專利名稱：表達(dá)可被蛋白酶激活的活性物質(zhì)的核酸構(gòu)建體和其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)可以被蛋白酶激活的活性物質(zhì)的核酸構(gòu)建體，其制備方法和用途。
類似炎癥的區(qū)域，腫瘤可以通過實(shí)質(zhì)上增加蛋白酶的形成和分泌與周圍的正常組織相區(qū)別[Schmitt等，F(xiàn)ibrinol.6，3(1992)，Cottam等，Int.J.Oncol.2，861(1993)，Tryggvason等，乳腺癌研究與治療.24，209(1993)，Leto等，抗癌研究.12，235(1992)，Hart，F(xiàn)ibrinol.6，11(1992)，Albini等，J.Natl.Cancer Inst.83，735(1991)]這些蛋白酶的例子是纖溶酶原激活物、組織蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶。
這些腫瘤蛋白酶的必需功能是溶解胞外基質(zhì)，使得腫瘤細(xì)胞可以侵入正常組織并以滲透性方式在其中生長(zhǎng)。這些蛋白酶保護(hù)腫瘤使之不受身體防御機(jī)制的作用，因?yàn)榉烙璧幕钚曰衔锉荒[瘤形成的蛋白酶切割進(jìn)而失活。這樣，例如，抗體，細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，補(bǔ)體因子，凝固因子和調(diào)節(jié)物可以被腫瘤蛋白酶滅活。
因此，過去的目標(biāo)是通過抑制腫瘤細(xì)胞蛋白酶來抑制腫瘤的滲透性生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)以及滅活身體的防御機(jī)制[Hocman，國(guó)際生物化學(xué)雜志.24，1365(1992)，Troll等，JNCI 73，1245(1984)，Ray等，Eur.Respir.2，2062(1994)，Koop等，癌癥研究.54，4791(1994)，Chiriri等，國(guó)際癌雜志58，460(1994)，Denhardt等，59，329(1993)，Melchiori等，癌癥研究.52，2353(1992)]。然而，特別是由于化學(xué)計(jì)量和藥物動(dòng)力學(xué)上的原因，以前在抑制腫瘤細(xì)胞蛋白酶上很少取得成功。
因此嘗試進(jìn)行了利用腫瘤細(xì)胞蛋白酶激活細(xì)菌毒素如金黃色葡萄球菌α-溶血素[Panchal等，Nature Biotechn，14，852(1996)]。為此，將一種氨基酸序列(即XX-Arg-X)插入到α-溶血素的129至132位中，以這種方式產(chǎn)生非活性突變體，其僅被腫瘤蛋白酶(如組織蛋白酶B)切割，進(jìn)而被激活。
基于這些結(jié)果，提出了免疫溶素原(proimmunolysins)[Panchal等，Nature Biotechn，14，852(1996)]，這些免疫溶素原包括抗體，其連接到金黃色葡萄球菌α-溶血素(可以由腫瘤蛋白酶激活)或海葵equinatoxinII上，用抗體測(cè)定連接產(chǎn)物的靶細(xì)胞特異性。
然而，就其在腫瘤治療中的用途而言，所提出的概念具有下列缺點(diǎn)首先，作者選擇xenogeneic nonendogenous溶素和/或毒素，其對(duì)宿主有機(jī)體(患者)是免疫原性的，結(jié)果在宿主有機(jī)體中引起免疫反應(yīng)，這一免疫反應(yīng)中和和滅活抗體/毒素綴合物。
第二，已知[Sedlacek等，作為細(xì)胞毒性載體的抗體.Contrib.toOncol.43，Karger Verlag，慕尼黑，1992]由于它們的分子大小和在腫瘤上的流變學(xué)條件，腫瘤-特異性抗體和免疫毒素在腫瘤上僅以極小的量(0.01-0.001％給定的抗體或免疫毒素/g腫瘤)產(chǎn)生，或者僅僅滲透到腫瘤不完全的程度，由此，其要么不可能消滅所有的腫瘤細(xì)胞，要么僅可能消滅一小部分腫瘤細(xì)胞。此外，腫瘤抗原的程度(抗體所針對(duì)的抗原)通常在個(gè)體腫瘤細(xì)胞之間的表達(dá)是不同的和可變的，抗原-陰性腫瘤細(xì)胞容易逃避抗體或免疫毒素的進(jìn)攻。除此之外，腫瘤細(xì)胞分泌的抗原中和腫瘤外周的抗體(Sedlacek等，腫瘤療法的單克隆抗體，Contrib.to Oncol.，Karger Verlag，1988)。
因而，仍然非常需要對(duì)腫瘤和炎癥的靶細(xì)胞-特異性療法。因此，本發(fā)明的目的是提供針對(duì)腫瘤和炎癥的活性化合物，這種活性化合物不顯示出所說的缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明涉及使用腫瘤或炎癥區(qū)域中分泌的酶以獲得活性化合物(其非活性前體在腫瘤細(xì)胞、腫瘤-相關(guān)細(xì)胞或炎性細(xì)胞中表達(dá))的局部釋放的新技術(shù)。
因此，本發(fā)明的主題的一部分是表達(dá)活性物質(zhì)的核酸構(gòu)建體，該活性物質(zhì)被哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的酶激活，這種活性物質(zhì)包括下列組分a)至少一個(gè)啟動(dòng)子元件，b)至少一種編碼活性化合物(蛋白質(zhì)B)的DNA序列，
c)至少一種編碼一種氨基酸序列(部分結(jié)構(gòu)C)的DNA序列，所說的氨基酸序列可以被從哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的酶特異性地切割，和d)至少一種編碼一種肽或蛋白質(zhì)(部分結(jié)構(gòu)D)的DNA序列，所說的肽或蛋白質(zhì)利用可切割的氨基酸序列(部分結(jié)構(gòu)C)連接到活性化合物(蛋白質(zhì)B)上并抑制活性化合物(蛋白質(zhì)B)的活性。
在它們的最簡(jiǎn)單的形式中，單獨(dú)的組分可被排列，例如，如

圖1所示的。在這種情況下，由組分b)，c)和)d)編碼的蛋白質(zhì)BCD的表達(dá)由激活啟動(dòng)子序列[組分a)]誘導(dǎo)。然后，表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列C由細(xì)胞酶(例如蛋白酶)切割，其結(jié)果是構(gòu)成活性化合物的蛋白質(zhì)B被釋放。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，蛋白酶或酶將被理解為一種或多種蛋白酶或酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所說的酶是蛋白酶，特別是纖溶酶原激活物、組織蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶。所說的哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選地是腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、滑液細(xì)胞或病毒-感染細(xì)胞。
酶最好在有機(jī)體中由腫瘤和腫瘤細(xì)胞以及炎癥過程中所涉及的細(xì)胞釋放[Barrett等，哺乳動(dòng)物蛋白酶，學(xué)術(shù)出版社，倫敦1980；Sedlacek和Mry，免疫反應(yīng)，Springer Verlag，1995)]。
因而，按照本發(fā)明，選擇組分c)，以使所表達(dá)的蛋白質(zhì)(例如BCD)優(yōu)選地在它的部分結(jié)構(gòu)C中被蛋白酶切割，所述的蛋白酶是在腫瘤中形成的或由腫瘤細(xì)胞或炎性細(xì)胞分泌的。這些蛋白酶的例子是纖溶酶原激活物，如尿激酶型纖溶酶原激活物或組織纖溶酶原激活物；組織蛋白酶，如組織蛋白酶B，組織蛋白酶D，組織蛋白酶L，組織蛋白酶E或組織蛋白酶H，或它們的前體(組織蛋白酶原)；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，如膠原酶，例如I，II，III，IV或V組；基質(zhì)溶素1，基質(zhì)溶素2或基質(zhì)溶素3；metrilysins；明膠酶，如明膠酶A(MMP2)和明膠滅原B(MMP9)和明膠酶原A[Pappot等，肺癌12，1(1995)，Schmitt等，F(xiàn)ibronolysis 614，3(1992)，Monsky等，癌生物學(xué)，4，251(1993)，Rochefort等，醫(yī)藥/科學(xué)7，30(1991)，Kao等，46，1349(1986)，F(xiàn)ridman等，癌癥研究.55，2548(1995)，Ray等，Eur.Respir.J.7，2062(1994)，Cottam等，Int.J.Oncol.2，861(1993)，Tryggvason等，乳腺癌研究和治療.24，209(1993)]；腫瘤細(xì)胞表面蛋白酶[表面表達(dá)的蛋白酶＝seprase；Monsky等，癌癥研究.54，5702(1994)]；彈性蛋白酶[Kao等，癌癥研究.46，1355(1986)]；前列腺-特異性抗原[Lundwall，生物化學(xué)生物物理研究通訊161，1151(1989)，Riegman等，生物化學(xué)生物物理研究通訊159，95(1989)]或胰蛋白酶原[Miszuk-Jamska等，F(xiàn)EBS Lett.294，175(1991)]。
依據(jù)另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案，可通過添加組分b，)延長(zhǎng)組分b)的核苷酸序列。這個(gè)組分b’)編碼配基(部分結(jié)構(gòu)B’)，該配基能夠?qū)⒒钚曰衔锝Y(jié)合到靶結(jié)構(gòu)上。組分b’)是如圖2所示排列的。與圖2相應(yīng)的核酸構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生蛋白質(zhì)，即B’BCD，其利用配基(部分結(jié)構(gòu)B’)結(jié)合到靶結(jié)構(gòu)上。然后，部分結(jié)構(gòu)C由細(xì)胞蛋白酶切割，進(jìn)而釋放活性化合物，即蛋白質(zhì)B’B。
在一特殊的實(shí)施方案中，所說的蛋白質(zhì)B和部分結(jié)構(gòu)D是部分蛋白質(zhì)活性化合物的天然前體，具有已由部分結(jié)構(gòu)C代替的天然切割序列，該序列連接部分結(jié)構(gòu)B和D；特別是，所說的部分結(jié)構(gòu)D是蛋白質(zhì)活性化合物天然前體的部分結(jié)構(gòu)。
新的核酸構(gòu)建體優(yōu)選地由DNA組成。術(shù)語″核酸構(gòu)建體″應(yīng)理解為能夠在靶細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄的人工核酸結(jié)構(gòu)。它們優(yōu)選地插入到載體中，用質(zhì)粒載體或病毒載體是特別優(yōu)選的。
取決于選擇的啟動(dòng)子元件[組分a)]，新的核酸構(gòu)建體非特異性地、細(xì)胞-特異性地、病毒-特異性地、在特定代謝條件下地、細(xì)胞周期-特異性地或在四環(huán)素的存在下表達(dá)一種結(jié)構(gòu)基因[組分b)+c)+d)或b’)+b)+c)+d)]。至少兩個(gè)相同的或不同的啟動(dòng)子元件也可組合在一起，其目的在于依據(jù)選擇的這些啟動(dòng)子元件來修飾結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。組分a)優(yōu)選地在下列細(xì)胞中激活在內(nèi)皮細(xì)胞中、在靠近激活的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞中、在肌肉細(xì)胞中、在白血病細(xì)胞中、在腫瘤細(xì)胞中、在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中、在淋巴細(xì)胞中、在巨噬細(xì)胞中和/或在滑液細(xì)胞中。
由新的結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)B(蛋白質(zhì)B)構(gòu)成實(shí)際的新的活性化合物，其被釋放或被部分結(jié)構(gòu)C的切割激活，并且由此從抑制狀態(tài)(例如，為蛋白質(zhì)BCD或?yàn)榈鞍踪|(zhì)B’BCD)轉(zhuǎn)化成活性狀態(tài)(例如為蛋白質(zhì)B或?yàn)榈鞍踪|(zhì)B’B)。
