專利名稱：人絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅱ編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人絲氨酸/蘇氨酸激酶II(簡(jiǎn)稱為STK2)的cDNA序列，該蛋白是Rac蛋白的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
Rac蛋白激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶大家族中的Rho家族的一部分。它被認(rèn)為參與信號(hào)分子傳導(dǎo)過(guò)程。Rac蛋白激酶還與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白活動(dòng)，使肌動(dòng)蛋白構(gòu)成細(xì)胞骨架的組成部分并參與各種細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。Rac蛋白是一類小型的GTP酶，它的N端是保守的pleckstrin同源區(qū)，C端是絲氨酸蘇氨酸激酶活性區(qū)。它是信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，當(dāng)它結(jié)合了GTP后，就成為活性狀態(tài)，使多種蛋白磷酸化而被激活，產(chǎn)生各種細(xì)胞反應(yīng)。Rac蛋白廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、遷移、趨化、超氧化物形成等活動(dòng)，和神經(jīng)生長(zhǎng)中的肌動(dòng)蛋白骨架的組織、表皮細(xì)胞的細(xì)胞極性和形態(tài)的確立以及胚胎發(fā)育的細(xì)胞遷移直接相關(guān)。另外，在淋巴肥大細(xì)胞中，Rac蛋白具有調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的分泌作用的功能(Curr.Biol.5(1)68-73，1995)。Rac下游的一個(gè)效應(yīng)物變異與免疫系統(tǒng)異常的Wiskott-Aldrich綜合癥直接相關(guān)(Curr.Biol.6(1)70-75，1996)。
對(duì)于Rac蛋白，最早由瑞典Jones等人于1991年從人MCF-7和WI38細(xì)胞株cDNA文庫(kù)中克隆得到的兩個(gè)高度同源的基因(Proc.Natl.Acad.Sci.88(10)4171-4175，1991；Cell Regul.2(12)1001-1009，1991)。1994年日本的Konishi等人在大鼠的精巢細(xì)胞cDNA庫(kù)中分離得到Rac基因在鼠中的同源物Racα和Racβ(Biochem.Biophys.Res.Commun.205(1)817-825，1994)，并于1995年從大鼠的腦細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆得到Rac的第三個(gè)成員Racγ基因(Biochem.Biophvs.Res.Commun.216(2)526-534，1995)。在本發(fā)明之前，尚沒(méi)有任何人公開(kāi)過(guò)本申請(qǐng)中涉及的另一個(gè)人類Rac家族成員STK2。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼Rac同源蛋白，本發(fā)明的Rac同源基因被命名為人STK2。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的蛋白，該蛋白被命名為人STK2。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人STK2蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種人STK2編碼序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核昔酸48-1487位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.7所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸49-1487位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的STK2蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.7氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有STK2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成STK2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成STK2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)STK2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有STK2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為1706個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.6，其中開(kāi)放讀框位于48-1487位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“STK2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中48-1487位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框48-1487位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.6中48-1487位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，更佳地能在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人STK2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“STK2蛋白多肽”指具有STK2蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人STK2相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括STK2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與STK2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗STK2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含STK2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了STK2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有STK2多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供STK2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然STK2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括STK2多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)STK2的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針?lè)肿?