專利名稱：生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)包括紅豆杉醇的塔三烷型雙萜的方法，所述紅豆杉醇可用作卵巢癌，乳腺癌，肺癌等的治療劑。
可用作卵巢癌，乳腺癌，肺癌等的治療劑的紅豆杉醇是塔三烷型雙萜，它分離和鑒定自屬于紅豆杉科家族的紅豆杉屬的植物短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia NUTT)。此化合物具有與其活性相關(guān)的復(fù)合酯基團(tuán)。在短葉紅豆杉植物體的任何部分都可發(fā)現(xiàn)紅豆杉醇，據(jù)報(bào)道樹(shù)皮中的紅豆杉醇含量最高。最近，從野生或栽培的樹(shù)中收集到紅豆杉醇，然而，紅豆杉植物是生長(zhǎng)緩慢的植物，其地上部分花10年以上才能長(zhǎng)高20cm，另外，剝?nèi)?shù)皮會(huì)導(dǎo)致樹(shù)的死亡，因此難以得到大量的紅豆杉醇。如果能利用細(xì)胞培養(yǎng)合成紅豆杉醇和塔三烷型雙萜，如漿果赤霉素Ⅲ(紅豆杉醇的前體)，對(duì)于無(wú)需采樹(shù)而輕易得到大量這些化合物非常有利。
有關(guān)紅豆杉醇生產(chǎn)的現(xiàn)有技術(shù)，授予Holton等人的美國(guó)專利5,015,744中公開(kāi)了由紅豆杉醇生物合成的前體，即漿果赤霉素Ⅲ或10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ生產(chǎn)紅豆杉醇的半合成法。在歐洲和美國(guó)，由這種半合成法得到的紅豆杉醇已經(jīng)被批準(zhǔn)并用于臨床。通過(guò)使用植物細(xì)胞培養(yǎng)法，可以生產(chǎn)半合成所用的粗物質(zhì)，如漿果赤霉素Ⅲ，通過(guò)上述半合成法可將該物質(zhì)用于紅豆杉醇的生產(chǎn)。
有關(guān)使用經(jīng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞生產(chǎn)紅豆杉醇的方法，在美國(guó)已有一個(gè)方法被授予專利權(quán)(美國(guó)專利5,019,504)，其中紅豆杉醇由經(jīng)培養(yǎng)的短葉紅豆杉(Taxus brevifolia NUTT)細(xì)胞生產(chǎn)。然而，根據(jù)此方法，紅豆杉醇的產(chǎn)量是1-3mg/l，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)而言這是不夠的。此外，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的紅豆杉醇生產(chǎn)力也不穩(wěn)定。盡管通過(guò)選擇可得到高生產(chǎn)力的原代細(xì)胞，但通過(guò)傳代培養(yǎng)難以維持細(xì)胞的紅豆杉醇含量(E.R M.Wickremesine等人，細(xì)胞和組織培養(yǎng)國(guó)際會(huì)議(1992))。
在這種情況下，已嘗試了多種方法以改善紅豆杉醇的生產(chǎn)力，例如，可列舉使用了具有高紅豆杉醇含量的經(jīng)培養(yǎng)的紅豆杉(Taxus chinensis)細(xì)胞的方法(美國(guó)專利5,407,816)；使用了連續(xù)傳代培養(yǎng)法的方法(日本待審查的專利特許公開(kāi)7-255495)；和在培養(yǎng)基中加入了信息傳遞物質(zhì)甲基茉莉酸酯的方法(日本待審查的專利特許公開(kāi)8-33490,EP 683232)，然而，上述方法中沒(méi)有一個(gè)已被實(shí)際應(yīng)用，還需要對(duì)生產(chǎn)力作進(jìn)一步地改善。
甚至當(dāng)在液體培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞不是形成單個(gè)細(xì)胞，而是產(chǎn)生了大小為幾十微米至幾毫米的細(xì)胞群體，這是因?yàn)橐话闱闆r下，靠細(xì)胞壁粘附的各個(gè)細(xì)胞是牢固和緊密的。在本發(fā)明所用的喬木植物，如紅豆杉植物中，由于次生細(xì)胞壁，如木質(zhì)素生長(zhǎng)的結(jié)果，細(xì)胞間的粘附特別有力。
涉及經(jīng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞中次生代謝物的產(chǎn)生的最新研究表明隨著上述這些細(xì)胞群體大小的變化，次生代謝物會(huì)有所變化(Y.Yamada和Y.Fujita，植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)，第1卷，D.A Evans等人編輯，Macmillan出版公司，紐約，pp.717-728(1983)；Y.Hara等人，Planta Med.,55,pp.151-154(1989))。然而，沒(méi)有報(bào)道顯示這些細(xì)胞群體的顆粒大小與塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力之間的關(guān)系。
另一方面，美國(guó)專利5,344,775公開(kāi)了得到由1-10個(gè)細(xì)胞組成的紅豆杉植物小細(xì)胞群體的方法，該方法步驟如下(ⅰ)提供得自紅豆杉外植體的愈傷組織片段，該片段含有被支持物培養(yǎng)基物理支持的分生組織，所述培養(yǎng)基含有如植物生長(zhǎng)素的α-萘乙酸和如細(xì)胞激動(dòng)素的6-芐基氨基嘌呤；(ⅱ)在含有植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞激動(dòng)素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)愈傷組織以產(chǎn)生具有受限的細(xì)胞間粘附的大量1-10個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群體的懸浮液；(ⅲ)在含有植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞激動(dòng)素的支持物培養(yǎng)基表面平鋪從細(xì)胞懸浮液中得到的細(xì)胞。
(ⅳ)在支持物培養(yǎng)基上培養(yǎng)得自步驟(ⅲ)的被平鋪的細(xì)胞以形成假愈傷組織細(xì)胞，假愈傷組織細(xì)胞是缺少分化的維管或器官組織的細(xì)胞和缺少被清楚地確定的分生帶的細(xì)胞的疏松的，無(wú)定形的聚集，細(xì)胞聚集具有差的細(xì)胞間粘附，極端的脆性，當(dāng)受到機(jī)械干擾時(shí)會(huì)分散成大量單個(gè)細(xì)胞和小細(xì)胞群體，假愈傷組織細(xì)胞表明在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中質(zhì)量加倍的最初速度比步驟(ⅰ)中愈傷組織的質(zhì)量加倍速度要快，并顯示出生產(chǎn)塔三烷的水平比步驟(ⅰ)中的愈傷組織所生產(chǎn)的要高的特性。
然而，得到由1-10個(gè)細(xì)胞組成的小的細(xì)胞聚集體，從而能生長(zhǎng)或產(chǎn)生次生代謝物是十分困難的(紅豆杉植物經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞的直徑通常為20-30μm，因此由10個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞聚集體的直徑估計(jì)為100μm以下)。除非如上述美國(guó)專利中所述將培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件精心聯(lián)合，否則不可能得到上述這種聚集。
在包括本發(fā)明人所用的那些細(xì)胞的大量紅豆杉植物的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞中，僅僅加強(qiáng)液體培養(yǎng)中所用的攪拌條件不能得到由1-10個(gè)健康細(xì)胞組成的小群體。通過(guò)使用孔徑為100μm的篩分級(jí)分離能得到的只是不具有生長(zhǎng)或產(chǎn)生次生代謝物之能力的老化細(xì)胞克隆的碎片。
