專利名稱：改進(jìn)的差異展示聚合酶鏈反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的分子生物學(xué)差異展示聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)即差示PCR技術(shù)(mRNA Differential DisplayPolymerase Chain Reaction，mRNA DD-PCR)是一項(xiàng)尋找差異表達(dá)基因的新技術(shù)，它是對來源背景相同但處于不同狀況的組織或細(xì)胞進(jìn)行比較研究并篩選出在不同階段呈差異表達(dá)基因的一種新技術(shù)。差示PCR技術(shù)要找的是差異表達(dá)基因，基因表達(dá)水平的變化是最根本的改變，也是相當(dāng)敏感的改變，它的改變反映了機(jī)體的狀況，也就是說，機(jī)體的不同狀況在基因水平上的特征性的代表變化就是表達(dá)水平的改變，即差異表達(dá)基因的改變。此技術(shù)是Liang與Pardee于1992年發(fā)明的，建立此技術(shù)時(shí)的條件為5’端采用20條引物，每條由10個(gè)堿基組成；3’端錨定引物為12條，每條由14個(gè)堿基組成；循環(huán)參數(shù)為94℃ 30S，40℃ 1min，72℃ 30S，40個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸5min。實(shí)踐證明這種方法有效，但繁瑣，呈現(xiàn)出的條帶太多，假陽性率達(dá)70％，后續(xù)處理工作量大。1996年，Liang與Pardee對引物進(jìn)行了改進(jìn)，5’端引物為8條，每條由13個(gè)堿基組成，3’端引物為3條，每條由16個(gè)堿基組成，循環(huán)條件不變。這種方法也有不足之處，如差異條帶特征性不好，假陽性仍不能消除，重復(fù)性不是很好。
本發(fā)明能更好地呈現(xiàn)出差異條帶，同時(shí)能減少非特征性條帶的呈現(xiàn)，既保持了呈現(xiàn)效率，又提高了產(chǎn)物的特異性和重復(fù)性，克服了假陽性，大大減低了工作量，提高了工作效率。
本發(fā)明的技術(shù)方案采用Liang與Pardee改進(jìn)的第三代DD-PCR引物，建立了差示PCR的優(yōu)化條件5’端引物為8條，每條由13個(gè)堿基組成；3’端引物為3條，每條由16個(gè)堿基組成，上下游引物Tm值皆為38℃最適起始溫度為54.5℃，循環(huán)條件為前五輪循環(huán)采用94℃ 35S，40℃ 2min，72℃ 30S，后35個(gè)循環(huán)采用94℃ 35S，55℃ 2min，72℃ 1min，最后在72℃延伸7min。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)利用本發(fā)明在差示PCR中能獲得很好的重復(fù)性，同時(shí)又保證了差異條帶的敏感性及特征性，減少了相同條帶的呈現(xiàn)，是獲取差異表達(dá)基因較理想的方法。
具體實(shí)施例方式以胃癌細(xì)胞株GC7901與胃粘膜細(xì)胞株GES-1為研究對象，采用本發(fā)明的方法，分離回收了差異條帶154條，胃癌細(xì)胞株泳道中存在而胃粘膜細(xì)胞株泳道中缺失的有82條；胃粘膜細(xì)胞株泳道中存在而胃癌細(xì)胞株泳道中缺失的有35條；胃癌細(xì)胞株泳道中表達(dá)高于胃粘膜細(xì)胞株泳道中的有23條；胃粘膜細(xì)胞株泳道中表達(dá)高于胃癌細(xì)胞株泳道中的有14條；分別來自于H-T11G、H-T11C、H-T11A錨定引物的差異條帶為61條、47條、46條。我們從篩出的片段中隨機(jī)挑取了17個(gè)差異條帶(命名為GCYS-1至17)作探針，與細(xì)胞株GC7901及GES-1總RNA進(jìn)行打點(diǎn)雜交，結(jié)果證實(shí)17個(gè)片段在兩個(gè)細(xì)胞株之間呈差異表達(dá)。