨形成；和用于治療其它可以通過促進成骨細胞活性來治療的骨骼疾病，如骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎。由本發(fā)明的方法提供的從頭骨形成將用于修補天生的、創(chuàng)傷誘導(dǎo)的、骨腫瘤切除，或放射誘導(dǎo)的骨壞死后骨愈合(Hart等，腫瘤，372580-2585，1976)。本發(fā)明的分子可以在整形外科學(xué)中找到用途。
對于藥物使用，根據(jù)傳統(tǒng)方法本發(fā)明的蛋白可以配方用于胃腸外，尤其是靜脈內(nèi)或皮下施用。靜脈內(nèi)施用將是通過一至幾小時典型時段的團注射或注入?？偟膩碚f，藥物配方將包括與藥物可接受載體如鹽、緩沖液鹽水、水中5％葡萄糖等結(jié)合的zFGF-5蛋白。配方可以進一步包括一個或多個賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑、防止在小瓶表面蛋白丟失的白蛋白等。配方的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并顯示在如Remington’s藥物科學(xué)，Gennar，編輯，Mack出版公司，Easton PA，1990，中，此處作為參考引入。治療劑量一般是每天在0.1至100μg/kg患者體重范圍內(nèi)，優(yōu)選每天0.5-20μg/kg，精確劑量由臨床大夫根據(jù)可接受的標準，考慮到要治療情況的本性和嚴重性、患者特性等等來確定。劑量的確定在本領(lǐng)域普通技術(shù)的水平內(nèi)。蛋白可以施用于急性治療。經(jīng)一周左右，經(jīng)常經(jīng)一至三天左右時間，或用于慢性治療，經(jīng)過幾個月或幾年。zFGF-5的治療有效量是足夠在肌細胞增殖、心臟功能、骨形成中產(chǎn)生臨床顯著改變或使和間充質(zhì)干細胞以及肌細胞、成骨細胞和軟骨細胞的前體細胞相關(guān)的特異細胞類型產(chǎn)生增長的量。尤其是，通過測量施用zFGF-5分子前后左心室射血組分，并通過確定總射血組份至少有5％增加，優(yōu)選10％或更多，可以確定肌細胞或肌細胞祖細胞數(shù)目的臨床顯著增加。確定射血組分的試驗，即測量每次搏動射血量，對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是熟知的。
通過下面非限制性實施例進一步說明本發(fā)明。實施例實施例1 EST序列的延伸用生長因子的探測物掃描翻譯的DNA數(shù)據(jù)庫產(chǎn)生表達序列標簽(EST)序列的確定，此EST發(fā)現(xiàn)是FGF家族的新成員，并命名為zFGF-5。
從表達序列標簽(EST)的序列中設(shè)計寡核苷酸引物ZC11,676(SEQID NO3)和ZC11,677(SEQ ID NO4)。此引物作為EST內(nèi)的內(nèi)部引物，當PCR進行時使用來自成體心臟組織的MARATHON READYcDNA(Clontech，Palo Alto，(A)作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板。
PCR的使用條件是94℃、90秒，一個循環(huán)，94℃、15秒；68℃、1分鐘；35個循環(huán)，接著72℃、10分鐘，1個循環(huán)，4℃溫育時間。PCR反應(yīng)重新制備了160bp的EST序列，并確定EST序列是正確的。
可以用寡核苷酸引物能擴增的其它文庫包括骨骼肌、肺、胃、小腸和甲狀腺。實施例2組織分布使用來自Clontech(Palo Alto，CA)的人類多組織雜交進行Northern雜交。實施例1中所描述的160bp DNA片段在1％瓊脂糖凝膠中電泳。然后用隨機引物MEGAPRIME DNA標記系統(tǒng)(Amersham，Arlington Heights，IL)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行放射活性標記。使用NUCTRAP推進柱(Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，CA)純化探針。EXPRESSHYB(Clontech，Palo Alto，CA)溶液用作預(yù)雜交，并作為Northern雜交的雜交液。雜交于68℃過夜進行，然后雜交在2×SSC和0.05％SDS中室溫沖洗，接著50℃在0.1×SSC和0.1％SDS中洗。在大約2.0kb處觀察到單一條帶。對成體心臟信號強度最高，在骨骼肌和胃中具有相對較弱的信號。實施例3測量zFGF-5的體外活性A.