因此，上述美國(guó)專利中公開(kāi)的分離小細(xì)胞群體的要點(diǎn)在于制備這種能容易地釋放小細(xì)胞群體的愈傷組織。在基本思路和方法上，該專利與限定了振蕩和攪拌條件以釋放小細(xì)胞群體的本發(fā)明有所不同。換句話說(shuō)，根據(jù)上述美國(guó)專利的說(shuō)明書(shū)，專利中用于釋放由1-10個(gè)健康細(xì)胞組成的小細(xì)胞群體的振蕩和攪拌條件屬于常規(guī)方法之列。與本發(fā)明的條件不同的是，美國(guó)專利中所用的條件不超出常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)所用條件的范圍。
另外，考慮到實(shí)際的，工業(yè)化的培養(yǎng)方法，我們希望在任何上述方法中，通過(guò)利用所謂的兩步培養(yǎng)法來(lái)增加最終得到的塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力，在兩步培養(yǎng)法中，預(yù)培養(yǎng)和主培養(yǎng)在不同的條件下進(jìn)行。進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)是為了培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行主培養(yǎng)是為了生產(chǎn)感興趣的塔三烷型雙萜，如紅豆杉醇。通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)塔三烷型雙萜時(shí)，從上述3個(gè)涉及改善紅豆杉醇生產(chǎn)力的專利中可以看出它們強(qiáng)調(diào)了主培養(yǎng)條件的改善。例如，加入誘導(dǎo)劑(elicitor)或信息傳遞物質(zhì)；或改善培養(yǎng)方法。至于預(yù)培養(yǎng)，還不知道改善感興趣的化合物的最終生產(chǎn)力所優(yōu)選的具體條件。
至于預(yù)培養(yǎng)的作用，首先是增加細(xì)胞的生長(zhǎng)速率以為主培養(yǎng)提供盡可能多的細(xì)胞，同時(shí)，需要預(yù)培養(yǎng)以增加細(xì)胞生產(chǎn)塔三烷型雙萜的潛伏能力，使得當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)在主培養(yǎng)中有效地生產(chǎn)雙萜。然而，如上所述，從增加細(xì)胞潛伏能力的角度看，一點(diǎn)也未認(rèn)識(shí)到預(yù)培養(yǎng)條件的重要性。
一般情況下，有關(guān)控制或調(diào)節(jié)懸浮培養(yǎng)中的植物細(xì)胞的氧供給等的參數(shù)，可列舉例如質(zhì)量傳遞體積系數(shù)(kLa)和溶解氧的濃度(DO)。盡管振蕩速率和氣體供應(yīng)的速率易于測(cè)定，并在此意義上是有利的，但它們得不到普遍使用，這是因?yàn)樗鼈兪芘囵B(yǎng)容器的形狀和所用培養(yǎng)基量的影響，因此，在培養(yǎng)工程方面它們統(tǒng)統(tǒng)是沒(méi)有意義的參數(shù)。已知在滿刻度培養(yǎng)中，感興趣產(chǎn)物的生產(chǎn)力(積累的量/細(xì)胞)受kLa和DO的影響(Y.Fujita ＆ Y.Hara，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，49,pp.2071-2075(1985))。然而，至今仍未檢查出這些參數(shù)對(duì)預(yù)培養(yǎng)的影響。
本發(fā)明的目的是在通過(guò)培養(yǎng)植物細(xì)胞生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法中改善塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力。
作為針對(duì)解決上述任務(wù)的深而廣的研究結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)(ⅰ)在培養(yǎng)生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物細(xì)胞時(shí)，使用小細(xì)胞群體可增加塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力；和(ⅱ)在加強(qiáng)氧供給的條件下預(yù)培養(yǎng)生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物細(xì)胞可增強(qiáng)所得細(xì)胞生產(chǎn)塔三烷型雙萜的潛伏能力，依次會(huì)改善主培養(yǎng)中雙萜的生產(chǎn)力，從而達(dá)到本發(fā)明的目的。
本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法，所述方法包括下列步驟(a)和(b)中的一個(gè)或兩個(gè)以增加其大小適于生產(chǎn)雙萜的那些細(xì)胞群體的比率(a)在預(yù)培養(yǎng)用以提供給主培養(yǎng)以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的細(xì)胞的過(guò)程中，或在細(xì)胞從一次預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到下一次預(yù)培養(yǎng)時(shí)，用篩和/或?yàn)V器進(jìn)行至少一次操作以除去大細(xì)胞群體；(b)在劇烈攪拌條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
其大小適于生產(chǎn)雙萜的細(xì)胞群體的平均直徑范圍為0.12mm-1.6mm，優(yōu)選為0.12mm-1.0mm，平均直徑以細(xì)胞群體的長(zhǎng)軸和短軸之間的中間值表示。
相對(duì)于細(xì)胞的總濕重而言，優(yōu)選其大小適于生產(chǎn)雙萜的細(xì)胞群體的比率增加到65％或更高，尤其是80％或更高。
本發(fā)明還涉及通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法，所述方法包括在氧供給條件下，在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，其中氧對(duì)液體培養(yǎng)基的質(zhì)量傳遞體積系數(shù)(kLa)為10h-1或更高；為主培養(yǎng)提供所得的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜；和從所得培養(yǎng)物中回收塔三烷型雙萜。
另外，本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法，所述方法包括在將液體培養(yǎng)基的溶解氧濃度(DO)維持在培養(yǎng)所用溫度下的飽和氧濃度的30％或更高的條件下，在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞；為滿刻度培養(yǎng)提供所得的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜；和從所得培養(yǎng)物中回收塔三烷型雙萜。


圖1是表示底部具有用作擋板的折疊結(jié)構(gòu)的燒瓶的圖。
以下將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
用于本發(fā)明的生產(chǎn)方法中的能生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的例子包括紅豆杉植物，如歐洲紅豆杉(Taxus Baccata LINN)，東北紅豆杉(T.cuspidata SIEB.etZUCC),Kyaraboku(T.cuspidata SIEB.et ZUCC var.nana REHDER),Pacific yew(T.brevifolia NUTT)，加拿大紅豆杉(T.canadensis MARSH)，紅豆杉(T.chinensis)，西藏紅豆杉(T.wallichiana ZUCC)和雜種紫杉(T.media)，其中特別優(yōu)選歐洲紅豆杉和T.media。
