專利名稱：人熱休克關(guān)聯(lián)蛋白編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族的新成員的cDNA編碼序列。本發(fā)明還涉及該cDNA序列編碼的多肽、所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法、以及這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用。
熱休克蛋白(hsp)是細(xì)胞或生物體在諸如熱休克、化學(xué)物質(zhì)等環(huán)境壓力下，合成受誘導(dǎo)或增加的一類蛋白。值得注意的是，壓力的類型和嚴(yán)重程度決定著hsp的應(yīng)答情況，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞存活或死亡。輕度的壓力可使細(xì)胞作好準(zhǔn)備對(duì)付以后嚴(yán)重的壓力，而沒有作好準(zhǔn)備的細(xì)胞通常不能存活。根據(jù)分子量和氨基酸順序同源度，hsp可分為不同的家族，hsp70家族就是其中之一。
這個(gè)家族的蛋白不僅在壓力下誘導(dǎo)，而且一些被稱為熱休克關(guān)聯(lián)蛋白(hsc)成員還組成型表達(dá)，這表明它們不僅在關(guān)鍵時(shí)刻起作用，而且在正常條件下也起作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)此類蛋白廣泛參與蛋白質(zhì)的代謝活動(dòng)，包括蛋白質(zhì)的折疊、跨細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸、蛋白水解、蛋白裝配，以及蛋白集合體和多蛋白結(jié)構(gòu)的解裝配。大腸桿菌中的DnaJ、DnaK就屬于這類蛋白，DnaJ作為調(diào)控因子調(diào)節(jié)DnaK的活性，主要是刺激DnaK的ATP酶活，使產(chǎn)生能量用于蛋白折疊等代謝活動(dòng)。
近幾年的研究表明，真核細(xì)胞中也存在與DnaJ、DnaK同源的蛋白家族。1989年Sadler等人(J.Cell.Biol.109(1989)，2665-1675)首次描述了酵母中與DnaJ同源的蛋白Sec63。蛋白Sec63含有與DnaJ的N端相似的一段70個(gè)氨基酸的區(qū)域，該蛋白質(zhì)參與將蛋白運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程。此后，從酵母中分離克隆到一些DnaJ同源蛋白。1992年Cheetham等人(Biochem.J.284(1992)，469-476)用雙螺旋纖維蛋白的多克隆抗血清掃描人類前腦皮層表達(dá)cDNA庫，首先克隆人類的DnaJ同源cDNA，HSJ1，推導(dǎo)出的氨基酸順序與其它物種中的蛋白很相似。隨后幾年又有HDJ1，HDJ2，HSJ1-b等與DnaJ同源的人類蛋白被克隆。但在本發(fā)明被公布之前，尚沒有任何人公開過本發(fā)明涉及的人類HSC家族新成員。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的人多核苷酸，該多核苷酸編碼熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族的一個(gè)新成員，本發(fā)明的熱休克關(guān)聯(lián)蛋白同系物命名為HSC3。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族成員，它被命名為HSC3。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族成員的方法。
本發(fā)明還涉及HSC3多肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HSC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的HSC3蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有HSC3蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有HSC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成HSC3蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成HSC3蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)HSC3蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有HSC3蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1203個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于108-1037位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HSC3蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HSC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中108-1037位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框108-1037位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中108-1037位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人HSC3相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HSC3蛋白多肽”指具有HSC3蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人熱休克關(guān)聯(lián)蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括HSC3蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與HSC3 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗HSC3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含HSC3多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了HSC3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有HSC3多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供HSC3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然HSC3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括HSC3多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)HSC3的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有HSC3多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼HSC3的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測HSC3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于HSC3多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)HSC3 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于HSC3基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與HSC3基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制HSC3蛋白的分子，也包括那些并不影響HSC3蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的HSC3基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的HSC3基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)HSC3或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷HSC3功能的抗體以及不影響HSC3功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用HSC3基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與HSC3基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體，可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
