專利名稱:具有免疫活性的乳清成分及其制取方法
本項(xiàng)發(fā)明涉及一種具有免疫活性的乳清成分及其制取方法。本申請(qǐng)是1986年1月13日提出的6/818，610號(hào)專利申請(qǐng)的延續(xù);而后者又是1985年4月15日提出的美國專利申請(qǐng)6/723，612號(hào)的延續(xù)。上述申請(qǐng)中披露的內(nèi)容包含在本文的參考文獻(xiàn)中。
與大多數(shù)家畜一樣，小牛出生時(shí)是沒有免疫能力的。母畜(母親)通過最初的乳腺分泌(稱做初乳)，在產(chǎn)后向幼畜傳輸被動(dòng)免疫。初乳中具有免疫活性的高分子量蛋白質(zhì)(稱做免疫球蛋白，以下簡稱Ig)的水平會(huì)很快的降低。這些Ig分子具有抗體的性質(zhì)，只有成年動(dòng)物才能產(chǎn)生以增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)細(xì)菌、病毒或寄生蟲感染的免疫力?？墒窃谛∨３錾鷷r(shí)，它的血液中缺乏Ig。只有當(dāng)它出生以后不久，從母畜初乳中消化與吸收一定數(shù)量與質(zhì)量的Ig，才能使小牛的免疫系統(tǒng)具備有效的功能。
在天然的被動(dòng)免疫傳輸機(jī)制中第一重要的因素關(guān)系到母畜初乳的特性。為了能有理想的被動(dòng)免疫，母畜初乳中應(yīng)含有適量的Ig，而且這種Ig中應(yīng)具有對(duì)不同的病原體的特異性抗體，每一種特異性抗體還應(yīng)有合適的濃度。如果母畜初乳中對(duì)某些重要的病原體的特異性抗體的濃度不夠，則小牛只能由此得到對(duì)該幾種病原體不充分的抗體，這樣就會(huì)因此而形成對(duì)這幾種病原體的免疫能力的缺陷。
天然被動(dòng)免疫傳輸機(jī)制中的第二重要的因素是小牛的調(diào)整，即關(guān)系到初乳消化的量和時(shí)間。對(duì)于消化的量，以前的研究曾經(jīng)指出，為了使吸收的Ig進(jìn)入小牛循環(huán)系統(tǒng)達(dá)最大水平，被消化的初乳體積是有極限的。食入超過2升的初乳則不能有意義地增高小牛對(duì)Ig的吸收。而且，新生牛在一次喂食期間難以消化多于2升的液體。至于消化的時(shí)間，新生小牛腸道對(duì)大分子Ig的穿透性隨出生后小腸細(xì)胞的成熟而迅速下降。這種已經(jīng)被充分了解的天然的小腸的機(jī)制可以稱作為“吸收的關(guān)鍵時(shí)期”，它的意思是指，只有在產(chǎn)后的一段很短的時(shí)期內(nèi)小牛必須食入并吸收合適量的高質(zhì)量的初乳，以達(dá)到其理想的被動(dòng)免疫水平。雖然在產(chǎn)后24小時(shí)食入初乳還可能實(shí)現(xiàn)一定程度的免疫傳輸，再晚則初乳的食入對(duì)被動(dòng)免疫已經(jīng)沒有什么效力了。理想的情況是，在產(chǎn)生后的前8個(gè)小時(shí)內(nèi)攝入初乳。
實(shí)際上，相當(dāng)數(shù)量的新生小?；蚴浅圆坏胶侠頂?shù)量與質(zhì)量的初乳，或是不能在這個(gè)吸收的關(guān)鍵時(shí)期吃到初乳。結(jié)果所造成的免疫傳輸?shù)氖”憩F(xiàn)為高死亡率、對(duì)疾病的易感性增加和生長速度減慢。
在出生時(shí)，小牛缺乏對(duì)疾病的免疫性的證據(jù)是血清抗體濃度低。大約在產(chǎn)后的6-12小時(shí)內(nèi)，小牛攝入2升有合理的Ig濃度并對(duì)病原體有廣泛特異性抗體的初乳。當(dāng)大分子Ig，或抗體被腸道吸收時(shí)，血清抗體濃度會(huì)迅速上升。初乳攝入后的幾個(gè)小時(shí)，初乳Ig分子經(jīng)腸道進(jìn)入小牛血流的過程即可完成。在以后的數(shù)天內(nèi)，通過正常的系統(tǒng)更新，來源于母畜初乳的血清Ig逐漸降低。隨后，小牛的免疫系統(tǒng)開始產(chǎn)生活性的Ig以取代逐漸降低的初乳來源的Ig。最后，小牛的免疫系統(tǒng)達(dá)到了能自身維持或生產(chǎn)活性Ig的能力，并從而保持了必要的恒定的血清Ig濃度。
以前的研究指出，血清的Ig濃度在20毫克/毫升的水平或高于此水平是理想的。具有這樣的Ig濃度的小牛與只具有較低水平被動(dòng)免疫的小牛相比，表現(xiàn)出死亡率明顯降低，對(duì)疾病的抵抗力增高和生長速度加快。
理想的免疫傳輸與實(shí)際存在的自發(fā)進(jìn)行的免疫傳輸相差甚遠(yuǎn)。食入的初乳量不夠或是僅得到低Ig濃度的初乳造成被動(dòng)免疫傳輸缺陷。如果這種被動(dòng)免疫水平不足的小牛接觸疾病(這種可能性是極大的)就會(huì)得病，需要付出昂貴的醫(yī)療費(fèi)用，小牛也可能會(huì)死去或缺乏充分的生長能力。
因?yàn)楫a(chǎn)奶的牛被選擇性的繁殖以取得最大的牛奶產(chǎn)量，對(duì)于牛奶場場主來說，這種被動(dòng)免疫傳輸問題是特別實(shí)際的。在哺乳一開始，生產(chǎn)牛奶的母牛因其奶量大而很快地稀釋了初乳中有限量的Ig分子。結(jié)果是，新生牛所食入的牛奶中Ig分子的濃度大大低于為了實(shí)現(xiàn)合適的被動(dòng)免疫所需要的水平。因?yàn)榈湫偷牟粣蹱幨车男∨Ｔ谄湮盏年P(guān)鍵時(shí)期僅能吃到相對(duì)少量的初乳，使在小牛腸道中的Ig分子的數(shù)目及可供吸收到血流中的Ig經(jīng)常低到不合理的程度。結(jié)果造成被動(dòng)免疫水平難于提供合適的對(duì)疾病的抵抗力。
為了與上述的免疫缺陷問題作斗爭，有些有小奶牛的牛奶場主人為從一頭母牛那里收集一些他們認(rèn)為質(zhì)量好的初乳并在吸收關(guān)鍵期強(qiáng)迫喂給新生小牛。這種費(fèi)力的控制初乳喂食時(shí)間和量的方法，無法補(bǔ)償初乳中Ig含量低或缺乏抗重要致病菌特異性抗體的困難。因?yàn)閷?duì)于初乳中Ig濃度及抗體分布的測定只能用復(fù)雜的費(fèi)時(shí)的實(shí)驗(yàn)室測定方法，這些牧場主無法判斷他們耗時(shí)費(fèi)力所得來的這些喂新生牛的初乳，是否能提供合適的被動(dòng)免疫水平。
在眾多的牛奶場中，另一種辦法被用于控制初乳的攝入時(shí)間、Ig的質(zhì)量及初乳中對(duì)病原體特異的抗體的分布。把一群母牛產(chǎn)后12小時(shí)內(nèi)收集到的牛奶混合，然后將一定量的這種混合的“初乳”喂給每一頭新生牛。但是因?yàn)榕Ｄ虉鲋鳠o法控制混合“初乳”中的Ig的濃度及對(duì)病原體特異的抗體分布，這種費(fèi)力的勞動(dòng)仍是不能得到滿意的結(jié)果。
另一種增強(qiáng)小牛對(duì)某一疾病抗性的有吸引力的方法是采用在產(chǎn)前對(duì)母牛用疫苗進(jìn)行免疫。免疫的結(jié)果增高了血清中對(duì)這種病原體特異的抗體的濃度，并導(dǎo)致在初乳中也有較高的該種抗體。當(dāng)小牛食入這樣的初乳后增強(qiáng)了免疫力，但僅僅是針對(duì)上述選定的疾病。
在實(shí)驗(yàn)研究中，研究者們化驗(yàn)了初乳中Ig的濃度及對(duì)病原體特異的抗體的分布，并在吸收關(guān)鍵時(shí)期內(nèi)令小牛食入一定量的初乳。證實(shí)了初乳的Ig水平與小牛的抗病能力、死亡率、生長速度之間有直接的相關(guān)。雖然這些實(shí)驗(yàn)室的測試大大增加了我們對(duì)動(dòng)物天然被動(dòng)免疫傳輸機(jī)制的了解，但他們并未提供一種控制初乳中Ig濃度和對(duì)病原體特異的抗體分布的方法，因此仍未解決上述的免疫傳輸問題。
由于無法控制被動(dòng)免疫傳輸機(jī)制，給牛奶場主和其他人造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，這說明對(duì)一種能促進(jìn)免疫傳輸機(jī)制的產(chǎn)品或方法有強(qiáng)烈的需求。
本發(fā)明的主要目的在于，利用初級(jí)分離罐將乳清底層的最低分子量部份與中層較高分子量部份和上層最高分子量部份分開，然后用二級(jí)分離罐將乳清中層部份與上層部份分離開，從而產(chǎn)生一種高度濃縮的具有免疫活性的產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一主要目的在于，以兩臺(tái)分開的超濾分離罐完成乳清的分部分離。第一臺(tái)分離罐將乳清的底層部份與中層及頂層的部份分開，并同時(shí)具有保證第二臺(tái)分離罐能行使將乳清的中層與頂層分開的功能。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的在于，提供一種乳清的分部分離方法，它能使較高分子量的乳清蛋白與較低分子量的乳清蛋白分離，從而得到一種含量增高的較高分子量的免疫活性乳清蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種由乳清中提取天然存在的Ig分子的方法，以生產(chǎn)一種高濃度的免疫活性產(chǎn)品，這種產(chǎn)品以后可以溶于液體中成為初乳的代用品或補(bǔ)充食品，這種產(chǎn)品的Ig濃度可控制，并已知其中所含有的對(duì)各種病原體抗體的分布和濃度。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，通過讓新生牛在吸收關(guān)鍵時(shí)期內(nèi)喂食免疫活性乳清制品，以控制天然被動(dòng)免疫傳輸機(jī)制的方法，使新生牛對(duì)廣譜病原體的每種抗體都能達(dá)到設(shè)想的濃度，而且無需依賴于食入天然的初乳。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是，由乳清中制取上述的免疫活性物質(zhì)，這種物質(zhì)是低廉的牛奶場的付產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，應(yīng)用市場上可供應(yīng)并且在牛奶場中普遍使用的裝備來制取上述的產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供以合理的價(jià)格生產(chǎn)大量的上述乳清制品的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，對(duì)上述產(chǎn)品制成干粉狀的制品，以便于能保存相當(dāng)長的時(shí)間。
本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，上述的制品可按小牛的需要(按照其大小)來投予，以提供被動(dòng)免疫。
簡而言之，本項(xiàng)發(fā)明包括從其主要部份的Ig分子是處于活性形式的乳清粗制品中，通過特定的可控超濾方法來制取一種干燥的、具有免疫活性的過濾產(chǎn)品。這種過濾產(chǎn)品的活性Ig濃度至少占固體量的大約7%，并同時(shí)具有其分子量高于或低于Ig的其它乳清免疫活性成分。雖然以前的看法堅(jiān)持認(rèn)為，新生牛所食入的初乳需每升含有40-50克Ig，才能實(shí)現(xiàn)理想的被動(dòng)免疫并激活主動(dòng)免疫系統(tǒng)，但本項(xiàng)發(fā)明所敘述的乳清過濾產(chǎn)品只需3.5克/升就能顯現(xiàn)出完全有效地取代天然初乳的能力。本項(xiàng)發(fā)明所敘述的免疫活性過濾產(chǎn)品也被試用做食品添加劑，并證實(shí)當(dāng)在一段時(shí)期內(nèi)反復(fù)小量給藥時(shí)，它能提高動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗力，并促進(jìn)生長速度。因?yàn)檫@項(xiàng)過濾產(chǎn)品已被證實(shí)它的活性不僅對(duì)動(dòng)物而且也針對(duì)人類的抗原，因此對(duì)人類可能會(huì)有很好應(yīng)用前景，特別是做為新生兒的補(bǔ)充食品。
本項(xiàng)發(fā)明的產(chǎn)品生產(chǎn)，或是用一級(jí)超濾罐，或是將一級(jí)和二級(jí)超濾罐串連使用。一級(jí)超濾罐使用含有活性Ig及其它免疫活性成分的粗制乳清為原料生產(chǎn)一種初級(jí)產(chǎn)品，它保持了相對(duì)高分子量的乳清的中層及頂層部分，使大部分相對(duì)低分子量的乳清底層部分濾掉。初級(jí)的產(chǎn)品可在二級(jí)超濾罐中被進(jìn)一步濃縮，得到一種二級(jí)產(chǎn)品，它保持住相當(dāng)豐富的乳清頂部成分，這種成分中含有Ig及其它高分子量免疫活性物質(zhì)，而將占一定百分比的較低分子量的中層部分濾掉。將二級(jí)產(chǎn)品干燥，以產(chǎn)生本項(xiàng)發(fā)明的干燥的免疫活性產(chǎn)品。全部操作及干燥過程都是在能保護(hù)Ig及其它免疫活性成分的免疫活性的條件下進(jìn)行的。