首先，將取自紅豆杉植物部分，如根，生長(zhǎng)點(diǎn)，葉，莖，種子或等等的外植體滅菌，置于用gelan樹(shù)膠固化的木本植物培養(yǎng)基(下文稱之為“WP培養(yǎng)基”)上，在10-35℃下放置14-60天，以使組織塊的部分變成愈傷組織。次生培養(yǎng)所得的愈傷組織逐漸加快了生長(zhǎng)速率以產(chǎn)生穩(wěn)定化的愈傷組織。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化的愈傷組織”是指在培養(yǎng)過(guò)程中能保持愈傷組織狀態(tài)而不會(huì)分化成莖干或根的愈傷組織，而且所述愈傷組織的細(xì)胞具有一致的生長(zhǎng)速率。
將這種穩(wěn)定化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到適于生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基(如液體WP培養(yǎng)基)中，然后生長(zhǎng)速率被進(jìn)一步地加快(此階段的預(yù)培養(yǎng)被特別地稱為“生長(zhǎng)培養(yǎng)”)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行下列步驟中的一個(gè)或兩個(gè)以增加這些穩(wěn)定化的細(xì)胞中那些適于生產(chǎn)塔三烷型雙萜的細(xì)胞群體。
第一步，通過(guò)篩分經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞除去大細(xì)胞群體?？梢杂脼V器代替篩或者聯(lián)合使用篩和濾器進(jìn)行此除去操作。不特別地限制篩的孔徑，只要篩能除去大細(xì)胞群體即可?？紤]到改善感興趣產(chǎn)物的生產(chǎn)力的效率，優(yōu)選孔徑為1410μm或更小，更優(yōu)選840μm或更小。
由于紅豆杉植物經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的群體不呈球形，那些短軸比上述孔徑小細(xì)胞群體可穿過(guò)每個(gè)上述篩。當(dāng)孔徑為1410μm時(shí)，能穿過(guò)每個(gè)篩的細(xì)胞群體的平均直徑(以細(xì)胞群體長(zhǎng)軸和短軸的中間值表示)為1.6mm或更小，當(dāng)孔徑為840μm時(shí)，上述平均直徑為1.0mm或更小。那些能穿過(guò)孔徑為100μm的篩的，平均直徑為0.12或更小的細(xì)胞群體既可以從細(xì)胞群中除去，也可以保留，因?yàn)樗鼈兩L(zhǎng)的能力和它們生產(chǎn)塔三烷型雙萜的能力都顯著地降低。
篩分經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間可以在預(yù)培養(yǎng)的過(guò)程中，也可以在將細(xì)胞從一次預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到下一次預(yù)培養(yǎng)時(shí)?？紤]到操作的效率和經(jīng)濟(jì)，優(yōu)選在轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)篩分。優(yōu)選在生產(chǎn)塔三烷型雙萜的主培養(yǎng)之前的第2代至第10代培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程中，和/或在第2代至第10代每次培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)進(jìn)行的細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，至少進(jìn)行一次除去大細(xì)胞群體的操作。盡管可以在將細(xì)胞從預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到主培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行篩分操作，但考慮到培養(yǎng)的花費(fèi)和廢物處理的花費(fèi)，在此時(shí)篩分是不利的，因?yàn)榫o接主培養(yǎng)之前的預(yù)培養(yǎng)中細(xì)胞量大；在篩分操作過(guò)程中微生物污染的可能性也高；需棄去的大細(xì)胞群體的量也大。
WO 95/14103(EP 683232)公開(kāi)了一種方法，其中在細(xì)胞從預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到主培養(yǎng)時(shí)通過(guò)顆粒大小來(lái)分級(jí)分離細(xì)胞。然而，進(jìn)行分級(jí)分離是為了增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，此文獻(xiàn)中的方法與本發(fā)明中所用方法在思路和操作上完全不同，即由于通過(guò)篩分以增加適于生產(chǎn)塔三烷型雙萜的那些細(xì)胞群體的比率的發(fā)明效果通?？梢詮募s第2代延續(xù)到約第10代，而無(wú)需在篩分操作后轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)進(jìn)行類似的操作，因此不需要在將細(xì)胞由預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到主培養(yǎng)時(shí)再進(jìn)行此操作。
當(dāng)在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的篩分時(shí)，需從培養(yǎng)容器中將細(xì)胞取出一次以篩分?；蛘呖蓪⒑Y或?yàn)V器摻入培養(yǎng)裝置中以使大細(xì)胞群體能被自動(dòng)地除去。也可以當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中時(shí)有規(guī)律地進(jìn)行上述篩分操作，從而得到一組穩(wěn)定的小細(xì)胞群體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)培養(yǎng)”是指主要為了培養(yǎng)提供給主培養(yǎng)的種子細(xì)胞而進(jìn)行的培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)的目的是根據(jù)細(xì)胞量的增加分階段地增加培養(yǎng)規(guī)模。為了生產(chǎn)塔三烷型雙萜，通常需進(jìn)行2-10次預(yù)培養(yǎng)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“主培養(yǎng)”是指為了最終生產(chǎn)出感興趣的產(chǎn)物塔三烷型雙萜而進(jìn)行的培養(yǎng)。
第二步，在實(shí)現(xiàn)強(qiáng)攪拌的條件(下文稱之為“強(qiáng)攪拌條件”)下培養(yǎng)細(xì)胞，所述強(qiáng)攪拌條件不會(huì)傷害單個(gè)細(xì)胞，其目的是破碎大細(xì)胞群體，從而產(chǎn)生小細(xì)胞群體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“強(qiáng)攪拌條件”中所指的那些條件能破碎細(xì)胞群體，以使平均直徑通常范圍為0.12mm-1.6mm，優(yōu)選為0.12mm-1.0mm的小細(xì)胞群體的比率相對(duì)于細(xì)胞的總濕重而言變成通常為65％或更高，優(yōu)選為80％或更高。
通過(guò)增加葉輪的旋轉(zhuǎn)速度或改變?nèi)~輪的形狀，或者通過(guò)在培養(yǎng)容器中安裝擋板可達(dá)到這種攪拌條件。在用于生產(chǎn)塔三烷型雙萜的主培養(yǎng)中，或者預(yù)培養(yǎng)中，可在這種攪拌條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)周期中，可在特殊時(shí)期或整個(gè)培養(yǎng)周期中增加攪拌的強(qiáng)度。
