專利名稱：三羥基芪合酶基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三羥基芪合酶基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及新的三羥基芪合酶，涉及在植物中具有組成性表達(dá)的重組質(zhì)粒，和涉及其各組織在沒有環(huán)境壓情況下均能表達(dá)三羥基芪合酶的轉(zhuǎn)基因植物。
三羥基芪(Resveratrol，也稱為白藜蘆醇)是植物的次生代謝產(chǎn)物，最初是以其植保素[1]功能被發(fā)現(xiàn)的。三羥基芪合酶(簡稱RS)基因只存在于花生、葡萄和松樹等少數(shù)植物中[2]，它是植物本身的一種防御基因。據(jù)文獻(xiàn)報道，只有在外部逆性條件(如病原菌侵染等)誘導(dǎo)下，才能激發(fā)該基因轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成三羥基芪合酶，進(jìn)而催化植物本身所含的前體物質(zhì)(一般植物都有)生成三羥基芪。歐洲專利(EP-464461 A2)和有關(guān)文獻(xiàn)描述了以真菌誘導(dǎo)的葡萄愈傷組織為來源構(gòu)建cDNA文庫，從cDNA文庫中分離到三羥基芪合酶的調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因，用該調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因一起轉(zhuǎn)化煙草，其轉(zhuǎn)基因煙草只有在外部條件的誘導(dǎo)下，即特定波長紫外線或灰葡萄孢霉菌侵染情況下，其轉(zhuǎn)基因組織中才能檢測到三羥基芪合酶的mRNA積累、三羥基芪合酶和產(chǎn)物三羥基芪的存在，對灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)感染有抗性。
上述和其它的現(xiàn)有技術(shù)由于它的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受到外界條件的限制，三羥基芪在植物各組織也不均一，它的發(fā)明的出發(fā)點也僅限于植保素的功能，其應(yīng)用受到局限。而三羥基芪在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)方面的重要性和實際應(yīng)用的價值也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了植保素的功能。近幾年來由于三羥基芪它的新的生物功能開始引起國外醫(yī)、藥學(xué)家的極大興趣。1997年美國科學(xué)家從幾百種植物提取液中發(fā)現(xiàn)了一種新的抗癌物質(zhì)三羥基芪[3]。由于三羥基芪在生理代謝過程中的抗氧化和抗突變作用，它在癌細(xì)胞最初形成、生長、發(fā)展的三個階段中均有抗癌活性，在小鼠乳腺癌和皮膚癌模式實驗中也得到極好的抑制效果[3]。此外三羥基芪還可抑制ADP誘導(dǎo)的血小板凝集[4]。含三羥基芪的天然食品與純的三羥基芪一樣能起到預(yù)防癌癥和心血管疾病的作用[3,5]。遺憾的是這種物質(zhì)“三羥基芪”僅存在于少數(shù)可食植物中，且含量甚低。
針對上述存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種可獲得三羥基芪合酶的新的結(jié)構(gòu)基因、重組質(zhì)粒、組成性表達(dá)的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一個目的是通過新的組成性表達(dá)的三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因，培育出系列藥食兼用、藥用的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的又一目的是將本發(fā)明的三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化到高效、穩(wěn)定表達(dá)的微生物，借助生物轉(zhuǎn)化可獲得三羥基芪。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)并非所有的葡萄品種都象EP-464461 A2和有關(guān)文獻(xiàn)所述的那樣，只有通過外部條件誘導(dǎo)的葡萄組織才可做為構(gòu)建基因的材料。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)誘導(dǎo)的情況下，從特定品種的健康葡萄組織中可以檢測出三羥基芪合酶酶蛋白，而有的葡萄品種雖然經(jīng)過誘導(dǎo)，但是在其組織中也未能檢出三羥基芪合酶酶蛋白。于是本發(fā)明的特點是利用中國特有的、古老的葡萄栽培品種龍眼和日本培育的歐美種的雜交后代藤稔為材料，采用脫毒的組培苗或田間栽培植株的莖、葉和葉柄組織的總RNA為模板，利用RT-PCR得到了二個三羥基芪合酶基因，這二個基因與歐洲專利(EP-464461 A2)相比，其核苷酸序列同源性分別為93％和95％，氨基酸序列同源性均為98％；本發(fā)明所得二個三羥基芪合酶基因其核苷酸同源性為92.5％，氨基酸序列同源性為98％；構(gòu)建了能在植物中具有組成性表達(dá)的重組質(zhì)粒。其優(yōu)點是所得的轉(zhuǎn)基因植物各組織在沒有環(huán)境壓情況下均能表達(dá)三羥基芪合酶，并催化植物本身所含的前體物質(zhì)生成衡定量的三羥基芪；植物可食部分也會含有三羥基芪；不可食部分還可用于提取三羥基芪來制藥；可將三羥基芪合成酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化到高效、穩(wěn)定表達(dá)的微生物后，借助生物轉(zhuǎn)化將獲得大量的三羥基芪，可精制成藥，具有更高的應(yīng)用價值。