一級(jí)超濾罐在非預(yù)期條件下操作，使乳清再成形，這樣降低了乳清蛋白在二級(jí)罐超濾膜的較大的孔眼限制動(dòng)態(tài)膜的傾向。對(duì)第二級(jí)超濾罐來說使用再成形的原料能使乳清的中層和頂層部分得以分級(jí)，因而在二級(jí)產(chǎn)品中得以實(shí)現(xiàn)Ig和其它高分子量免疫活性物質(zhì)的濃度明顯增高的結(jié)果。如果沒有這種二階段的操作程序，則在二級(jí)罐的超濾膜上很快形成動(dòng)態(tài)膜，使乳清中的中層和頂層成分的分級(jí)無法進(jìn)行。
發(fā)明之處將特別在申報(bào)的權(quán)利要求
書中指出。但是，發(fā)明的操作及其目的和優(yōu)點(diǎn)可參考下列詳細(xì)的敘述，并同時(shí)參閱下列的圖注來得到較好的了解。即圖1小牛食用天然初乳及食用本項(xiàng)發(fā)明所說的乳清制品后血清中Ig濃度的比較。
圖2操作流程圖，說明改進(jìn)了的超濾過程以產(chǎn)生高濃度Ig的過濾產(chǎn)品。
圖3操作流程圖。說明一種綜合的超濾/離子交換過程，以由乳清中分離免疫活性Ig。
圖4操作流程圖。說明在圖2中指出的從流路A中過濾的產(chǎn)品與在圖3中指出的流路B離子交換單位中的高濃度Ig合并，產(chǎn)生一種具有高濃度Ig的混合物，這樣的濃度大大高于僅用超濾方法所能得到的。
圖5示出乳清蛋白部份的組成圖6流程圖。說明液狀乳清原料通過初級(jí)分離罐和二級(jí)分離罐的二個(gè)階段操作。
為了較好地說明本項(xiàng)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及其在本領(lǐng)域中的貢獻(xiàn)，下面較為詳細(xì)地說明本發(fā)明產(chǎn)品及方法的較好實(shí)施。
像由奶場母牛這樣的家畜分泌的牛奶中長期含有低濃度的Ig，這樣的Ig當(dāng)攝入后表現(xiàn)不出被動(dòng)免疫的效應(yīng)。本項(xiàng)發(fā)明關(guān)系到從乳清中提取和濃縮Ig的方法，操作是在小心控制的條件下進(jìn)行的，以保護(hù)結(jié)構(gòu)易損，對(duì)熱敏感的Ig的免疫活性。所謂“免疫學(xué)活性”或“免疫上有活性”這樣的術(shù)語與Ig分子相連系時(shí)，意味著Ig分子與抗原結(jié)合的能力。這種濃縮的、免疫上有活性的Ig分子可在產(chǎn)后喂給新生的小牛，或是做為初乳的代替品或是做為初乳的補(bǔ)充，以增強(qiáng)天然的免疫傳輸機(jī)制。本項(xiàng)發(fā)明認(rèn)識(shí)到并且利用了Ig分子在牛奶中是最大的分子和在乳酪制造過程的乳清付產(chǎn)品中存在有少量的廉價(jià)的這種分子這樣的事實(shí)。作為奶酪生產(chǎn)的付產(chǎn)品，全世界每年產(chǎn)生大約85，000，000公噸乳清，其中的大約34，000，000公噸未在經(jīng)濟(jì)上被利用。因此，在實(shí)施本項(xiàng)發(fā)明的過程中能以最低的成本利用乳清副產(chǎn)品，并且減輕處理廢乳清的負(fù)擔(dān)。
在常規(guī)的乳酪綜合生產(chǎn)過程中，粗牛奶加工成凝乳，即初級(jí)的奶酪成分，和一種液狀的乳清付產(chǎn)物。粗制的牛奶輸入物中包含大約14%的固體。其中4%由蛋白質(zhì)構(gòu)成，包括高分子量的免疫活性Ig蛋白質(zhì)和其它有免疫活性的乳清蛋白成份。牛奶中蛋白成份中的相當(dāng)部分在奶酪制造過程中被沉淀出來形成酪蛋白。在乳清付產(chǎn)品中可能含大約6%的固體，其中的70%是乳糖，30%是蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及脂肪。這些殘留的乳清蛋白一般形成乳白蛋白、乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白(Ig)和多肽的混合物。
在本項(xiàng)發(fā)明中所用的術(shù)語“乳清”包括二種成份一是奶酪制造過程中形成的液狀乳清付產(chǎn)品，二是已去掉酪蛋白的牛奶。
本項(xiàng)發(fā)明的目的是在小心控制的條件下處理粗制牛奶及其乳清付產(chǎn)品，以增加最終產(chǎn)品中Ig的濃度，而不像在粗制牛奶中那樣僅有少量的、免疫學(xué)上無作用的Ig濃度。這項(xiàng)操作必須在小心控制的條件下進(jìn)行，以避免Ig分子的免疫活性的明顯降低。
現(xiàn)已有多種由乳清提取并制成干燥濃縮的蛋白產(chǎn)品的方法。這些蛋白提取物通常稱作乳清蛋白濃縮物或“WPC”。在這類提取和濃縮蛋白的技術(shù)中主要關(guān)心的是保持WPC的食用性，如味道、嗅味、溶解度等等。雖然這些乳清和WPC提取技術(shù)可以生產(chǎn)有用的食品，但在這些方法中的粗牛奶、乳清和生產(chǎn)出的WPC都暴露在下列因素的影響下1)過熱(時(shí)間/溫度);2)過多的細(xì)菌;3)在操作中加入或由細(xì)菌中產(chǎn)生過多的酶的活力。
現(xiàn)在詳細(xì)討論能由粗牛奶中分離出Ig分子并生產(chǎn)出高度濃縮的免疫活性Ig的產(chǎn)品的方法步驟。
一批粗牛奶一般都得自生長在某一特定地理環(huán)境中的一群或數(shù)群奶牛場母牛。粗牛奶首先被施用瞬間的巴斯德滅菌，例如快速加熱到160°F，在這一溫度維持15-20秒鐘，然后迅速降溫。測試表明，在這樣的瞬間巴斯德滅菌中，相對(duì)快的升溫，在高溫中僅保持短的時(shí)間及迅速地降溫可合宜的將牛奶中的微生物活力控制在一定的水平上，而對(duì)牛奶中Ig的免疫活性無明顯影響。
如果在操作中明顯偏離了上述的瞬時(shí)巴斯德滅菌法的要點(diǎn)，就像其它通常所熟知的較長時(shí)間的巴斯德滅菌操作那樣，牛奶中的Ig分子的免疫活性會(huì)出現(xiàn)明顯降低或破壞，因此在操作本項(xiàng)發(fā)明所述的方法時(shí)需加以避免。
在某些情況下，在乳清加工中可再加以第二次瞬間巴斯德滅菌。這樣的第二次巴斯德滅菌會(huì)導(dǎo)致Ig分子的免疫活性的降低，但仍可將免疫活性保持在有用的水平上。已經(jīng)證實(shí)進(jìn)行第三次瞬間巴斯德滅菌的結(jié)果將造成Ig分子的全部免疫活性破壞，因此在大部分情況下務(wù)必避免。在本項(xiàng)發(fā)明操作中于每次瞬間巴斯德滅菌后都需仔細(xì)測試Ig分子的免疫活性，以判定Ig的免疫活性是否仍保持著。這些測試的結(jié)果將提示巴斯德滅菌的步驟是否需要修正或限制。
巴斯德滅菌完成后，牛奶將被加入制造奶酪的引發(fā)劑，如乳酸桿菌。如同普通的奶酪加工過程一樣，奶酪形成桶的溫度被調(diào)到華氏86到90度，并維持二個(gè)小時(shí)，直到凝乳的形成達(dá)到設(shè)計(jì)的程度。此時(shí)，奶酪桶的溫度提高到大約102°F，并將乳清排出，此過程通常需要30-45分鐘。乳清付產(chǎn)品即刻移入約100°F的澄清器或分離器，在那里乳清付產(chǎn)物中的脂肪和酪蛋白顆粒成分將被分離。此時(shí)，澄清的乳清或被貯存于40°F以抑制細(xì)菌的生長，或立即移入一個(gè)超濾系統(tǒng)中，超濾過程中乳清被加熱并維持在大約120°F-130°F。上述的操作參數(shù)可基本上保持Ig的免疫活性。在實(shí)施本項(xiàng)發(fā)明的操作時(shí)，上述的時(shí)間和溫度必要時(shí)可改變，但需用下述的測試方法監(jiān)測，以基本上能保持住Ig的免疫學(xué)活性。在奶酪制造過程中或超濾操作中，將乳清或乳清付產(chǎn)物始終保持在低于130°F的溫度下是十分重要的。
超濾技術(shù)多年來用于從澄清的乳清中將較低分子量的非蛋白成分與各組較大分子量的蛋白分離開。本項(xiàng)發(fā)明中沿用了相似的超濾技術(shù)。溫?zé)岬某吻迦榍逯苯幼⑷敕Q作“UF1”的第一級(jí)超濾裝置。具體說是UF1中所用的超濾膜可容許分子量低于大約10，000的分子穿過，但不讓像蛋白質(zhì)這樣的較高分子量的分子通過。被超濾膜保留住的物質(zhì)稱作“保留物”，而對(duì)能穿過超濾膜的物質(zhì)稱之為“穿透物”。不希望要的低分子物質(zhì)，如乳糖、礦物質(zhì)和無機(jī)鹽穿透過超濾膜在第一級(jí)超濾中隨水一起從乳清付產(chǎn)物中除去。
當(dāng)保留物或是反復(fù)通過一臺(tái)單個(gè)的超濾裝置，或是直接注入串連的第二臺(tái)超濾裝置后，保留物被濃縮成有較多的固體物質(zhì)，表現(xiàn)出粘性增加，并在超濾膜上出現(xiàn)極化現(xiàn)象使膜失效?？朔O化現(xiàn)象的方法是用水稀釋保留物，令稀釋的保留物作進(jìn)一步的超濾，這樣的操作稱為透析過濾(diafiltration)。一系列的超濾步驟反復(fù)進(jìn)行，直至保留物所含的固體中達(dá)到高濃度的蛋白質(zhì)含量，最好能高到含70-80%的蛋白質(zhì)。在這時(shí)，Ig分子在全部保留物蛋白質(zhì)中的含量低于10%。因?yàn)樵诒Ａ粑镏械腎g分子的最小分子量處于等于或高于160，000道爾頓的水平，又因?yàn)榈诙蟮谋Ａ舻牡鞍踪|(zhì)分子是血清白蛋白，它的分子量處于66，000道爾頓的水平，上述初步濾過分離的保留物可直接再通過一臺(tái)或數(shù)臺(tái)能讓血清白蛋白和其它低分子量蛋白通過但不能讓較大的Ig分子通過的超濾裝置，就能明顯增加保留物中的Ig濃度。具有這樣能力的超濾膜在市場上是可以買到的。
雖然在上面的敘述中第一級(jí)超濾過程用切割分子量10，000的膜，第二級(jí)超濾用切割分子量100，000的膜，這種特定的切割水平僅是為了用做說明的目的。這項(xiàng)發(fā)明可在多種不同的方式下執(zhí)行，或是反復(fù)利用一臺(tái)單獨(dú)的超濾裝置并順序采用有不同穿透能力的膜;或是利用有固定穿透能力或逐漸增加的穿透能力膜的一系列的超濾裝置;或是僅利用一臺(tái)具有穿透能力為大約66，000-160，000道爾頓的超濾裝置。實(shí)際上，一臺(tái)有100，000道爾頓穿透膜的超濾裝置可以工作得頗為不錯(cuò)?；谏鲜鰧?duì)目的與操作的記敘，為了達(dá)到對(duì)大分子量Ig有滿意的高濃度的濃縮，選擇合宜的超濾裝置和超濾操作是本項(xiàng)方法中基本的技巧之一。
在實(shí)際運(yùn)用本項(xiàng)發(fā)明時(shí)，在各步操作中包括超濾步驟，保持Ig分子的免疫活性是至為重要的。方法是合適的溫度控制，最低的微生物活性，同時(shí)要小心控制和監(jiān)測加熱及巴斯德滅菌。在現(xiàn)有的奶酪加工廠和超濾工廠中，幾乎無一注意到這些安全措施，結(jié)果造成它們所生產(chǎn)的WPC只能含有無免疫活性的Ig。
因?yàn)镮g分子免疫性質(zhì)的喪失可能并不變更分子的大小和分子量，因此在實(shí)施本項(xiàng)發(fā)明中基本保持所有Ig分子的免疫活性是重要的。在加工過程中期望僅僅只有一小部分Ig分子在免疫上失活。新生牛攝入一份免疫學(xué)上無活性的Ig溶液無助于在它們的血液中形成有效的血清免疫活性Ig濃度。因此在實(shí)施本項(xiàng)發(fā)明的每一步中都要維持活性的Ig要顯著高于非活性的Ig，以生產(chǎn)一種能夠控制被動(dòng)免疫傳輸?shù)漠a(chǎn)品。
隨后，產(chǎn)品用通常的冰凍干燥(低壓凍干)法或噴霧干燥技術(shù)弄干。在多數(shù)情況下，噴霧干燥法較好，因?yàn)檫@種裝置在一般的奶牛場中都有。同時(shí)，噴霧干燥效率高、速度快，并較冰凍干燥法來得便宜。最后形成的過濾產(chǎn)品可置室溫下保存。
因?yàn)镮g的免疫活性易被過熱所破壞，低溫或冰凍則對(duì)其并無影響，因此從部分脫水的超濾保留物中用冰凍干燥裝置脫水不會(huì)影響Ig的免疫活性。在噴霧干燥中，是另一種機(jī)制防止了Ig免疫活性的明顯降低。雖然在噴霧干燥裝置中部分脫水的保留物是在約300°F的溫度下經(jīng)受高速空氣的吹動(dòng)，可是Ig分子卻由于水蒸發(fā)的吸熱作用而保持在較低的溫度下?？偠灾?，噴霧干燥與冰凍干燥相比更為經(jīng)濟(jì)，并可以用遠(yuǎn)為高速的方式生產(chǎn)出干燥的粉狀WPC。
以前用部分干燥濃縮超濾保留物的技術(shù)來生產(chǎn)作為動(dòng)物和人類食品的WPC時(shí)，經(jīng)常將保留物在高溫下置真空裝置中6-8小時(shí)。雖然以這種方式真空干燥的WPC的嗅味和營養(yǎng)可能并未受影響，Ig的免疫活性則可完全被破壞了。因此在執(zhí)行本項(xiàng)發(fā)明時(shí)，這類干燥技術(shù)是不能使用的。