按照本發(fā)明，這一活性化合物可以是激活或抑制生物激活級(jí)聯(lián)的酶和/或是這一級(jí)聯(lián)的活性組分。這種性質(zhì)的生物激活級(jí)聯(lián)的例子是凝固系統(tǒng)(其可以被激活或被抑制)、血纖維蛋白溶解(其優(yōu)選地被激活)、補(bǔ)體系統(tǒng)(其同樣地優(yōu)選地被激活)或激肽系統(tǒng)(其也優(yōu)選地被激活)?；钚曰衔镆部梢允前阉幚韺W(xué)物質(zhì)的非活性前體轉(zhuǎn)化成為活性物質(zhì)的酶，或自身是一種藥理學(xué)上的活性物質(zhì)。給出的特別優(yōu)選的活性化合物(蛋白質(zhì)B)是選自凝血酶、因子Va、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、TF凝固-活性片段或因子XIIa的凝固因子；在Arg-Thr切割位點(diǎn)(327/328位氨基酸)區(qū)中突變的凝血酶；選自尿激酶、tPA或其功能性雜合體的血纖維蛋白溶解蛋白質(zhì)；選自CVF、C3b或其功能性切割產(chǎn)物的補(bǔ)體因子；選自蛋白質(zhì)C、C-1S抑制劑、αl-抗胰蛋白酶、水蛭素、AT-III、TFPI、PAI-1、PAI-2或PAI-3的抗血栓形成蛋白質(zhì)；激肽釋放酶；抑制細(xì)胞的、細(xì)胞毒性的或引起炎癥的蛋白質(zhì)；抗血管生成蛋白質(zhì)；免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)；抗炎蛋白質(zhì)；減輕對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損壞的蛋白質(zhì)；抑制或中和TNFα的神經(jīng)毒性作用的蛋白質(zhì)；血管生成-刺激蛋白質(zhì)；減壓蛋白質(zhì)；抗病毒蛋白質(zhì)；細(xì)胞因子；干擾素；腫瘤壞死因子；制瘤素M或LIF；細(xì)胞因子受體；胞外部細(xì)胞因子受體的部分；細(xì)胞因子拮抗劑；生長(zhǎng)因子；生長(zhǎng)因子受體；胞外部生長(zhǎng)因子受體的部分；趨化因子；血管抑制蛋白；血小板因子4；TIMP1、TIMP2或TIMP3；硝基還原酶；β-葡萄糖醛酸酶；羧肽酶；β-內(nèi)酰胺酶；胞嘧啶脫氨酶；過氧化氫酶；過氧化物酶；磷酸酯酶；氧化酶；激肽釋放酶或內(nèi)皮細(xì)胞氧化氮合酶。
由新的結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)B’構(gòu)成將活性化合物(蛋白質(zhì)B)結(jié)合到靶結(jié)構(gòu)上的新配基。一種優(yōu)選的靶結(jié)構(gòu)是細(xì)胞的表面、優(yōu)選地是細(xì)胞膜受體、細(xì)胞膜抗原、細(xì)胞膜-定位粘附分子、或胞外基質(zhì)，例如內(nèi)皮細(xì)胞的，特別是激活的或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、肌肉細(xì)胞的，尤其是平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、滑液細(xì)胞、炎性細(xì)胞、病毒-感染細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、白血病細(xì)胞或其它組織與器官的細(xì)胞的。一種特別優(yōu)選的靶結(jié)構(gòu)是激活的和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞的表面。
另一個(gè)優(yōu)選的靶結(jié)構(gòu)由胞外基質(zhì)組分構(gòu)成，例如膠原[Prockop等，生物化學(xué)年評(píng).64，403(1995)，Wetzels等，Am.J.Pathol.139.451(1991)]；ficolin[Ichijo等，生物化學(xué)雜志.268，14505(1993)]；涎蛋白[Bellahcene等，癌癥研究.54，2823(1994)]；層粘連蛋白[von derMark等。生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)823，147(1985)；Hunt.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué).57，165(1989)]；蛋白聚糖[Schmidtchen等，生物醫(yī)學(xué).色譜學(xué)1，48(1993)]或腱生蛋白[Oyama等，癌癥研究.51，4876(1991)；Herlyn等，癌癥研究.51，4853(1991)]。
新的配基(部分結(jié)構(gòu)B’)可以是例如抗體或抗體片段，如抗體的表位-結(jié)合部分，F(xiàn)ab，F(xiàn)v，單鏈Fv或Fc，其特異性地結(jié)合到細(xì)胞膜抗原或在胞外基質(zhì)上的抗原上，或者是結(jié)合到在相關(guān)細(xì)胞膜上的受體上的另一種肽或蛋白質(zhì)。這些包括，例如，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，干擾素，腫瘤壞死因子，趨化因子，它們的受體-結(jié)合部分序列，肽激素，血管緊張肽，激肽或葉酸。所述配基也可以是結(jié)合到在細(xì)胞膜或胞外基質(zhì)上的相應(yīng)分子上的粘附分子或其粘附序列，或靶細(xì)胞-結(jié)合部分，F(xiàn)c受體的胞外部分，病毒(這種病毒具有所選擇的細(xì)胞的向性)的靶細(xì)胞-結(jié)合糖蛋白，或結(jié)合到這些細(xì)胞上的糖蛋白的部分序列，或肽(借助于該肽，活性化合物錨定在表達(dá)它的細(xì)胞的細(xì)胞膜上)。這些錨定肽的例子是受體或病毒蛋白質(zhì)或糖磷脂錨的跨膜結(jié)構(gòu)域。
組分d)編碼肽(部分結(jié)構(gòu)D)，其利用部分結(jié)構(gòu)C結(jié)合到蛋白質(zhì)B或蛋白質(zhì)B’B上，從而抑制蛋白質(zhì)B的活性。組分d)可以是任何核酸序列。然而，為了避免或減少免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)，優(yōu)選地是它由編碼內(nèi)源性肽或蛋白質(zhì)的核酸序列組成的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，新的結(jié)構(gòu)基因的組分b)和d)編碼內(nèi)源性蛋白質(zhì)或肽。
大量的蛋白質(zhì)活性化合物天然以非活性前體(蛋白質(zhì)BSD)的形式存在。這種類型的前體由酶切割這一前體成為構(gòu)成實(shí)際蛋白質(zhì)活性化合物(蛋白質(zhì)B)的部分結(jié)構(gòu)和無活性的部分結(jié)構(gòu)(部分結(jié)構(gòu)D)所激活。這一前體在至少一種限定的氨基酸序列上被切割，所述氨基酸序列即所謂的切割序列(部分結(jié)構(gòu)S)。
本發(fā)明的主題的一個(gè)特殊部分是，天然以蛋白質(zhì)活性化合物的前體形式存在的這種切割序列(部分結(jié)構(gòu)S)由部分結(jié)構(gòu)C取代。編碼天然前體(蛋白質(zhì)BSD)的核酸序列中，這種取代通過由編碼部分結(jié)構(gòu)C的組分c)取代編碼部分結(jié)構(gòu)S的序列來實(shí)現(xiàn)。在組分a)和合適時(shí)組分b’)已添加于其上后，產(chǎn)生新的核酸構(gòu)建體，其包括，例如，組分a)b’)b)c)d)或a)b)c)d)，其表達(dá)產(chǎn)物(即分別是蛋白質(zhì)BB’CD或BCD)的部分結(jié)構(gòu)C被蛋白酶切割，所述的蛋白酶是在腫瘤中形成的或由腫瘤細(xì)胞或炎性細(xì)胞分泌的，這樣可以形成活性化合物，即蛋白質(zhì)B’B或B。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，新的構(gòu)建體包括至少兩個(gè)相同的或不同的組分b)c)d)和/或b’)b)c)d)，這些組分利用所謂的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)相互連接。
在插入到非病毒載體或病毒載體中后，新的核酸構(gòu)建體一般在預(yù)防和/或治療疾病中經(jīng)局部施用或注射進(jìn)血液循環(huán)中。這些疾病特別是包括腫瘤疾病和炎癥。這樣的炎癥可以由例如物理化學(xué)損傷，或感染，或針對(duì)內(nèi)源或外源組織的免疫反應(yīng)觸發(fā)。
因此，本發(fā)明還涉及新的核酸構(gòu)建體在制備預(yù)防和/或治療下列疾病的局部或全身施用的藥物上的用途腫瘤，白血病，變態(tài)反應(yīng)，自身免疫疾病，感染，炎癥，移植物排斥反應(yīng)，血栓形成，血管阻塞，凝血和血液循環(huán)失調(diào)，和組織損傷和/或神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
新的核酸構(gòu)建體的組分的選擇取決于通過施用核酸構(gòu)建體來治療的疾病，并且可以按照如下進(jìn)行制備啟動(dòng)子序列[組分a)]按照本發(fā)明，特別優(yōu)選的啟動(dòng)子序列[組分a)]一方面涉及可以以不受限制的方式激活的啟動(dòng)子和激活物序列，例如，RNA聚合酶III啟動(dòng)子，RNA聚合酶II啟動(dòng)子等，CMV啟動(dòng)子，以及CMV增強(qiáng)子，或SV40啟動(dòng)子，另一方面涉及病毒啟動(dòng)子和激活物序列，如HBV，HCV，HSV，HPV，EBV，HTLV或HIV。
例如，在HIV啟動(dòng)子的情況下，包括TAR序列[位置≤-453至≥-80，Rosen等，細(xì)胞41，813(1985)]的整個(gè)LTR序列可以用作病毒-特異性啟動(dòng)子。
作為組分a)同樣特別優(yōu)選的有代謝上可激活的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，例如缺氧可誘導(dǎo)增強(qiáng)子，可以以細(xì)胞周期-特異性方式激活的啟動(dòng)子，如cdc25C基因的啟動(dòng)子，細(xì)胞周期蛋白A基因，cdc2基因，Bmyb基因，DHFR基因或E2F-1基因的啟動(dòng)子，或四環(huán)素-可激活啟動(dòng)子，例如與合適的阻抑物組合的四環(huán)素操縱子。
按照本發(fā)明，在結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子之后激活在3’端靠近它們的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列也用作啟動(dòng)子序列。
此外，可以以細(xì)胞-特異性方式激活的啟動(dòng)子作為組分a)是特別優(yōu)選的。這些啟動(dòng)子優(yōu)選地包括啟動(dòng)子或者由優(yōu)選地在所選擇的細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)的那些基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子組成的激活物序列。例如，下列蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子優(yōu)選地用于下列細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活物序列，如腦-特異性，內(nèi)皮葡萄糖-I轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，endoglin，VEGF受體2(flt-1)，VEGF受體2(flk-1，KDR)，tiel-1或2，B61受體(Eck受體)，B61，內(nèi)皮素，尤其是內(nèi)皮素B和內(nèi)皮素1，內(nèi)皮素受體，特別是內(nèi)皮素B受體，甘露糖6-磷酸受體，von Willebrand因子，IL-lα，IL-lβ，IL-1受體，血管細(xì)胞粘附分子(VCAM1)或合成的激活物序列。
作為天然內(nèi)皮細(xì)胞-特異性啟動(dòng)子的替代物，也可以使用合成的激活物序列，其由在內(nèi)皮細(xì)胞中優(yōu)先或有選擇活性的轉(zhuǎn)錄因子的寡聚結(jié)合位點(diǎn)組成的。例子是轉(zhuǎn)錄因子GATA2，其在內(nèi)皮素1基因中的結(jié)合位點(diǎn)是5’-TTATCT-3’[Lee等，生物化學(xué)，266，16188(1991)，Dormann等，生物化學(xué)雜志，267，1279(1992)和Wilson等，分子細(xì)胞生物學(xué)，10，4854(1990)]。
在激活的內(nèi)皮細(xì)胞附近的細(xì)胞中(特別在平滑肌細(xì)胞中)激活的啟動(dòng)子或激活物序列存在于例如VEGF基因中。VEGF基因的基因-調(diào)節(jié)序列是5’-側(cè)翼區(qū)，3’-側(cè)翼區(qū)，c-Src基因或v-Src基因。