采用PCR產(chǎn)物直接測序及全自動(dòng)測序技術(shù)獲取了17個(gè)差異片段序列，利用計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)對序列進(jìn)行GenBank同源性檢索分析，發(fā)現(xiàn)七個(gè)序列為新序列，獲取的序列重新設(shè)計(jì)了17對引物，利用RT-PCR方法對細(xì)胞株、新鮮組織標(biāo)本、血標(biāo)本進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明通過對GES-1及GC7901細(xì)胞株總RNA的檢測，證實(shí)17對引物皆能從GC7901細(xì)胞株中擴(kuò)出相應(yīng)產(chǎn)物，其中NO.1、4、8、10、11這5對引物不能從GES-1細(xì)胞株中擴(kuò)出相對應(yīng)產(chǎn)物。因此，我們選擇了這五對引物進(jìn)一步用于臨床標(biāo)本檢測。通過對26例胃癌臨床標(biāo)本檢測，發(fā)現(xiàn)了這5對引物(NO.1P1 agcagatagtcagacagtcgP2 gatatgtcattcttcagatgNO.2P7 cagactagccgatcatcagaP8 accggatcagatctgacataNO.3P15 taggcagccagccagaggccP16 cgttgcactgcagcgcccgNO.4P19 acagacctgtcgccgcggctP20 taggcagtcagctcctggtcNO.5P21 cagtagatcctacaactgcgP22 ctaacgtcgcagctcgttgt)在26例腫瘤標(biāo)本中檢出覆蓋率為100％；在6例活檢的胃癌胃粘膜中檢出率為100％，這5對引物組合能夠完全避免腫瘤的漏檢，但是是否對所有的胃癌患者完全避免漏檢，還在進(jìn)一步驗(yàn)證。這5對引物在胃癌中的檢出率高于其它腫瘤，而且經(jīng)臨床標(biāo)本驗(yàn)證及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明它們皆與胃癌的癌前病變及進(jìn)展期有關(guān)。因此，篩選出的這五對引物能夠建立胃癌的基因診斷方法并能運(yùn)用于胃癌的臨床診斷，具有重大的開發(fā)價(jià)值及應(yīng)用價(jià)值。篩選出的七個(gè)新基因同樣具有開發(fā)價(jià)值及應(yīng)用價(jià)值。七個(gè)新序列為GCYS-1片段(AF071052)，AP2與D-T11G為引物5’AAGCTTCGAC TGTGAATGGA ATGTTGTGGC GTGTCTGGAT CGTATGTCTG TTCTGTGCCA GATGAGCTGTCAGTCCAGTT CCAGCCTGAC TCGCAGTTGG CTACCGGATC GCTATCCGCG ATGGCTGGACCAGGACGATC GATCGAGTCG ATCTGGCAGT CTTGATCCCT TGGACTGTGG GCCGACGACAGTCGCGGATC GATCCGAGCG CGCGATCCAG CAGGCTGGTC GATCGGTTCT GGTCGGTCTGCAGCAGATCG GATCGATCGC CATCTCGTCG GTGGATCCTG TCAGCCTGGT GTATTTGTGC CGG3’GCYS-2片段(AF071053)，AP5與D-T11A為引物5’AAGCTTAGTA GGCGCCGCCG GACCAGCGGA CCGGGGCCGC TTTGCACCAG CAGCGCCGTGGGCACCAGC CAGCCACTCG CGTCCCCGTA CAGTAGAGCT TGATCCTGGA CTGCTGCGCGGACACGCCTG GGCGGTAGGC GCACGGGACA GTGTCAGTC TGCAACTACC ACGGTGTCGGCGTGAGCCAA GGGCTAAGCC CATCTGACCG GGACGGCCGC TGCGTGTCCAACGGAGTGGG GCGGCTAACC AGGACCTTAC GGGCCCTAAG ATACTCGAGG ATCGGGCCCTAAGAGGAACGCCCGGTAAGA CTCCTCTGGC