使用細胞系和原代培養(yǎng)的細胞測量zFGF-5的促有絲分裂活性。來自表達重組蛋白的細胞的條件培養(yǎng)基和/或純化蛋白加入下列細胞系的培養(yǎng)物中NIH3T3成纖維細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1658)、CHH-1 chum心臟細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1680)、H9C2大鼠心臟成肌細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1446)、Shionogi乳房癌細胞(Tanaka等，1992，ibid)和LNCap.FGC腺癌細胞。對檢測zFGF-5增殖活性有用的新鮮分離細胞包括心臟成纖維細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞。
根據(jù)Raines和Ross的方法(酶學(xué)方法109749-773，1985)通過測量3H-腺苷摻入測量促有絲分裂活性。簡單地說休眠細胞在合適的培養(yǎng)基中以3×104細胞/ml的密度鋪盤。典型的生長培養(yǎng)基是含10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s生長培養(yǎng)基(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)。細胞培養(yǎng)在96-孔板上并允許生長3-4天。除去生長培養(yǎng)基，每孔加入180μl含有1％FCS的DFC(表5)。一半的孔有zFGF-5蛋白加入其中，另一半是負對照，沒有zFGF-5。細胞37℃在5％CO2中培養(yǎng)3天，并除去培養(yǎng)基。100μl含0.1％FCS和2uci/ml3H-腺苷的DFC加入每一孔，細胞培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)另外的1-24小時。吸走培養(yǎng)基，向每一孔加入150μl胰蛋白酶。培養(yǎng)板37℃溫育直至細胞分開(至少10分鐘)。分開的細胞用LKB Wallac 1295-001細胞收獲器(LKBWallac，Pharmacia，Gaithersburg，MD)收獲到濾膜上。濾膜在微波爐中加熱10分鐘干燥，并在LKB β-板1250閃爍計數(shù)器(KB Wallac)中按照供應(yīng)商所述的計數(shù)。
表5250ml Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco-BRL)250ml Ham’s F12培養(yǎng)基0.29mg/ml L-谷氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)1mM丙酮酸鈉(Sigma，St.Louis，MO)25mM Hepes(Sigma，St.Louis，MO)10μg/ml胎球蛋白(Aldrich，Milwallkee，WI)50μg/ml胰島素(Gibco-BRL)3ng/ml硒(Aldrich，Milwaukee，WI)20μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(JRH，Lenexa，KS)B.從一天齡的新生小鼠中分離心臟，然后根據(jù)Br和等，(生物化學(xué)雜志26811500-11503，1993)的方法通過反復(fù)的膠原酶的消化來分裂。通過Percoll梯度分離單個肌細胞，2ml以0.5×106細胞/ml鋪盤子6孔組織培養(yǎng)皿上。3天后用無鈣和鎂的PBS將孔沖洗3次，再加入1ml無血清培養(yǎng)基(表6)。用每孔1011顆粒AdCMV-zFGF-5或者AdCMV-GFP(綠色熒光蛋白)作為對照接種到孔中，37℃培養(yǎng)8小時。然后每一孔再次用無鈣和鎂的PBS沖洗3次，然后加入2ml無血清培養(yǎng)基。
用AdCMV-zFGF 5接種48小時內(nèi)，培養(yǎng)的肌細胞已停止跳動，并經(jīng)歷形態(tài)上的變化，而用AdCMV-GFP接種的孔繼續(xù)自發(fā)跳動，形態(tài)上未受接種的影響。48小時后用AdCMV-zFGF5接種的孔也含有一匯合層可見的、未貼壁細胞，在貼壁肌細胞層的匯合中并無任何細胞丟失，表明adCMV-zFGF5對培養(yǎng)的小鼠肌細胞的增殖作用。
表6DMEMHam’s營養(yǎng)混合液F12(Gibco-BRL；與DMEM的1∶1混合液)17mM NaHCO3(Sigma)2mM L-谷氨酰胺(Sigma)1％PSN(Sigma)1μg/ml胰島素5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白1nM氯化鋰(Sigma)1nM硒25μg/ml抗壞血酸(Sigma)1nm甲狀腺素(Sigma)C.
如實施例9A中所述的并按照實施例10中所描述純化的、與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合的zFGF-5，以0.1/ng/ml的濃度加到肌細胞中(實施例3B)，MBP-zFGF5也顯示能促進肌細胞的增殖。實施例4測量zFGF-5的離體活性從新生或8周齡小鼠或大鼠上去除整個心臟離體測量心臟有絲分裂的發(fā)生。離體的心臟在37℃、5％CO2中于Joklik’s(Sigma，St.Louis，MO)或Dulbeco’s培養(yǎng)基中放置4-24小時。在此培養(yǎng)時間內(nèi)以1pg/ml至100μg/ml的濃度范圍加入zFGF-5多肽。負對照僅使用緩沖液。加入3H-腺苷。樣品培養(yǎng)1-4小時，此后切開心臟，通過放射自顯影測定有絲分裂的發(fā)生。切片用以組織形態(tài)計量法以確定核/質(zhì)體積(McLaughlin，美國生理學(xué)雜志，271R122-R129，1996)。
另一可選擇的方法是凍干心臟并重懸于1ml 0.1N NaOH中。用冰預(yù)冷的10％三氯乙酸(TCA)沉淀DNA。上清加入9ml閃爍液中測量非特異3H-腺苷摻入。產(chǎn)生的沉淀重懸于1ml BTS-450組織溶解液(Beckman，F(xiàn)ullerton，CAO，并加入9ml閃爍液以測定3H-腺苷的特異的DNA摻入。
從一天齡CD-1小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)中分離左右心室，并用3ng/ml zFGF5Hep2(n＝13；見實施例10)或?qū)φ?n＝10)培養(yǎng)4小時。3H-腺苷加入1小時。心室沖洗幾次，然后在Joklik’s培養(yǎng)基中勻漿，產(chǎn)生的勻漿加入9ml閃爍混合液，并分析總的3H-腺苷的吸收和DNA摻入。
zFGF-Hep2將3H-腺苷在DNA中的吸收和摻入比對照提高2.068±0.489倍，表明zFGF5對心臟細胞是有促有絲分裂作用的。實施例5測量zFGF-5的體內(nèi)活性使用兩周齡新生大鼠和/或兩月齡成年大鼠體內(nèi)測量zFGF-5的增殖效應(yīng)。大鼠急性或慢性心包內(nèi)注射。A.
新生大鼠用zFGF-5以50ng/天至100ng/天的劑量范圍處理1至14天。處理后，通過測量增加心臟體積、改善的體內(nèi)和離體左心室功能，并通過增加的核/質(zhì)體積比，此體積比由組織形態(tài)計量法確定，來評估zFGF-5處理的對假處理的動物的效應(yīng)。B.