也合適的是類固醇激素受體和它們的啟動(dòng)子元件，特別是小鼠乳瘤病毒啟動(dòng)子，或編碼原肌球蛋白、α-肌動(dòng)蛋白、α-肌球蛋白、PDGF受體、FGF受體、MRF-4、磷酸果糖激酶A、磷酸甘油酸變位酶、肌鈣蛋白C、肌漿蛋白、內(nèi)皮素A受體、結(jié)蛋白的基因的啟動(dòng)子元件或單獨(dú)的″人工″啟動(dòng)子。螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)家族的因子(MyoD，Myf5，肌漿蛋白和MRF4[在Olson和Klein，Genes Dev.8，1(1994)]中回顧)可以結(jié)合于其上的啟動(dòng)子元件作為肌肉-特異性轉(zhuǎn)錄因子同樣是合適的。肌肉-特異性轉(zhuǎn)錄因子也包括鋅指蛋白GATA-4(Arceci等，分子細(xì)胞生物學(xué).13，2235(1993)，Ip等，分子細(xì)胞生物學(xué).14 7517(1994)]和MEF轉(zhuǎn)錄因子組[Yu等，Gene Dev.6，1783(1992)]。
HLH蛋白質(zhì)以及GATA4顯示出類似的肌肉-特異性轉(zhuǎn)錄，不僅具有肌肉-特異性基因啟動(dòng)子而且具有異源物即″人工″啟動(dòng)子。這樣的人工啟動(dòng)子的例子是肌肉-特異性HLH蛋白質(zhì)的(DNA)結(jié)合位點(diǎn)的若干拷貝，例如E盒(myo D)，如4x AGCAGGTGTTGGGAGGC[Weintraub等，PNAS 87，5623(1990)]或α-肌球蛋白重鏈基因的GATA4的DNA結(jié)合位點(diǎn)的若干拷貝，如5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3’[Molkentin等，分子細(xì)胞生物學(xué)14，4947(1994)]。
在白血病細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活物序列的例子是c-myc，HSP-70，bcl-l/細(xì)胞周期蛋白D-l，bcl-2，IL-6，IL-10，TNFα，TNFβ，HOX-11，BCR-Abl，E2A-PBX-1或PML-RATA的啟動(dòng)子。
在腫瘤細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子或激活物序列的例子是與在腫瘤細(xì)胞中形成的或活性的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的啟動(dòng)子或激活物序列。這些優(yōu)選的啟動(dòng)子或激活物序列包括基因-調(diào)節(jié)序列或編碼形成的(尤其是在癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞中形成的)蛋白質(zhì)的基因的元件。這樣，例如，在小-細(xì)胞支氣管癌的情況下使用N-CAM蛋白啟動(dòng)子，在卵巢癌的情況下使用肝炎生長(zhǎng)因子受體或L-絲束蛋白啟動(dòng)子，在胰癌的情況下使用L-絲束蛋白或多形上皮細(xì)胞粘蛋白(PEM)啟動(dòng)子。
在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活物序列尤其是基因-調(diào)節(jié)序列或編碼例如下列蛋白質(zhì)的基因的元件施旺細(xì)胞-特異性蛋白質(zhì)periaxin，谷酰胺合成酶，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-特異性蛋白質(zhì)(神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì))＝GFAP)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)S100b，IL-6(CNTF)，5-HT受體，TNFα，IL-10，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體I和II或VEGF。VEGF基因的基因-調(diào)節(jié)序列以上已經(jīng)列出。
在淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活物序列的例子是編碼細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體和粘附分子、抗體的Fc片段的受體的基因的啟動(dòng)子和激活物序列。這些的例子是IL-I受體，IL-lα，IL-Iβ，IL-2，IL-2受體，IL-3，IL-3受體(α亞單位)，IL-3受體(β亞單位)，IL-4，IL-4受體，IL-5，IL-6，IL-6受體，干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)，(IRF-1的啟動(dòng)子由IL-6和由IFNγ或IFNβ激活的程度相同)，IFNγ-效應(yīng)啟動(dòng)子，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，IFNγ，GM-CSF，GM-CSF受體(α鏈)，IL-13，LIF，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)受體，I和II型巨噬細(xì)胞消除受體，MAC-I(白細(xì)胞功能抗原)，LFA-lα(白細(xì)胞功能抗原)或p150,95(白血病功能抗原)。
在滑液細(xì)胞中被激活的啟動(dòng)子和激活物序列的例子是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的啟動(dòng)子序列，例如MMP-1(間質(zhì)膠原酶)或MMP-3(基質(zhì)溶素/transin)的啟動(dòng)子序列。這些也包括金屬蛋白酶(TIMP)的組織抑制劑的啟動(dòng)子序列，例如TIMP-1，TIMP-2和TIMP-3。
按照本發(fā)明，以例子方式列出了的一些啟動(dòng)子序列可以相互組合，以便在新的核酸構(gòu)建體的表達(dá)中獲得最高可能的靶細(xì)胞特異性。兩個(gè)相同的的啟動(dòng)子也可以加以組合。若干啟動(dòng)子序列可以加以組合，例如，利用嵌合啟動(dòng)子或雜合啟動(dòng)子。嵌合啟動(dòng)子是上游激活物序列(其可以被細(xì)胞-特異性地，代謝性地或病毒-特異性地激活)與下游啟動(dòng)子組件(其結(jié)合CDF和CHF家族或E2F和CHF家族的轉(zhuǎn)錄因子)的組合，進(jìn)而可以抑制在細(xì)胞周期的G0和G1階段上游激活物序列的激活(Lucibello等，EMBO J.14，132(1994)]。
在雜合啟動(dòng)子的情況下，啟動(dòng)子的TATA盒是例如突變的，這種突變由TATA-結(jié)合蛋白的基因中的相應(yīng)突變補(bǔ)償，這一TATA-結(jié)合蛋白處于另一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下。編碼配基(部分結(jié)構(gòu)B’)的核酸序列[組分b’)]按照本發(fā)明，配基是把膜抗原結(jié)合到受體上或在靶細(xì)胞上的粘附分子上的物質(zhì)，或者是整合到細(xì)胞膜中和/或結(jié)合到胞外基質(zhì)上的物質(zhì)。Ayad等，胞外基質(zhì)，學(xué)術(shù)出版社1994；Callard等，細(xì)胞因子，學(xué)術(shù)出版社1994；Pigott等，粘附分子，學(xué)術(shù)出版社1994，和Barclay等，白細(xì)胞抗原，學(xué)術(shù)出版社1994提供了重要的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子及它們的受體，粘附分子和胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的綜述。
結(jié)合到受體上的物質(zhì)的例子是生長(zhǎng)因子，如VEGF，PDGF，EGF，TGFα，TGFβ，KGF，SDGF，F(xiàn)GF，IGF，HGF，NGF，BDNF，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，BMF，鈴蟾肽，M-CSF，血小板生成素，紅細(xì)胞生成素，SCF，SDGF，制瘤素，PDEGF或內(nèi)皮素-1，細(xì)胞因子，如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，干擾素α，β和γ，腫瘤壞死因子TNFα和TNFβ，趨化因子，如RANTES，MCAF，MIP-1α或MIP-1β，NAP或β-血小板球蛋白，肽激素，如SRH，SIH或STH，MRH或MSH，PRH，PIH或催乳激素，LH-RH，F(xiàn)SH-RH，LH/ICSH或FSH，TRH或TSH，CRH或ACTH，血管緊張肽，激肽，其同系物或類似物，或維生素，如葉酸。
按照本發(fā)明，配基也可以是粘附分子，粘附分子的一部分或者結(jié)合到相應(yīng)粘附分子(位于細(xì)胞膜中)上或結(jié)合到在靶細(xì)胞上或在胞外基質(zhì)中的粘附分子的另一個(gè)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)上的粘附分子類似物。
能夠作為配基起作用的這樣的粘附分子的例子是Lewis X(對(duì)GMP-140)，S Lewis X(對(duì)ELAM-1)，LFA-1(對(duì)ICAM-1和ICAM-2)，MAC-1(對(duì)ICAM-1)，VLA-4(對(duì)VCAM-1)，PECAM(對(duì)PECAM)，玻連蛋白(對(duì)玻連蛋白受體)，GMP-140(對(duì)Lewis X)，S Lewis X(對(duì)ELAM-1)，ICAM-1，ICAM-2(對(duì)LFA-l和MAC-1)，VCAM-1(對(duì)VLA-4)，纖連蛋白(對(duì)VLA4)，層粘連蛋白(對(duì)VLA-6)，層粘連蛋白(對(duì)VLA-1，VLA-2和VLA-3)，血纖維蛋白原(對(duì)GPIIb-IIIa)，B7(對(duì)CD28)，CD28(對(duì)B7)，CD40(對(duì)CD40L)或CD40L(對(duì)CD40)。
按照本發(fā)明，配基也可以是Fc受體的胞外部分[Dougherty等，輸血科學(xué)，17，121(1996)]。此外，配基也可以是抗體分子或抗體分子的表位-結(jié)合部分。鼠單克隆抗體優(yōu)選地以人源化的形式使用。人源化以Winter等，自然349，293(1991)和Hoogenbooms等Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993)描述的方式進(jìn)行。
重組抗體片段直接從現(xiàn)有的雜交瘤制備或采用噬茵體-展示技術(shù)[Smith，科學(xué)228，1315(1985)]從鼠或人類抗體片段文庫分離[Winter等，免疫學(xué)年評(píng)，12，433(1994)]。然后，抗體片段以遺傳水平直接使用，供進(jìn)一步的操作，例如用于與其它蛋白質(zhì)融合。
為了從雜交瘤制備重組抗體片段，通過分離mRNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)[Saiki等，科學(xué)，230，1350(1985)]和利用互補(bǔ)于可變片段的5’和3’末端(Orlandi等，1989)的寡核苷酸擴(kuò)增cDNA來獲得編碼抗體的抗原-結(jié)合域(VH和VL)的遺傳信息。然后將VH和VL片段克隆進(jìn)細(xì)菌表達(dá)載體，例如以Fv片段的形式[Skerra& Pl
ckthun，科學(xué)，242，1038(1988)]，單鏈Fv片段(scFv)的形式[Bird等，科學(xué)，242，423(1988)，Huston等，PNAS-USA，85，5879(1988)]或以Fab片段的形式[Better等，科學(xué)，240，1041(1988)]。
噬茵體-展示技術(shù)也可以用于直接從鼠或人源的抗體文庫(免疫文庫或原初文庫)分離新抗體片段。在抗體片段的噬菌體-展示中，抗原-結(jié)合域(作為與絲狀噬菌體外被蛋白質(zhì)g3P的融合蛋白)以scFv片段的形式(McCafferty等，自然348，552(1990)]或Fab片段的形式[Hoogenboom等，核酸研究，19，4133(1941)，Barbas等，PNAS-USA，88，7978(1991)]被克隆進(jìn)噬茵體基因組[McCafferty等，自然348，552(1990)]或噬菌粒載體[Breitling等，基因，104，147(1991)]。在抗原-荷載塑料容器上(淘選)[Marks等，分子生物學(xué)雜志，222，581(1991)]，在抗原-綴合的順磁小珠上[Hawkins等，分子生物學(xué)雜志，226，889(1992)]或通過結(jié)合到細(xì)胞表面上[Marks等，生物技術(shù)，11，1145(1993)]選擇抗原-結(jié)合噬菌體。