在保留物被干燥以后，對(duì)干燥的粉狀產(chǎn)品將被化驗(yàn)其所含Ig的免疫學(xué)性質(zhì)，包括Ig中所含對(duì)病原體特異抗體的濃度和分布。由于在不同批產(chǎn)品中Ig分子是由不同批的含不同Ig分布與濃度的牛奶中制造的，應(yīng)用本項(xiàng)發(fā)明所生產(chǎn)的各批產(chǎn)品中對(duì)病原體特異的抗體的相對(duì)濃度是不同的。實(shí)際上，每種最低可接受的抗體水平都要小心地測定，以保證對(duì)在產(chǎn)后一定時(shí)期內(nèi)喂以一定量上述產(chǎn)品的小牛，至少在對(duì)某一特定疾病所獲得的被動(dòng)免疫能力上應(yīng)該達(dá)到預(yù)計(jì)的水平。
對(duì)產(chǎn)品中病原體特異抗體活性的測量所用的測試方法稱作“EIA”試驗(yàn)。這種測試方法記敘在一篇篇名為“用酶聯(lián)免疫法定量測定牛對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌B毒素產(chǎn)生的IgG、IgM和IgA抗體，I、為提高免疫力的被動(dòng)傳輸而進(jìn)行的預(yù)先免疫”的論文中。這篇論文發(fā)表在“獸醫(yī)免疫學(xué)和免疫病理學(xué)”(Veterinary Immunology and Immunopathology)第4卷(1983)579-591頁，作者是W·A·Fleenor和G·H·Stott這篇論文包括在參考文獻(xiàn)中。那篇論文中所討論的EIA測定對(duì)在合適領(lǐng)域中有過基本訓(xùn)練的人來說是熟知的。
將EIA方法與輻射狀免疫擴(kuò)散(RID)試驗(yàn)合用能測量出在本項(xiàng)發(fā)明的操作中所造成免疫學(xué)上失活的Ig百分?jǐn)?shù)。雖然RID可測出牛奶、乳清或過濾產(chǎn)品中Ig分子的數(shù)目，但無力區(qū)分免疫學(xué)上有活性與無活性的免疫球蛋白分子。
因此可對(duì)牛奶或乳清原料制品進(jìn)行雙重的分析1)用EIA方法測定在原料中對(duì)一種或數(shù)種病原體特異的抗體的活性;2)用RID方法測定原料中Ig分子的總數(shù)。EIA結(jié)果除以RID結(jié)果所得到的第一組比例數(shù)代表了每一種被測試病原體特異抗體與原料中Ig分子總數(shù)之比，不論這種分子在免疫學(xué)上有無活性。
EIA和RID試驗(yàn)被以同樣的方式用于過濾產(chǎn)品，EIA的測試結(jié)果除以RID的測試結(jié)果得到第二組比例數(shù)，代表了每一種被測試病原體特異抗體與過濾產(chǎn)品中Ig分子總數(shù)之比，不論這種分子在免疫學(xué)上有無活性。比較第一組與第二組中的各個(gè)比例數(shù)將示出每一種病原體特異抗體的相對(duì)濃度下降的百分比，這就代表了在應(yīng)用本發(fā)明的加工過程中造成免疫失活的Ig分子的百分?jǐn)?shù)。
因此，上述的EIA/RID聯(lián)合測試方法代表了一種技術(shù)，用它可以判斷在執(zhí)行本項(xiàng)發(fā)明中基本上維持住了Ig分子的免疫活性。可對(duì)加工中的每一步及產(chǎn)品都施用這樣的聯(lián)合監(jiān)測，以找出和排除造成Ig分子免疫活性不可接受地被降低的操作條件。一但加工過程標(biāo)準(zhǔn)化了的時(shí)候，可以考慮停止EIA/RID的聯(lián)合測試，直至又出現(xiàn)免疫失活的問題。
一但整個(gè)加工過程的標(biāo)準(zhǔn)化已被確立，也可僅僅用EIA測試監(jiān)測過濾產(chǎn)品中對(duì)病原體特異抗體的分布和濃度。如果發(fā)現(xiàn)有一種病原體特異抗體的濃度變化與整個(gè)加工過程引起的Ig免疫活性的降低有直接的比例關(guān)系，則可用此單一病原體特異抗體代替EIA/RID聯(lián)合測試來監(jiān)測免疫失活問題。
新生牛一般會(huì)碰到下列的病原菌，因此需要對(duì)下列病原體的被動(dòng)免疫1、大腸桿菌2、都柏林沙門氏菌3、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌，B型和C型
4、嗚疽梭狀芽胞桿菌(肖氏梭菌)5、睡眠嗜血桿菌6、Paraflueuza 3粘病毒7、傳染性牛鼻子宮頸炎(Rhinotracheitis)8、鼠傷寒沙門氏菌EIA或等效的測試程序可被選用來測試對(duì)某一類常見病原體特異抗體的出現(xiàn)和濃度。以商品規(guī)模執(zhí)行本項(xiàng)發(fā)明時(shí)所選用的化驗(yàn)測試種類的范圍取決于所選用方法的復(fù)雜性、重復(fù)性及價(jià)格，也取決于對(duì)某一特定病原體被動(dòng)免疫所欲增高的水平。例如，在某些條件下測試程序可以修改或擴(kuò)展，以測定像諸如巴斯德氏菌屬、產(chǎn)氣莢膜梭狀桿菌D型、Rota病毒、冠狀病毒等。
在將本項(xiàng)發(fā)明應(yīng)用于商業(yè)規(guī)模時(shí)所用的化驗(yàn)手段一般都要選用在全過程質(zhì)量控制中所擬定的一組病原體的抗體，以確定每批產(chǎn)品的合格程度。必要時(shí)可修改化驗(yàn)方法以適應(yīng)不同的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，例如地區(qū)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
當(dāng)使用過濾產(chǎn)品來控制小牛的被動(dòng)免疫傳輸時(shí)，取一定量的本產(chǎn)品溶于液體中，如初乳、牛奶或水，形成1-2升Ig溶液。在吸收關(guān)鍵期將此Ig溶液喂給小牛，一般是產(chǎn)后12小時(shí)內(nèi)，最好在產(chǎn)后2小時(shí)內(nèi)。因?yàn)樾律Ｔ谧畛醯奈橹凶疃喑匀?-2升液體，因此需保證在溶液中有足夠高的Ig濃度，以使有合適量的Ig分子進(jìn)入小牛的血液從而達(dá)到最低血清有效Ig濃度。
市場研究指出，用戶樂于用干燥形式藥物喂給動(dòng)物，而不是液體的藥物。為迎合這種需求，本產(chǎn)品也可制成藥片或膠囊。將產(chǎn)品裝入一種兩部分的明膠膠囊，可用一種方便的現(xiàn)存的技術(shù)，也避免了產(chǎn)品遇熱。膠囊被小牛攝入后溶解并釋出本產(chǎn)品。隨后它會(huì)溶解在給藥時(shí)同時(shí)被小牛食入的液體中，如水、牛奶或母牛的初乳中。Ig溶液中的Ig隨之通過小牛腸道而被吸收。無論用固體或是液體的形式投予，本產(chǎn)品的劑量都是一樣的。
已經(jīng)得知，為了實(shí)現(xiàn)合適的被動(dòng)免疫傳輸，至少要在小牛血清中Ig水平達(dá)到15毫克/毫升，最好20毫克/毫升，因此對(duì)一頭通常是100磅的小牛必須要投予較高濃度的Ig溶液供它攝入。因?yàn)閮H僅大約200克本產(chǎn)品可溶于一升初乳、牛奶或水中，又因?yàn)橐活^新生牛通常在一次喂食中僅能吸收一到二升液體，因此在產(chǎn)品中含Ig達(dá)到40-50%的產(chǎn)品將可使小牛血清中的Ig濃度達(dá)到通常被認(rèn)可的水平。
現(xiàn)在對(duì)本項(xiàng)產(chǎn)品在控制病原體特異抗體的濃度和分布方面的適應(yīng)性做詳細(xì)的討論。必要時(shí)，混合二批或多批干燥的免疫活性過濾產(chǎn)品來得到一種能符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的要求是有利的，此時(shí)往往單批的產(chǎn)品達(dá)不到要求。
應(yīng)用更加復(fù)雜的過濾操作和超濾膜可去掉更多的非Ig分子，這樣的超濾方法可以生產(chǎn)有高濃度的免疫活性的過濾產(chǎn)品，并因此而增加每一種病原體特異抗體的濃度。在多數(shù)情況下，通過高水平的超濾產(chǎn)生更為濃縮的產(chǎn)品往往可達(dá)到較低濃縮的產(chǎn)品達(dá)不到的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
既使不應(yīng)用上述的混合技術(shù)，按照本發(fā)明所生產(chǎn)的過濾產(chǎn)品也可達(dá)到相對(duì)均勻的病原體特異抗體的濃度和分布，這是因?yàn)橛糜趯⑴Ｄ碳庸こ扇榍錓g的原料來自一群大的、同一地區(qū)的母牛。雖然由一頭母?；蚴且恍∪耗概５玫降呐Ｄ炭赡苋狈Ρ匾牟≡w特異抗體或是只具有較低的Ig濃度，本過濾產(chǎn)品則不會(huì)表現(xiàn)出這種來自個(gè)別牛奶樣品的免疫不適應(yīng)性。相反，由于它的均勻性，過濾產(chǎn)品可具有更多同樣有用的免疫學(xué)性質(zhì)。
作為應(yīng)用本項(xiàng)發(fā)明產(chǎn)生高濃度免疫活性Ig過濾產(chǎn)品的直接結(jié)果，可導(dǎo)致大量其它的對(duì)天然被動(dòng)免疫實(shí)施正相控制的技術(shù)，這對(duì)一個(gè)掌握了本項(xiàng)發(fā)明基本技術(shù)的人來說，顯然因此而可以得到附加的技術(shù)及利益。
當(dāng)本項(xiàng)發(fā)明的方法在某一選定設(shè)備中執(zhí)行時(shí)，要用上述的化驗(yàn)來監(jiān)測原料、中間產(chǎn)品及最終產(chǎn)物，以判定Ig的免疫活性是否已被基本保持住了。如果在加工過程的某一步驟中Ig的免疫活性被明顯地降低或喪失了，需判定出其原因并加以排除。一般說來，免疫活性的喪失是由于溫度過高，在某一給定溫度持續(xù)的時(shí)間過長，微生物的活力過高或是由于過高的微生物酶活力而引起分子的破壞。
按本項(xiàng)發(fā)明所討論的被動(dòng)免疫機(jī)制主要與奶牛場奶牛有關(guān)。但是，其它的小牛和牛以外的家畜，只要它們也是通過攝入初乳樣的乳腺分泌物實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的被動(dòng)免疫者，也可從應(yīng)用本項(xiàng)發(fā)明從中得到好處。這里之所以首先考慮到奶牛場小牛，是因?yàn)檎J(rèn)識(shí)到在那里有普遍的免疫學(xué)問題，并因此而對(duì)牛奶場主造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
一項(xiàng)最近發(fā)表的研究提示牛的抗體，如抗旋轉(zhuǎn)病毒的抗體，可能對(duì)人的旋轉(zhuǎn)病毒株也有充分的活性，從而也可預(yù)防感染。如果進(jìn)一步的研究能確實(shí)證實(shí)牛的抗體能預(yù)防選定的人類疾病，本項(xiàng)發(fā)明所敘及的免疫活性產(chǎn)品也可在人類被用于預(yù)防這些疾病。
下面詳細(xì)討論一些應(yīng)用上述的乳清產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
例1這項(xiàng)發(fā)明的加工過程基本按上述記敘的步驟執(zhí)行。澄清的乳清在第一級(jí)有10，000道爾頓分子量超濾膜的超濾罐中加工成初級(jí)產(chǎn)品，它含35%蛋白質(zhì)，其中5%為Ig。初級(jí)產(chǎn)品然后直接注入第二級(jí)超濾罐，第二級(jí)罐的超濾膜是100，000道爾頓。在超濾操作時(shí)，超濾裝置和原料維持在室溫下。進(jìn)行反復(fù)的超濾和透析過濾。最后得到干燥的粉狀二級(jí)產(chǎn)品，Ig濃度7%，總蛋白濃度約80%。
先有技術(shù)研究指出在產(chǎn)后短期內(nèi)投予的初乳應(yīng)含有足夠量的Ig，使小牛血液中足以產(chǎn)生15毫克/毫升，最好20毫克/毫升或更高的濃度的Ig。這種只有7%Ig的過濾產(chǎn)品和它在牛奶中溶解后的最大Ig濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到傳統(tǒng)認(rèn)為的在新生小?？蓪?shí)現(xiàn)被動(dòng)免疫傳輸?shù)淖畹虸g濃度。但是用這樣的產(chǎn)品對(duì)一組奶牛場小牛做了實(shí)驗(yàn)，研究是否這種乳清產(chǎn)品對(duì)控制和調(diào)節(jié)新生小牛的免疫系統(tǒng)有潛力，這些過濾產(chǎn)品首次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在表1中。
