專利名稱：Hsv－1病毒載體系統(tǒng)及構(gòu)建和快速導(dǎo)入方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳工程C12N 15/00，病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)及構(gòu)建。
隨著社會健康保障體系的完善和發(fā)展，人口老化現(xiàn)象在我國乃至全世界已日趨顯著，患Alzheimer氏病(老年性癡呆癥)的患者數(shù)量也隨之不斷增加。這是一種以慢性進(jìn)行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的大腦變性性疾病，迄今為止，尚無任何有效的治療辦法。由于這種疾病造成患者生活不能自理，給家庭和社會造成沉重的負(fù)擔(dān)。因此，Alzheimer氏病已成為困擾人類的一大難題。
近年來，分子生物學(xué)技術(shù)及現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，給Alzheimer氏病的基因治療提供了可能性。因此與其它的疑難癥及不治之癥的基因治療一樣，Alzheimer氏病的基因治療研究，已成為目前世界各國關(guān)注的熱點。神經(jīng)病理學(xué)研究證明，Alzheimer氏病的主要病理改變是大腦內(nèi)側(cè)顳葉部位的神經(jīng)元細(xì)胞，隨著年齡的增長，不斷發(fā)生變性、減少和萎縮，并由此而引起這些神經(jīng)元功能降低或喪失，因為這些神經(jīng)元和記憶功能相關(guān)，因此，上述神經(jīng)元的變性及其功能喪失將造成癡呆。這些神經(jīng)病理學(xué)研究結(jié)果也告訴我們，如果進(jìn)行Alzheimer氏病的基因治療，其關(guān)鍵是如何改善和恢復(fù)變性神經(jīng)元的功能。目前國際上，尤其是美國Alzheimer氏病的基因治療，研究發(fā)展很快，并且已經(jīng)建立了旨在將Alzheimer氏病的基因治療技術(shù)實用化的大型研究企業(yè)(Geron，California，1993)，專門從事細(xì)胞老化的分子生物學(xué)研究，針對淀粉樣變性的基因治療和用生長因子為目的基因的基因治療研究，有的也已經(jīng)進(jìn)行臨床實驗階段。但是，這些基因治療所采用的治療方案都是先給病人做開顱手術(shù)，然后經(jīng)手術(shù)開顱部位向腦內(nèi)直接注入載體細(xì)胞的體細(xì)胞基因治療方案。這種基因?qū)胪緩讲坏怯袆?chuàng)性的，而且也難以準(zhǔn)確定位，對于Alzheimer氏病的患者來說，都必須先施行開顱手術(shù)，這一點是很難以接受的，而且要維持治療效果，需再次開顱向顱內(nèi)重復(fù)給藥，這就更難實施。所以該唯一治療方案也難以推廣應(yīng)用。因此，探索由外周神經(jīng)采用非手術(shù)方式，向皮質(zhì)中樞導(dǎo)入目的基因的新途徑，對于實施腦內(nèi)神經(jīng)元疾病的基因治療具有重要意義。
本發(fā)明的目的是提供一種不需手術(shù)、患者無痛苦的基因治療物質(zhì)、其構(gòu)建方法及快速高效給藥方式，一種單純皰疹病毒-I型(HVS-1病毒)載體系統(tǒng)的構(gòu)建及快速導(dǎo)入方法。HVS-1病毒載體系統(tǒng)的表達(dá)式
它含有缺陷型單純皰疹病毒HSV1的啟動子IE、外源目的基因神經(jīng)生長因子NGF、SV40和HSV1包裝點as，其特征是目的基因NGF的功能片段cDNA在BamH1酶切位點上，形成HSV-1病毒載體系統(tǒng)。
性質(zhì)對宿主神經(jīng)細(xì)胞具有高度特異性，特別是對有絲分裂后的神經(jīng)元細(xì)胞具有高度親嗜性。
HVS-1病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法包括利用生物工程產(chǎn)品的外源目的基因NGF、單純皰疹病毒-I型、內(nèi)切酶、連接酶、應(yīng)用分子生物學(xué)的基因重組技術(shù)，其特征是將外源性目的基因NGF(神經(jīng)生長因子)的互補(bǔ)(cDNA)功能片段克隆到病毒載體的內(nèi)切酶BamH1的酶切位點上，構(gòu)建成HSV-1病毒載體系統(tǒng)。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后，用溶菌酶SDS裂解細(xì)菌，酚氯仿提取DNA、乙醇沉淀、TE溶解DNA，通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡高心法，45000rpm18小時，提純質(zhì)粒DNA。應(yīng)用分子生物學(xué)的缺失變異包裝技術(shù)，對上述構(gòu)建的粒子進(jìn)行轉(zhuǎn)染和對HSV-1載體病毒進(jìn)行包裝。以HSV-1 17tsk輔助病毒感染Vero細(xì)胞，將脂質(zhì)體DNA復(fù)合物逐漸加到無血清培養(yǎng)液中混勻，31℃培養(yǎng)三天，獲得有病毒外膜的載體病毒，用空斑形成實驗測定病毒滴度為107pfu/ml。
HSV-1病毒載體系統(tǒng)用于臨床的快速導(dǎo)入方法，利用其對神經(jīng)元細(xì)胞的高度親嗜性，選擇嗅神經(jīng)作為導(dǎo)入通道，將0.1mlHSV-1，病毒滴度為106pfu/ml，從鼻腔注入，該構(gòu)建成的這種單純皰疹病毒-I型載體系統(tǒng)便能迅速進(jìn)入Alzheimer氏病的病變部位(中樞的海馬、杏仁核等內(nèi)側(cè)顳葉部位)通過外源目的基因產(chǎn)物神經(jīng)生長因子NGF對功能降低或喪失的病變神經(jīng)元起到賦活的作用，從而達(dá)到對Alzheimer氏病基因治療的目的。