在本發(fā)明中，HSC3的cDNA核苷酸序列是如此獲得的以人睪丸λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物A15′-TACCTATTTGCAGTCACTACCTC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B15′-ATCCTTTTCTGACATACCCATTC-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。電泳檢測得到約1.2kb的目的片段。經(jīng)鑒定測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的HSC3的cDNA序列與已被發(fā)表并確認(rèn)為的熱休克關(guān)聯(lián)蛋白基因序列高度同源，并且本發(fā)明HSC3蛋白也與已知的熱休克關(guān)聯(lián)蛋白(如鼠的熱休克關(guān)聯(lián)蛋白)高度同源。此外，本發(fā)明的HSC3蛋白還具有熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族高度保守的氨基酸序列。因此，這表明，與已知鼠熱休克關(guān)聯(lián)蛋白等熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族成員一樣，本發(fā)明的HSC3蛋白也屬于熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族，并且具有相似的功能。
許多慢性炎癥是由抗原激活免疫系統(tǒng)引發(fā)的，一系列隨后的反應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)，這些蛋白反過來保護(hù)細(xì)胞和組織免受炎癥的有害影響?，F(xiàn)有跡象表明，hsp70等熱休克蛋白的一些保護(hù)功能可能依賴于熱休克蛋白的正常細(xì)胞功能，即陪伴變性或折疊不正確的蛋白以及伴隨它們穿過細(xì)胞膜的功能(Experienntia(1994)501031-1038)。有實(shí)驗(yàn)表明hsp70家族的成員可改善抗原加工及遞呈，從而使免疫應(yīng)答更有效(Int.Immun.6(1994)925-930)。這都說明hsp70在炎癥中的保護(hù)作用，而且hsp70對(duì)于真核細(xì)胞中受損蛋白的復(fù)性也是必需的。DnaJ主要功能是協(xié)助hsp70及其同源蛋白的功能，例如蛋白折疊、蛋白裝配等。由于與DnaJ蛋白同源，因此本發(fā)明的HSC3在蛋白質(zhì)代謝過程中也具有類似于DnaJ的功能，特別是在炎癥反應(yīng)中可能起到保護(hù)作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1HSC3的cDNA的克隆和測序1.PCR擴(kuò)增以人睪丸λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物A15′-TACCTATTTGCAGTCACTACCTC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B15′-ATCCTTTTCTGACATACCCATTC-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A1/B1的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約1.2kbd的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⒉襟E1中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1203bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于108-1037位核苷酸。
根據(jù)得到的全長基因組序列推導(dǎo)出HSC3的氨基酸序列，共309個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實(shí)施例2HSC3同源比較本發(fā)明的全長cDNA順序進(jìn)行Basic BLAST同源比較，采用的數(shù)據(jù)庫是非冗余的GenBank+EMBL+DDBJ+PDB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鼠的熱休克關(guān)聯(lián)蛋白(數(shù)據(jù)庫編號(hào)及名稱gb|AF03596|MRJ)同源度最高，核苷酸順序與對(duì)應(yīng)的MRJ相似度為90％。
用PCGENE軟件將本發(fā)明的全長cDNA順序翻譯成蛋白質(zhì)順序，ORF位于108-1037位核苷酸，編碼一段長309個(gè)氨基酸的多肽。然后將得到的氨基酸順序進(jìn)行Basic BLAST同源比較，采用的數(shù)據(jù)庫是非冗余的GenBank翻譯CDS+PDB+SwissPort+更新SP+PIR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鼠的熱休克關(guān)聯(lián)蛋白(數(shù)據(jù)庫編號(hào)及名稱gi|3142372|MRJ)同源度最高，氨基端68個(gè)氨基酸殘基98％相同，羧基端的四分之一順序也有96％相似，92％相同。
Hsp70是一類熱休克蛋白，它作用的基本機(jī)理是在依賴ATP的方式下結(jié)合、釋放非天然構(gòu)像的多肽。研究發(fā)現(xiàn)hsp70不是單獨(dú)發(fā)揮作用的，需要另外的熱休克蛋白例如DnaJ的參與作用，DnaJ作為調(diào)控因子調(diào)節(jié)hsp70的活性。大腸桿菌DnaJ主要功能特征是直接與hsp70結(jié)合，刺激hsp70的ATP酶活(Trends.Biochem.Sci.19(1994)，20-25；Trends.Bochem.Sci.17(1992)，295-299)。在酵母、植物、人類中已鑒定出一些與大腸桿菌DnaJ同源的基因。
遺傳和生化實(shí)驗(yàn)表明真核生物DnaJ類似蛋白與大腸桿菌DnaJ功能相關(guān)(Cell71(1992)，1143-1155；J.Biol.Chem.267(1992)，20927-20931)。比較DnaJ家族成員的氨基酸順序，發(fā)現(xiàn)所有的DnaJ類似蛋白含有J結(jié)構(gòu)域，這是一段對(duì)應(yīng)于大腸桿菌DnaJ氨基端70個(gè)氨基酸的一段順序，而且DnaJ與hsp70結(jié)合并調(diào)節(jié)其ATP活性很有可能通過該結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用(Trends.Biochem.Sci.19(1994)，176-181)。本發(fā)明HSC3氨基端68個(gè)氨基酸殘基與大腸桿菌的J結(jié)構(gòu)域相似性達(dá)81％，表明HSC3也有J結(jié)構(gòu)域，屬于DnaJ類似蛋白，是熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族的新成員。
在不同的生物中，DnaJ類似蛋白直接或間接地參與胞內(nèi)活動(dòng)。它作為調(diào)控因子調(diào)節(jié)hsp70的活性，正是通過J結(jié)構(gòu)域識(shí)別hsp70而發(fā)揮功能的(Trends.Biochem.Sci.19(1994)，176-181)。本發(fā)明HSC3作為熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族的新成員，特別是作為DnaJ類似蛋白，也有調(diào)節(jié)hsp70的功能，與蛋白質(zhì)的代謝活動(dòng)密切相關(guān)。