TGGCTGCCTA AGGCCCTAGC TGGCCTATAG ACTCGTACTCTCTCCTAGAG CCGGCCTTAG CAGTAGCGCG TAAAGCCTAA GACTGGCCTT AGGTGACTGAAGGGCAGAGT AGAGCTAGTT AAGTTCAAGA CTGAGTTAAA GCGATTACGT AGACCTAGAATCAAGGATCC TTAGGTGACT GAAGGGCAGA GTAGAGCTAG TTAAGTTCAA GACTGAGTTAAAGCGATTAC GAGACCTAGA ATCAAGGATC TTAGACCAGA CCTGGGAAGC TGGTTACCTGGGATCCTGTG C3’GCYS-3片段(AF071054)，AP7與D-T11A為引物5’AAGCTTAACG AGGGACAGAC CTGTCGCCGC GGCTCGCGAC GGCTAGCTGC ACTGCTGCCTGTCCGAGTCA GTCGTCGTCG ATCGCCTTGG GCCTTCTCGG CTTGTGGCGG AGTGCTCCGTGTGTGGCTAC TACTTCTAGG ATCGCTACGC TGGTACTAGC TAGCAGCCGC TACTCGGCCCTAGCTGACTG ACGATGCTCT CGTCGGAGTA GGCAGTCAGC TCTGGTCAGC GTCATATCATCCAGTCCATC GGTCATGCTA GACTCTGCTA GCTCTCTGCA TGTCTGTCTC TCGATCAGGATCAGTCGGCG ATCGGTATCT TGTTCCTTGC CCAGCCATCG ATCTCCTGGC AATACGCCTCAGCCTAGCAG ACCGCCTGCA GGTACCGGTC CGGAATTCCC GGGTCTGGAC CGTCCGCGGACGCGTGGGTT ATCTCTCACA ACTGAAGTCC CCATTAGATA AATCTAGAAC CAAATGTTAGATAAGCACAT GTCCGGCCCA GAAAAGAGAG AAAGTTAAAA AAAAAAAAAA3’GCYS-4片段(AF071055)，AP3與D-T11C為引物5’AAGCTTTTAC CGCCTAGCCA GGACCAGCCA GCCGGAGACC GGAGTCCGAG AGACGCAGAC AGCAACAGACGAGAGACAGC CAAGGTACGA TCAGCAGCAC CAAGCCAAGA AGCCTAAAGA GCAGTCAGAC CTGACTGCAGCAGCACGCTC GCACTCGCCA GAGCACAGCA GCACTGACAC AACTACAGCC ATAGCGAGTC ATAGACAACACCCAACACAC TAATCCTATC TAATTTGGCC CACTCCTC3’GCYS-5片段(AF071056)，AP8與D-T11C為引物5’AAGCTTTTAC CGCCAACCCA CACCAACAGT CCAGCCAAAA AAAATTAGTT CGTGACTTGC ATGAGCGATGCTAGCACTAG ACTGACTGAAG CGGCAACTGC AGGTCCGAAG TCGTCTGAGT ACGTCCGCAG ACAGTCTTGGACGGCTATGAC GGTCGCATGC AGCGTGTACG TGTGTGGTGT GGTAGAGCTG CCGCGCTTTG TGTGTGTTGTTGTGTGTGTG TGTGTTATAT CGAGCGGTGG TAAAGTCTGA CACCATAACA CTTTAAAATA TTGTATTTATTCATTCAAAA TTCATTGAAA AATCACATGC TATTATATAT TAAAATTATG TGATTATTTT ACAAAATTAGACTTACAGAA AAGAACTATTTCCTACCCAAAAAGCTGTTAT GGTTATATGCAGCATGTTTTGAAAAAAAAAAAAAAA 3’GCYS-6片段，AP7(AF071057)與D-T11C為引物5’AAGCTTAACG AGGTCCCCGT GATGCAGCTG CCCCGGGCAC CGACCAGCGA TGTGCTCTCAGCCCCCGACA