通過對(duì)來源于免疫動(dòng)物[Sastry等.PNAS-USA 86,5728(1989)，Ward等，Nature 341，544(1989)，Clackson等，自然352，624(1991)]或患者[Mullinax等，PNAS-USA，87，8095(1990)，Barbas等，PNAS-USA，88.7978(1991)]的B淋巴細(xì)胞的可變抗體片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備免疫文庫。為此，采用對(duì)鼠[Orlandi等，PNAS-USA，86,3833(1989)，Sastry等，PNAS-USA，86,5728(1989)]或人類免疫球蛋白基因[Larrick等，BBRC 160，1250(1989)]或?qū)θ祟惷庖咔虻鞍谆蚣易錥Marls等，Eur.J.Immunol.l.21，985(1991)]特異性的寡核苷酸的組合。
可以采用非免疫供體作為免疫球蛋白基因來源[Marks等，分子生物學(xué)雜志222，581(1991)]制備原初文庫。另外，免疫球蛋白細(xì)菌系基因可以用于制備半合成抗體譜，具有采用簡(jiǎn)并引物[Hoogenboom &Winter.分子生物學(xué)雜志227，381(1992)，Barbas等，PNAS-USA，89,4457(1992)，Nissim等，EMBO J.13，692(1994)，Griffiths等，EMBO J.13 3245(1994)]經(jīng)PCR擴(kuò)增的可變片段的互補(bǔ)性決定區(qū)3。與免疫文庫相比較，這些所謂的單-pot文庫具有針對(duì)大量抗原的抗體片段可以從單一文庫分離的優(yōu)點(diǎn)[Nissim等，EMBO J，13，692(1994)]。
噬菌體-展示技術(shù)可以用來進(jìn)一步增加抗體片段的親和性，其采用隨機(jī)[Hawkins等，分子生物學(xué)雜志226，889(1992)，Gram等，PNAS-USA，89,3576(1992)]、基于密碼子的[Glaser等，免疫學(xué)雜志.149，3903(1992)]或定點(diǎn)的誘變[Balint & Larrick，基因137，109(1993)]，通過改組具有原初譜的那些片段的單個(gè)域的鏈[Marks等，Bio/Technol10，779(1992)]或通過采用細(xì)菌突變菌株[Low等，分子生物學(xué)雜志26，359(1996)]從已現(xiàn)成的抗體片段制備的新文庫，或者從通過在嚴(yán)格條件下再選擇分離的具有改進(jìn)的性質(zhì)的抗體片段[Hawkins等，分子生物學(xué)雜志226，889(1992)]制備的新文庫。此外，可以通過用人譜逐步代替一個(gè)可變區(qū)，并用原始抗原選擇(指導(dǎo)選擇)[Jespers等，生物/技術(shù)，12，889(1994)]使鼠抗體片段人源化。另外，通過用原始鼠抗體的相應(yīng)的區(qū)特異性地替代人抗體的高變區(qū)使鼠抗體人源化[Jones等，自然321，522(1987)]。
按照本發(fā)明，配基也可以是編碼病毒包被蛋白或包被蛋白一部分的核苷酸序列，所說病毒通過它們的包被蛋白特異性地結(jié)合到所選擇的細(xì)胞上。
配基也可以是肽，借助于該肽，活性化合物(蛋白質(zhì)B)錨定在表達(dá)它的細(xì)胞的細(xì)胞膜上。這些錨定肽包括細(xì)胞膜-定位受體或病毒蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，例如人類巨噬細(xì)胞菌落-刺激因子跨膜序列[DNA位置≤1485至≥1554；Cosman等，Behring Inst.Mitt.83，15(1988)]，或人類呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G的信號(hào)和跨膜區(qū)的DNA序列[氨基酸1至63或其部分序列，氨基酸38至63；Vijaya等.分子細(xì)胞生物學(xué).8,1709(1988)；Lichtenstein等，J.Gen.Virol.77.109(1996)]，流感病毒神經(jīng)氨酸苷酶的信號(hào)和跨膜區(qū)DNA序列[氨基酸7至35或氨基酸7至27的部分序列，Brown等，病毒學(xué)雜志.62；3824(1988)]。
然而，也可以插入糖磷脂錨的核苷酸序列[在Ferguson等中的糖磷脂-錨定膜蛋白回顧(生物化學(xué)年評(píng))57，285(1988)]，其目的在于在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中錨定活性化合物，這些細(xì)胞形成活性化合物。糖磷脂錨已有描述，例如，CEA[DNA位置＜893至＞1079；Berling等，癌研究，50 6534(1990)]，N-CAM[Cunningham等，科學(xué)，236，799(1987)]和其它膜蛋白質(zhì)，如Thy-1[Clissold，生物化學(xué)雜志，281，129(1992)]或CD16[Selvaray等，自然333，565(1988)]。
對(duì)配基的選擇首先和最重要地取決于待用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。用于激活的內(nèi)皮細(xì)胞的配基是這樣的例子。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這些配基包括抗體或抗體片段，其針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，這一點(diǎn)如例如Burrows等Pharmac.Ther.64.155(1994)，Hughes等，癌癥研究.49,6214(1989)和Maruyama等，PNAS-USA 87,5744(1990)所述。尤其是，這些抗體包括抗肌動(dòng)蛋白、血管緊張肽II受體的抗體，抗生長(zhǎng)因子如VEGF，F(xiàn)GF，PDGF或EGF的受體的抗體，抗粘附分子抗體，例如抗玻連蛋白受體或ICAM3的抗體。
配基還包括結(jié)合到在內(nèi)皮細(xì)胞上的膜結(jié)構(gòu)或膜受體上的所有活性化合物。這些的例子是IL-1或生長(zhǎng)因子，或它們的片段或其部分序列，其結(jié)合到在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的受體上，例如PDGF，bFGF，VEGF或TGFβ[Pusztain等，J.Pathol.169，191(1993)]。
配基還包括結(jié)合到激活的和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子。這種性質(zhì)的粘附分子(例如Slex，LFA-1，MAC-1，LECAM-1，VLA-4或玻連蛋白)已有描述[Augustin-Voss等，細(xì)胞生物學(xué)雜志.119.483(1992)，Pauli等，癌轉(zhuǎn)移回顧，9，175(1990)，Honn等，癌轉(zhuǎn)移回顧，11，353(1992)，Pigott等，粘附分子，學(xué)術(shù)出版社(1994)]。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的配基也包括，尤其是，具有內(nèi)皮細(xì)胞向性的病毒包被糖蛋白。這些病毒的例子是線狀病毒，例如具有其包被蛋白GP(糖蛋白)和sGP(第二糖蛋白)的Marburg病毒或Ebola病毒，在每種情況下都具有其包被蛋白質(zhì)GP和sG；巨細(xì)胞病毒，特別是具有其gB蛋白；單純皰疹病毒I型；HIV-1病毒；麻疹病毒；Hantaan病毒；α病毒，如Semliki森林病毒；流行性出血熱病毒；小兒麻痹病毒或腸道病毒，如ECHO9，ECHO12和柯薩奇病毒B3。
針對(duì)肌肉細(xì)胞(特別是平滑肌細(xì)胞)膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段是肌肉細(xì)胞的配基的例子。這種性質(zhì)的抗體的例子是抗體10F3，針對(duì)肌動(dòng)蛋白的抗體，針對(duì)血管緊張肽II受體的抗體，針對(duì)生長(zhǎng)因子受體的抗體或例如針對(duì)EGF受體，針對(duì)PDGF受體或針對(duì)FGF受體的抗體，或針對(duì)內(nèi)皮素A受體的抗體。
配基也包括結(jié)合到肌肉細(xì)胞上膜結(jié)構(gòu)或膜受體上的活性物質(zhì)的核苷酸序列[Pusztai等，J.Pathol.169，191(1993)，Harris，Curr.Opin.Biotechnol.2，260(1991)]。這些配基的例子是生長(zhǎng)因子，或它們的片段或其部分序列，其結(jié)合到在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的受體上，例如PDGF，EGF，TGFβ，TGFα，F(xiàn)GF或內(nèi)皮素A。
配基也包括具有肌肉細(xì)胞向性的那些病毒的包被的糖蛋白。這些病毒的例子是巨細(xì)胞病毒[Speir等，科學(xué)265，391(1994)]。
此外，激活的巨噬細(xì)胞和/或激活的淋巴細(xì)胞的配基的例子是編碼特異性地結(jié)合到免疫細(xì)胞表面的物質(zhì)的核苷酸序列。這些物質(zhì)包括針對(duì)免疫細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，其已由例如Powelson等，生物技術(shù)進(jìn)展.11，725(1993)和Barclay等，白細(xì)胞抗原，學(xué)術(shù)出版社(1994)描述。配基也包括單克隆或多克隆抗體或其抗體片段，它們通過其抗原-結(jié)合可變部分結(jié)合到免疫細(xì)胞的Fcγ，F(xiàn)cε，F(xiàn)cμ受體上[Rojanasakul等，藥學(xué)研究.11，1731(1994)]。它們還包括人類單克隆或多克隆免疫球蛋白的Fc片段。
配基還包括結(jié)合到免疫細(xì)胞表面上的膜受體上的所有物質(zhì)。這些物質(zhì)包括細(xì)胞因子，例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα，GM-CSF和M-CSF，以及生長(zhǎng)因子，例如EGF，TGF，F(xiàn)GF，IGF或PDGF，或者它們的片段或其部分序列，其結(jié)合到免疫細(xì)胞中表達(dá)的受體上[Callard等，細(xì)胞因子，學(xué)術(shù)出版社(1994)]。配基也包括結(jié)合到巨噬細(xì)胞上和脾，肝，肺和其它組織中的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的粘附分子和其它配基[Pigott等，粘附分子，學(xué)術(shù)出版社(1994)，Perales等，Eur.J.Biochem.226，255(1994)]。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的配基也包括具有淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞向性的病毒包被的糖蛋白。這些巨噬細(xì)胞-感染病毒的例子是HIV-1，特別那些在gp120的V3區(qū)具有突變(其導(dǎo)致增加結(jié)合至巨噬細(xì)胞上)的那些毒株，HIV-2，漢坦病毒，例如Punmalavirus，巨細(xì)胞病毒，呼吸道合胞病毒，單純皰疹病毒或線狀病毒。
淋巴細(xì)胞-感染病毒的例子是水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，由于VZV特別感染T細(xì)胞；皰疹病毒6(HHV 6)，由于HHV 6同樣特別感染T細(xì)胞；狂犬病病毒，由于狂犬病病毒包被蛋白質(zhì)特別結(jié)合TH2細(xì)胞；HIV-1，由于糖蛋白gp120優(yōu)選地結(jié)合T細(xì)胞的CD4分子；HTLV-II，由于HTLV-II特別感染B細(xì)胞；HTLV-I，由于HTLV-I特別感染T細(xì)胞；流感C病毒，由于流感C病毒結(jié)合N-乙酰基-9-β-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5，9Ac)，其優(yōu)先出現(xiàn)在B淋巴細(xì)胞上，較少或根本不出現(xiàn)在T淋巴細(xì)胞上面，以血凝素-酯酶融合(HEF)蛋白質(zhì)的方式，流感C病毒具有872位核苷酸突變，其編碼HEF的284位氨基酸序列，例如以異亮氨酸取代蘇氨酸，由于具有這種突變的表面蛋白質(zhì)HEF比野生型病毒具有明顯更強(qiáng)的對(duì)N-乙?；?9-O-乙酰神經(jīng)氨酸受體的親和性，流感C病毒HEF的切割產(chǎn)物包含結(jié)合到N-乙?；?9-β-乙酰神經(jīng)氨酸的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)合結(jié)構(gòu)由絲氨酸71、組氨酸368或369和天冬氨酸261催化三聯(lián)體限定；Epstein-Barr病毒，由于EBV特別感染B細(xì)胞；單純皰疹病毒2，由于HSV-2特別感染T細(xì)胞；或麻疹病毒。