當(dāng)細(xì)胞具有正常的細(xì)胞間粘附強(qiáng)度時(shí)，為了通過(guò)增加葉輪的旋轉(zhuǎn)速度以達(dá)到上述攪拌條件，可在30-180rpm的速度，優(yōu)選為40-120rpm的速度下，使用例如直徑為培養(yǎng)容器內(nèi)徑的1/2，高度為培養(yǎng)液體深度的1/4的槳式葉輪。
為了通過(guò)改變?nèi)~輪的形狀以達(dá)到上述振蕩條件，可使用例如空心槳式，螺旋式或渦輪式葉輪。
為了通過(guò)在培養(yǎng)容器中安裝擋板以達(dá)到上述攪拌條件，可增加從培養(yǎng)容器內(nèi)壁表面至擋板末端的直線距離，和/或增加所安裝的擋板的數(shù)目。
將所得的細(xì)胞群體提供給為了生產(chǎn)塔三烷型雙萜而進(jìn)行的主培養(yǎng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)以從上述穩(wěn)定化的細(xì)胞中得到具有有所增加的生產(chǎn)塔三烷型雙萜的潛伏能力的種子細(xì)胞。將所得種子細(xì)胞提供給主培養(yǎng)以生產(chǎn)塔三烷型雙萜。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)的潛伏能力”是指當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中時(shí)，生產(chǎn)大量塔三烷型雙萜的能力。換句話說(shuō)，此術(shù)語(yǔ)是指種子細(xì)胞的生產(chǎn)能力(接種)。
在提供加富的氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)以得到具有有所增加的生產(chǎn)塔三烷型雙萜的潛伏能力的種子細(xì)胞。
具體地說(shuō)，通過(guò)將氧對(duì)液體培養(yǎng)基的質(zhì)量傳遞體積系數(shù)(下文稱之為“kLa”)設(shè)置為10h-1或更高，優(yōu)選為15-50h-1可達(dá)到加富的氧供給。
甚至在kLa大于50h-1的條件下也可改善種子細(xì)胞的生產(chǎn)能力，然而，實(shí)踐中不優(yōu)選通過(guò)增加通氣速度和/或攪拌速度來(lái)增加kLa，因?yàn)闀?huì)出現(xiàn)問(wèn)題，如通氣使細(xì)胞上升到培養(yǎng)液的表面，并對(duì)細(xì)胞造成損害。為了測(cè)定kLa值，可使用例如下列的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在與本發(fā)明培養(yǎng)方法中所用條件相同的條件(如溫度，攪拌等)下，在液體培養(yǎng)基中加入CuSO4，所述液體培養(yǎng)基與本發(fā)明所用的培養(yǎng)基相同，不同之處在于培養(yǎng)基中不含細(xì)胞。然后，在其中通入具有特異性氧濃度的含氧氣體以測(cè)定飽和的溶解氧濃度(Cs)。隨后，加入適量的Na2SO3水溶液，或在其中通入非氧氣體如氮?dú)庖詫⑷芙庋鯘舛日{(diào)節(jié)至0-1ppm。(在使用非氧氣體的情況下，無(wú)需在液體培養(yǎng)基中加入CuSO4)隨后再次以特異性的通氣速度通入上述含氧氣體以增加溶解氧濃度。再通入含氧氣體后，分別在時(shí)間點(diǎn)t1和t2測(cè)定溶解氧濃度C1和C2。然后通過(guò)下式測(cè)定某些條件下的kLa(使用其中C1和C2的范圍都是3-5ppm的那些數(shù)據(jù))1nCs-C1Cs-C2=KLa(t2-t1)]]>一般情況下，kLa的值取決于通氣速度，攪拌速度等等。
控制kLa的方法包括對(duì)瓶培養(yǎng)而言，增加或減少培養(yǎng)液，改變振蕩方法(旋轉(zhuǎn)類型或活塞類型)，增加或降低振蕩速度等等；對(duì)罐培養(yǎng)而言，改變罐的形狀，增加或減少通氣量，改變攪拌器的位置或氣體噴嘴的直徑，安裝擋板，改變?nèi)~輪的形狀和旋轉(zhuǎn)速度等等。對(duì)罐培養(yǎng)而言，在這些方法中，優(yōu)選增加或減少通氣量和改變?nèi)~輪的旋轉(zhuǎn)速度作為控制kLa的方法。
在瓶培養(yǎng)和罐培養(yǎng)中，常規(guī)使用的kLa值低于10h-1。盡管特別地使用了超過(guò)10h-1的值，但它們被用于主培養(yǎng)中。通過(guò)將預(yù)培養(yǎng)的kLa設(shè)置在顯得比主培養(yǎng)中的后的上述范圍中而達(dá)到的效果是未知的。
另外，優(yōu)選將預(yù)培養(yǎng)中的kLa設(shè)置得比主培養(yǎng)中的高。
通過(guò)將用于培養(yǎng)細(xì)胞的液體培養(yǎng)基中的飽和氧濃度(下文稱之為“DO”)維持在30-90％，優(yōu)選50-75％可達(dá)到加富的氧供給的第二條件。由于DO受細(xì)胞的呼吸速率以及kLa的影響，所以不可能僅僅簡(jiǎn)單地通過(guò)通氣速度和攪拌速度來(lái)控制DO。然而，通過(guò)自動(dòng)地增加或降低通氣速度或者增加或降低通入氣體中氧氣的濃度，同時(shí)用氧電極等監(jiān)測(cè)培養(yǎng)溶液中的DO，即可控制DO。
在本發(fā)明中，通過(guò)將kLa和/或DO設(shè)置在上述范圍中，以改善種子細(xì)胞的生產(chǎn)能力的預(yù)培養(yǎng)如果在主培養(yǎng)前通常進(jìn)行直至10次傳代，即可在主培養(yǎng)中顯示出效果。當(dāng)進(jìn)行的預(yù)培養(yǎng)在時(shí)間上與主培養(yǎng)越接近時(shí)，這種預(yù)培養(yǎng)的效果越強(qiáng)烈。緊接主培養(yǎng)之前進(jìn)行這種預(yù)培養(yǎng)最適合。
塔三烷型雙萜并不受特別地限制，只需具有塔三烷骨架即可。具體的例子包括紅豆杉醇，10-脫乙酰紅豆杉醇，7-表紅豆杉醇，漿果赤霉素Ⅲ，10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ,7-表漿果赤霉素Ⅲ，三尖杉寧堿(cephalomannine)，10-脫乙酰三尖杉寧堿，7-表三尖杉寧堿，漿果赤霉素Ⅵ，塔三烷la,xylosyl三尖杉寧堿，xylosyl紅豆杉醇，紅豆杉醇C，10-脫乙酰紅豆杉醇C,taxisineⅠ,taxisineⅡ，紫杉?jí)AⅠ，紫杉?jí)AⅡ和taxagifine。
本發(fā)明中用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基的例子包括那些常規(guī)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的已知培養(yǎng)基，如Murashige ＆ Skoog培養(yǎng)基(1962),Linsmaier Skoog培養(yǎng)基(1965)，木本植物培養(yǎng)基(1981),Gamborg氏B-5培養(yǎng)基，F(xiàn)ujita等人的M-9培養(yǎng)基。
可在這些培養(yǎng)基中加入植物激素，如果必要，還可加入碳源，無(wú)機(jī)成分，維生素，氨基酸等等。至于碳源，可使用如蔗糖，麥芽糖和乳糖的二糖；如葡萄糖，果糖和半乳糖的單糖；淀粉；或適當(dāng)比例的兩種或多種這些糖源的混合物。
至于無(wú)機(jī)成分，具體的例子包括磷，氮，鉀，鈣，鎂，硫，鐵，錳，鋅，硼，銅，鉬，氯，鈉，碘和鈷。這些成分可以以下列化合物的形式被加入，如硝酸鉀，硝酸鈉，硝酸鈣，氯化鉀，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，氯化鈣，硫酸鎂，硫酸鈉，硫酸亞鐵，硫酸鐵，硫酸錳，硫酸鋅，硼酸，硫酸銅，鉬酸鈉，三氧化鉬，碘化鉀，氯化鈷等等。
至于植物激素，可使用如吲哚乙酸(IAA)，萘乙酸(NAA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的生長(zhǎng)素；和如細(xì)胞分裂素，玉米素和二氫玉米素的細(xì)胞激動(dòng)素。
至于維生素，可使用生物素，硫胺素(維生素B1)，吡哆醇(維生素B6)，泛酸，肌醇，煙酸等等。