具有心肌病的大鼠或心肌病的模型如金黃心肌病倉鼠(Sole等，美國心臟學(xué)雜志62(11)20G-24G，1988)也用以評估zFGF-5對心臟功能和組織的效應(yīng)，心肌病通過慢性兒茶酚胺的灌注、或冠狀連接而誘導(dǎo)。
使用兒茶酚胺來誘導(dǎo)心肌病，7周齡大鼠通過肩胛骨之間皮下移植的微型滲透泵用腎上腺素連續(xù)灌注兩周。腎上腺素灌注會產(chǎn)生左心室纖維變性損傷的增加，損傷分數(shù)從0.005±0.005增至2.11±0.18，等級從0增至3；增加的左心室肌細胞寬度，從17.36±0.46μM增加至23.05±0.65μM；以及與鹽灌注大鼠相比較對異丙基腎上腺素可忽略的左心室乳頭肌收縮反應(yīng)(0.2對1.1克張力)處理兩周后，大鼠每天用載體、zFGF-5、bFGF、IGF-I或IGF-II心包內(nèi)注射14天。殺掉大鼠并進行組織形態(tài)計量法和組織細胞化學(xué)法。
在兒茶酚胺處理的以及生長因子再次處理以后評估如上述處理的大鼠，此處測量心臟的再生，如下降的左心室纖維變性損傷分數(shù)、下降的肌細胞寬度以及增加的對異丙基腎上腺素左心室乳頭肌收縮反應(yīng)。實施例6 zFGF-5的染色體作圖使用Whitehead研究所/MIT中心對基因組研究的“基因橋4放射雜交組”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)商業(yè)可獲得版本，zFGF-5定位于染色體5。基因橋4放射雜交組含有來自93個放射雜交克隆的適于PCR使用的DNA，再加上兩個對照DNA(HFL供體和A23受體)。一個可公共獲得的www網(wǎng)址(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi - bin/contig/rhmapper.pl)允許和Whitehead研究所/MIT中心對人類基因組的基因組研究放射雜交作圖“WICGR”放射雜交作圖)相關(guān)的作圖，而基因組研究的放射雜交作圖是用基因橋4放射雜交組建立起來的。
為了用“基因橋4放射雜交組”進行zFGF-5的作圖，在96-孔微滴定板(Stratagene，La Jolla，(A)中建立25μl反應(yīng)，并在“RoboCycler Gradient 96”熱循環(huán)儀(Stratagene)中用于PCR。95個PCR反應(yīng)的每一個含有2.5μl50x“有利的Klentaq聚合酶混合液”(Clontech)、2μl dNTPs混合液(每個2.5mM；Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)、1.25μl正義引物ZC11677(SEQ ID NO4)和1.25μl反義引物ZC12053(SEQ ID NO5)。
2.5μl“RediLoad”(Research Genetics，Inc)、0.5μl“有利的Klentaq聚合酶混合液”(Clontech Laboratories，Inc.)、來自每個雜交克隆或?qū)φ盏?5ng DNA和ddH2O，總體積25μl。反應(yīng)用等量礦物油覆蓋并封閉。PCR循環(huán)條件如下94℃4分鐘的一個初始循環(huán)，94℃1分鐘、66℃退火1.5分鐘和72℃延伸1.5分鐘，35個循環(huán)，接著最后一個循環(huán)72℃延伸7分鐘。反應(yīng)在3％NuSieve GTG瓊脂糖膠(FMC Bioproducts，Rockl和，ME))中通過電泳分離。
結(jié)果顯示在WICGR放射雜交圖上zFGF-5定位于距離人染色體5連鎖組頂部541.12cR處。相對于著絲點，它的最鄰近標記是WI-16922，它的最遠標記是WI14692。使用周圍的CHLC圖標民也會幫助將zFGF-5定位于CHLC染色體5版本V8C7整合標記圖上的5q34-q35區(qū)域(合作的人連鎖中心，www網(wǎng)址http//www.chlc.org/ChlcIntegratedMaps.html).實施例7 zFGF-5對骨的影響A.
使用Becker等，(細胞生物學(xué)方法43161-189，1994)所描述的方法構(gòu)建含有zFGF-5cDNA的腺病毒載體。簡單地說，zFGF-5的cDNA(如SEQ ID NO1所顯示)作為XbaI-SalI片段克隆進pACCMV(Gluzman等，在真核病毒載體中Gluzman(編輯)，187-192頁，冷泉港出版，冷泉港，紐約，1982)。pACCMV載體含有部分腺病毒5基因組、CMV啟動子和SV40終止序列。含有載體和cDNA插入子的質(zhì)粒和含有腺病毒5基因組的質(zhì)粒。其命名為pJM17(McGrory等，病毒學(xué)163614-617，1988)共轉(zhuǎn)染進入293細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號CRL-1573；美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)，導(dǎo)致了重組事件的發(fā)生，并產(chǎn)生含有zFGF-5的重組腺病毒，命名為AdCMV-zFGF5。zFGF-5 cDNA的存在由PCR確定。
通過1×1011和5×1011顆粒/小鼠之間的靜脈內(nèi)注射腺病毒載體AdCMV-zFGF5用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。已表明靜脈內(nèi)注射后，大部分病毒靶向肝臟，非常有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞(Herz等，美國國家科學(xué)院院刊902812-2816，1993)。已表明細胞合成由cDNA編碼的蛋白，在分泌蛋白的情況下，將它們分泌進循環(huán)。已顯示高水平的表達和生理效應(yīng)(Ohwada等，血液88768-774，1996；Stevenson等，動脈厚化、血栓形成和血管生物學(xué)15479-484，1995；Setoguchi等，血液842946-2953，1994和Sakamoto等，美國國家科學(xué)院院報9112368-12372，1994)。