本發(fā)明通過基因工程手段，為解決三羥基芪的資源找到了一條新的途徑，從而為其實現(xiàn)在醫(yī)藥、保健上的應(yīng)用提供了可能。
為達(dá)到上述目的，實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下以不同栽培品種葡萄為起始材料，從脫毒組培苗或田間栽培植株的莖、葉、和葉柄組織中分別提取的總RNA為模板，以合成的Oligo(dT)為引物，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)已報道的三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因5’端和3’端保守序列[6]設(shè)計并合成一對引物，通過PCR擴(kuò)增三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因(以下簡稱RS1和RS2)，并克隆三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因。純化PCR產(chǎn)物連接到T-pBluescript載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因重組質(zhì)粒pBRS1和pBRS2(見

圖1,2)及重組大腸桿菌JM109RS1和JM109RS2。測序表明三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因是1.189Kb的DNA。
從重組質(zhì)粒pBRS1和pBRS2分離出含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因的DNA片段，連接到大腸桿菌表達(dá)載體pBV221，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得能在大腸桿菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒pBV221-RS1和pBV221-RS2(見圖3,4)及重組大腸桿菌JM109-221-RS1和JM109-221-RS2。在可使上述三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)該重組菌，菌體蛋白質(zhì)的SDS-PAGE蛋白電泳分析證明有一條42KDa特異表達(dá)蛋白帶(見圖5)，其分子量與三羥基芪合酶一致。從凝膠中切出特異表達(dá)的蛋白帶，免疫兔子制備抗血清。
從重組質(zhì)粒pBRS1和pBRS2分離出含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因的DNA片段分別連接到植物組成性表達(dá)載體pBin438，連接物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLI-Blue和JM109，獲得能在植物中組成性表達(dá)的重組質(zhì)粒pBin438-RS1和pBin438-RS2(見圖6,7)及重組大腸桿菌XLI-Blue-438-RS1和JM109-438-RS2。
從上述重組菌中提取重組質(zhì)粒pBin438-RS1和pBin438-RS2，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。獲得重組農(nóng)桿菌LBA4404-RS1和LBA4404-RS2。
經(jīng)重組農(nóng)桿菌LBA4404-RS1和LBA4404-RS2的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草外植體，通過選擇性分化培養(yǎng)基和選擇性生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到抗卡那霉素植株。植株葉組織總DNA的PCR分析表明得到了PCR陽性煙草植株(見圖9)，即轉(zhuǎn)三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因的煙草(見圖8)。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
圖1三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因重組質(zhì)粒pBRS1構(gòu)建模式圖。
圖2三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因重組質(zhì)粒pBRS2構(gòu)建模式圖。
圖3三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因大腸桿菌表達(dá)重組質(zhì)粒pB221-RS1構(gòu)建模式圖。
圖4三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因大腸桿菌表達(dá)重組質(zhì)粒pB221-RS2構(gòu)建模式圖。
圖5三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因在大腸桿菌中的表達(dá)。
圖6三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因植物組成性表達(dá)重組質(zhì)粒pBin-438-RS1構(gòu)建模式圖。
圖7三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因植物組成性表達(dá)重組質(zhì)粒pBin-438-RS2構(gòu)建模式圖。
圖8轉(zhuǎn)三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因煙草。
圖9轉(zhuǎn)三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因煙草葉組織總DNA的PCR分析。