將要論及的滑液細(xì)胞和炎性細(xì)胞的配基的例子是核酸序列，其編碼通過它們的可變區(qū)結(jié)合滑液細(xì)胞或炎性細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段。這些膜結(jié)構(gòu)的例子是波形蛋白[Miettinen等，Am.J.Pathol.11718(1984)]，纖連蛋白[Wojciak等，Clin.Exp.Immuol.93，108(1993)]或Fc受體。這些配基也包括以它們的C定區(qū)結(jié)合Fc受體的抗體或抗體片段[Rojanasakul等，藥學(xué)研究.11，1731(1994)]。
這些配基還包括結(jié)合到滑液細(xì)胞上膜結(jié)構(gòu)或膜受體上的所有活性化合物。這些的例子是細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，或它們的片段或其部分序列，其結(jié)合到由滑液細(xì)胞表達(dá)的受體上，例如IL-1-RA，TNFα，IL-4，IL-6，IL-10，IGF或TGFβ[Callard等，細(xì)胞因子，學(xué)術(shù)出版社(1994)]。
將要論及的病毒-感染細(xì)胞配基的例子是核酸構(gòu)建體，其編碼針對(duì)位于病毒-感染細(xì)胞細(xì)胞膜上的病毒抗原的抗體或抗體片段。這種性質(zhì)的抗體直接針對(duì)，例如，HBV，HCV，HSV，HPV，HIV，EBV或HTLV抗原。
肝臟細(xì)胞和其它組織細(xì)胞配基的例子是所有結(jié)合到肝臟細(xì)胞的表面上膜結(jié)構(gòu)或膜受體上的物質(zhì)。這些的例子是生長(zhǎng)因子，如細(xì)胞因子，EGF，TGF，F(xiàn)GF或PDGF，或它們的片段或其部分序列，其結(jié)合到在這種性質(zhì)的細(xì)胞中表達(dá)的受體上。
這些配基還包括結(jié)合到對(duì)特定組織為選擇性的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的配基。例子是
Perales等，Eur.J.Biochem.226，255(1994)中綜述了這些配基和膜結(jié)構(gòu)。
配基特別是包括對(duì)選擇的細(xì)胞具有向性的病毒包被糖蛋白，所述細(xì)胞例如支氣管上皮細(xì)胞(呼吸道合胞病毒)，肝臟細(xì)胞(肝炎C病毒)，線狀病毒，利用肝臟細(xì)胞的脫唾液酸糖蛋白受體的Marburg病毒，肝炎B病毒(通過脫唾液酸糖蛋白受體肝臟細(xì)胞優(yōu)選地結(jié)合到HBV的preS2和preS1區(qū))，肝炎D病毒，肝臟-正弦樣細(xì)胞，和肝炎B病毒(HBV通過纖連蛋白結(jié)合)。
神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的配基的例子是核酸序列，其編碼針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，例如如Mirskey等[細(xì)胞和組織研究.240，723(1985)]，Coakham等[Prog.Exp.Tumor Res.29，57(1985)]和McKeever等[神經(jīng)生物學(xué)6，119(1991)]所報(bào)道的。這些膜結(jié)構(gòu)還包括神經(jīng)粘附分子如N-CAM，特別是其多肽鏈C[Nybroe等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，101，2310(1985)]。這些配基還包括結(jié)合到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或膜受體上的所有活性化合物。這些活性化合物的例子是胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子，和結(jié)合到有關(guān)膜受體上的這些生長(zhǎng)因子的片段。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的配基還包括核酸序列，其編碼具有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向性的那些病毒的包被糖蛋白。
這些病毒包括，例如，HIV-1亞型JRFI或單純皰疹病毒I。
白血病細(xì)胞的配基的例子包括核酸構(gòu)建體，其編碼針對(duì)白血病細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段。這種性質(zhì)的大量單克隆抗體用于診斷和治療程序已有描述[Kristensen，丹麥醫(yī)學(xué)報(bào)告41，52(1994)；Schranz，Therapia Hungarica 38，3(1990)；Drexler等，Leuk.Res.10，279(1986)；Naeim，Dis.Markers 1，1(1989)；Stickney等，Curr.Opin.Oncol.4，847(1992)；Drexler等，Blut 57，327(1988)；Freedman等，Cancer Invest.9，69(1991)]。取決于白血病的類型，具有如下特異性的單克隆抗體或它們的抗原-結(jié)合抗體片段例如適合作配基具有膜抗原CD13，CD14，CD15，CD33，CAMAL和sialosyl-Le的AML細(xì)胞；具有膜抗原CD5，CDlc和CD23，以及膜免疫球蛋白獨(dú)特型和同種型的B-CLL細(xì)胞；具有膜抗原CD33，M38，IL-2受體和T細(xì)胞受體的T-CLL細(xì)胞；具有膜抗原CALLA和CD19的ALL細(xì)胞，以及非Hodgkin’s淋巴瘤。
配基也包括結(jié)合到白血病細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)或膜受體上的所有活性化合物。這些的例子是生長(zhǎng)因子，或它們的片段或其部分序列，其結(jié)合到在白血病細(xì)胞中表達(dá)的受體上。
這種性質(zhì)的生長(zhǎng)因子已有描述[在Cross等，細(xì)胞64，271(1991)；Aulitzky等，藥物48，667(1994)；Moore.Clin.Cancer Res.1，3(1995)；Van Kooten等，Leuk.Lymph.12，27(1993)]中綜述。例如，它們包括IFNα(在-非Hodgkin’s淋巴瘤的情況下)，IL-2(特別是在T細(xì)胞白血病的情況下)，F(xiàn)GF(在T細(xì)胞、單核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、紅細(xì)胞、成巨核細(xì)胞白血病的情況下)，TGFβ(在白血病的情況下)，或視網(wǎng)膜樣的，例如視黃酸(在急性前髓細(xì)胞白血病的情況下)。
腫瘤細(xì)胞的配基的例子包括核酸序列，其編碼針對(duì)腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體和這些抗體的片段。這種性質(zhì)的抗體已被綜述，例如Sedlacek等，Contrib.to Oncol.32，Karger Verlag，Munich(1988)和Contrib.toOncol.43，Karger Verlag，Munich(1992)。
其它例子是針對(duì)sialyl Lewis的抗體，在T細(xì)胞識(shí)別的腫瘤上的肽，致基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，神經(jīng)節(jié)苷脂(如GD3，GD2，GM2，9-O-乙酰-GD3和巖藻糖基-GM1)，血型抗原和它們的前體，在多形上皮細(xì)胞粘蛋白上的抗原或在熱擊蛋白上的抗原。編碼活性化合物(蛋白質(zhì)B)的核酸序列[組分b)]
按照本發(fā)明的活性化合物(蛋白質(zhì)B)可以是例如間插在生物激活級(jí)聯(lián)中的物質(zhì)和/或是這一級(jí)聯(lián)的活性組分。這些物質(zhì)包括激活凝固級(jí)聯(lián)的活性化合物，例如凝血酶[MacGillivray等，Ann.N.Y.Acad.Sci.485.73(1986)]，在Arg-Thr切割位點(diǎn)(氨基酸位置327/328)的區(qū)域中突變的凝血酶，因子Va[Cripe等，生物化學(xué).31 3777(1992)，Jenny等，PNAS-USA 84,4846(1987)]，因子VIIa[O′Hara等，PNAS-USA 84，5158(1987)]，因子IXa[Yoshitake等，生物化學(xué).24，3736(1985)]，因子Xa[Messier等，基因99，291(1991)]或組織因子和其凝固-活性片段lMorrissey等，細(xì)胞50，29(1987)；Scarpati等，生物化學(xué).26，5234(1987)；Spicer等，PNAS-USA 84，5148(1987)；Rehemtulla等，Thromb.Heamost.65，521(1991)]；或者抑制凝固級(jí)聯(lián)或激活血纖維蛋白溶解的活性化合物，例如纖溶酶原激活物抑制劑PAI-1，PAI-2和PAI-3，水蛭素，蛋白質(zhì)C，絲氨酸蛋白酶抑制劑，如C-1S抑制劑，α]-抗胰蛋白酶或抗凝血酶III，組織因子途徑抑制劑(TFPI)，纖溶酶原激活物，如尿激酶，組織纖溶酶原激活物(tPA)，或其雜合體；或者激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的活性化合物，例如眼鏡蛇毒因子(CVF)或CVF的部分序列，其功能上相當(dāng)于人類補(bǔ)體因子C3b，即，能夠結(jié)合補(bǔ)體因子B并且在由因子D切割后構(gòu)成C3轉(zhuǎn)化酶(CVF的DNA序列和它的部分序列由Fritzinger等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，91，12775(1994)描述)，人類補(bǔ)體因子C3b(C3的DNA序列和它的部分序列由Bruijn等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)82，708(1985)描述)，人類補(bǔ)體因子C3的切割產(chǎn)物，所說因子在功能上和結(jié)構(gòu)上類似CVF(這樣的切割產(chǎn)物由O’Keefe等，生物化學(xué)雜志263，12690(1988)描述)或者激活激肽系統(tǒng)，補(bǔ)體系統(tǒng)和/或凝固系統(tǒng)，例如激活的Hagemann因子(FXIIa)[Shibuya等，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)，1206，63(1994)，Que等，生物化學(xué)，25.1525(1986)，Tripodi等，核酸研究，14，3146(1986)]或激肽釋放酶[Chen等，生物化學(xué)雜志307，481(1995)，F(xiàn)ukushima等，生物化學(xué)，24，8037(1985)]。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)也可以是抑制細(xì)胞的、細(xì)胞毒性的或引起炎癥的蛋白質(zhì)，如穿孔素，粒酶，細(xì)胞因子，如IL-1，IL-2，TL-4，IL-12，IL-3，IL-5，人類白血病抑制因子(LIF)，IL-7，IL-11，IL-13，GM-CSF，G-CSFb或M-CSF，干擾素，如IFNα，IFNβ或IFNγ，TNF，如TNFα或TNFβ，制瘤素M，鞘磷脂酶[Jarvis等，PNAS USA 91，73(1994)]，爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物[Crueiani等，PNAS USA 88，3792(1991)]；Jacob等，Ciba Found.symp.186，197(1994)；Peck-Miller等，Cancer Chemother.Pharmac.32，109(1993)]或趨化因子，如RANTES(MCP-2)，單核細(xì)胞趨化性和激活因子(MCAF)，IL-8，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)1(MIP-1α或MIP-1β)或嗜中性白細(xì)胞激活蛋白質(zhì)2(NAP-2)。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)也可以抗血管生成蛋白質(zhì)，如血管抑制蛋白，干擾素，如IFNα，IFNβ或IFNγ，血小板因子4，IL-12，TIMP-1，TIMP-2或TIMP-3。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)也可以是能夠把藥理學(xué)活性物質(zhì)的非活性前體(例如細(xì)胞靜止劑)轉(zhuǎn)化成為自身的活性物質(zhì)的酶。