專利名稱：治療血液病的生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，特別是一種治療血液病的生物制劑。
現(xiàn)有治療血液病如再生障礙性貧血、白血病時(shí)，一般采用化療、放療，使患者療后產(chǎn)生白細(xì)胞減少，抵抗病毒能力下降、脫發(fā)等副作用，對(duì)人體健康有害。在藥物治療上一般采用雄性激素、左旋咪唑、氨太素、康力龍、生血片等，其治愈率較低、副作用較大，且藥價(jià)昂貴。
本發(fā)明目的是提供一種治療血液病的生物制劑，能明顯改善骨髓造血功能，促進(jìn)血液中紅、白細(xì)胞同時(shí)增長(zhǎng)，血小板數(shù)及吞噬細(xì)胞的活性明顯增長(zhǎng)，以增加人體抵抗力。該制劑對(duì)各種原因引起的白細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血、白血病及因放療、化療導(dǎo)致的紅、白血球減少癥有顯著療效，且該制劑制做簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉。
本發(fā)明目的是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。該治療血液病的生物制劑是在發(fā)酵液中加入菌種，經(jīng)發(fā)酵工藝制成的，包括以下程序A、制作發(fā)酵液。該發(fā)酵液組成為在1000毫升蒸餾水中加入蛋白胨5-10克，酵母膏0.8-1.3克，蔗糖6-8克，氯化鈉8-12克，甘露醇6-10克，將上述組分混合、加熱、攪拌，使其溶解并過(guò)濾，調(diào)節(jié)PH值在7.2-7.8，再過(guò)濾、滅菌，在無(wú)菌條件下，在35-39℃下經(jīng)24-48小時(shí)，制成發(fā)酵液。
B、收集菌種。將自然環(huán)境中存在的沙雷氏菌收集并分離出來(lái)，并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌種，它具有以下特點(diǎn)(與沙雷氏菌生物A型比較)為紅色小菌落，用革蘭氏染色法檢驗(yàn)顯革蘭氏陰性小桿菌，在L-阿拉伯膠糖中不發(fā)酵。
1、生物特性(1)鏡檢形態(tài)G-短小桿菌，長(zhǎng)0.5-1.0μm，寬0.5μm，有周身鞭毛，有微莢膜，無(wú)穿胞。
(2)菌落形態(tài)園形、濕潤(rùn)、光滑，邊緣整齊，不透明，呈淺紅、紅或深紅色。
(3)生物型屬沙雷氏菌生物A型，在L-阿拉伯膠糖中不發(fā)酵。
(4)生化反應(yīng)對(duì)甲基紅呈陰性，對(duì)枸櫞酸鹽、VP、賴氨酸、烏氨酸、明膠、蔗糖、甘露醇、水楊苷、蕈糖、麥芽糖、果糖、七葉苷、觸酶均呈陽(yáng)性反應(yīng)，有活力。用革蘭氏法檢驗(yàn)為呈革蘭氏陰性小桿菌。
(5)對(duì)于抗生素的敏感性高敏反應(yīng)的有慶大霉素、羅美沙星、阿羅西林、氟呱酸、氯霉素、壯觀霉素、吡哌酸、鏈霉素、丁氨卡那霉素、羧基青霉素、頭孢哌酮。低敏反應(yīng)的有頭孢唑啉、氨基青霉素、青霉素、頭孢噻吩卡那霉素、利痛平、新霉素、
唑青霉素、麥迪霉素、桿菌肽。
(6)溶解性100-120℃時(shí)易容于水，在苦味酸鹽中的溶點(diǎn)為173-176℃。
(7)PH值為6-7，在酸性環(huán)境中易變紅。
(8)CO2培養(yǎng)25-37℃生長(zhǎng)良好，厭氧環(huán)境下生長(zhǎng)不良。相對(duì)密度為1.014。
(9)DNAG+C克分子量％為52-60。
2、理化指標(biāo)(1)干燥固型物p(B)/(g.L-1);79.1，(2)砷p(AS)/(mg.L-1):(0.2，(3)汞ω(Hg)/(mg.Kg-1):(0.012，(4)鉛p(Pb)/(mg.L-1):(0.1，(5)紫外可見掃描最大吸收波長(zhǎng)λmax=257.5nm線性關(guān)系ψ(B)/(以原液計(jì)％)0.1～5.0濃度范圍內(nèi)γ=0.99989a=0.0247b=0.507上述菌種已于97年7月28日交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC NO.0314，分類命名為粘質(zhì)沙雷氏菌生物A型，拉丁文為Serratiamarcescens tgpe A。