至于氨基酸，可加入甘氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸等等。
一般情況下，所用無(wú)機(jī)成分的濃度約為0.1M-100mM；碳源濃度約為1-30g/l；植物激素濃度約為0.01-10M；維生素和氨基酸的濃度約為0.1-100mg/l。
在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)中，可使用得自上述植物的根，生長(zhǎng)點(diǎn)，葉，莖，種子，花粉，花藥，花萼等的組織塊或細(xì)胞，或通過(guò)在上述培養(yǎng)基或常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述組織塊或細(xì)胞得到的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞。
通過(guò)用如甲醇的有機(jī)溶劑提取可從所得的經(jīng)培養(yǎng)的組織，經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離出塔三烷型雙萜?；蛘?，通過(guò)使適當(dāng)?shù)奈絼┖陀袡C(jī)溶劑共存于培養(yǎng)基中也可以不斷地回收塔三烷型雙萜。
在本發(fā)明中，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入生產(chǎn)促進(jìn)劑即可進(jìn)一步地改善塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力，所述生產(chǎn)促進(jìn)劑如EP 683232中公開(kāi)的茉莉酸或茉莉酸衍生物，如甲基茉莉酸酯；EP 727492中公開(kāi)的茉莉酸的亞氨基或氨基衍生物；EP727492中公開(kāi)的coronatine或coronatine衍生物，如coronafacic acid；EP 683232中公開(kāi)的含有重金屬和/或重金屬離子的化合物；EP 683232中公開(kāi)的胺；或EP 727492中公開(kāi)的環(huán)多糖，如環(huán)糊精。
至于本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)溫度，通常使用約10-35℃，特別優(yōu)選23-28℃，因?yàn)樵谶@些溫度下可達(dá)到最大的生長(zhǎng)速率。至于培養(yǎng)周期，優(yōu)選7-42天。
當(dāng)本發(fā)明培養(yǎng)方法中使用液體培養(yǎng)基時(shí)，在完成培養(yǎng)后通過(guò)傾析或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞，然后，通過(guò)例如用有機(jī)溶劑提取從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離感興趣的塔三烷型雙萜。
至于進(jìn)一步增加本發(fā)明效果的方法，可將本發(fā)明的方法與EP 683232中公開(kāi)的方法一起使用。在后一方法中，細(xì)胞根據(jù)它們特殊的重力被分級(jí)分離成很多層，培養(yǎng)至少一層中所含的細(xì)胞。
通過(guò)在本發(fā)明中使用EP 683232中公開(kāi)的主培養(yǎng)條件也可進(jìn)一步地改善生產(chǎn)力，即通過(guò)從培養(yǎng)的最初階段起即將培養(yǎng)容器中氣體相的氧氣濃度控制在低于空氣中的氧氣濃度以進(jìn)行培養(yǎng)，或者通過(guò)從培養(yǎng)的最初階段起即將接觸組織和/或細(xì)胞的液體培養(yǎng)基中的溶解氧濃度控制在低于培養(yǎng)細(xì)胞的溫度下的飽和溶解氧濃度以進(jìn)行培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)培養(yǎng)能生產(chǎn)塔三烷型雙萜之植物的細(xì)胞即可容易地得到大量塔三烷型雙萜。
下文中，將參照以下的實(shí)施例和比較實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1預(yù)培養(yǎng)中的振蕩速度對(duì)用篩分級(jí)分離細(xì)胞群體的影響(1)預(yù)培養(yǎng)從經(jīng)2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液滅菌的雜種紫杉種子中無(wú)菌分離胚。將胚的一部分置于經(jīng)高壓滅菌器滅菌的固體WP培養(yǎng)基上(按重量計(jì)含有0.25％的gelan樹(shù)膠)，所述培養(yǎng)基中添加有濃度為10-5的α-萘乙酸。在25℃下，于黑暗中進(jìn)行靜止培養(yǎng)以得到愈傷組織。隨后，將4g(濕重)此愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有100ml經(jīng)高壓滅菌器滅菌的液體WP培養(yǎng)基的300ml燒瓶中，所述培養(yǎng)基中添加有與上述濃度相同的α-萘乙酸(下文中將所述培養(yǎng)基稱之為“標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基”)。在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進(jìn)行回轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)(放大率25mm；100rpm)。每15天將愈傷組織次生培養(yǎng)總共5次以加快生長(zhǎng)速率，如此得到的細(xì)胞被稱之為“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞”。
在與上相同的條件下，將標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到燒瓶中，在相同類型的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以170rpm的振蕩速度培養(yǎng)14天。(2)篩分使用孔徑為1410μm,840μm和500μm的不銹鋼篩，根據(jù)細(xì)胞群體的大小相繼地分級(jí)分離所得的細(xì)胞，然后，測(cè)定各個(gè)級(jí)分濕重的比率。
另一方面，為了比較，使標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞經(jīng)受相同的篩分過(guò)程而不以170rpm進(jìn)行振蕩培養(yǎng)以通過(guò)細(xì)胞群體的大小分級(jí)分離，然后，測(cè)定各個(gè)級(jí)分濕重的比率。兩次篩分過(guò)程的結(jié)果示于表1。表1以170rpm和以100rpm進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞中顆粒大小的分布(％)
實(shí)施例2得自每個(gè)顆粒大小級(jí)分之細(xì)胞的紅豆杉醇生產(chǎn)力將2g(濕重)實(shí)施例1中所得的4個(gè)級(jí)分中的每一種轉(zhuǎn)移到含有20ml標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的100ml錐瓶中，所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中含有100μM可用作塔三烷型雙萜生產(chǎn)的促進(jìn)劑的甲基茉莉酸酯。然后，在25℃下，于黑暗中，在與上述類型相同的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以100rpm的振蕩速度進(jìn)行14天振蕩培養(yǎng)(主培養(yǎng))。
完成培養(yǎng)之后，通過(guò)過(guò)濾和凍干收獲細(xì)胞，測(cè)量細(xì)胞的干重以測(cè)定每升液體培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的重量。用甲醇或類似物從干燥的愈傷組織中提取塔三烷型雙萜，通過(guò)使用高效液相層析與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品比較，定量地測(cè)定塔三烷型雙萜，從而測(cè)出紅豆杉醇的產(chǎn)量。也可以用二氯甲烷從培養(yǎng)物濾液中提取塔三烷型雙萜，隨后如上所述進(jìn)行相同的定量測(cè)定，結(jié)果示于表2。表2得自各個(gè)顆粒大小級(jí)分的細(xì)胞的紅豆杉醇生產(chǎn)力