，該分子通常具有STK2多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼STK2的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)STK2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于STK2多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)STK2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于STK2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與STK2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制STK2蛋白的分子，也包括那些并不影響STK2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的STK2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的STK2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)STK2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷STK2功能的抗體以及不影響STK2功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用STK2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與STK2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
在本發(fā)明中，人STK2的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，合成正向引物C15’-GTTGTCATGTATGAAATGATGTG-3’和反向引物C25’-GTCTGAGCTGTAAATTCTTCATC-3’，進(jìn)行PCR，獲得334bp的目的片段。然后標(biāo)記該片段，以該標(biāo)記片段為探針與擴(kuò)增后的人腦λgt11cDNA文庫(kù)雜交，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)同樣的探針及篩選過(guò)程對(duì)得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行復(fù)篩后，最終得到若干陽(yáng)性單克隆。再以這些陽(yáng)性克隆為模板，用C1、C2與λgt11左右臂上的引物S1及S2(S15′-GTTCAACATCAGCCGCTACA-3′；S25′-CACCAGACCAACTGGTAATG-3′)進(jìn)行搭配擴(kuò)增，產(chǎn)物作為探針與擴(kuò)增后的人腦λgt11cDNA文庫(kù)雜交，再次得到若干陽(yáng)性克隆。以它們?yōu)槟０?，用寡核苷酸R5’-ACCATAGAACGTGTGCGGTCC-3’和S1、S2分別搭配，作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑選向5’端或3’端延伸最長(zhǎng)的3個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共1706bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.6。
Rac蛋白是一類小型的GTP酶。我們克隆了一個(gè)新的人類基因STK2，該基因與鼠Racγ基因高度同源，這表明它是Rac家族在人中的一個(gè)同源基因，并且具有和Rac家族其它成員相似的生物學(xué)功能。Rac蛋白的N端是保守的pleckstrin同源區(qū)，C端是絲氨酸蘇氨酸激酶活性區(qū)。它是信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，當(dāng)它結(jié)合了GTP后，就成為活性狀態(tài)，使多種蛋白磷酸化而被激活，產(chǎn)生各種細(xì)胞反應(yīng)。其中最重要的下游效應(yīng)物是磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)，PIP5K被活化后催化磷脂酰肌酸-4，5-二磷酸(PIP2)的形成(Curr.Opin.Cell Biol.986-92，1997；Curr.Opin.Gene Dev.863-67，1998)。PIP2可誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲纖維頂端帽蛋白的脫落和纖維的延伸，并且加速肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和肌動(dòng)蛋白絲的聯(lián)系，最終導(dǎo)致片狀足等結(jié)構(gòu)的形成和細(xì)胞膜的皺折。PIP2可以和含pleckstrin同源區(qū)的蛋白結(jié)合，活化它們的激酶活性，幫助它們?cè)诩?xì)胞膜上分布，并促進(jìn)Ca2+的流動(dòng)。PIP2對(duì)Rac蛋白也有逆效應(yīng)。Rac蛋白廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、遷移、趨化、超氧化物形成等活動(dòng)，和神經(jīng)生長(zhǎng)中的肌動(dòng)蛋白骨架的組織、表皮細(xì)胞的細(xì)胞極性和形態(tài)的確立以及胚胎發(fā)育的細(xì)胞遷移直接相關(guān)。另外，在淋巴肥大細(xì)胞中，Rac蛋白具有調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的分泌作用的功能(Curr.Biol.5(1)68-73，1995)。Rac下游的一個(gè)效應(yīng)物變異與免疫系統(tǒng)異常的Wiskott-Aldrich綜合癥直接相關(guān)(Curr.Biol.6(1)70-75，1996)。本發(fā)明的多肽為該病癥的病理研究和治療提供一種途徑。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1STK2的cDNA序列的克隆和測(cè)定1.引物擴(kuò)增以人腦λgt11cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸C15’-GTTGTCATGTATGAAATGATGTG-3’(SEQ ID NO.1)和寡核苷酸C25’-GTCTGAGCTGTAAAT TCTTCATC-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR，PCR條件為93℃3分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1.5分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的334bp目的片段。
2.探針及其標(biāo)記以C1、C2為引物，用α-32P-dATP(DuPont公司)對(duì)步驟1得到的目的片段進(jìn)行PCR法標(biāo)記，條件同步驟1，得到探針。
3.cDNA文庫(kù)擴(kuò)增及印跡標(biāo)記(篩選文庫(kù))將人腦λgt11cDNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，克隆數(shù)達(dá)50萬(wàn)個(gè)，然后將擴(kuò)增好的cDNA文庫(kù)印跡到Hybond TM-N+尼龍膜上(Amersham)，再將標(biāo)記好的探針變性后與印跡膜雜交，洗膜，放入帶增感屏的片夾，與FUJI MEDIAI X光膠片于-80℃下進(jìn)行放射自顯影，72小時(shí)后沖片。
4.挑取克隆及初篩克隆的復(fù)篩通過(guò)上述雜交篩選獲得多個(gè)初篩陽(yáng)性克隆，用上述相同的探針雜交和篩選過(guò)程對(duì)這些陽(yáng)性克隆進(jìn)行復(fù)篩，最終得到12個(gè)陽(yáng)性單克隆。