許多慢性炎癥是由抗原激活免疫系統(tǒng)引發(fā)的，其中主要被激活的是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。這些吞噬性的細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)(ROS)和細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)HSP蛋白的表達(dá)，這些蛋白反過來保護(hù)細(xì)胞和組織免受炎癥的有害影響。保護(hù)的機(jī)理包括阻礙ROS引發(fā)的DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化?，F(xiàn)有跡象表明，hsp70等熱休克蛋白的一些保護(hù)功能可能依賴于熱休克蛋白的正常細(xì)胞功能，即陪伴變性或折疊不正確的蛋白以及伴隨它們穿過細(xì)胞膜(Experienntia，1038)。有報(bào)道，hsp70家族的一些成員參與抗原遞呈及加工的不同步驟(J.Expl.Med.(1989)1701799-1803)。有人提出HSP不僅參與主要組織相容性復(fù)合物II的裝配，還參與隨后的抗原遞呈(Critical.Rev.Immum.13(1993)，71-81)，已有實(shí)驗(yàn)表明hsp70家族的成員可改善抗原加工及遞呈，從而使免疫應(yīng)答更有效(Int.Jmmun.6(1994)，925-930)。這都說明hsp70在炎癥中的保護(hù)作用，而且hsp70對(duì)于真核細(xì)胞中受損蛋白的復(fù)性也是必需的。與同源的DnaJ蛋白相似(J.Biol.Chem.271(1996)，11236-11246)，本發(fā)明的HSC3蛋白主要功能可能是協(xié)助hsp70或同源蛋白的功能，包括蛋白質(zhì)的折疊、跨細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸、蛋白水解、蛋白裝配，以及蛋白集合體和多蛋白結(jié)構(gòu)的解裝配。這提示本發(fā)明在蛋白質(zhì)代謝過程中起著類似DnaJ的作用，特別是在炎癥反應(yīng)中可能起到保護(hù)作用。
實(shí)施例3HSC3在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，編碼HSC3的DNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得HSC3插入片段。
PCR反應(yīng)5′寡核苷酸引物序列為5′-GGAAGTCGAC ATGGTGGATT ACTATGAAG-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有SalI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的HSC3編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-GTGCTGCAGT TAACAATTCC TTTTGGTAG-3′(SEQ ID NO.6)該引物含有PstI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和HSC3的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI和PstI消化pQE-9載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證HSC3的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至600光密度(OD600)為0.4-0.6，隨后加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的HSC3。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫HSC3?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘撸褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對(duì)含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
實(shí)施例4HSC3在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)參照實(shí)施例3，編碼HSC3的DNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，以合成HSC3基因作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-GCAACTGCAG ATGGTGGATT ACTATGAAG-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有PstI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的HSC3編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-TCGGATATCT TAACAATTCC TTTTGGTAG-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有EcoRV限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和HSC3的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用PstI和EcoRV消化pcDNA3載體及插入片斷，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗(yàn)證HSC的cDNA已正確插入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBcolife)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM oTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為35kD。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3或4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀HSC3蛋白的能力加以評(píng)估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1TACCTATTTG CAGTCACTAC CTC23(2)SEQ ID NO2的信息(ii)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2ATCCTTTTCT GACATACCCA TTC23(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1203bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31 TACCTATTTG CAGTCACTAC CTCTATCACC ACCACCAGCA GAGCCTGAGC TGAGGAAACC61 ACGGTTCTCA ATACCCAGCA CACCCACTTC CAACTATCTG TTAAAACATG GTGGATTACT121 ATGAAGTTCT AGGACTGCAA AGATATGCTT CACCTGAGGA CATTAAAAAA GCTTATCATA181 AAGTGGCACT TAAATGGCAC CCTGATAAAA ATCCAGAAAA TAAAGAAGAA GCAGAGAGAA241 AATTCAAAGA AGTAGCTGAG GCATACGAGG TATTATCAAA TGATGAGAAA CGGGACATTT301 ATGATAAATA TGGCACAGAA GGATTAAACG GAGGTGGAAG TCATTTTGAT GATGAATGTG361 AGTACGGCTT CACATTCCAT AAGCCAGATG ATGTTTTTAA AGAAATTTTT CATGAAAGGG421 ATCCATTTTC TTTTCACTTC TTTGAAGACT CGCTTGAGGA CCTGTTAAAT CGTCCAGGAA481 GCTCCTATGG