圖10來自龍眼、藤稔和Opitima的三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因DNA序列及由此推導(dǎo)出的氨基酸序列同源性比較。
實施例I1.葡萄組織總RNA的提取用原產(chǎn)于中國的古老葡萄栽培品種龍眼(Vitis vinefera var.LongYan)，取其脫毒生根組培苗莖和葉共3g，液氮研磨后，迅速加入15ml在65℃預(yù)熱過的RNA提取緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含2％CTAB、2％PVP4000、25mmol/L EDTA、2.0M NaCl、0.5g/LSpermidine和2％β-巰基乙醇)。分別用等體積的氯仿、異戊醇混合溶液(V/V＝24∶1)抽提兩次，取最后一次的上清溶液，加入1/4體積10mol/L LiCl，4℃放置過夜，次日4℃、10000rpm離心回收上述溶液中的RNA沉淀，沉淀再溶于500μl的SSTE溶液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0,1.0mol/L NaCl、0.5％SDS、1mmol/L EDTA)，用氯仿、異戊醇混合溶液再抽提兩次，上清液加入兩倍體積的乙醇，－70℃放置2小時后，于4℃、10000rpm離心20分鐘，回收RNA沉淀，用70％的乙醇洗滌沉淀，干燥后沉淀用DEPC處理過的無離子水溶解。RNA溶液的紫外分光光度測定結(jié)果為A260/A280＝1.80，A260/A230＝2.0，電泳分析估計28S、18S的tRNA量的比大約為28S∶18S＝2∶1，此RNA溶液可作為RT-PCR反應(yīng)的模板。
2. cDNA合成和擴(kuò)增在9μl的總RNA溶液中，加入1μl的Oligo(dT)18(0.4884μg/μl)引物，置90℃放2分鐘后立刻在冰浴上再放置2分鐘，瞬間離心。向上述溶液中依次加入dNTPs(每種dNTP為10mmol/L)1.5μl、ddH2O 3μl、核糖核酸酶抑制劑0.5μl(20u/μl)、5 AMV緩沖液4μl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl。該溶液于42℃放置30分鐘后，再在95℃溫浴5分鐘，立即置冰浴放2分鐘，瞬時離心。
上述反應(yīng)液1000倍稀釋后取出2μl作PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)的體系有dNTP 1μl(每種dNTP各為10mmol/L)、5’端引物5’-ATCCATGGCTTCAGT(C/T)G-3’和3’端引物5’-CTTCACTTAATTTGT(A/C)AC-3’各為1μl(25pmol/μl)、10Taq酶緩沖液5μl、Taq酶0.3μl(5u/μl)、用水補(bǔ)充至50μl。PCR反應(yīng)的條件為94℃3分鐘；94℃30秒、51℃1分鐘、72℃1分鐘20秒(30個循環(huán))；72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析顯示一條較為明顯的約1.189Kb的DNA帶。用乙醇純化PCR產(chǎn)物，溶于25μl的水。
3.含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因的克隆及序列分析取1μl的PCR產(chǎn)物與1μl的T-pBluescript作10μl連接體系反應(yīng)，其中含1μl(10連接緩沖液)、6μl水、1μl的T4DNA連接酶。連接體系在16℃反應(yīng)8小時，取0.8μl電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109后，涂于含Amp(氨芐青霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。挑取單菌落，利用以上的PCR系統(tǒng)，直接以菌落為模板進(jìn)行PCR。對PCR陽性的菌落，用煮沸法提質(zhì)粒。利用載體上的SalI和PCR產(chǎn)物上NcoI的酶切位點，對1μl的質(zhì)粒作NcoI、SalI的雙酶切反應(yīng)。根據(jù)電泳結(jié)果選擇含約1.189Kb DNA片段重組質(zhì)粒的菌落(JM109-RS1)，提取質(zhì)粒(pBRS1)，通過USB的T4Sequenase Version2.0測序試劑盒測序，測序結(jié)果見圖10的RS1。
4.含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因重組大腸桿菌表達(dá)載體和重組大腸桿菌的制備取10μl的質(zhì)粒pBRS1在100μl體系中，進(jìn)行NcoI，SalI的雙酶切反應(yīng)，37℃溫浴3.5小時，加入1μl Rnase(1μg/μl)繼續(xù)溫浴半小時后，取5μl的反應(yīng)液電泳檢查。100μl反應(yīng)液用乙醇沉淀，沉淀溶于10μl水后全部進(jìn)行電泳，打孔法回收含1.189KbDNA片段于10μl水中。取1μl的約1.189Kb DNA片段溶液和0.5μl同樣雙酶切pBV221后回收的大片段作連接反應(yīng)，體系同上。取0.8μl電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后，涂于含Amp的L3固體培養(yǎng)基上。通過PCR和重組質(zhì)粒的NcoI、SalI雙酶切方法，挑取含重組質(zhì)粒pBV221-RS1的JM109-221-RS1菌體。
含重組質(zhì)粒pBV221-RS1的JM109菌體在含50μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD＝0.5后，在42℃、250rpm再培養(yǎng)3.5小時。取1.5ml菌液于12000rpm離心30秒回收菌體。菌體重懸于100μlpH7.0的TE和100μl的2SDS蛋白裂解緩沖液中，煮沸3分鐘，再12000rpm離心5分鐘。取上清液5μl進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，顯示一條42KDa特異蛋白帶。