這樣的活性化合物的例子是細(xì)菌硝基還原酶，細(xì)菌β-葡萄糖醛酸酶，來源于Secale cereale的植物β-葡萄糖醛酸酶，人類β-葡萄糖醛酸酶，人類羧肽酶(CB)，例如桅桿細(xì)胞CB-A或胰腺CB-B，或細(xì)菌羧肽酶，細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶，細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶，人類過氧化氫酶或過氧化物酶，磷酸酶，特別是人類堿性磷酸酶或人類酸性前列腺磷酸酶，5型酸性磷酸酶，氧化酶，特別是人類賴氨酰氧化酶或酸性D-氨基氧化酶，過氧化物酶，特別是人類谷胱甘肽過氧化物酶，人類嗜酸性過氧化物酶或人類甲狀腺過氧化物酶。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)也可以是影響免疫的系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，例如具有抗變應(yīng)性作用的蛋白質(zhì)，如IFNβ，IFNγ，IL-10，可溶性IL-4受體，IL-12或TGFβ，或者可以預(yù)防移植器官排斥的蛋白質(zhì)，如，IL-10，TGFβ，可溶性IL-1受體，可溶性IL-2受體，IL-2受體拮抗劑或可溶性IL-6受體，或者治療抗體-介導(dǎo)的自身免疫疾病的蛋白質(zhì)，例如TGFβ，IFNα，IFNβ，IFNγ，IL-12，可溶性IL-4受體或可溶性IL-6受體，或者治療細(xì)胞-介導(dǎo)的自身免疫疾病的蛋白質(zhì)，例如IL-6，IL-9，IL-10，IL-13，TNFα，IL-4或TNFβ，或治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的蛋白質(zhì)。按照本發(fā)明，也可以選擇其表達(dá)的蛋白質(zhì)直接或間接抑制炎癥(例如關(guān)節(jié)中)和/或促進(jìn)關(guān)節(jié)中的胞外基質(zhì)(軟骨和結(jié)締組織)的重建的結(jié)構(gòu)基因。這些表達(dá)蛋白質(zhì)包括，例如，IL-1受體拮抗劑(IL-1-RA)，因?yàn)镮L-1-RA抑制IL-1α和IL-1β的結(jié)合，可溶性IL-1受體，因?yàn)榭扇苄訧L-1受體結(jié)合和滅活I(lǐng)L-1，IL-6，因?yàn)镮L-6增加滑液細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的TIMP和超氧化物分泌并降低其IL-1和TNFα分泌，可溶性TNF受體，因?yàn)榭扇苄訲NF受體結(jié)合和激活TNF，IL-4，因?yàn)镮L-4抑制IL-1、TNFα和MMP的形成和分泌，IL-l0，因?yàn)镮L-10抑制IL-1、TNFα和MMP的形成和分泌并增加TIMP的分泌，胰島素樣-生長(zhǎng)因子(IGF-1)，因?yàn)镮GF-1刺激胞外基質(zhì)合成，TGFβ，尤其是TGFβ1和TGFβ2，因?yàn)門GFβ刺激胞外基質(zhì)超氧化物歧化酶的合成，或TIMP(金屬蛋白酶組織抑制劑)，尤其是TIMP-1，TIMP-2或TIMP-3。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)也可以是減輕對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損壞的蛋白質(zhì)，例如生長(zhǎng)因子，如FGF，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3(NT-3)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白4(NT-4)或睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)，或細(xì)胞因子，或細(xì)胞因子抑制劑，其能夠抑制或中和TNFα的神經(jīng)毒性作用，例如TGFβ，可溶性TNF受體，IL-10，因?yàn)镮L-10抑制IFNγ、TNFα、IL-2和IL-4的形成，可溶性IL-1受體，如IL-1受體I或IL-1受體II，因?yàn)榭扇苄訧L-1受體中和IL-1，IL-1受體拮抗劑或可溶性IL-6受體的活性。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)也可以是刺激血管生成的蛋白質(zhì)，例如VEGF或FGF。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)還可以是降低血壓的蛋白質(zhì)，例如激肽釋放酶或內(nèi)皮細(xì)胞氧化氮合酶。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)也可以是治療慢性感染病的蛋白質(zhì)，例如顯示出細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)，或?qū)⒖共《净蚣?xì)胞毒性物質(zhì)的前體切割成活性物質(zhì)的酶，或具有抗病毒作用的細(xì)胞毒素或具有抗病毒作用的生長(zhǎng)因子。例子是IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFβ，TNFα，IL-1或TGFβ。
本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，其中組合了編碼相同的或不同的活性化合物(蛋白質(zhì)B)的兩種相同的或兩種不同的DNA序列[組分b)和b’)]。
為了保證兩種DNA序列被表達(dá)，優(yōu)選地是把內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的cDNA作為調(diào)節(jié)元件插入到兩種結(jié)構(gòu)之間。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)使得通過IRES相互連接的兩種DNA序列的表達(dá)成為可能。這種性質(zhì)的IRES已有描述，例如Montford和Smith TIG 11，179(1995)；Kaufman等，核酸研究19，4485(1991)；Morgan等，核酸研究20，1293(1992)；Dirks等，基因128，247(1993)；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988)和Sugitomo等，生物技術(shù).12 694(1994)所描述的。這樣，例如，小兒麻痹病毒IRES序列的cDNA(5′UT R的位置≤140至≥630)[Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988)]可以用來把組分c)的DNA與組分d)的DNA連接起來。編碼蛋白酶-可切割的部分結(jié)構(gòu)C的核酸序列[組分c)]按照本發(fā)明，部分結(jié)構(gòu)C包括一種氨基酸序列，其被在腫瘤中形成或由腫瘤細(xì)胞或炎性細(xì)胞形成的蛋白酶切割。這一部分結(jié)構(gòu)C的核酸序列插入到例如相關(guān)的活性化合物(蛋白質(zhì)B)的天然產(chǎn)生的前體(蛋白質(zhì)BSD，其中S是天然產(chǎn)生的切割序列)核酸序列中，替代切割序列S，以使這種重組核酸表達(dá)蛋白質(zhì)BCD或B’BCD。
編碼部分結(jié)構(gòu)C的核酸序列的選擇取決于主要在腫瘤或炎癥中分泌的蛋白酶。
下列部分結(jié)構(gòu)C可以，例如，用于下列酶[Barrett等，哺乳動(dòng)物的蛋白酶，學(xué)術(shù)出版社，倫敦(1980)，Panchal等，自然生物技術(shù)，14，852(1996)；Pigott等，Ayad等，胞外基質(zhì)，學(xué)術(shù)出版社(1994)；Yoshida等，國(guó)際癌雜志63，863(1995)，Petersen等，生物化學(xué)雜志.265，6104(1990)；Cramer等，泌尿科學(xué)雜志156，526(1995)；Forsgen等，F(xiàn)EBS Lett.213，254(1987)，Zhang等Chin.Chem.41，1567，(1995)]
氨基酸位置(A1-A6和A-1和A-2)按照Schechter和Berger，生物化學(xué)生物物理研究通訊27，157(1967)定義編碼部分結(jié)構(gòu)D的核酸序列[組分d)]按照本發(fā)明，核酸序列[組分d)]編碼一種肽(部分結(jié)構(gòu)D)，該肽通過部分結(jié)構(gòu)C連接到活性化合物(部分結(jié)構(gòu)B)上并以這種結(jié)合方式滅活活性化合物。
優(yōu)選地，那些核酸序列用于部分結(jié)構(gòu)D，其編碼天然產(chǎn)生的前體(蛋白質(zhì)BSD)中的部分結(jié)構(gòu)D，具有在蛋白質(zhì)BSD中的天然切割序列的部分結(jié)構(gòu)S。
活性化合物(蛋白質(zhì)B)的天然產(chǎn)生的前體的結(jié)構(gòu)已有綜述，例如Bartett等，哺乳動(dòng)物的蛋白酶，學(xué)術(shù)出版社，倫敦(1980)(在凝固因子，補(bǔ)體因子和激肽釋放酶的情況下)，Callard等，細(xì)胞因子手冊(cè)，學(xué)術(shù)出版社(1994)(白介素，趨化因子和生長(zhǎng)因子的情況下)，和Denhardt等，Pharmac.Ther.59，329(1993)(在金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)的情況下)。
當(dāng)選擇沒有任何天然產(chǎn)生的前體的活性化合物時(shí)，和在異種活性化合物的情況下，應(yīng)該使用這樣的核酸序列作為組分d)，其編碼任何肽，然而優(yōu)選地是編碼天然存在于人類活性化合物的前體中的那些部分結(jié)構(gòu)D的核酸序列。
為了有利于由新的核酸序列表達(dá)的蛋白質(zhì)BCD或B’BCD的分泌，可以用改善胞外分泌的異源信號(hào)序列替代可以存在于組分b)的DNA序列中的同源信號(hào)序列。例如可以插入免疫球蛋白信號(hào)序列[DNA位置≤63至≥107；Riechmann等，自然332，323(1988)]或CEA信號(hào)序列[DNA位置≤33至≥134，Schrewe等，分子細(xì)胞生物學(xué).10，2738(1990)；Be rling等，癌癥研究.50，5634(1990)]或人類呼吸道合胞病毒糖蛋白的信號(hào)序列[氨基酸≤38至≥50或48至65的cDNA；Lichtenstein等，J.Gen.Virol.77.109(1996)]。
此外，為了加強(qiáng)翻譯，可以在啟動(dòng)子序列的3’末端和直接在信號(hào)序列的起始信號(hào)(ATG)的5’末端插入核苷酸序列GCCACC或GCCGCC[Kozak，細(xì)胞生物學(xué)雜志，108，299(1989)]。制備新的核酸構(gòu)建體通過采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物方法，相互連接各個(gè)組分制備所描述的新的核酸構(gòu)建體。應(yīng)用新的核酸構(gòu)建體特別適宜于治療伴隨有局部形成的蛋白酶增加的疾病，如腫瘤疾病，白血病，變態(tài)反應(yīng)，自身免疫疾病，感染，炎癥，移植排斥反應(yīng)，血栓形成和血管阻塞和其它血液凝固和血液循環(huán)的失調(diào)，和組織損害，包括對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)傷害?？梢越?jīng)局部(例如在皮膚上的)，經(jīng)鼻，經(jīng)口，胃腸，支氣管內(nèi)，膀胱內(nèi)，陰道內(nèi)，向子宮，皮下，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)周，關(guān)節(jié)內(nèi)，向腦脊液，向脊髓，向腦組織，向傷口施用；經(jīng)腹膜內(nèi)或胸膜內(nèi)或全身(例如靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肝門內(nèi))或向心臟施用。
一般來說，合適的話，除常規(guī)添加劑和輔助物質(zhì)之外，藥物包括新的核酸構(gòu)建體或能夠表達(dá)新的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。藥物可以用來預(yù)防或治療以上詳細(xì)描述的疾病。
通過采用技術(shù)人員已知的方法，用新的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備所說的細(xì)胞。
合適的細(xì)胞的例子是內(nèi)皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肝臟細(xì)胞，腎細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，骨或軟骨組織細(xì)胞，滑液細(xì)胞，腹膜細(xì)胞細(xì)胞，皮膚細(xì)胞，上皮細(xì)胞，白血病細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞。