GGTTTCCTGG AAGATGGCGC CATTCTGGAT GATGCGGGGG CACTTGCGGTAGAAGACACG CACGGCGATG AGGGACATGC AGCCGCCATA GTCCTGGAAG CCAGGTAGAAGCCGCTGCGG TGACACAGGT CCGAAGCTCC GCACCTCGGT CGTTGACGTT TCATGACGGCGGCCACCTCA GGTCCACCTG GGAGAAGCTC TCGTCGGCTG CAATGGTATC CACCTTCACCCATGGATTCT CCATCCAGTT GGGGAAGGTT GGGCGTAGTA TCATGGTCAT AGCTGTTCCTGTGTGGAAA TTGTATCCGC TCATAATTCC AGACTACATG ACGGAGCCGG AAGCAT3’GCYS-7片段(AF071058)，AP7與D-T11C為引物5’AAGCTTTGCT CAGCAGATGA TCCTACAACT GCGACACTAT CATGCGCGCT CGCTACTAGA TAAGTCACTCGACAGTGCT ATATTGACTGA CGTACGATCG ACATCGTTGG ACTATCCAGA GTCATTGAAG ATATGTATGGAGTGATTTCA TCTGAAGAAT GACATATCTT TTATGGATCG GACACATTGG TACAGAGACT ACCGGATACGACGACAGACT GATAATTAGG AGCCTTCGAT ACTACTACGA CGTATCGATA CCAGTCAGTC ATCAGGACAACGAGCTGCGA CGTTGGTCGC TTGCATGTCT GCCTATGTGT CTCATCAAGG CACCGGTACG GCACCGCAGTATCACCGATA TTGGAGTACA GGACTTAATC ACG3’具體操作步驟(一)細(xì)胞培養(yǎng)1、常規(guī)培養(yǎng)胃癌7901細(xì)胞株至細(xì)胞數(shù)為108個(gè)。
2、按要求培養(yǎng)胃粘膜GES-1細(xì)胞株[2]至細(xì)胞數(shù)為108個(gè)。
(二)細(xì)胞RNA的提取采用異硫氰酸胍一步法[5-7]。
(三)去除總RNA中的DNA用無RNase的DNase去除其中的DNA，紫外掃描定量后，保存于-20℃。
(四)mRNA反轉(zhuǎn)錄以3’端錨定引物H-T11M(M＝G、C、A)為起始引物，依次加入無RNase的水9.4μL，5×RT Buffer 4.0μL，dNTP(250μmol/L)1.6μL，總RNA(0.1μg/μL)2.0μL，H-T11M 2.0μL，混勻后，12000rpm離心數(shù)秒上機(jī)，反應(yīng)條件為65℃ 5min，37℃ 60min，75℃ 5min，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)在37℃ 10min時(shí)加入。
(五)PCR擴(kuò)增標(biāo)記好0.2ml Ependorf管為1-16號，依次加入H2O 9.2μL，10×PCR Buffer 2μL，dNTP(25μmol/L)1.6μL，H-APM(M＝1、2、3、4、5、6、7、8)2.0μl，H-T11M(M＝G、C、A)2.0μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μl，α-32PdATP0.50μl，混勻后加入1.5UTaq酶，最后加入30μl石蠟油。PCR反應(yīng)條件為前5個(gè)循環(huán)條件為94℃ 35S，40℃ 2min，72℃ 30S；后35個(gè)循環(huán)條件為94℃ 45S，55℃ 2min，72℃ 1min，最后在72℃延伸7min。
(六)6％測序膠電泳配制6％聚丙烯酰胺凝膠，灌膠后充分聚合2小時(shí)，預(yù)電泳30min。各取3.5μlPCR產(chǎn)物加入2μL載樣液在80℃變性5min后上樣，1700V，25W電泳4.5小時(shí)，揭下濕膠，直接放射自顯影14-18小時(shí)。