5.芪合酶的抗體制備與以上類同，SDS-PAGE蛋白電泳后的凝膠經(jīng)4℃ 0.1N KCl浸泡5分鐘，蛋白帶顯乳白色，挖取42KDa特異表達(dá)蛋白帶凝膠；用無菌水浸泡5分鐘分別兩次，用液氮研磨后用無菌水或PBS或生理鹽水懸浮，用懸浮液免疫兔子，一個月后采集抗血清。
6.含三羥基芪成酶結(jié)構(gòu)基因重組植物組成性表達(dá)載體和重組農(nóng)桿菌的制備BamHI、SalI雙酶切質(zhì)粒pBRS1，回收DNA小片段。同樣雙酶切植物組成性表達(dá)載體pBin438，且乙醇純化溶于少量的水，取該酶切產(chǎn)物與上述DNA小片段連接。電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLI-Blue感受態(tài)細(xì)胞后，涂于含Kan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。利用PCR和BamHI、SalI雙酶切的鑒定并挑取含重組質(zhì)粒pBin438-RS1的XLI-Blue菌體。
經(jīng)煮沸法提取質(zhì)粒pBin438-RS1并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞后、涂于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif(利副平)的YEP固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落提質(zhì)粒，PCR顯示獲得了含pBin438-RS1的農(nóng)桿菌LBA4404-RS1。
挑取含pBin438-RS1的LBA4404單菌落，于5ml的含50μg/mlKan和50μg/ml Rif的YEP培養(yǎng)基中，于28℃、250rpm培養(yǎng)過夜。此菌液用液體MS培養(yǎng)基作100倍的稀釋，以備煙草轉(zhuǎn)化。
7.轉(zhuǎn)三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因煙草的培育取煙草K326種子，于70％酒精浸泡2分鐘，再用0.1％HgCl2表面消毒15分鐘，用無菌水沖洗5次，然后置于MS0培養(yǎng)基上萌發(fā)，25℃每日光照16小時。取二十天苗齡的煙草無菌苗的葉片，用刀片切去主脈及葉梗，整個葉片被切為1cm2的小片，然后置于以上的農(nóng)桿菌稀釋液中，浸泡4分鐘。取出葉片用無菌濾紙吸干菌液，將葉片置于MS1固體培養(yǎng)基上，使葉片切口接觸培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)48小時。
將共培養(yǎng)的葉片轉(zhuǎn)移到含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab(羧芐青霉素)的MS2培養(yǎng)基上，25℃每日光照16小時進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。當(dāng)愈傷組織上長出0.5~1cm高新生芽時，將新生芽切下置于含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab的MS3選擇性生根培養(yǎng)基上，25℃每日光照16小時。當(dāng)幼芽長出根并苗高約3~5cm時取出幼苗，并徹底清除根部培養(yǎng)基，將幼苗移入土壤中培養(yǎng)。
取上述轉(zhuǎn)基因煙草葉片50mg，加入150μl的CTAB緩沖溶液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，2％CTAB)后研磨，再另加入350μl CTAB緩沖溶液，輕輕攪勻，65℃溫浴半小時。然后加入500μl在4℃預(yù)冷過的氯仿，輕微搖勻，室溫10000rpm離心5分鐘，取出400μl水相移入另一個Eppendorf管。向移出的水相中加入400μl在4℃預(yù)冷過的異丙醇，輕微搖勻，室溫10000rpm離心5分鐘，棄上清液，用乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于100μl的無離子水中。取2μl該溶液作模板，按上述PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。電泳結(jié)果顯示為一條1.189Kb DNA帶，說明此植株為PCR陽性株即為轉(zhuǎn)RS基因的煙草。附注LB培養(yǎng)基5g/L NaCl；10g/LTrypton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NNaOH調(diào))；15g/L瓊脂；15磅滅菌30分鐘。YEP培養(yǎng)基5g/L NaCl；10g/L Polypepton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NKOH調(diào))；15g/L瓊脂；15磅滅菌30分鐘。MS培養(yǎng)基如文獻(xiàn)[8]所述。MS1培養(yǎng)基在MS培養(yǎng)基中加入過濾滅菌的1AA和6BA終濃度分別為0.1mg/L和1.2mmg/L。MS2培養(yǎng)基含0.1mmg/L IAA和1.0mg/L 6BA的MS培養(yǎng)基。MS3培養(yǎng)基含0.1～1mg/L IBA的MS培養(yǎng)基。實施例21.葡萄組織總RNA的提取稱取3g在田間生長四年的葡萄栽培品種藤稔(Fujiminori，歐美雜交種)的葉和葉柄，液氮研磨后迅速加入15ml經(jīng)65℃預(yù)熱的RNA提取緩沖液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，含2％CTAB、2％PVP4000、25mmol/L EDTA、2.0mol/L NaCl、0.5g/L Spermidine和2％β-巰基乙醇)。