c、制做藥劑。將上述程序A制做的發(fā)酵液中接入由程序B制做的菌種，一并放入培養(yǎng)箱中在35-39℃經(jīng)24-48小時(shí)發(fā)酵成為紅色菌液。將該菌液濃縮過(guò)濾，分裝瓶?jī)?nèi)，經(jīng)高壓滅菌即成藥劑。
下面以本發(fā)明產(chǎn)品紅色靈菌素做為實(shí)施例做具體介紹。
實(shí)施例1紅色靈菌素制劑的制備。
A、制做發(fā)酵液。在1000毫升蒸餾水中另入水解蛋白胨8克，酵母膏1克，蔗糖7克，氯化鈉10克，甘露醇10克，將上述組分混合熱攪拌，使其溶于水中，過(guò)濾去渣；調(diào)節(jié)PH值為7.5；再過(guò)濾滅菌，在37℃下，經(jīng)24小時(shí)，制成發(fā)酵液。
B、準(zhǔn)備菌種。將收集分離出的沙雷氏菌在無(wú)菌條件下放在MH瓊脂平板上，在37℃下保持24小時(shí)，生出粘質(zhì)紅色小菌落，用革蘭氏染色法檢驗(yàn)呈革蘭氏陰性小桿菌，將該菌放入無(wú)菌的培養(yǎng)基中保存。該培養(yǎng)基可由下列組分配制牛肉膏3克蛋白胨10克氯化鈉5克瓊脂5克蒸餾水1000毫升將上述組分溶解、調(diào)PH值為7.4-7.6，過(guò)濾滅菌即成。
C、制做藥劑。將用程序A制成的發(fā)酵液中接入用程序B制做的菌種，接種量為每毫升10億的菌種液1-10毫升加入到1000毫升發(fā)酵液中。將二者一并放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃下，經(jīng)24小時(shí)，發(fā)酵成為紅色的菌液，將其濃縮到原體積的20％，并經(jīng)離心抽濾，分裝在100毫升的瓶?jī)?nèi)。經(jīng)高壓蒸汽滅菌30分鐘，或經(jīng)煮沸滅菌30分鐘，制成紅色靈菌素。
實(shí)施例2紅色靈菌素急性毒性實(shí)驗(yàn)藥物紅色靈菌素，高壓消毒(紅色靈菌素1)，煮沸消毒(紅色靈菌素2)，共二批。為保證二批藥物樣品濃度一致，藥物用紫外分光光度計(jì)比色后，按1∶1將兩批藥物混合，經(jīng)比色使之與第一批藥物濃度一致。然后將藥物蒸發(fā)濃縮。
動(dòng)物昆明小鼠，體重20±2克。
方法采用腹腔給藥，每一劑量組10只動(dòng)物，共設(shè)4-6組，組間劑量比分別為0.64-0.8，觀察24～48小時(shí)死亡情況。按寇式法計(jì)算LD50及95％可信限。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表1表1．紅色靈菌素LD50
小結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高壓消毒的樣品毒性明顯小于煮沸消毒的樣品，兩樣品LD50相差1倍以上，按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，LD50大于1.0g/kg或1.0ml/kg，均屬于低毒藥物因此，高壓消毒和煮沸消毒的樣品均為低毒品。
實(shí)施例3紅色靈菌素對(duì)小鼠血像的影響藥物劑量紅色靈菌素1和2，經(jīng)5000rpm離心5分鐘，取上清液經(jīng)0.22um的濾膜過(guò)濾除菌備用。紅色靈菌素1(高壓消毒)采用13.6ml/kg和20ml/kg兩個(gè)劑量(分別為L(zhǎng)D50的1/5和1/3)；紅色靈菌素2(煮沸消毒)采用5ml/kg和7ml/kg兩個(gè)劑量(分別為L(zhǎng)D50的1/7和1/5)。動(dòng)物用BALB/c小鼠，體重20±2克，按上述劑量分組，每組6只動(dòng)物，腹腔給藥后分別于第1、3、5、7和9計(jì)數(shù)白細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和白細(xì)胞分類。結(jié)果見表2。