通過尾靜脈的IV或心包內(nèi)(IPC)注射用不含cDNA插入子(AdCMV-裸)的腺病毒或AdCMV-zFGF5處理6周齡CD-1小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)。總共注射5×1011病毒顆粒/100μl/小鼠。注射后14天，殺掉動物，去除并未分開的脛骨和股骨，以檢查任何在的發(fā)炎反應(yīng)。將骨固定在10％中性緩沖福爾馬林中并加工。它們在帶有10％檸檬酸鈉的5％甲酸中脫鈣，在水中沖洗，在一系列70％-100％乙醇中脫水，在二甲苯中清洗，包埋于石蠟中。樣品縱切經(jīng)過脛骨和股骨的干骺端，并用hemotoxylin和伊紅染色以辨別骨細胞。通過中心陰性高爾基區(qū)和偏心的細胞核定成骨細胞，通過多核、非均勻形狀和與這些吸收細胞相關(guān)的Howship胞隙鑒定破骨細胞。
對于骨的組織形態(tài)計量法，選擇股骨樣品。由于取樣點的變化(即在相同平面上股骨樣品并未精確切片)不能測量骨松質(zhì)體積。三個骨參數(shù)用于評估組織形態(tài)計量的改變。
1.骨內(nèi)成骨細胞的數(shù)量在鄰近生長板的1.22mm面積內(nèi)180x放大倍數(shù)沿骨松質(zhì)骨內(nèi)表面測量。
2.骨內(nèi)破骨細胞的數(shù)量在鄰近生長板的1.22mm面積內(nèi)以180x放大倍數(shù)沿骨松質(zhì)骨內(nèi)表面測量。
3.生長板寬度除了外周端沿整個生長板以90x放大倍數(shù)以每72μM測量，以確定生長板的活性。
數(shù)據(jù)的分析(平均±SD，n＝4-7/組)表明1.在脛骨和股骨之間的關(guān)節(jié)沒有可檢測到的炎癥反應(yīng)。
2.小鼠中IV或IPC注射AdCMV-zFGF5，當?shù)诙軝z查時，顯著提高了遠側(cè)股骨干骺端的骨生成活性。由下來表示骨生成活性a)和只是對照的相關(guān)載體比較，AdCMV-zFGF5 IV灌注或IPC注射后，在遠側(cè)股骨的骨松質(zhì)中骨內(nèi)成骨細胞的數(shù)量分別顯著提高530％和263％；b)在骨表面觀察到骨生成組織的增加，表明骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞系分化的增加。
3.與只是對照的相關(guān)載體比較，通過IV或IPC施用AdCMV-zFGF5并未顯著骨內(nèi)破骨細胞的數(shù)量。
4.通過AdCMC-zFGF5的IV灌注，而非IPC注射可以顯著降低生長板的慷痊表明IV灌注后抑制生長板活性。還未闡明AdCMV-zFGF5施用的分化效應(yīng)。
這些結(jié)果表明zFGF-5是促進成骨細胞增殖的強促有絲分裂原，zFGF-5有能力誘導(dǎo)新骨的形成。B.
用和上述7.A.中描述的基本相同的步驟，對雌性CD-1(JacksonLabs)進行QCT，這些CD-1每只小鼠注射了1×1011顆粒AdCMV-zFGF5。注射后30天殺掉小鼠，和對照(用空腺病毒或鹽水注射)相比心臟/脛骨長度比率提高。之間在脛骨長度沒有差異以解釋此改變，在組中間任何其它器官重量也沒有差異。這樣如QCT所測量，表明zFGF-5腺病毒選擇性提高整個骨密度、小染骨密度和股骨皮質(zhì)厚度。實施例8 zFGF-5對心臟的影響如7.B中所描述，給CD-1小鼠一次AdCMV-zFGF5的IV注射，4周后殺掉，和空載體或鹽水處理的小鼠相比發(fā)現(xiàn)心臟/脛骨長度比率增加。結(jié)果表明在脛骨長度上組之間沒有差異以解釋這個變化，在組之間任何其它器官重量上也沒有差異。此結(jié)果表明當作為一個IV腺病毒構(gòu)建物施用時AdCMV-zFGF5選擇性提高心臟生長。實施例9zFGF-5的表達A.編碼zFGF5的質(zhì)粒的構(gòu)建使用來自新英格蘭生物實驗室(NEB；Beverly，MA)的MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)融合系統(tǒng)在大腸桿菌中一達zFGF5，一個成纖維細胞生長因子同系物。在這個系統(tǒng)中，zFGF5 cDNA連到Mal E基因的3′端形成MBP-zFGFr融合蛋白。融合蛋白的表達由tac啟動子驅(qū)動；表達是“關(guān)閉”的，直至加入1mmol IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)啟動子生此融合蛋白的三個變種，只是從MBP上釋放zFGF5的切割位點存在差異。一個構(gòu)建物在MBP和zFGF5結(jié)構(gòu)域之間具有凝血酶切割位點。第二個構(gòu)建物有因子Xa切割位點。而不是凝血酶切割位點。第三個構(gòu)建物具有腸激酶切割位點，而不是凝血酶切割位點。