分別用等體積的氯仿、異戊醇混合溶液(V/V＝24∶1)抽提兩次，取最后一次的上清溶液，加入1/4體積的10mmol/L LiCl，4℃放置過夜，次日4℃、10000rpm離心回收上述溶液中的RNA沉淀。沉淀再溶于500ul的SSTE溶液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0含1.0mol/L NaCl、0.5％SDS和1mmol/L EDTA)，同樣用氯仿、異戊醇混合溶液抽提兩次，加入兩倍體積的乙醇，-20℃放置2小時。4℃、10000rpm、離心20分鐘回收RNA沉淀，用70％的乙醇洗滌沉淀，干燥后沉淀溶于用DEPC處理過的無離子水中。對此總RNA溶液進(jìn)行A260/A280、A260/A230及瓊脂糖電泳的分析，A260/A280＝1.85，A260/A230＝2.1，電泳分析顯示明顯的28s、18s的tRNA帶，且二者量的比大約為28S∶18S＝2∶1，可作為RT—PCR反應(yīng)的模板。
2.cDNA合成和擴(kuò)增在9ul的總RNA溶液中，加入1μl的O1igo(dT)18(0.4884μg/μl)引物，置于90℃保溫2分鐘后于冰浴上再放2分鐘，瞬間離心后再向上述溶液中依次加入dNTPs(每種dNTP為10mmol/L)1.5μl、ddH2O 3μl、核糖核酸酶抑制劑0.5μl(20u/μl)、5 AMV緩沖液4μl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl。該溶液于42℃反應(yīng)30分鐘，再于95℃溫浴5分鐘后立即置冰浴，2分鐘后瞬時離心。
以上反應(yīng)液1000倍稀釋后，取出2μl作PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)的體系為dNTP1 μl(每種dNTP各為10mmol/L)、RS引物1和2(25pmol/ul)各1μl、10Taq酶緩沖液5μl、Taq酶0.3μl(5u/μl)、用水補(bǔ)充至50μl。PCR反應(yīng)的條件為94℃3分鐘；94℃30秒、51℃60秒、72℃1分鐘20秒，(循環(huán)30次)；72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析顯示一條較為明顯的1.189Kb的DNA帶。用乙醇純化PCR產(chǎn)物，溶于25μl的水。
3.含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因的克隆及序列分析取1μl的PCR產(chǎn)物與1μl的T-pBluescript到10μl連接體系，其中含1μl 10連接緩沖液、6μl水、1μl T4DNA連接酶。連接體系在16℃反應(yīng)8小時，取0.8μl電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后，涂于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上。挑取單菌落，利用以上的PCR系統(tǒng)，直接以菌落為模板進(jìn)行PCR。對于PCR陽性的菌落，用煮沸法提質(zhì)粒。利用載體上的SalI和PCR產(chǎn)物上NcoI的酶切位點，對1μl的質(zhì)粒作NcoI、SalI的雙酶切反應(yīng)。選擇電泳結(jié)果表明有一約1.189KbDNA片段的含重組質(zhì)粒的菌落JM109-RS2。提取質(zhì)粒(pBRS2)，通過USB的T4-Sequenase Version2.0測序試劑盒測序，測序結(jié)果見圖10的RS2。
4.含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因重組大腸桿菌表達(dá)載體和重組大腸桿菌的制備取10μl的質(zhì)粒pBRS2在100μl體系中，進(jìn)行NcoI，SalI的雙酶切反應(yīng)，37℃溫浴3.5小時，加入1μl Rnase(1μg/μl)繼續(xù)溫浴半小時后，取5μl的反應(yīng)液電泳檢查。100μl反應(yīng)液用乙醇沉淀，沉淀溶于10μl水后全部進(jìn)行電泳，打孔法回收含1.189KbDNA片段于10μl水中。取1μl的1.189KbDNA片段溶液和0.5μl同樣雙酶切pBV221后回收的大片段作連接反應(yīng)，體系同上。取0.8μl電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后，涂于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上。通過PCR和重組質(zhì)粒的NcoI、SalI雙酶切方法，挑取含重組質(zhì)粒pBV221-RS2的JM109-221-RS2菌體。
含重組質(zhì)粒pBV221-RS2的JM109菌體在含50μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD＝0.5后，在42℃、250rpm再培養(yǎng)3.5小時。取1.5ml菌液于12000rpm離心30秒回收菌體。菌體重懸于100μl pH7.0的TE和100μl 2 SDS蛋白裂解緩沖液中，煮沸3分鐘再于12000rpm離心5分鐘。取上清液5μl進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析。
5.含三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因重組植物組成性表達(dá)載體和重組農(nóng)桿菌的制備用BamHI、SalI雙酶切質(zhì)粒pBRS2，回收DNA小片段。同樣雙酶切植物組成性表達(dá)載體pBin438，且乙醇純化溶于少量水，取該酶切產(chǎn)物與上述DNA小片段連接。電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后，涂于含Kan的LB固體培養(yǎng)基上。利用PCR和BamHI、SalI雙酶切鑒定并挑取含重組質(zhì)粒pBin438-RS2的JM109菌體。