5.單克隆的鑒定和測(cè)序以上述步驟4中得到的單克隆噬菌體為模板，用上述步驟1的兩個(gè)正反引物分別與λgt11左右臂上的引物S15′-GTTCAACATCAGCCGCTACA-3′(SEQ ID NO.3)及S25′-CACCAGACCAACTGGTAATG-3′(SEQ ID NO.4)進(jìn)行搭配擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以判斷每個(gè)克隆從探針出發(fā)向5′或3′步移(延伸)的長(zhǎng)度，從中選出向5′延伸最長(zhǎng)和向3′延伸最長(zhǎng)的克隆。將這個(gè)克隆S1-S2擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SwquiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序。用SequiThermEXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得部分cDNA序列。
6.全長(zhǎng)的獲得仿照步驟3，以C1S1和C2S2為混合探針再雜交以人腦λgt11cDNA文庫(kù)，得到26個(gè)陽(yáng)性克隆。以這26個(gè)克隆為模板，用寡核苷酸R5’ACCATAGAACGTGTGCGGTCC-3’(SEQ ID NO.5)和寡核苷酸S1、S2分別搭配，作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為93℃3分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃2分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。挑選向5’端或3’端延伸最長(zhǎng)的3個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共1706bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.6，其中開(kāi)放讀框位于49-1487位核苷酸。
根據(jù)得到的cDNA序列推導(dǎo)出STK2的氨基酸序列，共479個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID NO.7。
實(shí)施例2同源比較用STK2的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)STK2與小鼠RACγ基因及其編碼蛋白具有極高同源性，用PCGENE軟件比較發(fā)現(xiàn)它們?cè)诤怂岷偷鞍姿缴系耐恍苑謩e達(dá)到了85.3％和98.9％。這表明，它們屬于同一個(gè)家族，而且STK2具有相似或相同的功能。
Rac蛋白是一類小型的GTP酶，是絲氨酸/蘇氨酸激酶大家族中的Rho家族的一個(gè)組成部分。Rac的N端是保守的pleckstrin同源區(qū)(pH域)，該區(qū)域由大約100個(gè)氨基酸組成，顯示以下共同特征它由兩個(gè)互相垂直的反平行β-折疊組成，后續(xù)一個(gè)C-末端的親水螺旋。連接兩個(gè)β-折疊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在各種PH域中長(zhǎng)度有很大的不同，而且在PH域中還沒(méi)有完全保守的氨基酸殘基存在，使得PH域相對(duì)較難被識(shí)別。本發(fā)明中對(duì)應(yīng)的PH區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO.7中第1位至第109位氨基酸。Rac蛋白的C端是絲氨酸蘇氨酸激酶活性區(qū)(L/I/V/M/F/Y/C)X(H/Y)XD(L/I/V/M/F/Y)KX2N(L/I/V/M/F/Y/C/T)3，其中(L/I/V/M/F/Y/C)表示所列7種氨基酸中任選一種，Xn表示n個(gè)任意氨基酸，本發(fā)明中對(duì)應(yīng)的序列為SEQ ID NO.7中第267位至第289位氨基酸。這進(jìn)一步確定了本發(fā)明的STK2是Rac家族的一員，并且具有該家族蛋白的相關(guān)功能。
Rac蛋白是信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，當(dāng)它結(jié)合了GTP后，就成為活性狀態(tài)，使多種蛋白磷酸化而被激活，產(chǎn)生各種細(xì)胞反應(yīng)。其中最重要的下游效應(yīng)物是磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)，PIP5K被活化后催化磷脂酰肌酸-4，5-二磷酸(PIP2)的形成(Curr.Opin.Cell Biol.986-92，1997；Curr.Opin.Gene Dev.863-67，1998)。PIP2可誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲纖維頂端帽蛋白的脫落和纖維的延伸(Cell82643-653，1995)，并且加速肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和肌動(dòng)蛋白絲的聯(lián)系，最終導(dǎo)致片狀足等結(jié)構(gòu)的形成和細(xì)胞膜的皺折(EMBO J.153778-3786，1996)。PIP2可以和PH域的蛋白結(jié)合(Science 371168-170，1994)，活化它們的激酶活性，幫助它們?cè)诩?xì)胞膜上分布，并促進(jìn)Ca2+的流動(dòng)。PIP2對(duì)Rac蛋白也有逆效應(yīng)，可能對(duì)其在特定條件下的轉(zhuǎn)移、活化是必需的。Rac蛋白可通過(guò)PIP5K的作用廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、遷移、趨化、超氧化物形成等活動(dòng)。果蠅中的同源基因研究表明Rac和神經(jīng)生長(zhǎng)中的肌動(dòng)蛋白骨架的組織(Genes Dev.81787-1802，1994)、表皮細(xì)胞的細(xì)胞極性和形態(tài)的確立(J.Cell.Biol.131151-164，1995)以及胚胎發(fā)育的細(xì)胞遷移直接相關(guān)(J.Cell.Biol.133617-630，1996)。另外，在淋巴肥大細(xì)胞中，Rac蛋白被發(fā)現(xiàn)能捕獲從外層釋放的內(nèi)源纖絲成分，從而證明了其具有調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的分泌作用的功能(Curr.Biol.5(1)68-73，1995)。Rac下游的一個(gè)效應(yīng)物變異與免疫系統(tǒng)異常的Wiskott-Aldrich綜合癥直接相關(guān)。該病癥表現(xiàn)為血小板和T細(xì)胞形態(tài)異常及微絨毛數(shù)量減少，從而導(dǎo)致血小板數(shù)量減少，減弱免疫反應(yīng)(Curr.Biol.6(1)70-75，1996)。本發(fā)明的多肽可以為該病癥的病理研究和治療提供一個(gè)途徑。
實(shí)施例3STK2在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼STK2的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物在人腦λgt11cDNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得STK2 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-TCCGGTCGACATGAGCGATGTTACCATTG-3′(SEQ ID NO.8)，該引物含有SalI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的STK2編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-GTTGTCGACTTATTCTCGTCCACTTGCAG-3’(SEQ ID NO.9)，該引物含有SalI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和STK2的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI分別消化pQE-9載體與插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開(kāi)放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購(gòu)自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測(cè)序驗(yàn)證STK2的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子克隆。