三十頭新生小牛分為5組，每組6頭。第3組中有一頭小牛因?yàn)榧裟殠r(shí)太靠近臍眼而出血死亡，因?yàn)檫@頭小牛的死亡原因與實(shí)驗(yàn)無關(guān)，其死亡未列入到第三組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中去。
進(jìn)行了特別的安排以保證在不讓新生小牛有機(jī)會(huì)從其母畜吸取初乳的條件下取得它們。第1組新生牛在產(chǎn)后大約4小時(shí)喂給2升牛奶，然后在第一次喂食后的大約12小時(shí)時(shí)又第二次喂給2升牛奶。第1組小牛除從普通牛奶中得到無意義量的Ig外，得不到任何其它Ig。
第2組是對(duì)照組，在其產(chǎn)后的最初2次喂食中通過天然的初乳得到Ig。在本次實(shí)驗(yàn)中這2次喂食的時(shí)間都是相同的。
第3、4、5組小牛喂以乳清制品的Ig，生產(chǎn)的方式是通過上述的100，000道爾頓超濾膜裝置。第3組接受2次喂食，每次2升牛奶。300克制品溶于2升牛奶中，共2次，故喂食了600克過濾產(chǎn)品。小牛共食入600克溶于牛奶中的乳清Ig，而每300克含7%Ig相當(dāng)于在每次喂食中投予21克Ig，故二次42克。
第4組接受2次2升的牛奶，每次溶入100克過濾產(chǎn)品。每一次的Ig劑量為7克，共得到14克乳清Ig。
第5組在產(chǎn)后約4小時(shí)接受一次100克過濾產(chǎn)品溶于2升牛奶中。本組因而得到僅7克乳清Ig。
取血樣的時(shí)間是第一次喂食前，24小時(shí)以后，產(chǎn)后第五天，第十天和第二十天。每份血樣化驗(yàn)其Ig總量，并測定6種在新生小牛中最常見的病原體特異抗體的活力?？侷g量用輻射狀免疫擴(kuò)散(RID)法測定，其中使用羊抗牛免疫球蛋白。病原體特異抗體活性用酶聯(lián)免疫法(EIA)測定。進(jìn)行2份測定，一份用羊抗牛免疫球蛋白，另一份用來自單克隆雜交瘤的小鼠抗牛免疫球蛋白。測試病原體的抗原使用商品疫苗。
在本實(shí)驗(yàn)中使用的新生小牛當(dāng)它們出生時(shí)購自8家不同的奶牛場。11頭由其中的一家，8頭從第2家，其它的則來自剩下的6家。對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所用的30頭新生小牛盡可能施用相似的飼養(yǎng)和處理方法。
第1組中6頭小牛中的4頭在生后數(shù)天內(nèi)死亡。因此用牛奶喂養(yǎng)的第1組與其它接受初乳或本產(chǎn)品的組之間差別十分明顯。顯然，第1組的小牛未能控制病原微生物通過小腸上皮進(jìn)入體循環(huán)。而第2-5組似乎適當(dāng)?shù)乜刂谱×诉@些病原微生物的傳輸。
血清學(xué)資料顯示，第1組中的2頭小牛在第一次喂食前已有低濃度的Ig(0.3和2∶3毫克/毫升)。這些Ig顯然或是通過胎盤或是通過未察覺的吸食初乳得到的，這些Ig已可充分地保護(hù)這兩頭動(dòng)物不讓病原微生物在它們生命的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)的傳輸，在那段時(shí)間內(nèi)上皮細(xì)胞仍可將攝入物傳入體循環(huán)。在以后的血清學(xué)樣品中，這兩頭小牛顯示產(chǎn)生了自身的抗體，表現(xiàn)為總血清Ig量的增加和病原體特異抗體的增加。而第1組中死去的4頭小牛未表現(xiàn)出任何有抗體活性增加的證據(jù)。
第2組是對(duì)照組，這一組的小牛被喂以含有最高量Ig濃度的初乳，從多克隆和單克隆抗體測定中都顯示有高水平的病原體特異抗體。每頭小牛接受不同母牛的初乳，而且在多數(shù)情況下，有一頭母牛不是來自該小牛的出生地。正如預(yù)期的，在喂食后24小時(shí)，所有第2組小牛的血清Ig濃度都是很高的(17-35毫克/毫升)。
第3組小牛得到總量為600克本產(chǎn)品，含有42克來自乳清的Ig。這些小牛吸收了充分量的Ig，并顯示出血清Ig水平為3-4毫克/毫升，在產(chǎn)后24小時(shí)有明顯的病原體特異抗體活力。第3組小牛中無死亡，發(fā)病也有限。
第4組小牛得到200克本產(chǎn)品，含有14克乳清Ig。這些小牛達(dá)到1-1.5毫克/毫升的血清Ig濃度。與第3組小牛相比，在產(chǎn)后24小時(shí)時(shí)第4組小牛的病原體特異抗體活性較低，在產(chǎn)后20天時(shí)Ig的產(chǎn)生和活性抗體數(shù)都較低，有較高的死亡率和發(fā)病率。第4組中的2頭小牛于產(chǎn)后第5天死于嚴(yán)重腹瀉和脫水。
第5組小牛喂以100克本產(chǎn)品，含Ig7克。這些小牛死亡率和發(fā)病率都很高。這些小牛得到的Ig量足以預(yù)防敗血癥或攝入的病原微生物的吸收，但很易染上腹瀉及以后出現(xiàn)的呼吸道疾病。第5組的大多數(shù)小牛表現(xiàn)出慢性病態(tài)，其中的兩頭在早期死于營養(yǎng)疾患。第5組中有一頭牛血清濃度達(dá)到1.2毫克/毫升，從產(chǎn)后24小時(shí)直到產(chǎn)后20天都表現(xiàn)出明顯的病原體特異抗體濃度。
這些初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，小牛的生長及對(duì)疾病的抗性取決于要吸收充分量的乳清Ig，以實(shí)現(xiàn)血清的Ig濃度至少要有1毫克/毫升，也取決于在產(chǎn)后第24小時(shí)時(shí)病原體特異抗體的形成程度。任何不能滿足這一最低要求的小牛將易于染病，并可能形成一種慢性病態(tài)。
本次實(shí)驗(yàn)中的所有30頭小牛在60天實(shí)驗(yàn)期內(nèi)都每天給予仔細(xì)觀察。對(duì)每頭小牛都給以一項(xiàng)合并的主體/客體發(fā)病率得分。正如表Ⅰ第7行所示，第3組用本產(chǎn)品喂養(yǎng)的小牛發(fā)病率得分為80，明顯超出第2組初乳喂養(yǎng)小牛的得分50。牛奶喂養(yǎng)小牛的發(fā)病率得分及第5組小牛的得分低于第2組初乳喂養(yǎng)組的得分。
在60天的實(shí)驗(yàn)完成后，小牛的死亡率、發(fā)病率和生長率都被加以仔細(xì)地評(píng)價(jià)。表Ⅰ中的發(fā)病率一項(xiàng)表明每一組相對(duì)的、長期的整體功能。正如表中所示的，接受42克乳清Ig的第3組小牛超過了第2組喂以初乳的小牛。這樣的結(jié)果是令人驚奇并完全未預(yù)料到的，因?yàn)橐郧捌毡檎J(rèn)為必須食入充分量的Ig，以使血清Ig水平在產(chǎn)后短期內(nèi)至小達(dá)到15毫克/毫升，最好要20毫克/毫升，才能得到合宜的被動(dòng)免疫。事實(shí)上第2組喂初乳的小牛血清Ig水平達(dá)到以前預(yù)想的17-35毫克/毫升，并且具有滿意的免疫系統(tǒng)功能。雖然喂給本產(chǎn)品的第3組小牛所達(dá)到的血清Ig濃度僅為3-4毫克/毫升，這比以前通常認(rèn)為的最低需要低得多，這些小牛的免疫系統(tǒng)的功能卻超過了初乳喂養(yǎng)組。
此外，按照本項(xiàng)發(fā)明所生產(chǎn)的乳清Ig可完善地執(zhí)行由天然初乳所具有的三項(xiàng)不同的免疫學(xué)功能。首先，天然初乳能在上述的吸收關(guān)鍵期阻止病原菌進(jìn)入小牛的體循環(huán)。在這個(gè)吸收關(guān)鍵時(shí)期內(nèi)，新生小?？赏ㄟ^腸壁上的上皮細(xì)胞將Ig及其它攝入物轉(zhuǎn)入體循環(huán)內(nèi)。如上所述，僅僅第一組中牛奶喂養(yǎng)的小牛出現(xiàn)癥候并死于敗血癥，說明這一項(xiàng)免疫功能的完全失效。如列于表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所指出的，乳清制品甚至在低的Ig濃度，在吸收關(guān)鍵時(shí)期控制病原微生物通過小腸方面可以有與高濃度的天然初乳一樣的效力。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)乳清來源的產(chǎn)品的確執(zhí)行了這第一項(xiàng)免疫功能。
第二項(xiàng)免疫功能提供合宜數(shù)量的Ig以供小腸在吸收關(guān)鍵時(shí)期內(nèi)將它們吸收入體內(nèi)，以對(duì)新生畜提供有效的被動(dòng)免疫，直至其主動(dòng)免疫發(fā)生效能。在第3-5組中喂給小牛的乳清Ig總量僅是初乳中(第2組)所喂給的200-720克Ig的一部份。而且，第3組小牛僅喂給42克Ig，血清Ig水平也只達(dá)到3-4毫克/毫升，卻在實(shí)驗(yàn)中所測試全部6種病原中，都得到了對(duì)其特異性抗體8-10倍的增高。再者，第3實(shí)驗(yàn)組中死亡率是零，發(fā)病率得分為80，而第2組初乳喂養(yǎng)組中發(fā)病率得分僅有50。第4組小牛僅得到了14克乳清Ig，但僅有二例死亡，存活者的發(fā)病也尚有限-可與第2組初乳喂養(yǎng)小牛的免疫能力相比較或更好一點(diǎn)。
第三項(xiàng)免疫功能關(guān)系到對(duì)小牛主動(dòng)免疫功能的激活。新生小牛依靠其被動(dòng)免疫直至其主動(dòng)免疫系統(tǒng)有能力生產(chǎn)出合宜的、高水平的抗體活力。有效的被動(dòng)免疫增強(qiáng)新生畜主動(dòng)免疫系統(tǒng)發(fā)育的能力，因此對(duì)短期及長期的健康狀況都有影響。如果新生喂給乳清產(chǎn)品后不能夠?qū)崿F(xiàn)合適的主動(dòng)免疫系統(tǒng)的功能，那么這樣的產(chǎn)品就不能做為天然初乳的代用品。例1中的實(shí)驗(yàn)清楚地證實(shí)，在第1組中，未通過胎盤或初乳得到Ig的四頭小牛從出生到死亡未表現(xiàn)出任何病原體特異抗體的增高，但是初乳及乳清產(chǎn)品喂養(yǎng)組都激活了主動(dòng)免疫系統(tǒng)。
例1的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，接受了42克乳清Ig的第3組小牛的全部免疫功能高于喂給了2次最大體積的含高濃度天然初乳的第2組。對(duì)6種病原的抗體濃度，在初乳喂養(yǎng)小牛中都相應(yīng)地顯著高于本產(chǎn)品喂養(yǎng)組。因此，第3組用產(chǎn)品喂養(yǎng)的小牛的良好免疫功能似可認(rèn)為，與取自各個(gè)母牛的初乳中的抗體相比，乳清產(chǎn)品中含有針對(duì)更為廣泛的病原體的抗體。乳清的Ig來源于數(shù)以百計(jì)的母牛這一事實(shí)可以解釋在乳清產(chǎn)品中的抗菌譜要比天然初乳中來得廣泛這一現(xiàn)象。乳清產(chǎn)品中有廣譜的免疫能力代表了本產(chǎn)品優(yōu)于天然初乳的方面，并且提供了調(diào)節(jié)小牛免疫系統(tǒng)活性水平的方法和控制能被小牛的免疫系統(tǒng)有效地加以中和的病原菌譜的方法。因此，例1的實(shí)驗(yàn)證實(shí)乳清產(chǎn)品在功能上完全可做為天然初乳的代用品，能夠1)在新生階段阻止病原微生物進(jìn)入體循環(huán);2)在傳輸被動(dòng)免疫的有效性方面可與初乳相比較或更好一些;3)可在較早的階段提供激活與增高廣譜免疫活性的因子。
例2第二次乳清過濾物試驗(yàn)分5組，每組10頭小牛，如表2所示。在二級(jí)超濾罐中分別用120，000道爾頓螺旋超濾膜和100，000道爾頓中空纖維超濾膜，以產(chǎn)生不同批次含9%Ig的二級(jí)產(chǎn)物。與例1中相同的技術(shù)被用來生產(chǎn)這二批過濾物。第一組喂初乳的小牛作為對(duì)照，類似于例1中第二組小牛。例2實(shí)驗(yàn)中所有小牛均于產(chǎn)后4小時(shí)內(nèi)喂食并在12小時(shí)后再喂食一次。本次試驗(yàn)在極為嚴(yán)峻的條件下進(jìn)行，小牛要接觸比通常情況下多得多的病原體。
第二組小牛喂食二次，每次150克溶解在牛奶中的本產(chǎn)品，總的乳清Ig為27克。如表2中最后一行所示，第二組小牛免疫系統(tǒng)的功能比第一組對(duì)照差得多。
在產(chǎn)后4小時(shí)內(nèi)，第三組小牛給300克溶解在牛奶中的本產(chǎn)品，總的乳清Ig為27克。第二次喂2升天然初乳，含有200-720克初乳Ig。第三組小牛的免疫系統(tǒng)反應(yīng)性在實(shí)驗(yàn)初期很好，但小牛長期的健康情況最終較對(duì)照組差。
第四組小牛喂食二次，每次300克溶解在牛奶中的本產(chǎn)品，總的乳清Ig為54克。第四組小牛的免疫系統(tǒng)功能很好，長期健康狀況略差于對(duì)照組。