AAACAGAAAC AGAGATGCAG GATACTTTTT CTCCACTGCC AGTGAATATC541 CAATTTTTGA GAAATTTTCT TCATATGATA CAGGATATAC ATCACAGGGT TCATTGGGGC601 ATGAAGGCCT TACTTCTTTC TCTTCCCTGG CTTTTGATAA TAGTGGGATG GACAACTACA661 TATCTGTTAC AACTTCAGAC AAAATCGTTA ATGGCAGAAA TATTAATACA AAGAAAATTA721 TTGAAAGTGA TCAAGAAAGA GAAGCTGAAG ATAATGGAGA GTTGACATTT TTTCTTGTAA781 ATAGTGTGGC CAATGAAGAG GGCTTTGCAA AAGAATGCAG CTGGAGAACA CAGTCATTCA841 ACAACTATTC ACCAAATTCT CACAGCTCCA AACATGTATC TCAATATACT TTCGTGGACA901 ATGATGAGGG AGGTATATCT TGGGTTACCA GCAACAGAGA TCCCCCTATT TTCTCAGCAG961 GAGTCAAAGA GGGTGGTAAG AGGAAAAAAA AGAAGCGTAA AGAGGTGCAA AAGAAGTCTA1021 CCAAAAGGAA TTGTTAAATT GACTCTTCAA ATATATAACA TTTGAACACA ATTGTGTGTG1081 TTTTGGTTAA TCACAAATTT TGTAGATAAC ACTTAATACT ATACTAAGAG CTTTTCAACA1141 CTTTTAGCAG GATTGTGGAC ATTTGGTTAG TAGTTTTTTT GAATGGGTAT GTCAGAAAAG1201 GAT(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度309個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Val Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Leu Gln Arg Tyr Ala Ser16 Pro Glu Asp Ile Lys Lys Ala Tyr His Lys Val Ala Leu Lys Trp31 His Pro Asp Lys Asn Pro Glu Asn Lys Glu Glu Ala Glu Arg Lys46 Phe Lys Glu Val Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asn Asp Glu61 Lys Arg Asp Ile Tyr Asp Lys Tyr Gly Thr Glu Gly Leu Asn Gly76 Gly Gly Ser His Phe Asp Asp Glu Cys Glu Tyr Gly Phe Thr Phe91 His Lys Pro Asp Asp Val Phe Lys Glu Ile Phe His Glu Arg Asp106 Pro Phe Ser Phe His Phe Phe Glu Asp Ser Leu Glu Asp Leu Leu121 Asn Arg Pro Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Arg Asn Arg Asp Ala Gly136 Tyr Phe Phe Ser Thr Ala Ser Glu Tyr Pro Ile Phe Glu Lys Phe151 Ser Ser Tyr Asp Thr Gly Tyr Thr Ser Gln Gly Ser Leu Gly His166 Glu Gly Leu Thr Ser Phe Ser Ser Leu Ala Phe Asp Asn Ser Gly181 Met Asp Asn Tyr Ile Ser Val Thr Thr Ser Asp Lys Ile Val Asn196 Gly Arg Asn Ile Asn Thr Lys Lys Ile Ile Glu Ser Asp Gln Glu211 Arg Glu Ala Glu Asp Asn Gly Glu Leu Thr Phe Phe Leu Val Asn226 Ser Val Ala Asn Glu Glu Gly Phe Ala Lys Glu Cys Ser Trp Arg241 Thr Gln Ser Phe Asn Asn Tyr Ser Pro Asn Ser His Ser Ser Lys256 His Val Ser Gln Tyr Thr Phe Val Asp Asn Asp Glu Gly Gly Ile271 Ser Trp Val Thr Ser Asn Arg Asp Pro Pro Ile Phe Ser Ala Gly286 Val Lys Glu Gly Gly Lys Arg Lys Lys Lys Lys Arg Lys Glu Val301 Gln Lys Lys Ser Thr Lys Arg Asn Cys(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGAAGTCGAC ATGGTGGATT ACTATGAAG 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GTGCTGCAGT TAACAATTCC TTTTGGTAG 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iv)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GCAACTGCAG ATGGTGGATT ACTATGAAG 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(v)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8TCGGATATCT TAACAATTCC TTTTGGTAG 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人HSC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列雜交。
2如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸108-1037位的序列。
4.一種分離的HSC3蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有HSC3蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有HSC3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成HSC3蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成HSC3蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)HSC3蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有HSC3蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該核苷酸序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸108-1037位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的HSC3蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及熱休克關(guān)聯(lián)蛋白家族的新成員HSC3的cDNA編碼序列。本發(fā)明還涉及該cDNA序列編碼的多肽、所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法、以及這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1246532SQ9811104
公開日2000年3月8日 申請(qǐng)日期1998年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月31日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 劉擎, 屠強(qiáng), 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)