(七)差異條帶的確認(rèn)采用本所研制的GQS-960型成像及基因分析系統(tǒng)，掃描確認(rèn)位置異常及同一位置但光密度不一致的條帶為有意義的差異條帶。
(八)差異條帶的回收①從膠上挖出差異條帶，置含100μl三蒸水的Eppendorf管中；②煮沸10min，離心收集上清到一新管中，加入10μl 3mol/LNaAc，5μl 10mg/ml糖原，450μl無水乙醇，在冰上靜置30min；③4℃離心沉淀DNA，去除上清，用200μL預(yù)冷的85℃乙醇懸浮DNA，離心后去除殘留的乙醇；④溶沉淀于10μL蒸溜水中，-20℃保存。
(九)差異條帶的二次擴(kuò)增取4μl回收的產(chǎn)物作模板，依次加入ddH2O20.4μl，10×PCR Buffer 4.0μL，dNTP(25μlmol/L)3.2μl，H-T11M(M＝G、C、A)4.0μl，混合后加入Taq酶1.5U，最后加入30μl石蠟油。PCR循環(huán)條件為前5輪采用94℃ 35S，40℃ 2min，72℃ 30S，后35個(gè)循環(huán)采用94℃ 35S，55℃ 2min，72℃ 1min，最后在72℃，最后在72℃延伸7min。
(十)按純化試劑盒說明書進(jìn)行純化PCR產(chǎn)物。
(十一)采用末端標(biāo)記法在PCR產(chǎn)物末端標(biāo)記上r-32pdATP作探針，按分子克隆說明進(jìn)行。
(十二)打點(diǎn)雜交取RNA10μg，加入適量變性液混勻，50℃水浴變性1h，將變性后的RNA點(diǎn)樣于經(jīng)預(yù)處理過的硝酸纖維膜上，烤干，預(yù)雜交，雜交，放射自顯影。
(十三)對純化的二次擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行序列分析。
權(quán)利要求
1.改進(jìn)的差異展示聚合酶鏈反應(yīng)方法，其特征在于采用Liang與Pardee改進(jìn)的第三代DD-PCR引物，建立了差異展示聚合酶鏈反應(yīng)的優(yōu)化條件5’端引物為8條，每條由13個(gè)堿基組成；3’端引物為3條，每條由16個(gè)堿基組成，上下游引物Tm值皆為38℃最適起始溫度為54.5℃，循環(huán)條件為前五輪循環(huán)采用94℃ 35S，40℃ 2min，72℃ 30S，后35個(gè)循環(huán)采用94℃ 35S，55℃ 2min，72℃ 1min，最后在72℃延伸7min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改進(jìn)差異展示聚合酶鏈反應(yīng)方法，獲取了七個(gè)在胃癌中呈高表達(dá)的新序列，同時(shí)篩選出在胃癌組織中檢出符合率為100％的五對引物，GCYS-1序列(AF071052)，AP2與D-T11G為引物5’AAGCTTCGAC TGTGAATGGA ATGTTGTGGC GTGTCTGGAT CGTATGTCTG TTCTGTGCCA GATGAGCTGTCAGTCCAGTT CCAGCCTGAC TCGCAGTTGG CTACCGGATC GCTATCCGCG ATGGCTGGACCAGGACGATC GATCGAGTCG ATCTGGCAGT CTTGATCCCT TGGACTGTGG GCCGACGACAGTCGCGGATC GATCCGAGCG CGCGATCCAG CAGGCTGGTC GATCGGTTCT GGTCGGTCTGCAGCAGATCG GATCGATCGC CATCTCGTCG GTGGATCCTG TCAGCCTGGT GTATTTGTGC CGG3’GCYS-2序列(AF071053)，AP5與D-T11A為引物5’AAGCTTAGTA GGCGCCGCCG GACCAGCGGA CCGGGGCCGC TTTGCACCAG CAGCGCCCGTGGGCACCAGC CAGCCACTCG CGTCCCCGTA CAGTAGAGCT TGATCCTGGA CTGCTGCGCGGACACGCCTG GGCGGTAGGC GCACGGGACA GTGTCAGTC TGCAACTACC ACGGTGTCGGCGTGAGCCAA GGGCTAAGCC CATCTGACCG GGACGGCCGC