根據(jù)生產(chǎn)商的說明，按照pMAL-C2載體(NEB)的多克隆位點將此構(gòu)建物構(gòu)造為具有MBP的框架內(nèi)融合物。使用能引入方便的克隆位點以及切割位點的引物通過PCR擴增zFGF5，使用以下引物1)對于凝血酶構(gòu)建物ZC12,652(SEQ ID NO7)和ZC12,631(SEQ ID NO8)；2)對因子Xa構(gòu)建物ZC15,290(SEQ ID NO9)和ZC12,631(SEQ ID NO8)；和3)對腸激酶構(gòu)建物ZC15,270(SEQ ID NO10)AND zc12,631(SEQ IDNO8)。在每一種情況，不擴增天然zFGF5信號序列；zFGF5在SEQ IDNO2的26位氨基酸殘基(纈氨酸變成丙氨酸)處開始表達。通過將XbaI-SalI zFGF5片段插入pMAL-C2的XbaI-SalI位點構(gòu)建凝血酶構(gòu)建物。通過將平端-SalI片段插入MCS的XmnI-SalI位點構(gòu)建因子Xa構(gòu)建物。通過將XbaI-SalI片段插入pMAL-C2的XbaI-SalI位點構(gòu)建腸激酶構(gòu)建物。一旦構(gòu)建了構(gòu)建物，它們可以轉(zhuǎn)化進許多大腸桿菌菌株，并分析高水平表達。凝血酶構(gòu)建物(命名為pSDH90.5)轉(zhuǎn)染進DH10B細胞(GIBCO-BRL)，而因子Xa構(gòu)建物(命名為pSDH117.3)和腸激酶構(gòu)建物(命名為pSDH116.3)轉(zhuǎn)染進TOP10細胞(Invitrogen，San Diego，CA)，三個MBP融合蛋白大約都是63KD(MBP結(jié)構(gòu)域中43KD，zFGF5結(jié)構(gòu)中約20KD)。B.同源重組/zFGF5在甲醇畢赤酵母中zFGF5的表達使用共同轉(zhuǎn)讓的PCT WO 9717450中所描述的表達系統(tǒng)，在此處作為參考引入。通過同源重組構(gòu)建含有編碼zFGF5全部或部分多核苷酸的質(zhì)粒pCZR204構(gòu)建表達載體，pCZR204含有AUG1啟動子、接著是αFpp前導(dǎo)肽、接著是氨基末端肽標鑒、平末端SmaI限制性位點、羧基末端肽標鑒、翻譯終止密碼子、接著是AUG1終止子、ADE2選擇性標記、和最終的AUG1 3′未翻譯區(qū)域。此載體也包括在啤酒酵母中選擇和復(fù)制所需的URA3和CEN-ARS序列以及在大腸桿菌中選擇和復(fù)制所需的AmpR和colE1 on序列。插入載體的zFGF5序列以zFGF氨基酸序列的第27位殘基(丙氨酸)開始。
為了構(gòu)建pSDH114，一個在甲醇畢赤酶母中表達zFGF5的質(zhì)粒，下列DNA片段轉(zhuǎn)化進啤酒酵母100ng已用SmaI消化的‘受體載體’pCZR204；1μg以pSDH90.5中釋放出的并包括zFGF5編碼序列的XbaI-SalI限制性片段；1μg合成的、PCR產(chǎn)生的、雙鏈衍接物區(qū)段，此衍接物片段一端跨越αFpp編碼序列的70堿基對，另一端和來自成熟zFGF5序列的氨基末端編碼序列的70個堿基對相連接，它是從4個寡核苷酸ZC13,497(SEQ ID NO11)；ZC15,131(SEQ ID NO12)ZC15,132；(SEQ ID NO18)；ZC15,134(SEQ ID NO13)中產(chǎn)生，雙鏈序列的正義鏈顯示于SEQ ID NO19(5′衍接物序列(αFpp→zFGF5 N-末端))；以及1μg合成的、PCR產(chǎn)生的、雙鏈衍接物段，此衍接物片段用AUG1終止序列的70個堿基對一端跨越來自zFGF5的羧基末端編碼序列的70個堿基對，它是從4個寡核苷酸13,529(SEQ ID NO14)；ZC13,525(SEQ ID NO15) AC13,526(SEQ ID NO16)；ZC13,528(SEQ ID NO17)中產(chǎn)生，雙鏈序列的正義鏈顯示于SEQ IDNO20(3′衍接物序列(zFGF5 C-末端→AUG1終止子))。挑選Ura+克隆，提取來自酵母克隆的DNA，并轉(zhuǎn)化進大腸桿菌。用寡核苷酸ZC13,497(SEQ ID NO11)和ZC13,528(SEQ ID NO12)通過PCR篩選確認含有正確表達構(gòu)建物的單個克隆，接著通過限制性消化證實zFGF5插入子的存在，并通過DNA測序確認所要的DNA序列已與另一個連接在一起。對正確克隆中的一個分離大量質(zhì)粒DNA，用SfiI消化DNA以從載體骨干上釋放畢赤-zFGF5表達DNA序列組件。SfI所切割DNA轉(zhuǎn)化進畢赤甲醇酵母表達宿主，命名為PMAD16，并在ADE D盤上鋪盤以選擇克隆。挑出許多克隆，并通過Western雜交篩選高水平的zFGF表達。
更特異地，為了小量蛋白合成(如盤或振蕩燒瓶合成)，帶有含有甲醇調(diào)控啟動子(如AUG1啟動子)的表達DNA序列組件的畢赤甲醇酵母轉(zhuǎn)化子在存在甲醇并缺少干擾量的其它碳源(如葡萄糖)的條件下生長。為了小量實驗，包括表達水平的初步篩選，轉(zhuǎn)化子可以于30℃，在含有20g/L細菌培養(yǎng)用瓊脂(Difco)、6.7g/L無氨基酸酵母氮基(Difco)、10g/L甲醇、0.4mg/L生物素和0.56g/L Ade-Thr-Trp粉末的固態(tài)培養(yǎng)基上生長。因為甲醇是易揮發(fā)的碳源，它很容易在延長的培養(yǎng)中丟失。通過在倒置盤的蓋上放置在水中的50％甲醇溶液來提供持續(xù)來源的甲醇，由此通過蒸發(fā)轉(zhuǎn)移甲醇轉(zhuǎn)到生長的細胞中。一般來說，每100mm盤中用不超過1ml甲醇。使用生長在振蕩燒瓶中的培養(yǎng)中進行稍微更大量的實驗。在典型的方法中，細胞在上述最少限度甲醇的盤中30℃生長兩天，然后克隆從大約1×106細胞/ml的細胞密度接種于小體積的最少限度甲醇培養(yǎng)基中(6.7g/L無氨基酸酵母氮基、10g/L甲醇、0.4mg/L生物素)。細胞于30℃生長。生長在甲醇中的細胞對高氧氣水平的需要，使培養(yǎng)過程中劇烈振蕩成為必要。每天補充甲醇(一般每天1/100體積的50％甲醇)。