第五組小牛喂2次，每次300克溶解在牛奶中的本產(chǎn)品，總的乳清Ig為54克。第五組小牛的免疫系統(tǒng)功能很好，長期健康狀況與對(duì)照組一樣的好。
第二次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與第一次相類似。表2的資材指出在嚴(yán)峻的條件下，54克乳清Ig能產(chǎn)生令人滿意的免疫系統(tǒng)功能。接受54克乳清Ig的第五組小牛所達(dá)到的優(yōu)良的免疫系統(tǒng)功能與第一次實(shí)驗(yàn)中接受42克乳清Ig的第三組小牛相同。
第二組小牛較差的免疫系統(tǒng)功能表明2次每次只有13.5克乳清Ig的喂食不能達(dá)到將乳清Ig作為天然初乳代用品的水平。接受27克本產(chǎn)品，然后給初乳的第三組小牛，其免疫系統(tǒng)功能在嚴(yán)峻的條件下雖比對(duì)照組差，但在較為正常的條件下，27克的劑量卻有可能是適當(dāng)?shù)摹?br>例3以不同于例1和例2實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)行第三次實(shí)驗(yàn)，以試驗(yàn)本發(fā)明的乳清過濾物。第三次試驗(yàn)采用從單一牧群來的60頭小牛，分成三組，每組20頭。試驗(yàn)在相當(dāng)有利的條件下進(jìn)行。
在第三次實(shí)驗(yàn)中用了二種不同濃度的Ig。有100，000道爾頓中空纖維超濾膜的二級(jí)超濾罐，用于使含35%蛋白質(zhì)的初級(jí)產(chǎn)品加工成含9%Ig的二級(jí)產(chǎn)品。在同樣的二級(jí)超濾罐中，如延長初級(jí)產(chǎn)品的加工時(shí)間，則其產(chǎn)品Ig濃度達(dá)12%。小?；蛭?00克9%Ig的產(chǎn)品，或喂227克12%Ig的產(chǎn)品，它們都溶解在1升牛奶中，這都能使每次喂食的乳清Ig總量為27克。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表3。
表3小牛 Ig來源 劑量 通過產(chǎn)品攝 長期健康狀況分組 入的總Ig1 初乳 5×1升 - 對(duì)照組喂6天1升1次 27克 與對(duì)照組2 產(chǎn)品 300克，9%Ig 一樣好或227克，12%Ig產(chǎn)品1升產(chǎn)品 1次(300克9% 27克 與對(duì)照組3 然后初乳 或227克12%)， 一樣好然后4×1升初乳喂6天第一組小牛產(chǎn)后四天中接受5次天然初乳，每次1升。這一組作為對(duì)照。第二組小牛接受27克溶解在1升牛奶中的乳清Ig。表3最后一行表明第二組小牛的免疫系統(tǒng)功能像對(duì)照組一樣，使小牛達(dá)到長期健康。
第三組小牛在產(chǎn)后初期接受27克溶解在1升牛奶中的乳清Ig，并在產(chǎn)后四天中又接受了4次天然初乳，每次1升。第三組小牛的免疫系統(tǒng)功能與對(duì)照組一樣好，使小牛達(dá)到長期健康。
第三次實(shí)驗(yàn)表明如果在產(chǎn)后短期內(nèi)給27克乳清Ig產(chǎn)品，在較好的條件下免疫系統(tǒng)功能可能達(dá)到天然初乳所具有的水平。把本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與例2實(shí)驗(yàn)中第二組小牛的結(jié)果對(duì)照時(shí)，表明在好的條件下，27克乳清Ig代表了Ig的有效治療劑量，它能達(dá)到天然初乳所能達(dá)到的三個(gè)目標(biāo)中的每一個(gè)目標(biāo)。這與例2實(shí)驗(yàn)中第三組小牛在嚴(yán)峻條件下得到的結(jié)果一致，表明使免疫系統(tǒng)功能達(dá)到足夠水平可能不一定需要給第二次初乳。事實(shí)上例1中第四組小牛只接受14克乳清Ig，此Ig水平所達(dá)到的免疫系統(tǒng)功能與用天然初乳所達(dá)到的水平可相比較，這表明根據(jù)現(xiàn)在發(fā)明的加工方法產(chǎn)生的乳清Ig至少應(yīng)該給到大約14克。14克乳清Ig是最低水平，希望至少27克，這代表了在好的條件下使免疫系統(tǒng)達(dá)到與用天然初乳相似的水平的治療有效劑量。在嚴(yán)峻條件下，為了使免疫系統(tǒng)功能相當(dāng)或優(yōu)于用高質(zhì)量天然初乳所達(dá)到的水平，新生牛在產(chǎn)后頭12小時(shí)內(nèi)應(yīng)攝入大約40-50克的治療有效劑量的Ig。
雖然在表1、2、3中列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都以小牛攝入Ig的克量來表示，乳清Ig的重量與動(dòng)物體重之比在評(píng)價(jià)產(chǎn)品對(duì)某一特定動(dòng)物治療有效劑量中是合適的參數(shù)。由于實(shí)際上上述各次實(shí)驗(yàn)中所用動(dòng)物體重都在90-100磅之間，彼此之間沒有明顯差異，故表中未列出。
如果以對(duì)體重為100磅的小牛，25克乳清Ig為最小治療有效劑量，40-50克為最適治療有效劑量，以這樣的概念來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，那么按乳清Ig與動(dòng)物體重比，對(duì)任何新生小牛至少應(yīng)該給體重的0.055%，最好給0.09-0.10%的乳清Ig。此比例用于體重為125磅(56750克)的新生小牛，產(chǎn)后4小時(shí)內(nèi)至少一次劑量應(yīng)該給31克乳清Ig。根據(jù)上述表格中所列出的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來決定其它產(chǎn)品的劑量、劑量分布和與天然初乳合并使用的量顯然是本項(xiàng)技藝中的基本技巧之一。為了使小牛外的其它動(dòng)物免疫系統(tǒng)功能達(dá)到與天然初乳相當(dāng)?shù)男Ч?，治療有效劑量可以根?jù)例1、2、3中所敘的類型來測定。
顯然，本發(fā)明的乳清產(chǎn)品既能作為天然初乳的補(bǔ)充物以提高Ig水平低的天然初乳中Ig的有效水平，又能作為經(jīng)小?；蚱渌Ｃ庖呦到y(tǒng)最后達(dá)到廣譜活性免疫力的來源。乳清產(chǎn)品同樣可在連續(xù)小劑量服用的基礎(chǔ)上用作小牛、成熟?；蛉魏纹渌鼊?dòng)物，包括人的食品的補(bǔ)充物，以提供有免疫活性的免疫球蛋白和產(chǎn)品中其它免疫學(xué)活性的乳清成分，使之能攻擊動(dòng)物消化系統(tǒng)中存在的病原體。作為食品補(bǔ)充物可以用較少量的本產(chǎn)品，對(duì)100磅體著的動(dòng)物每天大約2克或更少。
為了試驗(yàn)這個(gè)設(shè)想，用38頭動(dòng)物進(jìn)行60天試驗(yàn)。19頭飼養(yǎng)的小牛(體重大約300磅)作為對(duì)照組并接受定額的正常高蛋白飼養(yǎng)，其余19頭小牛除了上述飼養(yǎng)外，每天給5-10克本產(chǎn)品，內(nèi)含7%Ig。
在試驗(yàn)的頭30天，喂本產(chǎn)品的小牛的日體重增加超過對(duì)照組。每天體重的增加比對(duì)照組多0.4磅，高16%。在試驗(yàn)的第二個(gè)30天中，喂產(chǎn)品的小牛每天體重增加超過對(duì)照組0.3磅。一般說喂本產(chǎn)品的小牛顯出比對(duì)照組更健康，生長快，發(fā)病率低。這試驗(yàn)似可證明乳清產(chǎn)品可作為食品的補(bǔ)充物，對(duì)正在生長或成熟的動(dòng)物有用。
用上述實(shí)驗(yàn)3中所敘述的含100，000道爾頓中空纖維超濾膜的二級(jí)超濾罐生產(chǎn)了一定量的乳清過濾產(chǎn)品。為了得到最大的Ig濃度，運(yùn)用了再循環(huán)和透析過濾(diafiltration)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)最后產(chǎn)生的過濾產(chǎn)品具有12%Ig。
參閱圖2，此圖詳細(xì)記敘了在上述系統(tǒng)上略加改變的超濾系統(tǒng)。乳清、脂肪和酪蛋白原料在干酪加工的標(biāo)準(zhǔn)裝置中澄清，得到脂肪、酪蛋白副產(chǎn)物和用于本發(fā)明的澄清的乳清原料。澄清的乳清然后直接通過巴氏消毒器進(jìn)行第二次瞬間巴氏消毒，以破壞乳清中存在的細(xì)菌和粗制凝乳酶，前者是利用乳酸桿菌，后者是干酪制備過程中的試劑。進(jìn)行第二次短時(shí)間瞬間巴氏消毒發(fā)現(xiàn)對(duì)澄清乳清中Ig分子的免疫學(xué)活性沒有不好的影響。
巴氏滅菌的乳清然后直接進(jìn)入超濾裝置，超濾器中有一層或多層穿透1000-10000道爾頓的超濾膜。用上面所講的100，000道爾頓超濾膜的經(jīng)驗(yàn)表明，在超濾膜上迅速形成膠狀物，降低了對(duì)100，000道爾頓以下物質(zhì)的穿透能力?？纱┩?000-10000道爾頓的超濾膜足以從乳清中去除水、乳糖和無機(jī)鹽。在超濾保留物中殘存的乳糖和無機(jī)鹽在干燥時(shí)和喂新生小牛時(shí)不會(huì)產(chǎn)生不希望的副作用。
超濾時(shí)穿透的物質(zhì)直接進(jìn)入廢物容器。超濾保留物包括大約80%蛋白質(zhì)，其中Ig濃度是8%。這些保留物直接進(jìn)入噴霧干燥器，制成干燥的過濾產(chǎn)品，它們含有8%經(jīng)試驗(yàn)和證明有免疫學(xué)活性的Ig。這種乳清過濾產(chǎn)品然后包裝和貯存起來，溶解在液體如牛奶或水中，并在上文所講的關(guān)鍵吸收時(shí)期喂給新生牛。這種乳清Ig將具有廣譜抗體，因?yàn)樗鼈兪莵碜圆煌乩矸植?、不同牧群的幾百頭奶牛牛乳的乳清副產(chǎn)物。
最初敘述并結(jié)合圖2所描述的超濾過程能產(chǎn)生一種可作為初乳代用品的過濾產(chǎn)品，此產(chǎn)品被生產(chǎn)和銷售、贏利。然而為了提高含乳清Ig的產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值，希望把劑量降到遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于例1第三組小牛所需喂給的600克。因?yàn)閺某瑸V過程得到干燥過濾產(chǎn)品中約80%是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)作為食品具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此為了增加產(chǎn)品中Ig濃度而從中去除非Ig蛋白成分的過程將引起經(jīng)濟(jì)上的注意。如果這一過程能實(shí)現(xiàn)，那么非Ig蛋白能通過現(xiàn)有的商業(yè)渠道作為食物制品出售，從而降低了喂新生小牛的產(chǎn)品的制造價(jià)，使現(xiàn)在的發(fā)明更具實(shí)用性。
再參閱圖2，3和4。超濾系統(tǒng)的輸出物能與超濾或離子交換系統(tǒng)相連生產(chǎn)一種混合產(chǎn)品，它具有更高的Ig濃度而較小分子量蛋白質(zhì)濃度并沒有明顯降低。隨著混合產(chǎn)品中Ig濃度的提高，在給相應(yīng)的乳清Ig時(shí)能明顯地降低本產(chǎn)品所用的劑量，實(shí)際上由于避免使用大量無免疫活性的蛋白質(zhì)而節(jié)省了開支。
使用這些不同的技術(shù)來生產(chǎn)初乳代用品，圖2的超濾過程用來制備具有大約8%Ig的過濾產(chǎn)品。而當(dāng)像圖4所指出的，含8%Ig的流路A產(chǎn)品與含50%Ig的流路B的離子交換產(chǎn)品混合，使乳清產(chǎn)品達(dá)到相當(dāng)高的Ig濃度。
參閱圖3，本圖詳細(xì)敘述了為了產(chǎn)生含50%Ig的產(chǎn)品，流路B結(jié)合了超濾和離子交換過程。圖3的過程利用與圖2超濾系統(tǒng)中所用相同的乳清、脂肪和酪蛋白原料。如圖3中所示離子交換Ig分離可放在與圖2的超濾系統(tǒng)所在的同一位置進(jìn)行，或在不同的干酪生產(chǎn)廠進(jìn)行。
原料被澄清以除去脂肪和酪蛋白，澄清的乳清直接通過第二次瞬間巴氏消毒步驟，就像圖2超濾系統(tǒng)中的那樣。
澄清乳清的超濾是用有1000-10000道爾頓超濾膜的超濾單元進(jìn)行，產(chǎn)生含37%蛋白質(zhì)的保留物。超濾穿透物直接進(jìn)入廢液單元。用這種超濾過程可能要用透析超濾從保留物中除去鹽，使它的電導(dǎo)率降到接近零，在2-3毫姆水平。電導(dǎo)率超過這個(gè)水平時(shí)，說明離子交換儀已無效。另一些技術(shù)，如電滲析也可以用來脫鹽。