經(jīng)煮沸法提取質(zhì)粒pBin438-RS2并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞后、涂于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEP固體培養(yǎng)基上，PCR顯示獲得了含pBin438-RS2的農(nóng)桿菌LBA4404-RS2。
挑取含pBin438-RS2的LBA4404單菌落，于5ml的含50μg/mlKan和50μg/ml Rif的YEP培養(yǎng)基中，于28℃、250rpm培養(yǎng)過夜。此菌液用液體MS培養(yǎng)基作100倍的稀釋，以備煙草轉(zhuǎn)化。
6.轉(zhuǎn)三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因煙草的培育取煙草K326種子，于70％酒精浸泡2分鐘，再用0.1％HgCl2表面消毒15分鐘，用無菌水沖洗5次，然后置于MSO培養(yǎng)基上萌發(fā)，25℃每日光照16小時，取二十天苗齡的煙草無菌苗的葉片，用刀片切去主脈及葉梗，整個葉片被切為1cm2的小片，然后置于以上的農(nóng)桿菌稀釋液中，浸泡4分鐘。取出葉片用無菌濾紙吸干菌液，將葉片置于MS1固體培養(yǎng)基上，使葉片切口接觸培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)48小時。
將共培養(yǎng)的葉片轉(zhuǎn)移到含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab的MS2培養(yǎng)上，25℃每日光照16小時進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。當(dāng)愈傷組織上長出0.5～1cm高新生芽時，將新生芽切下置于含300μg/ml Kan、500μg/ml Cab的MS3選擇性生根培養(yǎng)基上，25℃每日光照16小時。當(dāng)幼芽長出根并苗高約3～5cm時，取出幼苗，并徹底清除根部培養(yǎng)基，將幼苗移入蛭石置溫室培養(yǎng)10天左右后再移入土壤中培養(yǎng)。
取上述轉(zhuǎn)基因煙草葉片50mg，加入15μl的CTAB緩沖溶液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA和2％CTAB)后研磨，再另加入350μl的CTAB緩沖溶液，輕輕搖勻，65℃溫浴半小時后加入500μl在4℃預(yù)冷過的氯仿，輕微搖勻，室溫10000rpm離心5分鐘，取出400μl水相并移入另一個Eppendorf管。向移出的水相中加入400μl在4℃預(yù)冷過的異丙醇，輕微搖勻，室溫10000rpm離心5分鐘，棄上清液，用乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于100μl的無離子水中。取2μl該溶液作模板，按上述PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。電泳結(jié)果顯示為一條1.189Kb DNA帶，說明此植株為PCR陽性株，即為轉(zhuǎn)RS基因的煙草。附注LB培養(yǎng)基5g/L NaCl；10g/LTrypton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NNaOH調(diào))；15g/L瓊脂；15磅滅菌30分鐘。YEP培養(yǎng)基5g/L NaCl；10g/L Polypepton；10g/LYeast ExtractpH7.0(3NKOH調(diào))；15g/L瓊脂；15磅滅菌30分鐘。MS培養(yǎng)基如文獻(xiàn)[8]所述。MS1培養(yǎng)基在MS培養(yǎng)基中加入過濾滅菌的IAA和6BA終濃度分別為0.1mg/L和1.2mg/L。MS2培養(yǎng)基含0.1mmg/L IAA和1.0mg/L 6BA的MS培養(yǎng)基。MS3培養(yǎng)基含0.1～1mg/L IBA的MS培養(yǎng)基。
主要參考文獻(xiàn)[1]Langcake，P et al.(1979)Phytochemistry 181025-1027[2]Hain，R et al.(1993)Nature 361153-156[3]Meishiang，J et al.(1997)Science 275218-220[4]Mei-lng Chung et al.(1992)Planta Med.58274-276[5]Siemam，E.H et al.(1992)Am.J.Enol VlTIc.4349-52[6]Molchior，F(xiàn) et al.(1991)Arch Biochem Biophys.288552-557[7]Shujun Chang et al.(1993)Plant Molecular Biology Report 11113[8]Murashige.T et al.(1962)Physiol.Plant.15473-49權(quán)利要求