為了生產(chǎn)量培養(yǎng)，在振蕩燒瓶中制備高產(chǎn)克隆的新鮮培養(yǎng)物。產(chǎn)生的培養(yǎng)物用于接種發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基。一般情況下，在劇烈振蕩條件30℃于YEPD中生長1-2天的500ml培養(yǎng)物用于接種5升發(fā)酵罐。細胞在含有鹽、葡萄糖、生物素、和微量元素的合適培養(yǎng)基中，于28℃、pH5.0以及＞30％溶解氧氣下生長。在葡萄糖最初投料消耗后(由氧氣消耗的降低來顯示)，葡萄糖/甲醇轉(zhuǎn)移至溶器中以誘導(dǎo)目的蛋白的合成。因為大量發(fā)醇是在限制碳的條件下進行，飼料中葡萄糖的存在并不抑制甲醇誘導(dǎo)的啟動子。實施例10 zFGF-5的純化從以麥芽糖結(jié)合蛋白融合體形式(pSDH90.5，如上述)表達zFGF5的菌株中獲得大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基。使用含20mM Hepes、0.4M Nacl、0.01M EDTA、10mM DTT、pH7.4的緩沖液在超聲處理或Fench壓力破碎過程中溶解MBP-zFGF-5融合體。提取緩沖液也可以包括5μg/ml胃酶抑制劑、亮抑酶肽、抑酶肽、苯丁抑制素。也可以包括0.5mM最終濃度的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
提取物于4℃以18000xg離心30分鐘。得到的上清經(jīng)過直鏈淀粉樹脂(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)，此樹脂結(jié)合融合體的MBP結(jié)構(gòu)域。一旦沖洗柱子，在與提取緩沖液相同的緩沖液，無DTT和蛋白酶抑制劑，但含10mM麥芽糖中洗脫結(jié)合的MBPzFGF5融合體。
以1∶100(w/w)牛凝血酶對MBPzFGF5融合體處理MBPzFGF5的洗脫集合。切割反應(yīng)允許在室溫進行6至8小時，此后使用和上述直鏈淀粉親和層析相同的洗脫緩沖液，反應(yīng)混合物經(jīng)過苯基淀粉溶素瓊脂糖床(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscatawaym，NJ)以除去凝血糖。
將經(jīng)過的組份，含有切割產(chǎn)物zFGF5和自由MBP結(jié)構(gòu)域，加到TosoHaas肝素親和基質(zhì)中(Toso Haas，Montgomeryville，PA)，此基質(zhì)已在0.5M Nacl、20mM Hepes、0.01M EDTA、pH7.4中平衡。在此條件下MBP和zFGF5都結(jié)合到肝素上。用2至3柱體積在柱緩沖液中形成的0.5M Nacl至2.0 Nacl之間的梯度洗脫結(jié)合蛋白。
MBP洗脫得早，在大約0.7M Nacl，切割的zFGF5在大約1.3M Nacl處洗脫。收集的zFGF5組份經(jīng)過直鏈淀粉步再一次去除任何殘余的MBPzFGF5，MBPzFGF5是次要污染物。純化的物質(zhì)命名為zFGF5-Hep2，在還原SDS-PAGE分析中在20KDa處顯示單一高純的種類。
氨基酸N-末端測序產(chǎn)生天然的N-末端序列，但質(zhì)量分光光度測量法數(shù)據(jù)揭示分子量，表明C-末端一害在SEQ ID NO2的196位殘基(賴氨酸)處被截短，此處存在“二堿性位點”。
zFGF5蛋白在1.3M Nacl中非常穩(wěn)定。一旦進PBS中透析，zFGF5聚合并離開溶液相。因而包括肝素和其它“聚陰離子”的配方可以用以防止純zFGF5的聚合。實施例11抗體的合成使用本領(lǐng)域已知和以前描述的標準技術(shù)，用肽QTRADDVSRKQLRLYC(SEQ ID NO2 40位至56位氨基酸殘基)，命名為zFGF-1；YTTVTKRSRRIRPTHRAC(SEQ ID NO2 191至207位氨基酸殘基，C-末端帶有附加的胱氨酸)，命名為zFGF-5或SEQ IDNO2中顯示的全長zFGF5多肽，加上MPB融合蛋白，命名為MBP-FGF5，通過免疫豚鼠、兔和小鼠合成zFGF5的抗體。使用順丁烯二酰亞胺活化的KLH(Pierce chmical Co.，Rockford，IL)通過胱氨酸基使肽偶聯(lián)。
表7是動物、免疫水平和抗體分離的描述。
表7
實施例12 zFGF5對ob/ob小鼠的影響使用雌性ob/ob小鼠(C57B1/6J，Jackson Labs，Bar Harbor，ME)檢測zFGF5對脂肪細胞和脂肪代謝的影響。小鼠是肥胖的、具胰島素抗性的并有“脂肪骨”。對小鼠稱重并發(fā)現(xiàn)所有都是相同重量，如實施例7所述，給每只小鼠IV注射1011顆粒AdCMVzFGF5或鹽水或Ad5CMV-GFP作為對照。注射后17天，注射Ad5CMV-GFP的對照小鼠比注射那天增加5.342±0.5克體重，而AdCMVzFGF-5處理的小鼠丟失了3.183±0.743克體重。
從前面所述，可以理解盡管為了說明的目的已描述了本發(fā)明特殊的實施方案，但在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以進行各種修改。因此，本發(fā)明并不受除附加權(quán)利要求之外的限制。
序列表(1)基本信息(i)申請人ZymoGenetics，Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattle，Washington 98102United States of America(ii)發(fā)明名稱成纖維細胞生長因子同系物(iii)序列數(shù)目20(iv)聯(lián)系地址(A)地址ZymoGenetics，Inc.