生總產(chǎn)量(即從細(xì)胞中收獲的紅豆杉醇+從培養(yǎng)基中收獲的紅豆杉醇)計(jì)算出紅豆杉醇的產(chǎn)量。
表2表明不銹鋼篩的篩孔越小，用篩分級(jí)分離出的 那些細(xì)胞中紅豆杉醇的產(chǎn)量越高。實(shí)施例3預(yù)培養(yǎng)中的振蕩速度對(duì)紅豆杉醇生產(chǎn)的影響(1)預(yù)培養(yǎng)將4g(濕重)實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有100ml標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的300ml錐瓶中，在25℃下，于黑暗處，在與上述類型相同的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以170rpm的振蕩速度進(jìn)行14天振蕩培養(yǎng)。(2)主培養(yǎng)通過(guò)過(guò)濾從液體培養(yǎng)基中分離所得的細(xì)胞，然后將2g(濕重)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有20ml標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的100ml錐瓶中，所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基含有100μM甲基茉莉酸酯。在25℃下，于黑暗處，在與上述類型相同的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以100rpm的振蕩速度進(jìn)行14天振蕩培養(yǎng)。按與實(shí)施例2中相同的方式處理所得的細(xì)胞和培養(yǎng)基，接著測(cè)定干細(xì)胞產(chǎn)量和紅豆杉醇的產(chǎn)量。
另一方面，進(jìn)行相同的操作，不同之處在于預(yù)培養(yǎng)中旋轉(zhuǎn)振蕩器的振蕩速度被設(shè)置在100rpm和80rpm，接著測(cè)定干細(xì)胞產(chǎn)量和紅豆杉醇的產(chǎn)量。
另外，進(jìn)行相同的操作，不同之處在于預(yù)培養(yǎng)中所用的燒瓶具有用作擋板的折疊結(jié)構(gòu)以增加攪拌的強(qiáng)度(見(jiàn)圖1)。接著測(cè)定干細(xì)胞產(chǎn)量和紅豆杉醇的產(chǎn)量，結(jié)果概括于表3。表3
表3表示紅豆杉醇的產(chǎn)量隨著預(yù)培養(yǎng)中振蕩速度的增加而增加。實(shí)施例4主培養(yǎng)中的振蕩速度對(duì)紅豆杉醇生產(chǎn)的影響及其對(duì)細(xì)胞群體顆粒大小的影響將1升含有100μM甲基茉莉酸酯和100g(濕重)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到小型發(fā)酵罐中，所述發(fā)酵罐具有經(jīng)改動(dòng)的槳式葉輪，該葉輪的攪拌速度被設(shè)置成40rpm,60rpm或80rpm。在25℃下，于黑暗中將細(xì)胞培養(yǎng)14天，培養(yǎng)的同時(shí)以0.1vvm的速度通入含1％CO2的空氣。按與上述實(shí)施例2相同的方式處理所得細(xì)胞的一部分和培養(yǎng)基以測(cè)定干細(xì)胞產(chǎn)量和紅豆杉醇的產(chǎn)量。用孔徑為840μm的篩篩分剩下的細(xì)胞，測(cè)定穿過(guò)此篩的小顆粒大小細(xì)胞的比率，結(jié)果示于表4。表4
穿過(guò)孔徑為840μm的篩的細(xì)胞表4表明當(dāng)主培養(yǎng)中攪拌速度增加時(shí)，紅豆杉醇的產(chǎn)量也有所增加。另外，在那些以較高的攪拌速度培養(yǎng)的細(xì)胞中，小細(xì)胞群體占細(xì)胞總濕重的比率也增加了。實(shí)施例5用篩分級(jí)分離細(xì)胞群體對(duì)紅豆杉醇生產(chǎn)的影響從實(shí)施例1中所述的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞中除去能穿過(guò)孔徑為1410μm或840μm的不銹鋼篩的細(xì)胞群體，然后通過(guò)過(guò)濾從液體培養(yǎng)基中分離出剩下的細(xì)胞。將4g(濕重)所得細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有100ml標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的300ml錐瓶中，在25℃下，于黑暗處，在與上述類型相同的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以100rpm的振蕩速度進(jìn)行14天振蕩培養(yǎng)。通過(guò)過(guò)濾從液體培養(yǎng)基中分離出所得的整個(gè)細(xì)胞。將2g所得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有20ml標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的100ml錐瓶中，所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基含有100μM甲基茉莉酸酯。在25℃下，于黑暗處，在與上述類型相同的旋轉(zhuǎn)振蕩器上，以100rpm的振蕩速度進(jìn)行14天振蕩培養(yǎng)。按與實(shí)施例2中相同的方式處理所得的細(xì)胞和培養(yǎng)基，接著測(cè)定干細(xì)胞產(chǎn)量和紅豆杉醇的產(chǎn)量，結(jié)果示于表5。
另一方面，按與上述相同的方式處理標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，不同之處在于無(wú)需用篩除去大細(xì)胞群體，然后測(cè)定干細(xì)胞產(chǎn)量和紅豆杉醇的產(chǎn)量，結(jié)果示于表5。表5每個(gè)細(xì)胞群體組的紅豆杉醇產(chǎn)量
由總產(chǎn)量(即從細(xì)胞中收獲的紅豆杉醇+從培養(yǎng)基中收獲的紅豆杉醇)計(jì)算出紅豆杉醇的產(chǎn)量。
表5表明在預(yù)培養(yǎng)中轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)，用較小孔徑的篩分級(jí)分離的細(xì)胞能生產(chǎn)更多的紅豆杉醇。實(shí)施例6用500μm或更小孔徑的篩分級(jí)分離出的細(xì)胞中的顆粒大小分布，和所得級(jí)分中的紅豆杉醇生產(chǎn)力按與實(shí)施例1中相同的方式篩分實(shí)施例1中所得的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，不同之處在于使用了孔徑為500μm,250μm和100μm的篩。測(cè)定每個(gè)所得級(jí)分中細(xì)胞濕重的比率，結(jié)果示于表6。表6以170rpm和以100rpm進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞中顆粒大小的分布(％)
用顯微鏡檢查能穿過(guò)100μm篩的那些細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論振蕩速度如何，這些細(xì)胞都是變成褐色或其碎片的老化細(xì)胞群，盡管也可觀察到很少的由1-10個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞簇。按與實(shí)施例2中相同的方式重新培養(yǎng)這些細(xì)胞，但一點(diǎn)也未觀察到新的細(xì)胞生長(zhǎng)或塔三烷型雙萜的產(chǎn)生。