所述新的細(xì)胞也適于制備由新的核酸構(gòu)建體編碼并可以直接用作藥物的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明還涉及新的核酸構(gòu)建體在制備重組改變的細(xì)胞(將核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞中)上的用途，新的核酸構(gòu)建體在制備由核酸構(gòu)建體編碼的蛋白質(zhì)上的用途，使核酸構(gòu)建體在合適的細(xì)胞中表達(dá)，分離所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及攜帶新的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。上述細(xì)胞是優(yōu)選的細(xì)胞。
依據(jù)疾病的性質(zhì)與位點(diǎn)和待轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞，可以例如從以上提到的啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)基因的例子進(jìn)行以下選擇(對(duì)蛋白質(zhì)BCD或B’BCD)腫瘤的治療啟動(dòng)子[組分a)]內(nèi)皮細(xì)胞-特異性和細(xì)胞周期-特異性或細(xì)胞-非特異性或肌肉細(xì)胞-特異性和細(xì)胞周期-特異性或腫瘤細(xì)胞-特異性(實(shí)體腫瘤，白血病)的。下列靶細(xì)胞的配基[組分b’)]增殖內(nèi)皮細(xì)胞或與內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞鄰近的基質(zhì)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。結(jié)構(gòu)基因[組分b)c)d)]凝固-誘導(dǎo)因子的，補(bǔ)體因子的，血管生成抑制劑的，細(xì)胞靜止和細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的，炎癥誘導(dǎo)物的或用以激活細(xì)胞靜止劑前體的酶，例如切割非活性的前體物質(zhì)(原藥)進(jìn)而形成活性細(xì)胞靜止劑(藥物)的酶的。自身免疫疾病和炎癥的治療啟動(dòng)子[組分a)]內(nèi)皮細(xì)胞-特異性和細(xì)胞周期-特異性，或巨噬細(xì)胞-特異性和/或淋巴細(xì)胞-特異性和/或細(xì)胞周期-特異性或滑液細(xì)胞-特異性和/或細(xì)胞周期-特異性的。下列靶細(xì)胞的配基[組分b’)]增殖內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞或滑液細(xì)胞。結(jié)構(gòu)基因[組分b)c)d)]治療抗體-介導(dǎo)的自身免疫疾病的，細(xì)胞增殖抑制劑的，用以激活細(xì)胞靜止劑的前體的或治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞靜止的或細(xì)胞毒素蛋白質(zhì)或酶的。對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的傷害的治療啟動(dòng)子[組分a)]神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞-特異性，內(nèi)皮細(xì)胞-特異性和細(xì)胞周期-特異性或非特異性和細(xì)胞周期-特異性的。下列靶細(xì)胞的配基[組分b’)]神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或增殖內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因[組分b)c)d)]神經(jīng)元生長(zhǎng)因子的，例如細(xì)胞因子和細(xì)胞因子抑制劑(抑制或中和TNFα的神經(jīng)毒性作用)的。血液凝固系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)的失調(diào)的治療啟動(dòng)子[組分a)]細(xì)胞-非特異性，細(xì)胞-非特異性和細(xì)胞周期-特異性，內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞特異性，或內(nèi)皮細(xì)胞特異性，平滑肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞和細(xì)胞周期-特異性的。下列靶細(xì)胞的配基[組分b’)]內(nèi)皮細(xì)胞，增殖的內(nèi)皮細(xì)胞或在內(nèi)皮細(xì)胞附近的體細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。結(jié)構(gòu)基因[組分b)c)d)]抑制凝固的或增強(qiáng)血纖維蛋白溶解的，血管生成因子的，低血壓肽的，抗擴(kuò)增的、細(xì)胞靜止的或細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)的或用以切割細(xì)胞靜止劑的前體(進(jìn)而形成細(xì)胞靜止劑)的酶的，在內(nèi)皮層傷害后抑制平滑肌細(xì)胞增殖的，或血漿蛋白質(zhì)(如C1非激活物、血清膽堿酯酶或αl-抗胰蛋白酶)的。慢性傳染病的治療啟動(dòng)子[組分a)]病毒-特異性，細(xì)胞-特異性或病毒-特異性或細(xì)胞-特異性和細(xì)胞周期-特異性的。下列靶細(xì)胞的配基[組分b’)]肝臟細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)構(gòu)基因[組分b)c)d)]顯示細(xì)胞靜止或細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)的，切割抗病毒或細(xì)胞毒性物質(zhì)的前體進(jìn)而形成活性物質(zhì)的酶的以及抗病毒蛋白質(zhì)(如抗病毒活性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子)的。
借助于下列實(shí)施例與附圖更詳細(xì)地解釋(而不限制)本發(fā)明。
附圖描述圖1包含組分a)，b)，c)和d)的新的核酸構(gòu)建體的圖解。圖2已由添加組分b’)擴(kuò)大了的新核酸構(gòu)建體的圖解。圖3PSA-可激活的因子X的核酸構(gòu)建體的圖解。
實(shí)施例1.編碼前列腺-特異性抗原(PSA)-可激活的FX的核酸構(gòu)建體的制備本實(shí)施例涉及治療前列腺癌轉(zhuǎn)移的治療劑的制備。盡管可以外科切除癌變的前列腺，但前列腺癌的轉(zhuǎn)移經(jīng)常出現(xiàn)，仍然很大程度上是當(dāng)前不可治療的并導(dǎo)致病人死亡。這樣的前列腺癌轉(zhuǎn)移引起血管生成。此外，前列腺癌轉(zhuǎn)移分泌組織-特異性酶，即前列腺-特異性抗原(PSA)。依據(jù)本發(fā)明，制備一種核酸構(gòu)建體，其在引入到增殖的內(nèi)皮細(xì)胞后導(dǎo)致修飾的FX凝固因子表達(dá)。所述修飾包括用編碼PSA-特異性切割位點(diǎn)的核苷酸序列取代天然FX基因中天然切割位點(diǎn)的核苷酸序列，天然切割位點(diǎn)的切割導(dǎo)致凝固-活性FXa。結(jié)果，由前列腺癌轉(zhuǎn)移分泌的PSA能夠特異性地激活修飾的FX(它由轉(zhuǎn)移附近的增殖的內(nèi)皮細(xì)胞分泌)，從而引起凝固，導(dǎo)致向轉(zhuǎn)移處供血被中斷進(jìn)而壞死。
依據(jù)圖3中描述的方案制備PSA-可激活的FX的核酸構(gòu)建體。
按照如下，以5’到3’方向，將單獨(dú)組分的DNA序列連接起來將組分a)融合到組分b)c)d)上，所述組分a)包含cdc25C基因的啟動(dòng)子序列[核酸-290至+121；Lucibello等，EMBO J.14 132(1995)；Zwicker等，核酸研究23，3822(1995)；EMBO J.14 4514(1995)]、序列GCCACC(Kozak，細(xì)胞生物學(xué)雜志.108，229(1989))和免疫球蛋白信號(hào)肽的cDNA[核苷酸序列≤63至≥107；Riechmann等，自然332，323(1988)]，所述組分b)c)d)包含人類FX的cDNA(核苷酸序列1至≥1468)[Messier等，基因99，291(1991)]，其中氨基酸194已從Arg突變至Tyr。
利用合適的限制位點(diǎn)(通過PCR擴(kuò)增在不同的元件的末端引入的)將構(gòu)建體的各個(gè)組分連接起來。利用對(duì)限制位點(diǎn)特異性的技術(shù)人員已知的酶和DNA連接酶進(jìn)行連接。這些酶可以從商業(yè)途徑獲得。
將以這種方法制備的核苷酸構(gòu)建體克隆進(jìn)pUC18/19或Bluescript-衍生的質(zhì)粒載體中。
2.在人類胚胎腎細(xì)胞中的表達(dá)采用本領(lǐng)域已知的方法[Graham和van der Eb，病毒學(xué).52，456(1973)]用以上所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染保持在培養(yǎng)物中的增殖的人類胚胎腎細(xì)胞[HEK 293；Racchi等，生物化學(xué)雜志.268，5735(1993)]。
從約107轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞[Watzke等，J.Clin.Invest.88，1685(1991)]上清液純化突變的因子X，添加和不添加PSA下在凝固試驗(yàn)中試驗(yàn)因子X。從Chemicon(Temecula，CA，美國(guó))獲得純化的PSA。
在這一試驗(yàn)中，人類FX-缺陷血漿中的凝固缺陷被功能性活性FXa補(bǔ)償。
將未突變的(野生型)FX(被Russel’s蝰蛇毒激活)用作陽性對(duì)照。除缺乏PSA的試驗(yàn)混合物之外，將未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的上清液的模擬制劑用作陰性對(duì)照。
由再鈣化時(shí)間測(cè)量突變FX的凝固活性(Seitz R等，國(guó)際癌雜志53514-520，1993)。在37℃下將100μl FX-缺陷血漿(Behringwerke，Marburg)與細(xì)胞上清液100μlFX制劑一起溫育120秒鐘。FX制劑包含作為激活物的PSA。在陰性對(duì)照的情況下不添加PSA。FX(野生型)和Russel’s蝰蛇毒(RVV)用作陽性對(duì)照。通過添加100μl 0.02 MCaCl2加強(qiáng)凝固反應(yīng)，在血凝度計(jì)中測(cè)定。
獲得下列結(jié)果沒有任何凝固的激活的陰性對(duì)照給出約200秒的凝固時(shí)間。相反，當(dāng)使用激活的FX(突變的FX和PSA或野生型FX和RVV)時(shí)，達(dá)到50秒的明顯較短的凝固時(shí)間。
從此可以得出結(jié)論，轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK293細(xì)胞表達(dá)突變的FX，其在附加存在PSA時(shí)，補(bǔ)償FX-缺陷血漿的凝固缺陷。
3.在人類內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)采用本領(lǐng)域已知的方法[Lucibello等，EMBO J.14 132(1995)]用以上所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染保持在培養(yǎng)物中的人類臍帶內(nèi)皮細(xì)胞。
為了檢查細(xì)胞周期特異性，通過在48小時(shí)期間撤去甲硫氨酸，使內(nèi)皮細(xì)胞G0/G1同步。在以Hoechst 33258(Hoechst AG，F(xiàn)rankfurt)染色之后，在熒光-激活細(xì)胞分選儀中測(cè)定細(xì)胞的DNA含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。
用類似于在HEK293細(xì)胞上進(jìn)行的研究的方法在內(nèi)皮細(xì)胞上清液中測(cè)定核酸構(gòu)建體的表達(dá)。
獲得下列結(jié)果由轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)補(bǔ)償FX-缺陷血漿的凝固缺陷，與未轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞上清液的模擬制劑相反。