過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過(guò)使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過(guò)在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的STK2。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫STK2?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約56KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.7的序列一致。
實(shí)施例4STK2在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼STK2的cDNA序列，用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得STK2 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-TCGGGAATTCATGAGCGATGTTACCATTG-3′(SEQ ID NO.10)該引物含有EcoRI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的STK2編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-GTTGGGCCCTTATTCTCGTCCACTTGCAG-3’(SEQ ID NO.11)該引物含有ApaI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和STK2的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用EcoRI和ApaI分別消化pcDNA3載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測(cè)序驗(yàn)證STK2的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO是用脂轉(zhuǎn)染法，采用Lipofectin試劑盒(GiBcolife)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽(yáng)性亞克隆。48小時(shí)后，開(kāi)始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為56KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.7的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3或4中獲得的重組蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀STK2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GTTGTCATGT ATGAAATGAT GTG23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.2GTCTGAGCTG TAAATTCTTC ATC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.3GTTCAACATC AGCCGCTACA 20(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.4CACCAGACCA ACTGGTAATG 20(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5ACCATAGAAC GTGTGCGGTC C 21(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1706bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.61 TCACAAAGTACCATTTCTTCAAGTTGGGGGCTCAGAGGGGAGTCATCATGAGCGATGTTA61 CCATTGTGAAAGAAGGTTGGGTTCAGAAGAGGGGAGAATATATAAAAAACTGGAGGCCAA121 GATACTTCCTTTTGAAGACAGATGGCTCATTCATAGGATATAAAGAGAAACCTCAAGATG181 TGGATTTACCTTATCCCCTCAACAACTTTTCAGTGGCAAAATGCCAGTTAATGAAAACAG241 AACGACCAAAGCCAAACACATTTATAATCAGATGTCTCCAGTGGACTACTGTTATAGAGA301 GAACATTTCATGTAGATACTCCAGAGGAAAGGGAAGAATGGACAGAAGCTATCCAGGCTG361 TAGCAGACAGACTGCAGAGGCAAGAAGAGGAGAGAATGAATTGTAGTCCAACTTCACAAA421 TTGATAATATAGGAGAGGAAGAGATGGATGCCTCTACAACCCATCATAAAAGAAAGACAA481 TGAATGATTTTGACTATTTGAAACTACTAGGTAAAGGCACTTTTGGGAAAGTTATTTTGG541 TTCGAGAGAAGGCAAGTGGAAAATACTATGCTATGAAGATTCTGAAGAAAGAAGTCATTA601 TTGCAAAGGATGAAGTGGCACACACTCTAACTGAAAGCAGAGTATTAAAGAACACTAGAC661 ATCCCTTTTTAACATCCTTGAAATATTCCTTCCAGACAAAAGACCGTTTGTGTTTTGTGA721 TGGAATATGTTAATGGGGGCGAGCTGTTTTTCCATTTGTCGAGAGAGCGGGTGTTCTCTG781 AGGACCGCACACGTTTCTATGGTGCAGAAATTGTCTCTGCCTTGGACTATCTACATTCCG841 GAAAGATTGTGTACCGTGATCTCAAGTTGGAGAATCTAATGCTGGACAAAGATGGCCACA901 TAAAAATTACAGATTTTGGACTTTGCAAAGAAGGGATCACAGATGCAGCCACCATGAAGA961 CATTCTGTGGCACTCCAGAATATCTGGCACCAGAGGTGTTAGAAGATAATGACTATGGCC1021 GAGCAGTAGACTGGTGGGGCCTAGGGGTTGTCATGTATGAAATGATGTGTGGGAGGTTAC1081 CTTTCTACAACCAGGACCATGAGAAACTTTTTGAATTAATATTAATGGAAGACATTAAAT1141 TTCCTCGAACACTCTCTTCAGATGCAAAATCATTGCTTTCAGGGCTCTTGATAAAGGATC1201 CAAATAAACGCCTTGGTGGAGGACCAGATGATGCAAAAGAAATTATGAGACACAGTTTCT1261 TCTCTGGAGTAAACTGGCAAGATGTATATGATAAAAAGCTTGTACCTCCTTTTAAACCTC1321 AAGTAACATCTGAGACAGATACTAGATATTTTGATGAAGAATTTACAGCTCAGACTATTA1381 CAATAACACCACCTGAAAAATATGATGAGGATGGTATGGACTGCATGGACAATGAGAGGC1441 GGCCGCATTTCCCTCAATTTTCCTACTCTGCAAGTGGACGAGAATAAGTCTCTTTCATTC1501 TGCTACTTCACTGTCATCTTCAATTTATTACTGAAAATGATTCCTGGACATCACCAGTCC1561 