TGCGTGTCCAACGGAGTGGG GCGGCTAACC AGGACCTTAC GGGCCCTAAG ATACTCGAGG ATCGGGCCCTAAGAGGAACGCCCGGTAAGA CTCCTCTGGC TGGCTGCCTA AGGCCCTAGC TGGCCTATAG ACTCGTACTCTCTCCTAGAG CCGGCCTTAG CAGTAGCGCG TAAAGCCTAA GACTGGCCTT AGGTGACTGAAGGGCAGAGT AGAGCTAGTT AAGTTCAAGA CTGAGTTAAA GCGATTACGT AGACCTAGAATCAAGGATCC TTAGGTGACT GAAGGGCAGA GTAGAGCTAG TTAAGTTCAA GACTGAGTTAAAGCGATTAC GAGACCTAGA ATCAAGGATC TTAGACCAGA CCTGGGAAGC TGGTTACCTGGGATCCTGTG C3’GCYS-3序列(AF071054)，AP7與D-T11A為引物5’AAGCTTAACG AGGGACAGAC CTGTCGCCGC GGCTCGCGAC GGCTAGCTGC ACTGCTGCCTGTCCGAGTCA GTCGTCGTCG ATCGCCTTGG GCCTTCTCGG CTTGTGGCGG AGTGCTCCGTGTGTGGCTAC TACTTCTAGG ATCGCTACGC TGGTACTAGC TAGCAGCCGC TACTCGGCCCTAGCTGACTG ACGATGCTCT CGTCGGAGTA GGCAGTCAGC TCTGGTCAGC GTCATATCATCCAGTCCATC GGTCATGCTA GACTCTGCTA GCTCTCTGCA TGTCTGTCTC TCGATCAGGATCAGTCGGCG ATCGGTATCT TGTTCCTTGC CCAGCCATCG ATCTCCTGGC AATACGCCTCAGCCTAGCAG ACCGCCTGCA GGTACCGGTC CGGAATTCCC GGGTCTGGAC CGTCCGCGGACGCGTGGGTT ATCTGTCACA ACTGAAGTCC CCATTAGATA AATCTAGAAC CAAATGTTAGATAAGCACAT GTCCGGCCCA GAAAAGAGAG AAAGTTAAAA AAAAAAAAAA3’GCYS-4序列(AF071055)，AP3與D-T11C為引物5’AAGCTTTTAC CGCCTAGCCA GGACCAGCCA GCCGGAGACC GGAGTCCGAG AGACGCAGAC AGCAACAGACGAGAGACAGC CAAGGTACGA TCAGCAGCAC CAAGCCAAGA AGCCTAAAGA GCAGTCAGAC CTGACTGCAGCAGCACGCTC GCACTCGCCA GAGCACAGCA GCACTGACAC AACTACAGCC ATAGCGAGTC ATAGACAACACCCAACACAC TAATCCTATC TAATTTGGCC CACTCCTC3’GCYS-5序列(AF071056)，AP8與-T11C為引物5’AAGCTTTTAC CGCCAACCCA CACCAACAGT CCAGCCAAAA AAAATTAGTT CGTGACTTGC ATGAGCGATGCTAGCACTAG ACTGACTGAAG CGGCAACTGC AGGTCCGAAG TCGTCTGAGT ACGTCCGCAG ACAGTCTTGGACGGCTATGAC GGTCGCATGC AGCGTGTACG TGTGTGGTGT GGTAGAGCTG CCGCGCTTTG TGTGTGTTGTTGTGTGTGTG TGTGTTATAT CGAGCGGTGG TAAAGTCTGA CACCATAACA CTTTAAAATA TTGTATTTATTCATTCAAAA TTCATTGAAA AATCACATGC TATTATATAT TAAAATTATG TGATTATTTT ACAAAATTAGACTTACAGAA AAGAACTATTTCCTACCCAAAAAGCTGTTAT GGTTATATGCAGCATGTTTTGAAAAAAAAAAAAAAA 