與已使G0/G1同步的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＝2S)的上清液比較，在增殖的轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＞2S)上清液中檢測(cè)到明顯較高濃度的突變FX。
因而，以上描述的核酸構(gòu)建體導(dǎo)致突變FX的基因在內(nèi)皮細(xì)胞中以細(xì)胞周期-依賴性方式表達(dá)，這種突變FX可以由PSA激活，由此其引起在FX-缺陷血漿中的凝固。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)活性物質(zhì)的核酸構(gòu)建體，所說的活性物質(zhì)被從哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的酶激活，其中所說的構(gòu)建體包括下列組分a)至少一個(gè)啟動(dòng)子元件，b)至少一種編碼活性化合物(蛋白質(zhì)B)的DNA序列，c)至少一種編碼一種氨基酸序列(部分結(jié)構(gòu)C)的DNA序列，所說的氨基酸序列可以被從哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的酶特異性地切割，和d)至少一種編碼一種肽或蛋白質(zhì)(部分結(jié)構(gòu)D)的DNA序列，所說的肽或蛋白質(zhì)利用可切割的氨基酸序列(部分結(jié)構(gòu)C)連接到活性化合物(蛋白質(zhì)B)上并抑制活性化合物(蛋白質(zhì)B)的活性。
2.權(quán)利要求1所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的酶是蛋白酶。
3.權(quán)利要求1或2所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的酶是纖溶酶原激活物、組織蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶。
4.權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、滑液細(xì)胞或病毒-感染細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的核酸構(gòu)建體通過添加組分b’)延長(zhǎng)，所說的b’)組分編碼配基(部分結(jié)構(gòu)B’)，該配基使活性化合物(蛋白質(zhì)B)結(jié)合到靶結(jié)構(gòu)上。
6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的蛋白質(zhì)B和部分結(jié)構(gòu)D是蛋白質(zhì)活性化合物的天然前體的部分，天然切割序列已由部分結(jié)構(gòu)C代替，所述天然切割序列連接部分結(jié)構(gòu)B和D。
7.權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的部分結(jié)構(gòu)D是蛋白質(zhì)活性化合物的天然前體的部分結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中其插入到質(zhì)?；虿《据d體中。
9.權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分a)是啟動(dòng)子序列，其可以被非特異性地、細(xì)胞-特異性地、病毒-特異性地、代謝地、細(xì)胞周期-特異性地激活和/或可以被四環(huán)素激活。
10.權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分a)是至少兩種相同的或不同的啟動(dòng)子序列的組合體。
11.權(quán)利要求9或10任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分a)優(yōu)選地在以下細(xì)胞中激活在內(nèi)皮細(xì)胞中、在靠近激活的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞中、在肌肉細(xì)胞中、在白血病細(xì)胞中、在腫瘤細(xì)胞中、在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中、在淋巴細(xì)胞中，在巨噬細(xì)胞中和/或在滑液細(xì)胞中。
12.權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的活性化合物(蛋白質(zhì)B)激活或抑制生物激活級(jí)聯(lián)和/或是這一級(jí)聯(lián)的活性組分，優(yōu)選地激活或抑制凝固系統(tǒng)，激活血纖維蛋白溶解，激活補(bǔ)體系統(tǒng)和/或激活激肽系統(tǒng)；或是將藥理學(xué)物質(zhì)的非活性前體轉(zhuǎn)化成為活性物質(zhì)的酶；或自身是一種藥理學(xué)上的活性物質(zhì)。
13.權(quán)利要求12所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的活性化合物(蛋白質(zhì)B)是選自凝血酶、因子Va、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、TF凝固-活性片段或因子XIIa的凝固因子；在Arg-Thr切割位點(diǎn)(327/328位氨基酸)區(qū)中突變的凝血酶；選自尿激酶、tPA或其功能性雜合體的纖維蛋白溶解蛋白質(zhì)；選自CVF、C3b或其功能性切割產(chǎn)物的補(bǔ)體因子；選自蛋白質(zhì)C、C-1S抑制劑、αl-抗胰蛋白酶、水蛭素、AT-III、TFPI、PAI-1、PAI-2或PAI-3的抗血栓形成蛋白質(zhì)；激肽釋放酶；細(xì)胞靜止的細(xì)胞毒性的或引起炎癥的蛋白質(zhì)；抗血管生成蛋白質(zhì)；免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)；抗炎蛋白質(zhì)；減輕對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損壞的蛋白質(zhì)；抑制或中和TNFα的神經(jīng)毒性作用的蛋白質(zhì)；血管生成-刺激蛋白質(zhì)；減壓蛋白質(zhì)；抗病毒蛋白質(zhì)；細(xì)胞因子；干擾素；腫瘤壞死因子；制瘤素M或LIF；細(xì)胞因子受體；胞外部的細(xì)胞因子受體的部分；細(xì)胞因子拮抗劑；生長(zhǎng)因子；生長(zhǎng)因子受體；胞外部的生長(zhǎng)因子受體的部分；趨化因子；血管抑制蛋白；血小板因子4；TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3；硝基還原酶；β-葡萄糖醛酸酶；羧肽酶；β-內(nèi)酰胺酶；胞嘧啶脫氨酶；過氧化氫酶；過氧化物酶；磷酸酶；氧化酶；激肽釋放酶或內(nèi)皮細(xì)胞氧化氮合酶。
14.權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中組分b’)編碼一種配基(部分結(jié)構(gòu)B’)，該配基結(jié)合到細(xì)胞的表面，優(yōu)選地結(jié)合到細(xì)胞膜受體、細(xì)胞膜抗原、細(xì)胞膜-定位粘附分子或胞外基質(zhì)或其組分上。
15.權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的配基是特異性地結(jié)合到細(xì)胞膜抗原或在胞外基質(zhì)上的抗原上的抗體或抗體片段，或是結(jié)合到在細(xì)胞膜上的受體上的肽或蛋白質(zhì)，優(yōu)選地結(jié)合到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、干擾素、腫瘤壞死因子、趨化因子、這些配基的受體-結(jié)合部分序列、肽激素、血管緊張肽、激肽、葉酸、粘附分子或結(jié)合到相應(yīng)的粘附分子或結(jié)合到胞外基質(zhì)上的粘附分子的部分序列、Fc受體的胞外部分、病毒糖蛋白、結(jié)合到這些細(xì)胞上的糖蛋白的部分序列、受體或病毒糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域或糖磷脂錨上。
16.權(quán)利要求14或15所要求的核酸構(gòu)建體，其中配基結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞，優(yōu)選地結(jié)合到激活或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、肌肉細(xì)胞優(yōu)選地是平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、腎細(xì)胞、滑液細(xì)胞、炎性細(xì)胞、病毒-感染細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或白血病細(xì)胞上。
17.權(quán)利要求1～16任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的構(gòu)建體包括至少兩個(gè)相同的或不同的組分b)c)d)或b’)b)c)d)，該組分利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)相互連接。
18.一種制備權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體的方法，該方法包括將所說的組分相互連接。
19.權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體在制備局部或全身施用來預(yù)防和/或治療下列疾病的藥物上的用途，所說的疾病是腫瘤、白血病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病、感染、炎癥、移植物排斥反應(yīng)、血栓形成、血管阻塞、凝血和血液循環(huán)失調(diào)、組織損傷和/或神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
20.權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體在制備重組改變的細(xì)胞上的用途，其中所說的核酸構(gòu)建體被引入到合適的細(xì)胞中。
21.權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體在制備一種蛋白質(zhì)上的用途，所說的蛋白質(zhì)由所說的核酸構(gòu)建體編碼，其中使所說的核酸構(gòu)建體在合適的細(xì)胞中表達(dá)，并分離形成的蛋白質(zhì)。
22.權(quán)利要求20或21所要求的用途，其中所說的細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨或軟骨組織細(xì)胞、滑液細(xì)胞、腹膜細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞、白血病細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞。
23.攜帶權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。
全文摘要
表達(dá)活性物質(zhì)(其被從哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的酶激活)的核酸構(gòu)建體,它包括下列組分:a)至少一個(gè)啟動(dòng)子元件,b)至少一種編碼活性化合物(蛋白質(zhì)B)的DNA序列,c)至少一種編碼一種氨基酸序列(部分結(jié)構(gòu)C)的DNA序列,所說的氨基酸序列可以被從哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放的酶特異性地切割,和d)至少一種編碼一種肽或蛋白質(zhì)(部分結(jié)構(gòu)D)的DNA序列,該肽或蛋白質(zhì)利用可切割的氨基酸序列(部分結(jié)構(gòu)C)連接到活性化合物(蛋白質(zhì)B)上并抑制活性化合物(蛋白質(zhì)B)的活性。還涉及所說的核酸構(gòu)建體在制備治療疾病的藥物上的用途。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1192473SQ9810379
公開日1998年9月9日 申請(qǐng)日期1998年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月16日
發(fā)明者H·H·海德特曼, R·穆勒, H·H·塞德拉塞克 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司