1.一種在宿主中組成性表達(dá)的三羥基芪合酶基因，其特征在于長度為具有1.189Kb，其編碼的氨基酸序列分別選自于下列RS1和RS2之一RS1MASVEEFRNAQRAKGPRS2MASVEEiRNAQRAKGPATILAIGTATPDHCVYATILAIGTATPDHCVYQSDYADYYFRVTKSEHQSDYADYYFRVTKSEHMTELKKKFNRICDKSMMsELKKKFNRICDKSMIKKRYIHLTEEMLEEHIKKRYIHLTEEMLEEHPNIGAYMAPSLNIRQEPNIGAYMAPSLNIRQEIITAEVPRLGRDAALKIITAEVPkLGkeAALKALKEWGQPKSKITHLAALKEWGQPKSKITHLvFCTTSGVEMPGADYKLFCTTSGVEMPGADYKLANLLGLETSVRRVMLYANLLGLETSVRRVMLYHQGCYAGGTVLRTAKDHQGCYAGGTVLRTAKDLAENNAGARVLVVCSELAENNAGARVLVVCSEITVVTFRGPSEDALDPITVVTFRGPSEDALDsLVGQALFGDGSSAVIVLVGQALFGDGSaAVIVGSDPDVSIERPLFQLVGSDPDVSIERPLFQLVSAAQTFIPNSAGAIAGSAAQTFIPNSAGAIAGNLREVGLTFHLWPNVPNLREVGLTFHLWPNVPTLISENIEKCLTQAFDTLISENvEKCLTQAFDPLGISDWNSLFWIAHPPLGISDWNSLFWIAHPGGPAILDAVEAKLNLEGGPAILDAVEAKLsLdKKKLEATRHVLSEYGNKqKLnATRHiLSEYGNMSSACVLFILDEMRKKMSSACVLFILDEMRKKSLKGEKATTGEGLDWGShKGEKATTGEGLDWGVLFGFGPGLTIETVVLVLFGFGPGLTIETVVLHSIPMVTNHSIPMVTNRS1來自龍眼；RS2來自藤稔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼三羥基芪合酶氨基酸的核苷酸序列分別選自于下列RS1和RS2之一。RS1ATCC 4RS2ATCCATG GCT TCA GTC GAG GAA TTT AGA AAC GCT CAA CGT GCC AAG GGT CCG 52ATG GCT TCA GTC GAG GAA aTc AGA AAt GCT CAA CGT GCC AAG GGT CCGGCC ACC ATC CTA GCC ATT GGC ACA GCT ACC CCC GAC CAC TGT GTC TAC 100GCC ACC ATC CTA GCC ATT GGC ACA GCT ACC CCC GAC CAC TGT GTC TACCAG TCT GAT TAT GCT GAT TAC TAT TTC AGG GTC ACT AAG AGC GAG CAC 148CAG TCT GAT TAT GCT GAT TAC TAT TTC AGG GTC ACT AAG AGC GAG CACATG ACT GAG TTG AAG AAG AAG TTC AAT CGC ATA TGT GAC AAA TCA ATG 196ATG tCT GAG TTG AAG AAG AAG TTC AAT CGC ATA TGT GAC AAA TCA ATGATC AAG AAG CGT TAC ATT CAC TTG ACC GAA GAA ATG CTT GAG GAG CAC 244ATC AAG AAG CGT TAC ATT CAT TTG ACg GAA GAA ATG CTT GAG GAG CACCCA AAC ATT GGT GCT TAT ATG GCT CCA TCT CTT AAC ATA CGC CAA GAG 292CCA AAC ATT GGg GCT TAT ATG GCT CCA TCT CTT AAC ATA CGC CAA GAGATT ATC ACT GCT GAG GTA CCT AGA CTT GGT AGA GAT GCA GCA TTG AAG 340ATT ATC ACT GCT GAG GTA CCc AaA CTT GGg Aag GAa GCA GCA TTG AAGGCT CTT AAA GAG TGG GGC CAA CCA AAG TCC AAG ATC ACC CAT CTT GCA 388GCT CTT AAg GAG TGG GGC CAA CCc AAa TCa AAG ATC ACC CAT CTT GtATTT TGT ACA ACC TCC GGT GTA GAA ATG CCC GGT GCG GAT TAC AAA CTC 436TTT TGT ACC ACC TCG GGT GTA GAA ATG CCt GGT GCa GAT TAt AAA CTCGCT AAT CTC TTA GGT CTT GAA ACA TCG GTT AGA AGG GTG ATG TTG TAC 484GCT AAT CTC TTA GGT CTc GAA ACA TCG GTT AGA AGa GTG ATG TTG TACCAT CAA GGG TGC TAT GCA GGT GGA ACT GTC CGG CGA ACT GCT AAG GAT 532CAT CAA GGG TGC TAT GCA GGT GGA ACT GTC Ctt aGA ACa GCT AAG GATCTT GCA GAA AAT AAT GCA GGA GCA CGA GTT CTT GTG GTG TGC TCT GAG 580CTT GCA GAg AAT AAT GCA GGA GCA aGA GTT CTT GTG GTG TGC TCT GAGATC ACT GTT GTT ACA TTC CGT GGG CCT TCC GAA GAT GCT TTG GAC CCT 628ATC ACa GTT GTT ACA TTt CGT GGg CCT TCC GAA GAT GCT TTG GAC tCTTTA GTT GGC CAA GCC CTT TTT GGT GAT GGG TCT TCA GCT GTG ATT GTT 676TTA GTT GGC CAA GCC CTT TTT GGT GAT GGG TCT GCA GCT GTa ATT GTaGGA TCA GAT CCA GAT GTC TCG ATT GAA CGA CCA CTC TTC CAA CTT GTT 724GGA TCA GAT CCA GAT GTC TCa ATT GAA CGA CCA CTC TTC CAg CTT GTtTCA GCA GCC CAA ACA TTT ATT CCT AAT TCA GCA GGA GCC ATT GCC GGA 772TCA GCA GCC CAA ACA TTT ATT CCT AAT TCt GCA GGt GCa ATT GCa GGAAAC TTA CGT GAG GTG GGG CTC ACC TTT CAT TTG TGG CCC AAT GTG CCT 820AAC TTA CGT GAG GTG GGa CTC ACC TTT CAT TTG TGG CCC AAT GTG CCcACT TTG ATT TCT GAG AAC ATA GAG AAA TGC TTG ACT CAG GCT TTT GAC 868ACT TTG ATT TCT GAG AAC gTA GAG AAA TGt TTG ACT CAG GCT TTT GACCCA CTT GGT ATT AGC GAT TGG AAC TCG TTA TTT TGG ATT GCT CAC CCA 916CCA CTT GGT ATT AGC GAT TGG AAC TCC TTA TTT TGG ATT GCT CAC CCAGGT GGC CCT GCA ATT CTC GAT GCA GTT GAA GCA AAA CTC AAT TTA GAG 964GGT GGC CCT GCA ATT CTt GAT GCg GTT GAA GCA AAA CTC AgT TTA GAtAAA AAG AAA TTG GAA GCA ACT AGG CAT GTG TTA AGT GAG TAC GGT AAC 1012AAg cAa AAA cTc aAt GCA ACa AGG CAT aTt cTA AGT GAa TAt GGa AACATG TCA AGT GCA TGT GTG TTG TTT ATT TTG GAT GAG ATG AGA AAG AAA 1060ATG TCA AGc GCA TGT GTG TTG TTT ATT TTG GAT GAG ATG AGA AAG AAATCC CTA AAG GGG GAA AAA GCC ACC ACT GGT GAA GGA TTG GAT TGG GGA 1108TCC Cat AAG GGG GAg AAg GCC ACC ACa GGT GAA GGA TTG GAT TGG GGAGTA CTA TTT GGT TTT GGG CCA GGC TTG ACC ATC GAA ACT GTT GTG CTA 1156GTA tTA TTc GGT TTT GGa CCA GGC TTG ACt ATt GAA ACT GTT GTG tTgCAT AGC ATT CCT ATG GTT ACA AAT TAA GTG AAG 1189CAT AGC ATT CCT ATG GTT ACA AAT TAA GTG AAGRS1來自龍眼；RS2來自藤稔。
3.一種重組質(zhì)粒，它含有權(quán)利要求1所述的三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，它是pBRS1和pBRS2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，它是pBV221-RS1和pBV221-RS2
6.一種重組微生物，是由權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物獲得的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物，其特征在于所述微生物是大腸桿菌。
8.能在植物中組成性表達(dá)的重組質(zhì)粒，其特征在于將權(quán)利要求1所述的三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因與pBin438連接獲得的。
9.重組微生物，含有權(quán)利要求8所述的重組質(zhì)粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組微生物，其中所述微生物是大腸桿菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組微生物，其中所述微生物是農(nóng)桿菌。
12.制備組成性表達(dá)三羥基芪的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于將權(quán)利要求11所述的含有能在植物中組成性表達(dá)的重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與植物外植體共培養(yǎng)，然后由外植體再生為植株。
全文摘要
以不同栽培品種葡萄的莖、葉和葉柄組織總RNA為模板，利用RT－PCR得到了三羥基芪合酶基因(Resveratrol synthase gene)cDNA克隆2個。由此提供了編碼三羥基芪合酶的新的結(jié)構(gòu)基因，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒和植物組成性表達(dá)質(zhì)粒。將所述的三羥基芪合酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化到高效、穩(wěn)定表達(dá)的微生物，借助生物轉(zhuǎn)化可獲得三羥基芪。并且獲得了含有植物組成性表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植物。植物可食部分也會含有三羥基芪，長期食用能起到預(yù)防癌癥和心血管疾病的作用；不可食部分還可用于提取三羥基芪來制藥。在轉(zhuǎn)基因植物、微生物的培育和生產(chǎn)及其它們在藥食兼用和制藥上都將具有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/64GK1239141SQ9810251
公開日1999年12月22日 申請日期1998年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月17日
發(fā)明者蔡文啟, 臘平 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所