3’GCYS-6序列(AF071057)AP7與D-T11C為引物5’AAGCTTAACG AGGTCCCCGT GATGCAGCTG CCCCGGGCAC CGACCAGCGA TGTGCTCTCAGCCCCCGACA GGTTTCCTGG AAGATGGCGC CATTCTGGAT GATGCGGGGG CACTTGCGGTAGAAGACACG CACGGCGATG AGGGACATGC AGCCGCCATA GTCCTGGAAG CCAGGTAGAAGCCGCTGCGG TGACACAGGT CCGAAGCTCC GCACCTCGGT CGTTGACGTT TCATGACGGCGGCCACCTCA GGTCCACCTG GGAGAAGCTC TCGTCGGCTG CAATGGTATC CACCTTCACCCATGGATTCT CCATCCAGTT GGGGAAGGTT GGGCGTAGTA TCATGGTCAT AGCTGTTTCCTGTGTGGAAA TTGTATCCGC TCATAATTCC AGACTACATG ACGGAGCCGG AAGCAT3’GCYS-7序列(AF071058)，AP7與D-T11C為引物5’AAGCTTTGCT CAGCAGATGA TCCTACAACT GCGACACTAT CATGCGCGCT CGCTACTAGA TAAGTCACTCGACAGTGCT ATATTGACTGA CGTACGATCG ACATCGTTGG ACTATCCAGA GTCATTGAAG ATATGTATGGAGTGATTTCA TCTGAAGAAT GACATATCTT TTATGGATCG GACACATTGG TACAGAGACT ACCGGATACGACGACAGACT GATAATTAGG AGCCTTCGAT ACTACTACGA CGTATCGATA CCAGTCAGTC ATCAGGACAACGAGCTGCGA CGTTGGTCGC TTGCATGTCT GCCTATGTGT CTCATCAAGG CACCGGTACG GCACCGCAGTATCACCGATA TTGGAGTACA GGACTTAATC ACG3’篩選出的五對引物NO.1 P1 agcagatagtcagacagtcgP2 gatatgtcattcttcagatgNO.2 P7 cagactagccgatcatcagaP8 accggatcagatctgacataNO.3 P15 taggcagccagccagaggccP16 cgttgcactgcagcgcccgNO.4 P19 acagacctgtcgccgcggctP20 taggcagtcagctcctggtcNO.5 P21 cagtagatcctacaactgcgP22 ctaacgtcgcagctcgttgt
全文摘要
改進(jìn)的差異展示聚合酶鏈反應(yīng)方法,涉及基因的分子生物學(xué),采用Liang與Pardee改進(jìn)的第三代引物,建立了差異展示聚合酶鏈反應(yīng)優(yōu)化條件:前五輪循環(huán)采用94℃35S,40℃2min,72℃30S,后35個(gè)循環(huán)采用94℃35S,55℃2min,72℃1min,最后在72℃延伸7min。并利用此方法以胃癌細(xì)胞株GC7901與胃粘膜細(xì)胞株GES－1為研究對象,分離出差異條帶154條,對17個(gè)條帶進(jìn)行了測序,其中七個(gè)序列為新序列,在胃癌中呈高表達(dá);設(shè)計(jì)了17對引物并運(yùn)用于臨床標(biāo)本檢測,篩選出5對引物,在胃癌組織中檢出符合率為100%。總之,這7個(gè)序列及5對引物在胃癌診斷中具有重要開發(fā)價(jià)值及應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/10GK1242431SQ9811292
公開日2000年1月26日 申請日期1998年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月22日
發(fā)明者崔大祥, 閆小君, 蘇成芝 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)