含37%蛋白質(zhì)的保留物直接進(jìn)入離子交換單元，這樣的離子交換單元對(duì)在這一相應(yīng)領(lǐng)域中有基本訓(xùn)練的人來說是熟知的。這種離子交換單元能構(gòu)成陽離子或陰離子提取的模式?，F(xiàn)在為了經(jīng)濟(jì)上的原因，首選的是陽離子模式。
離子交換單元能從乳清蛋白超濾保留物中分離出帶電荷不同于大部分非Ig蛋白的Ig蛋白。當(dāng)用陽離子交換系統(tǒng)在PH值略低于正常乳清PH值(PH6.2)時(shí)操作，離子交換單元的柱床吸附Ig蛋白和另一些蛋白(50%Ig蛋白和50%其它蛋白)。當(dāng)洗脫離子交換柱床時(shí)，離子交換產(chǎn)品中大約含有50%Ig和50%非Ig蛋白。
當(dāng)離子交換單元以陰離子模式操作，在PH6.2時(shí)非Ig蛋白結(jié)合到離子交換柱上，帶相反電荷的Ig蛋白不結(jié)合而直接通過柱。這個(gè)陰離子過程同樣產(chǎn)生大約50%Ig濃度的產(chǎn)品。
陽離子和陰離子交換單元的特殊構(gòu)造列在下面的例4和例5中例4用陽離子交換純化Ig，所用的陽離子交換材料如S-Sepharose(Pharmacia)用10mM醋酸緩沖液PH4.5-6.0，即5.0平衡。脫鹽的乳清蛋白溶液，電導(dǎo)2毫姆(2ms)，PH調(diào)到5.0，加到S-Sepharose凝膠中，約每毫升凝膠2-500毫克，例如4毫升50毫克/毫升的乳清蛋白溶液，與2毫升凝膠混合或通過2毫升的柱。乳清蛋白溶液中大約50%或更多的Ig結(jié)合到凝膠上。未結(jié)合的蛋白質(zhì)用10mM醋酸緩沖液PH5.0或用水(5毫升對(duì)2毫升膠)洗出來。用高鹽(100mM NaCl配在10mM醋酸緩沖液中)或高PH(8.0)洗脫Ig，例如100mM磷酸二鈉或碳酸銨。2毫升膠用5毫升洗脫緩沖液是合適的。
例5陰離子交換是通過結(jié)合非Ig蛋白而純化Ig。陰離子交換凝膠如Q-Sepharose或Amicon-AM凝膠用10mM PH7.5磷酸緩沖液平衡。低鹽(2ms)的乳清蛋白溶液被調(diào)到PH7.5并且與陰離子交換凝膠混合(100毫克蛋白/毫升凝膠)。收集未結(jié)合的蛋白，它們是富集Ig的蛋白(80%以上是Ig)。
參閱圖4，通過圖2過程流路A得到的8%Ig產(chǎn)品與圖3流路B離子交換Ig分離過程產(chǎn)生的50%Ig濃度的離子交換產(chǎn)品混合。當(dāng)流路A8%產(chǎn)品與流路B50%Ig濃度的產(chǎn)品以某種比例混合時(shí)，得到的產(chǎn)物具有的Ig濃度在8%-50%之間。
現(xiàn)在出于經(jīng)濟(jì)上的考慮，為了降低對(duì)非Ig蛋白成分的花費(fèi)，建議產(chǎn)品使用劑量不超過300克。
上述表中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出一次用含40克免疫活性乳清Ig的產(chǎn)品就能使免疫系統(tǒng)功能達(dá)到高水平。如果238克流路A的8%產(chǎn)品(8%×238克＝19克Ig)與42克從流路B來的50%Ig(50%×42克＝21克)混合，那末280克就含有40克乳清Ig?？偭?80克中含40克Ig代表14%Ig濃度。
由于流路A超濾產(chǎn)物被過濾到8%Ig濃度，在全部280克劑量的238克成分中基本沒有除去非Ig蛋白。由于流路A超濾保留物具有的最大蛋白濃度是8%，保留物中的大約20%是乳糖和無機(jī)物。試驗(yàn)指出，這種含量相對(duì)較低的乳糖和無機(jī)鹽不影響新生小牛，也不引起腹瀉。
圖3表明，從離子交換單元第二出口得到的殘留物大約有35%蛋白質(zhì)。選擇這樣的蛋白濃度是因?yàn)檫@是食品市場所用標(biāo)準(zhǔn)的、商業(yè)上可接受的蛋白濃度。35%蛋白的制品通過蒸發(fā)器和噴霧干燥器，最后包裝并再銷售到現(xiàn)有的食品市場上。
出售無免疫活性的蛋白質(zhì)制品實(shí)際上是一個(gè)成本回收過程，明顯降低混合物的成本，混合物是由流路A低濃度Ig產(chǎn)品與流路B高濃度Ig產(chǎn)品混合得到的濃縮Ig產(chǎn)品。
混合的乳清產(chǎn)品被包裝并投放市場。為了將此產(chǎn)品喂給新生小牛，可將其溶入大約1-2升的牛奶中，并按上述方式喂給新生牛。
根據(jù)上述表格所列出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，混合產(chǎn)品應(yīng)該至少含25克Ig，作為體重100磅的新生牛在好的條件下的初乳代用品。對(duì)體重不是100磅的新生牛應(yīng)該按Ig重量/體重比為0.055計(jì)算。為了使免疫系統(tǒng)功能相當(dāng)于或優(yōu)于天然初乳，應(yīng)該在產(chǎn)后12小時(shí)內(nèi)給新生牛40-50克Ig(0.09%-0.10%)。
正如用直接超濾產(chǎn)品的場合一樣，混合Ig產(chǎn)品同樣可用作初乳的補(bǔ)充物而不是初乳的替代物。此外，混合產(chǎn)品可以作為免疫活性食品的補(bǔ)充物。雖然流路A產(chǎn)品與流路B產(chǎn)品的特定比例已在上面講了，很容易根據(jù)上面詳細(xì)的記述使流路A和流路B按多種比例使混合制品中達(dá)到不同的Ig水平。根據(jù)混合Ig產(chǎn)品的特殊應(yīng)用以及經(jīng)濟(jì)、成本因素決定與流路B混合的流路A的量。
為了比較喂正常量天然初乳小牛的免疫系統(tǒng)功能與喂相對(duì)低量的現(xiàn)在發(fā)明的乳清產(chǎn)物的小牛免疫系統(tǒng)功能，對(duì)初乳產(chǎn)品原料和小牛血清的免疫學(xué)特性進(jìn)行了廣泛的研究。這些試驗(yàn)的主要目的是鑒定和定量出引起表Ⅰ-Ⅲ中所列結(jié)果的乳清產(chǎn)品中的免疫活性成分。
表4是將例1中第二級(jí)產(chǎn)品與例1中的初乳和牛奶原料中所存在的對(duì)某些病原體特異的抗體比較的ELISA試驗(yàn)數(shù)據(jù)。表4證明普通的牛奶與初乳相比對(duì)病原體特異的抗體數(shù)量很少，但二級(jí)產(chǎn)品中病原體特異抗體水平則超過初乳2-20倍。因此表4的數(shù)據(jù)證明與天然初乳相比，乳清產(chǎn)品中免疫活性成分有可能大大提高。
表4例1-不同飼料的抗體滴度微生物 二級(jí)產(chǎn)品 初乳 牛奶傳染性牛鼻子宮頸炎 400 200 ＜10B·abortus流產(chǎn)桿菌 4000 200 12產(chǎn)氣莢膜梭菌 5500 350 32大腸桿菌 4000 1250 60睡眠嗜血桿菌 3200 180 24都伯林沙門氏菌 2300 450 16
表5列出了產(chǎn)后第5天和第10天例1中小牛血清抗體滴度的平均ELISA數(shù)據(jù)第一組小牛喂牛奶，第二組喂初乳，第三組喂本產(chǎn)品。
表5 例1-小牛血清抗體滴度EIA-5天 EIA-10天微生物 第一組 第二組 第三組 第一組 第二組 第三組喂牛奶 喂初乳 喂產(chǎn)品 喂牛奶 喂初乳 喂產(chǎn)品傳染性牛鼻子＜5 16 15 ＜5 5 16宮頸炎B·abortus流產(chǎn)桿菌 ＜5 80 16 ＜5 20 21產(chǎn)氣莢膜梭菌 ＜5 95 34 ＜5 5 30大腸桿菌 ＜5 230 52 ＜5 23 60睡眠嗜血桿菌 ＜5 40 60 ＜5 5 16都伯林沙門氏 ＜5 270 76 ＜5 20 30菌表5材料證明第一組喂牛奶的小牛在產(chǎn)后5天和10天其免疫系統(tǒng)基本沒有活性。第二組喂初乳的小牛在產(chǎn)后第五天明顯出現(xiàn)血清抗體，而產(chǎn)后第十天主要由于來源于初乳的免疫活性成分耗盡而使抗體水平下降。第三組喂本產(chǎn)品的小牛，產(chǎn)后第五天雖然血清抗體滴度相當(dāng)于或低于第二組喂初乳的小牛，但產(chǎn)后10天第三組喂本產(chǎn)品的小牛血清抗體滴度卻超過了第二組喂初乳的小牛。因此表5證明現(xiàn)在發(fā)明的乳清產(chǎn)品具有很好地激活新生牛免疫系統(tǒng)的能力。表5中記敘的引起免疫系統(tǒng)功能優(yōu)勢的特異性免疫活性成分現(xiàn)在尚未完全鑒定出來。
雖然例1、2、3中所用的二級(jí)產(chǎn)品中Ig水平實(shí)際低于天然初乳中平均的Ig水平，但用相對(duì)低劑量的二級(jí)產(chǎn)品所達(dá)到的小牛免疫系統(tǒng)功能則可相當(dāng)于或高于天然初乳所能達(dá)到的水平。為了解釋這一不尋常的現(xiàn)象，研究了產(chǎn)品中其它可能的提高免疫力的成分。已知未加工的乳清含有分子量為90000道爾頓并具有免疫活性的乳鐵蛋白。除了已知具有直接抗菌效應(yīng)外，乳鐵蛋白能與Ig分子復(fù)合形成Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物。一種Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物已從未加工的乳清中分離出來，并證明其分子量為400000。對(duì)此復(fù)合蛋白分子特異的單克隆抗體已經(jīng)制備出來并用于標(biāo)準(zhǔn)的EIA試驗(yàn)來測定牛奶、初乳和過濾產(chǎn)品中Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物的濃度。分析結(jié)果列于表6。
表6材料證明在牛乳中幾乎沒有Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物的活性，初乳中僅有少量活性，但在乳清產(chǎn)品中確有相當(dāng)?shù)幕钚?。產(chǎn)品中高分子量Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物的存在和活性與其強(qiáng)烈的未設(shè)想到的免疫學(xué)活性有關(guān)已被證實(shí)。
為了鑒別產(chǎn)生Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物的機(jī)理，分析了未加工的原料牛奶中和奶酪制造過程產(chǎn)生的牛奶中來的乳清中復(fù)合物的抗體滴度。分析結(jié)果列于表7。被評(píng)價(jià)的原料指產(chǎn)后1、2、5或10天的母乳或同一母乳樣品來的乳清。一種對(duì)Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物特異的單克隆抗體被用于EIA試驗(yàn)以定量復(fù)合物的濃度。研究結(jié)果列于表7。
＊第一天為初乳產(chǎn)后10天母乳樣品只有微量Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物，而來自牛乳的乳清樣品則被證實(shí)在較長時(shí)間內(nèi)有此復(fù)合物。因此，表7資材指出Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物對(duì)現(xiàn)在發(fā)明的過濾物的免疫活性是有明顯意義的。
雖然沒有特別研究，但在包括過濾產(chǎn)品在內(nèi)的乳清各部分中還有下列免疫活性成分溶菌酶、乳過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、淋巴因子和促細(xì)胞分裂劑。所有這些物質(zhì)的分子量都能使它們保留在超濾保留液中。在保留液中測到了有免疫活性的乳過氧化物乳清蛋白，雖然量低但確實(shí)存在。
例3中小牛的血清Ig水平一直追蹤到產(chǎn)后70天。第一組喂初乳、第二組喂本產(chǎn)品，第三組喂產(chǎn)品加初乳，數(shù)據(jù)列于表8。
雖然產(chǎn)后35天內(nèi)第二、第三組喂產(chǎn)品的小牛的Ig水平明顯低于第一組喂初乳的小牛的Ig水平，但到了產(chǎn)后第70天，喂本產(chǎn)品的小牛的Ig水平已相當(dāng)于或超過第一組喂初乳的小牛的Ig水平。因此表8的試驗(yàn)結(jié)果確定了含27克免疫活性Ig的過濾產(chǎn)品是能有效地將免疫力轉(zhuǎn)到新生牛的劑量。
小牛血清中對(duì)病原體特異的抗體活性的更詳細(xì)的研究為表8資料提供了補(bǔ)充材料。例3小牛血清抗體活性的詳細(xì)分析列于表9。