因此，盡管實(shí)施例2中證實(shí)了用500μm篩分級(jí)分離的級(jí)分具有改善的紅豆杉醇生產(chǎn)力，但其中所含的能穿過(guò)100μm篩的那些細(xì)胞被認(rèn)為是不適于生產(chǎn)本發(fā)明的塔三烷型雙萜。實(shí)施例7預(yù)培養(yǎng)中kLa的影響(1)預(yù)培養(yǎng)從經(jīng)2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液滅菌的雜種紫杉種子中無(wú)菌分離胚。將胚的一部分置于經(jīng)高壓滅菌器滅菌的固體WP培養(yǎng)基上(按重量計(jì)含有0.25％的gelan樹(shù)膠)，所述培養(yǎng)基中添加有濃度為10-5的α-萘乙酸。在25℃下，于黑暗中進(jìn)行靜止培養(yǎng)以得到愈傷組織。隨后，將4g(濕重)此愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有100ml經(jīng)高壓滅菌器滅菌的液體WP培養(yǎng)基的300ml燒瓶中，所述培養(yǎng)基中添加有與上述濃度相同的α-萘乙酸，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進(jìn)行回轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)(放大率25mm；100rpm)。每14天對(duì)愈傷組織進(jìn)行一次次生培養(yǎng)以加快生長(zhǎng)速率(如此得到的細(xì)胞被稱之為“標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞”)。除非另有說(shuō)明，下文中的振蕩培養(yǎng)條件與上述相同。
將所得標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有15ml或20ml液體WP培養(yǎng)基的100ml錐瓶中，以使細(xì)胞密度為40mg(濕重)/ml，并培養(yǎng)14天(預(yù)培養(yǎng))。
通過(guò)上述方法計(jì)算上述每個(gè)體積培養(yǎng)基的kLa值，結(jié)果，當(dāng)培養(yǎng)基為15ml時(shí)，kLa值為21h-1，當(dāng)培養(yǎng)基為20ml時(shí)，kLa值為16h-1。
通過(guò)真空過(guò)濾從每個(gè)燒瓶中回收細(xì)胞，將其中的一部分提供給主培養(yǎng)作為種子細(xì)胞，將剩下的細(xì)胞凍干。測(cè)量細(xì)胞的干重以測(cè)定每升液體培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的重量，接著計(jì)算細(xì)胞的產(chǎn)量。
另一方面，將一部分所得細(xì)胞凍干，然后用甲醇或類似物從中提取塔三烷型雙萜，通過(guò)使用高效液相層析與標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品比較，定量地測(cè)定雙萜，從而測(cè)出紅豆杉醇和漿果赤霉素Ⅲ的產(chǎn)量。也可以用二氯甲烷從培養(yǎng)基中提取塔三烷型雙萜，隨后如上所述進(jìn)行相同的定量測(cè)定，將所得的量與提取自細(xì)胞的塔三烷型雙萜的量相加，結(jié)果示于表7。(2)主培養(yǎng)通過(guò)下列步驟進(jìn)行主培養(yǎng)，首先，在Nunc Multidish(Nunc公司)的每個(gè)孔中加入4ml含有100μM甲基茉莉酸酯(JA-Me)的液體WP培養(yǎng)基和500mg(濕重)上述種子細(xì)胞，按與上述相同的方式振蕩培養(yǎng)14天(主培養(yǎng))。作為對(duì)照，在無(wú)JA-Me的液體WP培養(yǎng)基中按與上述相同的方式培養(yǎng)細(xì)胞。
完成培養(yǎng)之后，用吸管回收培養(yǎng)基，凍干孔中剩下的細(xì)胞，測(cè)量細(xì)胞的干重以測(cè)定每升液體培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的重量，接著計(jì)算細(xì)胞的產(chǎn)量。按與上述相同的方式提取塔三烷型雙萜，隨后進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果示于表8，主培養(yǎng)中的kLa為5h-1。比較實(shí)施例1按與實(shí)施例7相同的方式進(jìn)行操作，不同之處在于當(dāng)預(yù)培養(yǎng)中第一次轉(zhuǎn)移標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞時(shí)，100ml燒瓶中的培養(yǎng)基體積為30ml或40ml，結(jié)果示于表7和8。當(dāng)培養(yǎng)基為30ml時(shí)，通過(guò)與上述相同的方法測(cè)定的kLa值為9h-1，當(dāng)培養(yǎng)基為40ml時(shí)，測(cè)定的kLa值為6h-1。
表7(預(yù)培養(yǎng)后)
表8(滿刻度培養(yǎng)之后)
“+”表示加JA-Me，“-”表示不加JA-Me。
如表7所示，我們清楚地認(rèn)識(shí)到預(yù)培養(yǎng)中的kLa對(duì)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)得到的細(xì)胞量(細(xì)胞產(chǎn)量)或塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力(紅豆杉醇和漿果赤霉素Ⅲ的產(chǎn)量)沒(méi)有影響。
另一方面，如表8所示，我們認(rèn)識(shí)到盡管預(yù)培養(yǎng)中的kLa對(duì)預(yù)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)得到的細(xì)胞量(細(xì)胞產(chǎn)量)沒(méi)有影響，但對(duì)塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力(紅豆杉醇和漿果赤霉素Ⅲ的產(chǎn)量)有顯著的影響，即實(shí)施例7中塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力(紅豆杉醇和漿果赤霉素Ⅲ的產(chǎn)量)顯著增加。另外，在含有JA-Me的培養(yǎng)基中生產(chǎn)力得以進(jìn)一步地提高。實(shí)施例8預(yù)培養(yǎng)中kLa的影響(1)預(yù)培養(yǎng)將1.6升液體WP培養(yǎng)基和64g(濕重)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小型發(fā)酵罐中，所述發(fā)酵罐具有經(jīng)改動(dòng)的槳式葉輪，該葉輪的攪拌速度被設(shè)置成70rpm，在25℃下，于黑暗中將細(xì)胞培養(yǎng)14天，培養(yǎng)的同時(shí)以0.05vvm或0.1vvm的速度通入含1％CO2的空氣。
通過(guò)真空過(guò)濾從所得的培養(yǎng)物中回收細(xì)胞，將全部的量用于隨后的主培養(yǎng)中作為種子細(xì)胞。(2)主培養(yǎng)在與上述類型相同的小型發(fā)酵罐中加入種子細(xì)胞和1.5升含有100μM甲基茉莉酸酯的液體WP培養(yǎng)基。進(jìn)行主培養(yǎng)的同時(shí)以0.05vvm的速度通入與預(yù)培養(yǎng)中所用的相同的氣體，其它培養(yǎng)條件和培養(yǎng)周期與預(yù)培養(yǎng)中相同。
按與實(shí)施例7中相同的方式定量地測(cè)定所得細(xì)胞和培養(yǎng)基中所含的塔三烷型雙萜。通過(guò)上述方法測(cè)定每個(gè)通氣條件下的kLa值，這里需注意甚至在相同的通氣速度下，預(yù)培養(yǎng)中的kLa也比主培養(yǎng)中的高，原因是預(yù)培養(yǎng)中每個(gè)小型發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的量較大，給出較高的液體深度(通氣速度0.05vvm；預(yù)培養(yǎng)中的kLa:22h-1；主培養(yǎng)中的kLa:19h-1)，結(jié)果示于表9。比較實(shí)施例2按與實(shí)施例8相同的方式進(jìn)行操作，不同之處在于預(yù)培養(yǎng)中對(duì)小型發(fā)酵罐的通氣速度為0.02vvm，結(jié)果示于表9。