表2紅色靈菌素對(duì)小鼠血像的影響給藥后 紅色靈菌素1 紅色靈菌素2時(shí)間劑量 WBC Rt 劑量 WBC Rt0天13.613.8±2.17 -5.014.3±3.10 1.9±0.5020.010.7±2.95 2.1±0.37 7.016.3±2.16 2.3±0.271天13.621.4±4.17 -5.014.7±1.33 2.5±1.1520.080.2±11.56 0.7±0.89 7.024.7±2.51 5.2±0.833天13.623.0±4.78 -5.027.1±9.82 3.7±1.4520.033.8±13.37 2.8 ±0.80 7.032.8±8.87 3.4±0.805天13.6 - -5.051.0±26.54 5.2±1.7820.017.1±29.6 3.6±0.66 7.033.6±11.46 6.6±3.307天13.616.2±3.21 -5.016.8±5.23 6.7±3.0420.017.9±2.96 6.6±0.99 7.018.2±3.51 7.0±2.029天13.614.7±2.45 -5.016.5±2.80 7.5±3.5320.012.2±2.22 8.8±1.00 7.017.3±3.24 9.2±2.73小結(jié)和討論結(jié)果表明，紅色靈菌素1和2對(duì)小鼠血象有明顯影響，給藥后第一天，白細(xì)胞即明顯增加，可達(dá)給藥前的2倍以上，直到第5天仍明顯升高，最高可達(dá)給藥前的5-6倍，第7天后逐漸下降，至第9天基本恢復(fù)正常。網(wǎng)織紅細(xì)胞的升高晚于白細(xì)胞，但是持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，至第9天基本仍高于正常，可達(dá)正常值的3-4倍。白細(xì)胞分類中以中性分葉核粒細(xì)胞為主，可達(dá)60％以上(是正常比例的1.5倍)早期伴有一過(guò)性單核細(xì)胞比例增加。對(duì)血象的作用，紅色靈菌素1強(qiáng)于紅色靈菌素2。在預(yù)試中，紅色靈菌素1和2對(duì)白細(xì)胞都有刺激作用；為了排除死菌的影響，本實(shí)驗(yàn)采用離心、過(guò)濾除菌的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也獲得同樣結(jié)果，表明作用是一種可溶性物質(zhì)。
實(shí)施例4紅色靈菌素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響藥物劑量紅色靈菌素1(高壓消毒)制備如上述；按20ml/kg腹腔給藥紅色靈菌素2(煮沸消毒)；制備如上述；按7ml/kg腹腔給藥對(duì)照生理鹽水適量。動(dòng)物昆明小鼠，體重22±2g方法1.墨汁的制備用5.0ml生理鹽水置于干凈平皿里，用優(yōu)質(zhì)墨研磨3分鐘過(guò)濾備用。
2.分別給實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物腹腔注射紅色靈菌素1、2和生理鹽水，次日腹腔注入0.2ml墨汁，2小時(shí)后再注入1ml生理鹽水，1分鐘后抽腹水，涂片。結(jié)果如表3所示表3紅色靈菌素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響
小結(jié)紅色靈菌素1和2均有明顯促進(jìn)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬作用尤以紅色靈菌素2更為顯著。經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，P＜0.01。此外，還發(fā)現(xiàn)紅色靈菌素1和2注射后，腹水中含大量的分葉核粒細(xì)胞。
總結(jié)1．紅色靈菌素1和2兩樣品的LD50均大于1.0ml/kg，均屬于低毒藥物2．紅色靈菌素有明顯刺激白細(xì)胞增加的作用，分類計(jì)數(shù)以中性分葉核粒細(xì)胞為主；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)網(wǎng)織紅細(xì)胞也有明顯增加，表明紅色靈菌素對(duì)粒系和紅色造血均有明顯的刺激作用，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
3．紅色靈菌素1和2均有明顯促進(jìn)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬活性。
以上的實(shí)施例2、3、4源自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液研究所的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。