TAGCTCTTACACATAGCAGGGGCACCTTCCGACATCCCAGACCAGCCAAGGGTCCTCACC1621 CCTCGCCACCTTTCACCCTCATGAAAACACACATACACGCAAATACACTCCAGTTTTTGT1681 TTTTGCATGAAATTGTATCCGGAATT(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度479個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.71 Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg16 Gly Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys31 Thr Asp Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val46 Asp Leu Pro Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln61 Leu Met Lys Thr Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg76 Cys Leu Gln Trp Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp91 Thr Pro Glu Glu Arg Glu Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val106 Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser121 Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala136 Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr151 Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val166 Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Lys181 Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr196 Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu Thr Ser211 Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val Met226 Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu241 Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile256 Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg271 Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile286 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala301 Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro316 Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp331 Gly Leu Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro346 Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met361 Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser376 Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp Pro Asn Lys Arg Leu Gly391 Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met Arg His Ser Phe Phe406 Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys Lys Leu Val Pro421 Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr Phe436 Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro Pro Glu451 Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Met Asp Cys Met Asp Asn Glu Arg Arg466 Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Arg Glu(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TCCGGTCGAC ATGAGCGATG TTACCATTG29(2)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.9GTTGTCGACT TATTCTCGTC CACTTGCAG 29(2)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.10TCGGGAATTC ATGAGCGATG TTACCATTG29(2)SEQ ID NO.11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.11GTTGGGCCCT TATTCTCGTC CACTTGCAG 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.7所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中核苷酸48-1487位的序列。
4.一種分離的STK2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有STK2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有STK2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成STK2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成STK2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)STK2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有STK2蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.6中從核苷酸48-1487位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的STK2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針?lè)肿?，其特征在于，它含有?quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說(shuō),本發(fā)明涉及一種新的人絲氨酸/蘇氨酸激酶STK2的cDNA序列,該蛋白是Rac蛋白的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1246537SQ98111040
公開(kāi)日2000年3月8日 申請(qǐng)日期1998年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月31日
發(fā)明者余龍, 戴方彥, 畢安定, 范玉新, 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)