(B)街道1201 Eastlake Avenue East(C)城市Seattle(D)州名WA(E)國家USA(F)郵政編碼98102(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ，Windows版本2.0(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)遞交日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)遞交日(viii)律師/代理人信息
(A)名稱Sawislak，Deborah A(B)登記號37,438(C)文件/著錄號96-20(ix)電信信息(A)電話206-442-6672(B)傳真206-442-6678(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度917個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵編碼序列(B)位置1...621(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG TAT TCA GCG CCC TCC GCC TGC ACT TGC CTG TGT TTA CAC TTC CTG 48Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu1 5 10 15CTG CTG TGC TTC CAG GTA CAG GTG CTG GTT GCC GAG GAG AAC GTG GAC 96Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp20 25 30TTC CGC ATC CAC GTG GAG AAC CAG ACG CGG GCT CGG GAC GAT GTG AGC 144Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser35 40 45CGT AAG CAG CTG CGG CTG TAC CAG CTC TAC AGC CGG ACC AGT GGG AAA 192Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys50 55 60CAC ATC CAG GTC CTG GGC CGC AGG ATC AGT GCC CGC GGC GAG GAT GGG 240His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly65 70 75 80GAC AAG TAT GCC CAG CTC CTA GTG GAG ACA GAC ACC TTC GGT AGT CAA 288Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln85 90 95GTC CGG ATC AAG GGC AAG GAG ACG GAA TTC TAC CTG TGC ATG AAC CGC 336Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg100 105 110AAA GGC AAG CTC GTG GGG AAG CCC GAT GGC ACC AGC AAG GAG TGT GTG 384Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val115 120 125TTC ATC GAG AAG GTT CTG GAG AAC AAC TAC ACG GCC CTG ATG TCG GCT 432Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala130 135 140AAG TAC TCC GGC TGG TAC GTG GGC TTC ACC AAG AAG GGG CGG CCG CGG 480Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg145 150 155 160AAG GGC CCC AAG ACC CGG GAG AAC CAG CAG GAC GTG CAT TTC ATG AAG 528Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys165 170 175CGC TAC CCC AAG GGG CAG CCG GAG CTT CAG AAG CCC TTC AAG TAC ACG 576Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr180 185 190ACG GTG ACC AAG AGG TCC CGT CGG ATC CGG CCC ACA CAC CCT GCC TAGGC626Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala195 200 205CACCCCGCCG CGGCCCTCAG GTCGCCCTGG CCACACTCAC ACTCCCAGAA AACTGCATCA686GAGGAATATT TTTACATGAA AAATAAGGAT TTTATTGTTG ACTTGAAACC CCCGATGACA746AAAGACTCAC GCAAAGGGAC TGTAGTCAAC CCACAGGTGC TTGTCTCTCT CTAGGAACAG806ACAACTCTAA ACTCGTCCCC AGAGGAGGAC TTGAATGAGG AAACCAACAC TTTGAGAAAC866CAAAGTCCTT TTTCCCAAAG GTTCTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAACTCGA G 917(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征
(A)長度207個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp20 25 30Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser35 40 45Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys50 55 60His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly65 70 75 80Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln85 90 95Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg100 105 110Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val115 120 125Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala130 135 140Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg145 150 155 160Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys165 170 175Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr180 185 190Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala195 200 205(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC11676(xi)序列描述SEQ ID NO3GGACTTGACT ACCGAAGGTG TCTG 24(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC11677(xi)序列描述SEQ ID NO4GTCGATGTGA GCCGTAAGCA GCT 23(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC12053(xi)序列描述SEQ ID NO5GCATACTTGT CCCCATCCTC GCCGCG 26(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息
(i)序列特征(A)長度621個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO6ATGTAYWSNG CNCCNWSNGC NTGYACNTGY YTNTGYYTNC AYTTYYTNYT NYTNTGYTTY 60CARGTNCARG TNYTNGTNGC NGARGARAAY GTNGAYTTYM GNATHGAYGT NGARAARCAR120ACNMGNGCNM GNGAYGAYGT NWSNMGNAAR CARYTNMGNY TNTAYCARYT NTAYWSNMGN180ACNWSNGGNA ARCAYATHCA RGTNYTNGGN MGNMGNATHW SNGCNMGNGG NGARGAYGGN240GAYAARTAYG CNCARYTNYT NGTNGARACN GAYACNTTYG GNWSNCARGT NMGNATHAAR300GGNAARGARA CNGARTTYTA YYTNTGYATG AAYMGNAARG GNAARYTNGT NGGNAARCCN360GAYGGNACNW SNAARGARTG YGTNTTYATH GARAARGTNY TNGARAAYAA YTAYACNGCN420YTNATGWSNG CNAARTAYWS NGGNTGGTAY GTNGGNTTYA CNAARAARGG NMGNCCNMGN480AARGGNCCNA ARACNMGNGA RAAYCARCAR GAYGTNCAYT TYATGAARMG NTAYCCNAAR540GGNCARCCNG ARYTNCARAA RCCNTTYAAR TAYACNACNG TNACNAARMG NWSNMGNMGN600ATHMGNCCNA CNCAYCCNGC N 621(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息((i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC12652(xi)序列描述SEQ ID NO7TATTTATCTA GACTGGTTCC GCGTGCCGCC GAGGAGAACG TGGACTT 47(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC12631(xi)序列描述SEQ ID NO8GTATTTGTCG ACTCAGGCAG GGTGTGTGGG CCG 33(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC15290(xi)序列描述SEQ ID NO9GCCGAGGAGA ACGTGGACTT CC 22(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC15270(xi)序列描述SEQ ID NO10TATTTATCTA GAGATGACGA TGACAAGGCC GAGGAGAACG TGGACTT 47(2)關(guān)于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC13497(xi)序列描述SEQ ID NO11AGCATTGCTA AAGAAGAAGG TGTAAGCTTG GACAAGAGAG A41(2)關(guān)于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度63個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC15131(xi)序列描述SEQ ID NO12GGTGTAAGCT TGGACAAGAG AGAGGAGAAC GTGGACTTCC GCATCCACGT GGAGAACCAG60ACG 63(2)關(guān)于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形
(vii)中間來源(B)克隆ZC15134(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGGCTGTAG AGCTGGTACA GCCGCAGCTG CTTACGGCT 39(2)關(guān)于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC13529(xi)序列描述SEQ ID NO14CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CC 42(2)關(guān)于SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度61個氨基酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC13525(xi)序列描述SEQ ID NO15ACGACGGTGA CCAAGAGGTC CCGTCGGATC CGGCCCACAC ACCCTGCCTA GGGGGAATTC 60G 61(2)關(guān)于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征
(A)長度61個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC13526(xi)序列描述SEQ ID NO16CAAACAGGCA GCCCTAGAAT ACTAGTGTCG ACTCGAGGAT CCGAATTCCC CCTAGGCAGG 60G 61(2)關(guān)于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC13528(xi)序列描述SEQ ID NO17CTCAAAAATT ATAAAAATAT CCAAACAGGC AGCCCTAGAA TACT 44(2)關(guān)于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度62個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(vii)中間來源(B)克隆ZC15132
(xi)序列描述SEQ ID NO18CAGCCGCAGC TGCTTAGCGC TCACATCGTC CCGAGCCCGC GTCTGGTTCT CCACGTGGAT GC 62(2)關(guān)于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度141個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述SEQ ID NO19AGCATTGCTG CTAAAGAAGA AGGTGTAAGC TTGGACAAGA GAGAGGAGAA CGTGGACTTC 60CGCATCCACG TGGAGAACCA GACGCGGGCT CGGGACGATG TGAGCCGTAA GCAGCTGCGG 120CTGTACCAGC TCTACAGCCG G141(2)關(guān)于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度144個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述SEQ ID NO20CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CCCGTCGGAT CCGGCCCACA60CACCCTGCCT AGGGGGAATT CGGATCCTCG AGTCGACACT AGTATTCTAG GGCTGCCTGT 120TTGGATATTT TTATAATTTT TGAG 14權(quán)利要求
1.編碼成纖維細胞生長因子(FGF)同系物多肽的分離的多核苷酸分子，選自a)包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位變體；c)編碼與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基的氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ ID NO6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子。
2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子，其中多核苷酸分子包含如SEQ ID NO1的1位至621位核苷酸所示的核苷酸序列或如SEQ IDNO6的1位至621位核苷酸所示的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子，其中多核苷酸分子包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子，其中多核苷酸是DNA。
5.含有下列可操作連接元件的表達載體轉(zhuǎn)錄啟動子；DNA片段，選自a)包含如SEQ ID NO1的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；b)(a)的等位變體；c)編碼與SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至207位(丙氨酸)氨基酸殘基的氨基酸序列至少60％相同的多肽的多核苷酸分子；和d)包含如SEQ ID NO6的82位至621位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；及轉(zhuǎn)錄終止子。
6.其中已導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達載體的培養(yǎng)細胞，其中所(c)在有利于通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增前列腺特異抗原(PSA)DNA而不利于擴增hK2 DNA的條件下，將由人生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的第二份DNA與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸，以產(chǎn)生擴增的PSADNA；和(d)檢測擴增的PSA DNA的存在。
12.一種檢測hK2 RNA的診斷方法，包括(a)從人類來源的生理樣品中提取RNA；(b)對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；(c)在有利于通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增DNA的條件下，將逆轉(zhuǎn)錄生成的該DNA與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸以生成一定量的擴增hK2DNA，其中至少一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸；(d)檢測擴增的hK2 DNA的存在，其中擴增hK2 DNA的存在表明人體中有轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品是組織樣品。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品是生理液體樣品。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述人做過前列腺完全切除術(shù)，其中hK2 DNA的存在表明此人有持續(xù)性前列腺癌。
16.一種監(jiān)測前列腺癌發(fā)展的方法，包括(a)將由前列腺癌患者的生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，在有利通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增DNA的條件下，將逆轉(zhuǎn)錄生成的該DNA一定量與一定量的至少兩種寡核苷酸接觸以產(chǎn)生一定量擴增的hK2 DNA，其中至少一種寡核苷酸是hK2特異的寡核苷酸；(b)檢測或測定擴增hK2 DNA的量；(c)過一段時間后重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)比較(b)和(c)步驟的結(jié)果，其中hK2 DNA量的增加表示所述人體中前列腺癌在發(fā)展。
17.一種病理確定前列腺癌級別的方法，包括(a)從前列腺癌患者的生理樣品來源的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，在有利于通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增DNA的條件下，將逆轉(zhuǎn)錄生成的該DNA一所示的氨基酸序列的多肽分子表位結(jié)合的抗體。
15.權(quán)利要求14的抗體，與包含如SEQ ID NO2的28位(谷氨酸)至196位(賴氨酸)殘基所示的氨基酸序列的多肽分子結(jié)合。
16.促進肌細胞或肌細胞前期細胞增殖的方法，包括向需要其的哺乳動物以足夠在所述哺乳動物中使肌細胞或肌細胞前期細胞數(shù)量臨床上顯著增加的量施用FGF同系物多肽。
17.權(quán)利要求16的方法，其中肌細胞或肌細胞前期細胞是心肌細胞或心肌細胞前期細胞。
18.離體刺激肌細胞前期細胞或肌細胞的方法，包括與缺少FGF同系物多肽時培養(yǎng)的心臟組織肌細胞前期細胞或肌細胞相比，在存在FGF同系物多肽時將心臟組織細胞與足以使培養(yǎng)的心臟組織細胞中肌細胞前期細胞或肌細胞數(shù)量增加的用量的FGF同系物多肽一起培養(yǎng)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中肌細胞或肌細胞前期細胞是心肌細胞或心肌細胞前期細胞。
20.將藥劑或藥物選擇性轉(zhuǎn)移至心臟組織的方法，包括將含有FGF同系物多肽的第一個分子與含有藥劑或藥物的第二個分子連接以形成嵌合體；并且將此嵌合體施用給心臟組織。
全文摘要
本發(fā)明涉及FGF家族的新成員zFGF－5的多核苷酸和多肽分子。多肽和編碼它們的多核苷酸對肌肉細胞有增生作用,可以用于重建心臟組織并改善心臟功能。本發(fā)明也包括抗zFGF－5多肽的抗體。
文檔編號C12N15/18GK1247568SQ97199827
公開日2000年3月15日 申請日期1997年10月16日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月16日
發(fā)明者T·A·戴舍爾, D·C·康克林, F·C·雷蒙德, T·R·布考斯基, S·D·霍爾德曼, B·翰森, P·O·舍帕爾德 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司