單純皰疹病毒I型(Herpes simplex virus typeI，HSV-1)，具有嗜神經(jīng)細(xì)胞的特點，能感染有絲分裂后的神經(jīng)細(xì)胞，并在神經(jīng)軸突及突觸間運(yùn)動，在神經(jīng)元內(nèi)長期潛伏感染。病毒DNA以閉合環(huán)狀的雙鏈形式存在于細(xì)胞核中，不影響細(xì)胞的功能。所以根據(jù)HSV-1的特點，應(yīng)用構(gòu)建的HSV-1系統(tǒng)攜帶NGF基因通過嗅神經(jīng)通路，快速導(dǎo)入至Alzheimer神經(jīng)中樞病變部位并獲得高活性、長期高表達(dá)的效果，是成功地進(jìn)行腫瘤基因治療的決定因素和技術(shù)關(guān)鍵。本發(fā)明的病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建及快速導(dǎo)入方法在國內(nèi)外末見報導(dǎo)，為國際首創(chuàng)。
眾所周知，實行有效的基因治療，其關(guān)鍵之一還在導(dǎo)入的靶細(xì)胞中是否能基因治療的逆病毒載體相比，其有明顯特性(1)新載體對宿主細(xì)胞(神經(jīng)元細(xì)胞)具有高度特異性，特別是對有絲分裂后的神經(jīng)元細(xì)胞具有高度親嗜性。(2)新型載體具有100％的導(dǎo)入效率。(3)嗅神經(jīng)的生理特征只是與大腦內(nèi)側(cè)的顳葉部位相連通，利用這種病毒載體，通過自然感染途徑，將目的基因從特定的外周神經(jīng)導(dǎo)入后，可逆行到達(dá)與之相連系的中樞皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)，并在其中長期表達(dá)外源基因。因此選擇這一通道給藥，導(dǎo)入定位確切，易于發(fā)揮療效。
權(quán)利要求
1.一種HSV-1病毒載體系統(tǒng)，用于Alzheimer氏病的基因治療，其特征是單純皰疹病毒-I型(Herpes Simplex Virus Type I，HSV-1)載體系統(tǒng)表達(dá)式
它含有缺陷型單純皰疹病毒HSV-1的啟動子IE、外源目的基因NGF、SV40、PolyA位點和HSV1包裝點as，其特征是目的基因NGF的功能片段cDNA在BamH1酶切位點上，形成HSV-1病毒載體系統(tǒng)。性質(zhì)對宿主神經(jīng)細(xì)胞具有高度特異性，特別是對有絲分裂后的神經(jīng)元細(xì)胞具有高度親嗜性。
2.一種HSV-1病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括利用生物工程產(chǎn)品的目的基因NGF基因、缺陷型病毒、內(nèi)切酶、連接酶、應(yīng)用分子生物學(xué)的基因重組技術(shù)和缺失變異包裝技術(shù)，其特征是將外源性目的基因神經(jīng)生長因子基因的cDNA功能片段克隆在缺陷型病毒的內(nèi)切酶BamH1的酶切位點上，構(gòu)建成HSV-1病毒載體系統(tǒng)；構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后，用溶菌酶SDS裂解細(xì)菌，酚氯仿提取DNA、乙醇沉淀、TE溶解DNA，通過氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法，45000rpm18小時，提純質(zhì)粒DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HSV-1病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征是所采用的缺失變異包裝技術(shù)對構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染和對載體病毒進(jìn)行包裝以1pfu/ml的HSV-1 17tsk輔助病毒感染Vero細(xì)胞，在37℃中吸附1小時，棄去病毒液，用無血清的1640培養(yǎng)液洗三遍，加2ml無血清培養(yǎng)液，將預(yù)先準(zhǔn)備好的脂質(zhì)體DNA復(fù)合物逐漸加到培養(yǎng)液中混勻，置31℃中培養(yǎng)三天，收獲的病毒為包裝有病毒外膜的載體病毒；用空斑形成實驗測定病毒滴度為107pfu/ml。
4.一種使構(gòu)建的HSV-1病毒載體系統(tǒng)用于臨床的快速導(dǎo)入方法，其特征是利用病毒對神經(jīng)細(xì)胞具有親嗜性的特性，選擇嗅神經(jīng)作為該病毒載體的導(dǎo)入通道；將獲得的高滴度HSV-1病毒載體0.1ml，滴度106pfu/Ml，從患者鼻腔注入，該載體能迅速進(jìn)入Alzheimer氏病的病變部位，通過外源目的基因產(chǎn)物NGF對病變神經(jīng)元功能的降低或喪失起到賦活的作用，從而達(dá)到對Alzheimer氏病基因治療的目的。
全文摘要
HSV－1病毒載體系統(tǒng)及構(gòu)建和快速導(dǎo)入方法,其特征是將外源性目的基因NGF神經(jīng)生長因子基因的互補(bǔ)DNA(cDNA)功能片段克隆到病毒載體的內(nèi)切酶BamHl的酶切位點上,并對構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和包裝,構(gòu)建成HSV－1病毒載體系統(tǒng)。利用病毒對神經(jīng)有親嗜性的特性,選擇嗅神經(jīng)作為該病毒載體的導(dǎo)入通道;將獲得的高滴度HSV－1病毒載體0.1ml(濃度10
文檔編號C12N15/64GK1242426SQ9811417
公開日2000年1月26日 申請日期1998年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月22日
發(fā)明者任常山, 張朝東, 隋承光, 陳紅 申請人:中國醫(yī)科大學(xué)