表9表明產(chǎn)后第一天喂初乳的小牛的抗體滴度超過喂產(chǎn)品或喂產(chǎn)品加初乳的小牛。如例1中表5的血清抗體滴度的情況那樣，喂初乳小牛的抗體滴度隨時(shí)間下降，而喂本產(chǎn)品的小牛由于本身產(chǎn)生抗體而使抗體滴度隨時(shí)間增加。產(chǎn)后70天，第三組小牛的免疫功能已接近或超過第一組和第二組小牛。表9分析結(jié)果表明本發(fā)明的產(chǎn)品能成功地作為高質(zhì)量天然初乳的代用品，它最終能使小?；钚悦庖呦到y(tǒng)功能相當(dāng)于和喂初乳一樣的結(jié)果。這一結(jié)果是令人驚奇和意想不到的，由于事實(shí)上過濾產(chǎn)品中Ig濃度遠(yuǎn)低于以前在這一領(lǐng)域中認(rèn)為應(yīng)接受的最低水平。這結(jié)果表明過濾產(chǎn)品含有天然初乳中不存在的或以很低的濃度存在的免疫活性成分。
表10-A列出樣品A、B和C(從不同天生產(chǎn)的過濾產(chǎn)品取樣)的成分分析。
表10-A 過濾產(chǎn)品的組成產(chǎn)品取樣成分 A B C濕度(%) 5.51 5.72 5.52蛋白質(zhì)(%) 63.80 70.10 69.30非蛋白氮(%) 0.83 0.88 0.81脂肪(%) 4.10 5.92 5.25乳糖(%) 19.70 11.80 14.90灰分(%) 3.57 2.68 3.05鈣(mM/kg) 114 104 113磷酸鹽(mM/kg) 32 16 22鈉(mM/kg) 99 88 93鉀(mM/kg) 213 148 180Ig/蛋白質(zhì)(%) 11.50 11.50 10.80乳鐵蛋白/蛋白(%) 0.50 0.22 0.67乳過氧化物酶/蛋白(%) 0.11 1.80 0.31
表10-B列出樣品A、B和C的Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物ELISA滴度，這些樣品的成分分析在表10-A。
表10-B 過濾產(chǎn)品中Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物的ELISA滴度抗體滴度微生物A B C傳染性牛鼻子宮頸炎 8000 7000 8000B·abortus流產(chǎn)桿菌 8000 6000 15000產(chǎn)氣莢膜梭菌 8000 8000 16000大腸桿菌 16000 8000 16000睡眠嗜血桿菌 16000 8000 16000都伯林沙門氏菌 8000 8000 16000表10-B指出過濾產(chǎn)品中含有有明顯免疫活性的Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物。
參閱圖6，乳清的二步分級(jí)的例子將被詳細(xì)討論。上面敘述了二步分級(jí)過程的原理，乳清的首次分級(jí)是通過具有一層或數(shù)層10000道爾頓膜的初級(jí)超濾罐，然后初級(jí)超濾罐的保留液通過具1層或多層100000道爾頓膜的次級(jí)超濾罐進(jìn)一步分級(jí)。
如表9所指，乳清中包括(1)0-8000道爾頓的底層部分，包括低分子量的物質(zhì)如乳糖和無機(jī)鹽;(2)8000-70000道爾頓的中層部分，含有較低分子量的蛋白質(zhì)如α-乳清蛋白，β-乳球蛋白，血清白蛋白和溶菌酶;(3)70000-400000道爾頓的頂層部分，含高分子量蛋白如免疫球蛋白，乳鐵蛋白，乳過氧化物酶及蛋白質(zhì)復(fù)合物。用表11所列的相同術(shù)語，圖6指出作為初級(jí)分離罐原料的液狀乳清由下層、中層和頂層部分組成。
表11 乳清各部分的組成分級(jí) 分子量范圍 典型的固體成分70000 高分子量蛋白，包括Ig、乳頂層 400000或更高 鐵蛋白、乳過氧化物酶和蛋白質(zhì)復(fù)合物8000 低分子量不形成復(fù)合物的蛋白中層 70000 質(zhì)，包括α-乳清蛋白、β-乳球蛋白，血清白蛋白和溶菌酶0 乳糖、無機(jī)鹽底部 8000 非蛋白氮本發(fā)明的目的是提高這種加工過程生產(chǎn)的過濾產(chǎn)品中乳清的各種免疫活性成分的濃度。Ig被廣泛認(rèn)為具有有用的免疫功能，乳鐵蛋白、溶菌酶和乳過氧化物酶也是如此。當(dāng)用“其它有免疫活性的乳清成分”這一短語時(shí)，表示非Ig的免疫活性乳清成分，包括乳鐵蛋白，溶菌酶，和乳過氧化物酶以及其它尚未確定的免疫活性乳清成分。
初級(jí)和二級(jí)超濾罐保留物的免疫活性被監(jiān)測，這些保留物的相對(duì)免疫活性一般是通過測定Ig免疫活性來定量。由于Ig是已知乳清蛋白中對(duì)熱最敏感的免疫活性，所以Ig免疫活性的任何降低都反映了超濾保留物中總免疫活性的喪失。一個(gè)新的免疫活性測量技術(shù)已可采用，這種技術(shù)能適用于測量已知和現(xiàn)在未知或未確定的免疫活性乳清成分的存在、分布、強(qiáng)度和分子量。
參閱下面表12，圖6中所示的在初級(jí)和二級(jí)分離罐中乳清的二步分級(jí)將被詳細(xì)敘述。圖6代表了一個(gè)概念圖，表明初級(jí)分級(jí)罐使頂層/中層部分保留，而底層通過，二級(jí)分離罐使頂層部分保留，中層部分通過的這種方式。實(shí)際上沒有一個(gè)分離系統(tǒng)能產(chǎn)生這樣理想的純的分級(jí)。確實(shí)初級(jí)分離罐的保留液或初級(jí)產(chǎn)品包括濃縮的乳清頂層和中層部分，但也包括少量底層部分。同樣，二級(jí)分離罐的保留液或二級(jí)產(chǎn)品含有濃縮的乳清頂層部分，但也含有少量底層和中層部分。然而圖6還是精確地從概念上表明了本發(fā)明的過程。表12中試驗(yàn)廠的資料指出以現(xiàn)在發(fā)明的這種方式可將Ig濃度為0.63毫克/毫升的液狀乳清原料進(jìn)行分級(jí)。
液狀乳清原料是通過上面所講的商品干酪制備中澄清和分離步驟得到的。小心地控制澄清和分離操作避免Ig分子失去免疫活性。為此操作最好在溫度不超過105°F的條件下進(jìn)行。
在表12引出的試驗(yàn)性工廠的運(yùn)行中，一個(gè)六步的超濾系統(tǒng)作為初乳分離罐。標(biāo)準(zhǔn)的10000道爾頓的聚砜(plysulfone)超濾膜用于分離底層低分子量乳清的中、頂層高分子量乳清。前四步超濾不需要透析過濾，而后二步超濾需要透析過濾。
如表12所指，液狀乳清原料被分成可通過的部分(測不出Ig)和初級(jí)保留液(Ig濃度為18.5毫克/毫升)。通過初級(jí)分離罐使Ig與總固體量的比從原料中的1%增加到初級(jí)產(chǎn)品中的9.1%，同時(shí)蛋白質(zhì)濃度從12.5%增加到83%。沒有高分子量的乳清蛋白進(jìn)入流出液或底層部分，這一部分中主要是水、乳糖、無機(jī)鹽和非蛋白氮(NPN)。Ig與固體物比例從1.0%增加到9.1%表明初級(jí)分離罐使Ig濃度提高910%。
初級(jí)產(chǎn)品作為二級(jí)罐的原料，主要含有乳清中層和頂層蛋白部分，已證明初級(jí)產(chǎn)品重量的83%是蛋白質(zhì)。
二級(jí)分離罐利用二個(gè)超濾單位，每個(gè)超濾單位含有一個(gè)螺旋狀彎曲的100000道爾頓的聚砜超濾膜。這種膜的型號(hào)是HFM-181。可從馬塞諸薩州威明頓的Koch公司的Abcor分部買到。每種超濾單位都要透析過濾。
二級(jí)分離罐的超濾單位入口壓為60磅/英吋2，出口壓為20磅/英吋2。PH控制在大約7.3。二級(jí)罐原料的最高溫度限于90°F，在二級(jí)罐中滯留時(shí)間盡量短。
表12指出二級(jí)罐原料Ig濃度為18.5毫克/毫升，蛋白量83%。二級(jí)分離罐將原料分成二級(jí)產(chǎn)品(Ig濃度36.4毫克/毫升)和中層流出液(Ig濃度為0.05毫克/毫升)。用100000道爾頓超濾膜使二級(jí)分離罐保留大部分Ig、Ig/乳鐵蛋白復(fù)合物、100000道爾頓和更高分子量的免疫活性乳清成分，而使低分子量的乳清蛋白進(jìn)入流出液。表12表明二級(jí)分離罐具有使低分子量的中層蛋白進(jìn)入流出液，高分子量的頂層蛋白進(jìn)入保留液的能力，流出液蛋白濃度69.6%，保留液蛋白濃度88.4%。中層和頂層蛋白的分離使Ig濃度提高174%(從原料中的9.1%到二級(jí)產(chǎn)品中的15.8%)，只有少量(1.92%)進(jìn)入流出液。初級(jí)和二級(jí)分離罐合用可使Ig濃度增加1580%(從乳清原料中1%到二級(jí)產(chǎn)品中15.8%)。
為了市場出售，商業(yè)食品規(guī)格的WPC必須具有最低蛋白濃度為35%。如表12所示，二級(jí)分離罐產(chǎn)生的流出液具有蛋白濃度超過35%，這種主要是無免疫活性的蛋白質(zhì)能作為商業(yè)規(guī)格的WPC產(chǎn)品出售。從本發(fā)明過程得到的這個(gè)WPC副產(chǎn)品的收益大大降低了有免疫活性的二級(jí)產(chǎn)品的成本。
通過上面所敘述的噴霧干燥去除了二級(jí)產(chǎn)品中的水份。合適的噴霧干燥裝置可由具高壓噴嘴的塔形噴霧干燥器和筒狀收集器構(gòu)成。用這種儀器，入口空氣溫度控制在大約390°F，這樣出口溫度就在160°F-180°F。二級(jí)產(chǎn)品中的水份干燥到占4-6%，最好是5%。噴霧干燥過程必須仔細(xì)監(jiān)測和控制，以避免二級(jí)產(chǎn)品中Ig和其它免疫活性乳清成份的熱失活。
以前的乳清蛋白濃縮(WPC)技術(shù)是一步超濾的保留物直接進(jìn)入蒸發(fā)器，那里溫度維持在140°F-160°F，保留液停留5-10分鐘以預(yù)熱，然后再噴霧干燥。這種蒸發(fā)器預(yù)熱的操作使WPC和有免疫活性的Ig暴露在過熱的條件下，完全破壞剩下的免疫活性。
根據(jù)現(xiàn)在的發(fā)明，二級(jí)產(chǎn)品在噴霧干燥器中停留時(shí)間應(yīng)力爭最短，而且溫度控制在不使二級(jí)產(chǎn)品中Ig和其它免疫活性乳清成分的生物學(xué)活性遭受破壞的水平。
由噴霧干燥器干燥的二級(jí)產(chǎn)品密閉貯存和包裝以避免受潮。
干燥的高質(zhì)量的二級(jí)產(chǎn)品，以總固體量的百分比計(jì)算應(yīng)該具有下列成分(1)蛋白質(zhì)濃度至少應(yīng)該占70%，最好達(dá)到80-85%;(2)乳糖加無機(jī)鹽的濃度少于30%;(3)脂肪含量少于6%;(4)水份少于6%;(5)活性Ig含量至少占7%。在干燥的二級(jí)產(chǎn)品中Ig的免疫活性應(yīng)該試驗(yàn)以測出免疫活性抗體的濃度和分布。進(jìn)行Ig試驗(yàn)的步驟上面已經(jīng)講了。
初級(jí)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)占總固體量的百分比可以從30%-85%?？s短初級(jí)分離罐的停留時(shí)間，限制初級(jí)超濾罐中的中間超濾步驟數(shù)造成低的蛋白/總固體量比，因此延長停留時(shí)間和增加中間超濾步驟數(shù)對(duì)獲得85%蛋白/固體量之比是必須的。在執(zhí)行本發(fā)明時(shí)，爭取得到的最終蛋白/總固體量之比是在60%-85%之間，更好一些的是達(dá)到不低于70%的水平，以使二級(jí)產(chǎn)品中Ig和其它免疫活性乳清成分達(dá)到最大的濃度。
如果初級(jí)分離罐的設(shè)計(jì)和操作產(chǎn)生出只含30%-35%蛋白/總固體比的初級(jí)產(chǎn)品，那末在初級(jí)產(chǎn)品中就含有較多的乳糖和無機(jī)鹽。這樣高的乳糖和無機(jī)鹽使初級(jí)產(chǎn)品不適合作為新生牛的被動(dòng)免疫傳遞物，因?yàn)樗鼤?huì)引起腹瀉、嚴(yán)重脫水、甚至可能死亡。
乳清原料中Ig濃度至少0.7毫克/毫升，例如約0.7-1.2毫克/毫升，那末初級(jí)分離罐能產(chǎn)生含7%-10%Ig的初級(jí)產(chǎn)品，這樣的Ig含量能在許多場合下用于提高免疫力或傳遞免疫力。
在干燥的二級(jí)產(chǎn)品中Ig和其它免疫活性乳清成分的濃度直接與液狀乳清原料中的Ig和其它免疫活性乳清成分的濃度有關(guān)。為了降低生產(chǎn)成本和使二級(jí)產(chǎn)品中Ig和其它免疫活性乳清成分達(dá)到最大濃度，選擇具有最大Ig和其它免疫活性乳清成分的乳清是十分重要的?，F(xiàn)在設(shè)計(jì)的干酪生產(chǎn)過程產(chǎn)生酸性乳清或甜乳清?，F(xiàn)在干酪生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)生的酸乳清中免疫活性成分濃度為零。因此在現(xiàn)在的發(fā)明中希望用通過粗凝乳酶沉淀酪蛋白后產(chǎn)生的甜乳清。甜乳清/酪蛋白分離應(yīng)該在PH6.5-4.6進(jìn)行。利用在此范圍內(nèi)較高的PH分離條件產(chǎn)生較高濃度的免疫活性Ig。