臨床效果自96年以來(lái)臨床應(yīng)用口服本發(fā)明制劑紅色靈菌素，治療各種血液疾病20例，取得明顯效果。用藥方法為口服本發(fā)明制劑30毫升/次，早晚各一次，空腹服藥。療效判斷分為痊愈、顯效、進(jìn)步、無(wú)效四種。結(jié)果為(1)再生障礙性貧血7例，均有半年以上的長(zhǎng)期口服西藥史，包括雄性激素、左旋咪唑、氨肽素、再障生血片等；其中3例曾肌肉注射呀秋堿達(dá)3個(gè)月，病情無(wú)好轉(zhuǎn)；采用本制劑紅色靈菌素治療，其中1例僅3個(gè)月即痊愈；1例并用中草藥益氣生血藥亦痊愈；4例顯效，1例進(jìn)步
(2)3例單純白細(xì)胞減低、白塞氏病、過(guò)敏性紫癜，單服本制劑1-3個(gè)月均獲痊愈。
(3)白血病4例。其中2例顯效，另2例無(wú)效。
(4)放射療、化療后白細(xì)胞減少病6例，其中5例顯效，1例進(jìn)步。此外，本制劑對(duì)其它病癥的效果有待臨床報(bào)告。
權(quán)利要求
1．一種治療血液病的生物制劑，其特征是它由以下程序制成A、制作發(fā)酵液。該發(fā)酵液由以下組分按重量比例組成蛋白胨5-10酵母膏0.8-1.3蔗糖6-8 氯化鈉8-12甘露醇6-10蒸餾水1000將上述組分混合、加熱、攪拌，使其溶解并過(guò)濾，調(diào)節(jié)PH值為7.2-7.8，再過(guò)濾滅菌，在無(wú)菌條件下，在35-39℃經(jīng)24-48小時(shí)，制成該發(fā)酵液；B、準(zhǔn)備菌種。將自然環(huán)境中存在的沙雷氏菌收集分離，在無(wú)菌條件下放在MH瓊脂平板上，在35-39℃下保持24-48小時(shí)，發(fā)出粘質(zhì)紅色小菌落，即為菌種，放入無(wú)菌的培養(yǎng)基中保存；C、制做藥劑。在A程序制成的發(fā)酵液中接入B程序的菌種，放入培養(yǎng)箱，在35-39℃下，經(jīng)24-48小時(shí)，發(fā)酵成紅色菌液，將該菌液濃縮、過(guò)濾、分裝、滅菌制成該制劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療血液病的生物制劑，其特征是在程序1A中所述的蛋白胨為水解蛋白胨。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療血液病的生物制劑，其特征是在程序1C中所述的滅菌為高壓蒸汽滅菌30分鐘。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療血液病的生物制劑，其特征是在程序1C中所述的滅菌為沸水中煮滅菌30分鐘。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療血液病的生物制劑，其特征是在程序1B中所述的粘質(zhì)紅色小菌落為粘質(zhì)沙雷氏菌生物A型(Serratia Marcescens TgpeA)，保藏號(hào)CGMCC0314。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療血液病的生物制劑，其特征是在程序1B中所述的培養(yǎng)基按下列組分配制牛肉膏3克蛋白胨10克 氯化鈉5克瓊脂5克 蒸餾水1000毫升將上述組分溶解、調(diào)PH值為7.4-7.6，過(guò)濾滅菌。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療血液病的生物制劑，其特征是在程序1C中所述的接種量為將10億/ml菌種液1-10ml加入1A制成的發(fā)酵液1000ml中。
全文摘要
本發(fā)明是一種治療血液病的生物制劑,它能使血液中紅細(xì)胞增長(zhǎng),它由發(fā)酵液與菌種發(fā)酵制成,發(fā)酵液由蛋白胨、酵母膏、蔗糖、氯化鈉、甘露醇、蒸餾水混合加熱制成;菌種為沙雷氏菌生物A型,為粘質(zhì)紅色小菌落,將菌種加入到發(fā)酵液中,一起放入培養(yǎng)箱內(nèi),發(fā)酵成紅色的菌液,將該菌液濃縮、過(guò)濾、分裝、滅菌即成制劑紅色靈菌素,本制劑治療再生障礙性貧血、白血病有顯著療效,且制作簡(jiǎn)單,成本低廉。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1223864SQ98103328
公開日1999年7月28日 申請(qǐng)日期1998年7月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月28日
發(fā)明者馬家蘭, 魏美華 申請(qǐng)人:馬家蘭