表9(主培養(yǎng)后)
如表9所示，我們認(rèn)識(shí)到預(yù)培養(yǎng)中的kLa對(duì)主培養(yǎng)結(jié)束時(shí)塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力(紅豆杉醇和漿果赤霉素Ⅲ的產(chǎn)量)有顯著的影響，即實(shí)施例8中塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力顯著提高。
出乎意料地是，kLa或DO在預(yù)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)不會(huì)影響所得細(xì)胞的量(細(xì)胞產(chǎn)量)或塔三烷型雙萜的生產(chǎn)力(紅豆杉醇和漿果赤霉素Ⅲ的產(chǎn)量)，而是特異性地影響細(xì)胞生產(chǎn)這些雙萜的潛伏能力。
權(quán)利要求
1．通過(guò)培養(yǎng)能生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法，所述方法包括下列步驟(a)和(b)中的一個(gè)或兩個(gè)以增加其大小適于生產(chǎn)雙萜的那些細(xì)胞群體的比率(a)在預(yù)培養(yǎng)用以提供給主培養(yǎng)以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的細(xì)胞的過(guò)程中，或在細(xì)胞從一次預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到下一次預(yù)培養(yǎng)時(shí)，用篩和/或?yàn)V器進(jìn)行至少一次操作以除去大細(xì)胞群體；(b)在劇烈攪拌條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
2．權(quán)利要求1的方法，其中適于生產(chǎn)雙萜的細(xì)胞群體的平均直徑范圍為0.12mm-1.6mm，所述平均直徑以所述細(xì)胞群體的長(zhǎng)軸和短軸之間的中間值表示。
3．權(quán)利要求1的方法，其中適于生產(chǎn)雙萜的細(xì)胞群體的平均直徑范圍為0.12mm-1.0mm，所述平均直徑以所述細(xì)胞群體的長(zhǎng)軸和短軸之間的中間值表示。
4．權(quán)利要求1的方法，其中相對(duì)于細(xì)胞的總濕重而言，其大小適于生產(chǎn)雙萜的細(xì)胞群體的比率增加到65％或更高。
5．權(quán)利要求1的方法，其中相對(duì)于細(xì)胞的總濕重而言，其大小適于生產(chǎn)雙萜的細(xì)胞群體的比率增加到80％或更高。
6．權(quán)利要求1的方法，其中在生產(chǎn)塔三烷型雙萜的主培養(yǎng)之前的第2代至第10代培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程中，和/或在所述第2代至第10代每次培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)進(jìn)行的細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，至少進(jìn)行一次步驟(a)的操作。
7．通過(guò)培養(yǎng)能生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法，所述方法包括在氧供給的條件下在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，其中氧對(duì)液體培養(yǎng)基的質(zhì)量傳遞體積系數(shù)(kLa)為10h-1或更高；將所得細(xì)胞提供給主培養(yǎng)以生產(chǎn)塔三烷型雙萜；和從所得培養(yǎng)物中回收塔三烷型雙萜。
8．權(quán)利要求7的方法，其中kLa的范圍為15h-1-50h-1。
9．權(quán)利要求7的方法，其中預(yù)培養(yǎng)中的kLa比主培養(yǎng)中的kLa高。
10．通過(guò)培養(yǎng)能生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法，所述方法包括在將液體培養(yǎng)基中的溶解氧濃度(DO)維持在培養(yǎng)所用溫度下的飽和氧濃度的30％或更高的條件下，在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞；將所得細(xì)胞提供給主培養(yǎng)以生產(chǎn)塔三烷型雙萜；和從所得培養(yǎng)物中回收塔三烷型雙萜。
11．權(quán)利要求10的方法，其中液體培養(yǎng)基的DO維持在培養(yǎng)所用溫度下的飽和氧濃度的50％或更高。
12．權(quán)利要求1,7或10的方法，其中塔三烷型雙萜是選自下列組中的至少一個(gè)，所述組由下列物質(zhì)組成紅豆杉醇，10-脫乙酰紅豆杉醇，7-表紅豆杉醇，漿果赤霉素Ⅲ,10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ,7-表漿果赤霉素Ⅲ，三尖杉寧堿，10-脫乙酰三尖杉寧堿，7-表三尖杉寧堿，漿果赤霉素Ⅵ，塔三烷1a,xylosyl三尖杉寧堿，xylosyl紅豆杉醇，紅豆杉醇C，10-脫乙酰紅豆杉醇C,taxisineI,taxisineⅡ，紫杉?jí)AⅠ，紫杉?jí)AⅡ和taxagifine。
13．權(quán)利要求1,7或10的方法，其中能生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物是屬于紅豆杉屬的植物。
14．權(quán)利要求13的方法，其中屬于紅豆杉屬的植物是雜種紫杉或歐洲紅豆杉。
15．權(quán)利要求1,7或10的方法，其中在主培養(yǎng)中使用了茉莉酸衍生物或coronatine衍生物以用作塔三烷型雙萜生產(chǎn)的促進(jìn)劑。
16．權(quán)利要求15的方法，其中茉莉酸衍生物是選自下列組中的至少一種，所述組由下列物質(zhì)組成茉莉酸，茉莉酸的烷基酯，和茉莉酸的亞氨基或氨基衍生物。
17．權(quán)利要求15的方法，其中coronatine衍生物是coronatine和/或coronafacic acid。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)培養(yǎng)能生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法,所述方法包括下列步驟(a)和(b)中的一個(gè)或兩個(gè)以增加其大小適于生產(chǎn)雙萜的那些細(xì)胞群體的比率:(a)在預(yù)培養(yǎng)用以提供給主培養(yǎng)以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的細(xì)胞的過(guò)程中,或在細(xì)胞從一次預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到下一次預(yù)培養(yǎng)時(shí),用篩和/或?yàn)V器進(jìn)行至少一次操作以除去大細(xì)胞群體;(b)在劇烈攪拌條件下培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明還公開(kāi)了通過(guò)培養(yǎng)能生產(chǎn)塔三烷型雙萜的植物的細(xì)胞以生產(chǎn)塔三烷型雙萜的方法。
文檔編號(hào)C12P7/02GK1209431SQ9810299
公開(kāi)日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1998年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月25日
發(fā)明者行宗敬人, 松原浩一, 原康弘 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社