從不同類型干酪生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的甜乳清其Ig濃度不同。下列干酪生產(chǎn)過程得到的甜乳清比較好。(1)Swiss;(2)Mozzarella/Provolons;(3)Chaddar;(4)Gouda;(5)Cottage干酪。
乳清中Ig濃度的變化直接與牛奶中Ig濃度有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)牛奶中Ig濃度夏天最低冬天最高。因此夏天的乳清要經(jīng)過比冬天乳清更長時(shí)間的超濾，在某種情況下冬天乳清經(jīng)過初級(jí)分離罐處理后就能用。
乳清中Ig濃度隨干酪生產(chǎn)過程變化而每天都不同。生產(chǎn)過程中的時(shí)間、溫度、微生物的活性水平的變化都會(huì)引起未加工乳清原料中Ig濃度的變化。干酪生產(chǎn)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化能減少這種每天間的變化，但不能消除。
在干燥的二級(jí)產(chǎn)品中Ig濃度的變化也與分級(jí)過程的參數(shù)，如溫度、停留時(shí)間、泵的攪動(dòng)和微生物活性有關(guān)。正如上面詳細(xì)解釋的，減少Ig和其它免疫活性乳清成分暴露在高溫中以及縮短這些物質(zhì)在高溫操作過程中的停留時(shí)間是十分重要的。微生物活性應(yīng)該控制并盡量減少。過量的微生物活性可能導(dǎo)致加工過程中PH下降，結(jié)果Ig和其它免疫活性成分失活。通過縮短制備過程中的停留時(shí)間可以降低微生物的活性。因此希望在干酪生產(chǎn)的初次瞬間巴氏消毒后約4小時(shí)內(nèi)完成二級(jí)產(chǎn)品的干燥。
避免將乳清暴露于空氣中，在分級(jí)罐中避免或盡量少用離心泵，因?yàn)殡x心泵使被泵物暴露于空氣中并受到強(qiáng)烈的機(jī)械攪動(dòng)。這樣可使Ig和其它免疫活性乳清成分達(dá)到最高濃度。實(shí)際上應(yīng)該用正相頂推泵(positive displacement pumps)而不用離心泵。
上面分析的動(dòng)物試驗(yàn)資料指出，在過濾產(chǎn)品中免疫活性Ig的濃度至少應(yīng)該7%，比較好的是9%、最好大于12%。上面圖6中所述的二步分級(jí)過程產(chǎn)生的過濾產(chǎn)品具有的Ig/固體量之比為15.8%。進(jìn)一步提高能使Ig/固體重量之比為20%或35%以上。
雖然上面提議單個(gè)100000道爾頓膜能用在初級(jí)分離罐中直接分離乳清頂層部分與底層及中層部分，但發(fā)現(xiàn)在100000道爾頓超濾膜的入口一面比較長的乳清蛋白形成一層網(wǎng)或“動(dòng)態(tài)膜”。在過濾開始后10分鐘內(nèi)，這層動(dòng)態(tài)膜就使有效超濾膜的孔徑從100000道爾頓降至10000道爾頓。不管所用膜的孔徑，初級(jí)分離罐能將乳清的底層部分與中層和頂層分開，但不能將乳清的中層與頂層分開。動(dòng)態(tài)膜限制了初級(jí)分離罐使初級(jí)產(chǎn)品中Ig和其它大分子量免疫活性乳清成分濃度的提高。
圖6中所示的初級(jí)分離罐的操作和乳清底層與中、頂層的分離，通過現(xiàn)在尚未知的機(jī)理又重新形成乳清。這種重新形成的初級(jí)產(chǎn)品直接進(jìn)入二級(jí)過濾罐，它的100000道爾頓超濾膜沒有明顯地引起動(dòng)態(tài)膜，也沒有明顯地降低100000道爾頓膜的有效孔徑。二級(jí)超濾罐的100000道爾頓膜直接與它們的孔徑大小有關(guān)，成功地將乳清中層與頂層分開。
為了成功地完成上述功能，選擇初級(jí)超濾罐的超濾膜大小，以保證低分子量乳糖、無機(jī)鹽和有關(guān)乳清成分通過初級(jí)分離罐的超濾膜，直接進(jìn)入初級(jí)分離罐的流出液中?？讖?0000到120000道爾頓的超濾膜可用于此目的。在100000或120000道爾頓的初級(jí)分離罐中，動(dòng)態(tài)膜的形成使超濾開始幾分鐘內(nèi)比較大孔徑的膜功能上相當(dāng)于10000道爾頓的膜。
二級(jí)產(chǎn)品可以經(jīng)過第三個(gè)分離罐，使其中Ig濃度增加。第三個(gè)分離罐由超濾系統(tǒng)或反向滲透單元構(gòu)成，從二級(jí)產(chǎn)品中除去水分并增加第三分離罐保留液中的Ig濃度。
如圖6所示用初級(jí)分離罐，接著用二級(jí)分離罐的結(jié)果比單用初級(jí)分離罐提高了產(chǎn)品質(zhì)量。圖6所示的二步分離過程可使免疫活性二級(jí)產(chǎn)品的生產(chǎn)全年進(jìn)行，雖然夏季乳清中Ig濃度與其它季節(jié)相比是明顯低的。在免疫活性過濾產(chǎn)品的某些應(yīng)用中，例如用于被動(dòng)免疫傳輸時(shí)，新生牛必須攝入一個(gè)最低量的免疫活性Ig。因?yàn)閳D6二步法生產(chǎn)的二級(jí)產(chǎn)品中有較高的Ig濃度，那末較少量的二級(jí)產(chǎn)品溶解于牛奶并喂給新生牛就能輸入達(dá)到這個(gè)最低需要量的Ig，這就明顯地降低了每劑的價(jià)格。
在許多不同的情況下都能用現(xiàn)在發(fā)明的免疫活性過濾產(chǎn)品。過濾產(chǎn)品的一個(gè)特殊用途是將被動(dòng)免疫力傳輸給新生牛，這一點(diǎn)已著重討論過。由于豬、山羊、綿羊和其它家畜具有類似的免疫傳輸機(jī)制，過濾產(chǎn)品或可用于將被動(dòng)免疫力傳輸給所有這些動(dòng)物。根據(jù)?？贵w能有效地中和人的抗原這一事實(shí)，過濾產(chǎn)品能用于抵抗人類疾病或降低人對(duì)某些疾病的易感性。一定量的過濾產(chǎn)品配入嬰兒食品中，能提高嬰兒對(duì)疾病的耐受性，這代表了將過濾產(chǎn)品用在人類的一項(xiàng)好用途。過濾產(chǎn)品可以作為幼畜或成年家畜的補(bǔ)充飼料或作為幼兒或成人的食品補(bǔ)充物。過濾產(chǎn)品同樣可能用于改變結(jié)腸或小腸細(xì)菌叢或控制、降低口腔微生物叢以控制口腔斑的形成。在獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域中的專業(yè)人員會(huì)很容易地想到本發(fā)明過濾產(chǎn)品的大量其它用途。
應(yīng)用在抗病方面，過濾產(chǎn)品的有效治療量可以用液體或固體形式喂給。以固體形式，過濾產(chǎn)品可以被包裝或以各種該領(lǐng)域中的專業(yè)人員熟知的方式封裝。產(chǎn)品外面可以涂腸衣使之到達(dá)小腸后才釋放出來。在包裝或制膠囊過程中本產(chǎn)品不應(yīng)該暴露于高溫。
至今，干酪生產(chǎn)過程中的乳清副產(chǎn)物被認(rèn)為是令人討厭的、不希望要的副產(chǎn)品，它們會(huì)引起嚴(yán)重的廢物處理問題。在一定程度上，超濾系統(tǒng)可以回收免疫學(xué)上無活性的乳清蛋白，用作食品添加劑。
上面所講的這種一步或二步超濾技術(shù)，使本發(fā)明的過程能以粗乳清為原料生產(chǎn)具有可控制的免疫活性成分的過濾產(chǎn)品。這種過濾產(chǎn)品中免疫活性成分的濃度能將被動(dòng)免疫力傳輸給新生小牛，因此可以作為天然初乳的全效代用品。令人驚奇的是過濾產(chǎn)品中相對(duì)低的Ig濃度與其它免疫活性乳清成分一起，顯示出與具有高Ig濃度的天然初乳同樣有效或甚至更有效。
由于幾乎消除了動(dòng)態(tài)膜的有害效應(yīng)，本發(fā)明的二步分離罐技術(shù)能產(chǎn)生一種過濾產(chǎn)品，它們主要由乳清頂層部分組成，含一定量的Ig及其它的乳清免疫活性成分，而乳清中層的副產(chǎn)品則可直接用作商業(yè)WPC食品。
根據(jù)對(duì)少數(shù)幾例成功地實(shí)施了本發(fā)明的詳細(xì)描述，對(duì)在本領(lǐng)域有專長的人員來說顯然公開了改進(jìn)分級(jí)和回收免疫活性乳清成分的多種可能性，也可能設(shè)想出上述實(shí)施方式以外的其它方案。據(jù)此，在申報(bào)的權(quán)利要求
書中將包括所有的那些根據(jù)本發(fā)明而做出的變化和修正，只要它們是在本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.從液狀乳清生產(chǎn)免疫活性產(chǎn)物的方法，此乳清具有(1)底層部分含乳糖和無機(jī)鹽；(2)中層部分含低分子量蛋白；(3)頂層部分含有具免疫活性的免疫球蛋白的高分子量蛋白，此方法包括如下步驟a、選擇有免疫活性免疫球蛋白的乳清；b、在保護(hù)上述的免疫球蛋白的免疫活性的條件下，超濾上述的乳清得到一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品中上述的底層部分濃度顯著降低，而上述的中層和頂層部分濃度明顯增高，在該產(chǎn)品中上述的頂層部分中有免疫活性的免疫球蛋白至少要占總固體量的7%；c、在保護(hù)上述的初級(jí)產(chǎn)品免疫球蛋白免疫活性的條件下，由上述的產(chǎn)品中除去水份制成干燥的產(chǎn)品。
2.按照權(quán)利要求
1的方法，其中所述乳清加工步驟一直繼續(xù)到該產(chǎn)品中有免疫活性的免疫球蛋白的濃度至少增加到該產(chǎn)品固體量的7%，該產(chǎn)品中底層部分的濃度低于總固體量的30%，中層和頂層部分的濃度至少增加到總固體量的70%。
3.按照權(quán)利要求
2的方法，其中所述乳清的加工步驟是采用超濾方法進(jìn)行，超濾膜使上述的底層部分大部分通過，而保留上述的頂層部分的大部分。
4.按照權(quán)利要求
3的方法，其中所述超濾方法還包括a、初級(jí)超濾罐具有保留大部分中層和頂層部分并使大部分底層部分通過的超濾膜;b、二級(jí)超濾罐具有保留大部分頂層部分并使大部分中層和底層部分通過的超濾膜。
5.按照權(quán)利要求
4的方法，其中所述的產(chǎn)品包括(1)該產(chǎn)品中底層部分的濃度占總固體量的10-30%;(2)該產(chǎn)品中中層和頂層部部分的濃度占總固體量的70%-85%。
6.按照權(quán)利要求
1的方法，還進(jìn)一步包括為了將被動(dòng)免疫力轉(zhuǎn)給動(dòng)物，在關(guān)鍵吸收期喂一次或多次該干燥產(chǎn)品給動(dòng)物，使該動(dòng)物所消耗的該產(chǎn)品中的免疫球蛋白重量等于或大于該動(dòng)物體重的0.055%。
7.按照權(quán)利要求
1的方法，還進(jìn)一步包括喂給動(dòng)物的劑量至少為每天1克該干燥產(chǎn)品。
8.按照權(quán)利要求
1的方法，還進(jìn)一步包括定期檢查該產(chǎn)品，并測量其中免疫活性的水平。
9.按照權(quán)利要求
4的方法，其中所述的初級(jí)超濾罐中的超濾膜穿透性約為10000-120000道爾頓，二級(jí)超濾罐的超濾膜穿透性約為80000-120000道爾頓。
10.按照權(quán)利要求
1的方法，其中所述的干燥產(chǎn)品包括一定量有治療效果的其它免疫活性乳清成分。
11.從液狀乳清得到的一種干燥的有免疫活性的產(chǎn)品，此乳清具有(1)底層部分含乳糖和無機(jī)鹽;(2)中層部分含低分子量蛋白質(zhì);(3)頂層部分含具有免疫活性免疫球蛋白的高分子量蛋白質(zhì)，該產(chǎn)品包含(1)明顯降低濃度的底層部分;(2)至少有70%或更高濃度中層和頂層部分，上述的頂層部分包括幾乎全部乳清免疫活性免疫球蛋白，濃度至少占該產(chǎn)品中總固體量的7%。
12.從乳清超濾得到的一種干燥的免疫活性產(chǎn)品，其主要的免疫球蛋白部分是活性形式，該產(chǎn)品具有乳糖和無機(jī)鹽很少的高分子量部分，并且含有幾乎全部乳清的活性免疫球蛋白和其它免疫活性乳清成分，該產(chǎn)品所含的活性免疫球蛋白濃度至少占總固體量的7%。
專利摘要
將液體狀的含有免疫活性免疫球蛋白(Ig)的乳清，通過可控制的一或二步超濾過程，制成一種干燥的、有免疫活性的、過濾制品。這種制品可作為天然初乳的代用品。口服這種過濾制品可增強(qiáng)各種動(dòng)物(包括人類)的抵抗疾病的能力，并提高生長的速度。這種制品的免疫活性來源于其組成中含量明顯增高的活性Ig及其它乳清免疫活性成分，這些成分的含量已大大高于液狀乳清原料中的量，而在原料中這些活性成分的量只處于無免疫效能的濃度。
文檔編號(hào)C07K16/00GK87100708SQ87100708
公開日1987年9月16日 申請(qǐng)日期1987年1月13日
發(fā)明者杰拉爾德·H·斯科特, 戴維·O·盧卡斯 申請(qǐng)人:拉尼爾工業(yè)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan