專利名稱：嘌呤核苷化合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用通過酶作用的核酸堿基的交換反應(yīng)以高產(chǎn)率制備嘌呤核苷化合物的方法，以及產(chǎn)生能用于該制備的酶的微生物。
一直以來，雖然提出了利用通過酶作用的核酸堿基的交換反應(yīng)制備核苷化合物的方法，但是原料體系和生成物體系之間形成反應(yīng)的平衡狀態(tài)，這就是無法提高產(chǎn)率的原因。作為解決方法，在特開平4-197193號公報中公開了使是核苷的肌苷或者2’-脫氧肌苷(下面稱為脫氧肌苷)和嘧啶堿基在磷酸鹽水溶液中通過嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)以及嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)的作用進行堿基的交換反應(yīng)，通過將該交換反應(yīng)生成的次黃嘌呤通過黃嘌呤氧化酶的作用轉(zhuǎn)變成尿酸，提高反應(yīng)產(chǎn)率的方法。在這種情況下，由于尿酸不在這些核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成，反應(yīng)向生成嘧啶核苷的一方移動。
但是，該公報所公開的方法是原料采用肌苷或者脫氧肌苷以及嘧啶堿基，具有較好效率的制備嘧啶核苷的方法，但不是以價格更便宜更容易得到的嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基為原料制備嘌呤核苷化合物的方法。在以嘧啶核苷化合物為原料的情況下，為了提高反應(yīng)效率必須向反應(yīng)體系中加入分解由堿基交換反應(yīng)生成的嘧啶堿基的酶使平衡失衡，也可從天然物質(zhì)在高活性狀態(tài)下制備這種酶，離析的事例至今還沒有報告。就是說，沒有以嘧啶核苷化合物為原料的嘌呤核苷化合物的高產(chǎn)率的制備方法。因此，迫切需要穩(wěn)定的高產(chǎn)率的嘌呤核苷化合物的制備方法。
本發(fā)明的發(fā)明者們應(yīng)該解決上述問題，努力研究生產(chǎn)將在嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基進行交換反應(yīng)時生成的嘧啶堿基轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物的酶的微生物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)屬于節(jié)細菌屬、桿菌屬、假單細胞屬或者紅球菌屬的微生物可生產(chǎn)這種酶，從而完成本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明的第一個方面是高產(chǎn)率制備嘌呤核苷化合物的方法，其特征在于在含有磷酸離子的水溶液中使嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基通過嘌呤核苷磷酸化酶堿基嘧啶核苷磷酸化酶的作用進行堿基的交換反應(yīng)中，生成的嘧啶堿基通過微生物或者由該微生物產(chǎn)生的酶轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物。
本發(fā)明的第二個方面是產(chǎn)生尿嘧啶胸腺脫氫酶或者二氫尿嘧啶脫氫酶的微生物，它是選自節(jié)細菌屬YGK 222(FERM BP-5907)、巨大芽胞桿菌YGK 252(FERM BP-5908)以及假單胞細菌屬YGK 443(FERMBP-5909)的微生物。
通過利用本發(fā)明的核酸堿基的交換反應(yīng)制備嘌呤核苷化合物的方法，可以以價格便宜且容易得到的嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基為原料，以高產(chǎn)率并且穩(wěn)定地制備嘌呤核苷化合物。


圖1表示在實施例1中在加入尿嘧啶胸腺分解酶溶液的反應(yīng)溶液中的各個成分的濃度隨時間的變化圖。
圖2表示在實施例1中在不加入尿嘧啶胸腺分解酶溶液的反應(yīng)溶液中的各個成分的濃度隨時間的變化圖。
下面詳細說明本發(fā)明。
首先說明本發(fā)明的第一方面。
第一方面是嘌呤核苷化合物的制備方法，其特征在于在含有磷酸離子的水溶液中，在嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基通過嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用進行堿基交換的反應(yīng)中，生成的嘧啶堿基通過微生物或者由該微生物形成的酶的作用下，轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物。<原料>
本發(fā)明的原料所采用的嘧啶核苷化合物如果受到嘧啶核苷磷酸化酶的作用，受到所使用生成的嘧啶堿基的分解酶的作用，對是否是天然型的或者非天然型的沒有特別的限制。例如可以列舉尿核苷、脫氧核苷、5-甲基核苷、脫氧胸腺嘧啶核苷，也可以包括其它非天然型的嘧啶核苷堿基及非天然型的脫氧嘧啶核苷。
本發(fā)明所采用的嘌呤堿基如果是受到嘌呤核苷磷酸化酶作用的，沒有特別的限定。例如可列舉腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤等天然型嘌呤堿基，5-羥基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤等的氨基化嘌呤，2-氯嘌呤、6-氯嘌呤、2,6-二氯嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤等鹵化嘌呤，以及6-巰基嘌呤、6-甲硫基嘌呤等硫化嘌呤等非天然型嘌呤堿基。<微生物以及酶>
用于本發(fā)明的嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶原則上說任何來源的都可以。
對于在本發(fā)明中所采用的由分解嘧啶堿基的微生物產(chǎn)生的酶可以是將堿基交換反應(yīng)生成的嘧啶堿基轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物的酶，對其沒有特別的限制。例如可列舉尿嘧啶胸腺脫氫酶(EC1.2.99.1)、二氫嘧啶脫氫酶(EC1.3.1.1)等。特別是由后面描述的本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的酶，以及由紅球菌屬JCM3132、或者紅球菌屬JCM3191產(chǎn)生的酶。
在本說明書中，通過微生物或者由微生物產(chǎn)生的酶是指采用含有微生物的懸濁液(菌體懸濁液)或者由這種微生物產(chǎn)生的酶進行嘧啶堿基的分解反應(yīng)。因此，在本發(fā)明中，采用含有微生物的懸濁液(菌體懸濁液)或者由該微生物產(chǎn)生的酶可以進行嘧啶堿基的分解反應(yīng)。也就是說，本發(fā)明可以直接采用含有微生物的菌體懸濁液來進行嘧啶堿基的分解反應(yīng)，而且也可提取由微生物產(chǎn)生的酶進行該反應(yīng)。<核糖-1-磷酸的穩(wěn)定劑>
在本發(fā)明中，通過嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用形成的堿基的交換反應(yīng)經(jīng)過作為中間體的核糖-1-磷酸或者脫氧核糖-1-磷酸的糖衍生物。這些中間體本來是不穩(wěn)定的，如果放置，經(jīng)過一段時間會分解成核糖或者脫氧核糖類的糖，但是如果反應(yīng)體系中存在磷酸酶，更加速了中間體的水解反應(yīng)。作為中間體的分解產(chǎn)物的核糖或者脫氧核糖類的糖不在這些核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成，因此，減少了嘌呤核苷或者脫氧嘌呤核苷的生成量。在此，為了提高這些嘌呤核苷化合物的生成效率，在努力尋找使核糖-1-磷酸或者脫氧核糖-1-磷酸類的糖衍生物穩(wěn)定化，阻止磷酸酶活性的物質(zhì)。其結(jié)果是發(fā)現(xiàn)結(jié)合一種形成絡(luò)合物的化合物是有效的。
也就是說發(fā)現(xiàn)與選自氨基乙酸、亞氨二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(簡稱EDTA)、乙二醇(2·氨基乙醚)四乙酸(簡稱EGTA)以及它們的鹽的至少一種以上的化合物和硼酸或者鹽的結(jié)合是有效的。特別是硼酸和乙二胺四乙酸的結(jié)合具有顯著效果。<反應(yīng)條件和分離·精制>
下面描述反應(yīng)條件。在本發(fā)明中，原料嘧啶核苷化合物的初始濃度是5～300mM，較好地是10～50mM。嘌呤堿基一般是難溶性的，但是如果假定初始添加量全部溶解來計，初始濃度為5～300mM，較好地是10～50mM。磷酸離子的初始濃度為1～20mM就足夠了。而且，核苷和嘌呤堿基通常采用相同的初始濃度。一般來說，相對于磷酸離子核苷的濃度比增大，目的產(chǎn)物的嘌呤核苷化合物的產(chǎn)率增大。
在作為穩(wěn)定劑使用的形成配合物的化合物中，硼酸或者其鹽的用量為5～200mM，較好地是50～100mM，結(jié)合的另一方面是EDTA或者其鹽等的用量為2～12mM，較好地是4～6mM。
反應(yīng)溶液的pH為6.5～10.5，較好地是7.0～8.0。反應(yīng)溫度為35～60℃，較好地是35～45℃。
從反應(yīng)溶液中提取生成物可以使用結(jié)晶和色譜分離法等。
下面說明本發(fā)明制備方法的原理。<本發(fā)明的原理和理論>
(1)在本發(fā)明的第一個階段，在磷酸離子存在情況下，通過嘧啶核苷磷酸化酶的作用，由嘧啶核苷化合物和磷酸離子生成嘧啶堿基和在如核糖-1-磷酸或者2-脫氧核糖-1-磷酸這樣的糖的1位上結(jié)合磷酸離子的糖衍生物(下面簡單地稱為糖衍生物)。
(2)下面，作為第二個階段，生成的糖衍生物通過嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤堿基的作用進行置換反應(yīng)。由此，由糖衍生物和嘌呤堿基的反應(yīng)生成嘌呤核苷化合物和磷酸離子。
整理(1)和(2)的反應(yīng)，采用嘧啶核苷和嘌呤堿基，通過嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的作用，進行堿基的置換反應(yīng)，生成嘧啶堿基和嘌呤核苷化合物。
(3)下面，在本發(fā)明中，反應(yīng)體系含有將嘧啶堿基轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物的酶或者產(chǎn)生這些酶的微生物。在本發(fā)明中，可以采用尿嘧啶胸腺脫氫酶或者二氫尿嘧啶脫氫酶這樣的酶或者產(chǎn)生這些酶的微生物，但是并不限于此。在本發(fā)明的制備方法中，通過上述酶或者產(chǎn)生這些酶的微生物和電子受體共存，嘧啶堿基被轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物。即，在反應(yīng)體系中采用菌體懸濁液時，由于菌體內(nèi)含有電子受體，反應(yīng)體系中可不必加入電子受體。轉(zhuǎn)變的嘧啶堿基由于不在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成，與基質(zhì)的交換反應(yīng)無關(guān)，從反應(yīng)體系中排除。由此，反應(yīng)的平衡向生成目的產(chǎn)物的嘌呤核苷化合物一側(cè)移動，可高產(chǎn)率地得到目的產(chǎn)物。
(4)進而，根據(jù)需要，為了通過下面的優(yōu)選方案進行具體地說明，也可含有進一步分解轉(zhuǎn)變的化合物的酶。
下面，以具體的實施例說明本發(fā)明的制備方法。
本發(fā)明的優(yōu)選方案原料嘧啶核苷化合物采用尿核苷或者2’-脫氧尿核苷(下面稱為脫氧尿核苷)，核酸堿基采用嘌呤堿基，酶采用嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶以及尿嘧啶胸腺脫氫酶(EC1.2.99.1)。
(1)首先，在第一階段，在磷酸離子存在情況下，通過嘧啶核苷磷酸化酶的作用，由尿核苷或者脫氧尿核苷和磷酸離子生成尿嘧啶和核糖-1-磷酸或者2-脫氧核糖-1-磷酸(下面稱為脫氧核糖-1-磷酸)。
(2)接著，在第二階段，生成的核糖-1-磷酸或者脫氧核糖-1-磷酸通過嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤堿基的作用進行置換反應(yīng)。由此，由核糖-1-磷酸和嘌呤堿基的反應(yīng)生成嘌呤核苷化合物和磷酸離子，由脫氧核糖-1-磷酸和嘌呤堿基的反應(yīng)生成2’-脫氧嘌呤核苷(下面稱為脫氧嘌呤核苷)和磷酸離子。
整理(1)和(2)的反應(yīng)，采用尿核苷或者脫氧尿核苷和嘌呤堿基，通過嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的作用，進行堿基交換反應(yīng)，生成尿嘧啶和嘌呤核苷或者脫氧嘌呤核苷。
(3)通過在反應(yīng)體系中尿嘧啶胸腺脫氫酶或者尿嘧啶胸腺脫氫酶和NAD等電子受體(氧化型)的共存，通過尿核苷或者脫氧尿核苷的分解生成的尿嘧啶不可逆地生成巴比土酸。由于生成的巴比土酸不在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成，與基質(zhì)的交換反應(yīng)無關(guān)，排除在反應(yīng)體系之外。由此，反應(yīng)平衡向生成目的產(chǎn)物的嘌呤核苷化合物的一側(cè)移動，以高產(chǎn)率地得到目的產(chǎn)物。
(4)進而，通過在反應(yīng)體系中存在巴比土酶(バルビツテ-ゼ)(EC3.5.2.1)，巴比土酸分解成尿素和丙二酸。從而通過尿嘧啶胸腺脫氫酶促進了轉(zhuǎn)換反應(yīng)。
例如，初始原料的嘧啶核苷化合物采用脫氧尿核苷，嘌呤堿基采用鳥嘌呤，作為目的產(chǎn)物的嘌呤核苷化合物得到2’-脫氧鳥嘌呤核苷(下面稱為脫氧鳥嘌呤核苷)的情況如下。
其中，PYNP表示嘧啶核苷磷酸化酶，PUNP表示嘌呤核苷磷酸化酶，Pi表示磷酸。由(1)和(2)組成下面的式子。
PYNPH和PUNP如前面所定義。
本發(fā)明其它的優(yōu)選方案是嘧啶核苷化合物采用尿核苷或者脫氧尿核苷，核酸堿基采用嘌呤堿基，酶采用嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶以及二氫尿嘧啶脫氫酶(EC1.3.1.1)。
(1)通過嘧啶核苷磷酸化酶的作用，由尿核苷或者脫氧尿核苷和磷酸離子生成尿嘧啶和核糖-1-磷酸或者脫氧核糖-1-磷酸。
(2)接著，生成的核糖-1-磷酸或者脫氧核糖-1-磷酸通過嘌呤核苷磷酸化酶的作用和嘌呤堿基進行置換反應(yīng)。由此，由核糖-1-磷酸和嘌呤堿基的反應(yīng)生成嘌呤核苷化合物和磷酸離子，由脫氧核糖-1-磷酸和嘌呤堿基的反應(yīng)生成脫氧嘌呤核苷和磷酸離子。
整理(1)和(2)的反應(yīng)，采用尿核苷或者脫氧尿核苷和嘌呤堿基，通過嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的作用，進行堿基的置換反應(yīng)，生成嘌呤核苷或者脫氧嘌呤核苷和尿嘧啶。
(3)通過在反應(yīng)體系中的二氫尿嘧啶脫氫酶或者二氫尿嘧啶脫氫酶和NADH等電子受體(還原型)共存，通過尿核苷或者脫氧尿核苷的分解生成的尿嘧啶不可逆地生成二氫尿嘧啶。由于生成的二氫尿嘧啶不在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成，與基質(zhì)的交換反應(yīng)無關(guān)，排除在反應(yīng)體系之外。由此，反應(yīng)的平衡向生成目的產(chǎn)物的嘌呤核苷化合物的一側(cè)移動，定量得到目的產(chǎn)物。
(4)進而，通過在反應(yīng)體系中存在二氫嘧啶酶(ピリミジナ-ゼ)(EC3.5.2.2)，二氫尿嘧啶分解成N-氨基甲酰-β-氨基丙酸。由此，促進了二氫尿嘧啶脫氫酶的反應(yīng)。
例如初始原料的嘧啶核苷化合物采用脫氧尿核苷，嘌呤堿基采用腺嘌呤，得到目的產(chǎn)物為2’-脫氧腺嘌呤核苷(下面稱為腺嘌呤核苷)的情況如下。
其中，PYNP、PUNP以及Pi如前面所定義。由(1)和(2)得到下面的式子。
但是，PYNP以及PUNP如前面所定義。
下面，說明第二個本發(fā)明的第二方面。
第二方面是產(chǎn)生尿嘧啶胸腺脫氫酶或者二氫尿嘧啶脫氫酶的微生物，它是選自節(jié)細菌屬YGK 222(FERM BP-5907)、巨大芽胞桿菌YGK252(FERM BP-5908)以及假單胞細菌屬YGK 443(FERM BP-5909)的微生物。<生產(chǎn)酶的微生物>
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)下面的微生物可生產(chǎn)使嘧啶堿基轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶以及嘌呤核苷磷酸化酶基質(zhì)中形成的化合物的一系列酶中的一種或者一種以上。
即，這些微生物可產(chǎn)生選自(1)尿嘧啶胸腺脫氫酶、(2)二氫尿嘧啶脫氫酶、(3)尿嘧啶胸腺脫氫酶和(EC3.5.2.1)和巴比土酶(EC3.5.2.1)以及(4)二氫尿嘧啶脫氫酶和二氧嘧啶酶(EC3.5.2.2)中至少一種的酶。<培養(yǎng)條件和酶的制備>
這些微生物在普通的培養(yǎng)基上可良好地生長，生產(chǎn)這種酶，但是在培養(yǎng)基上添加嘧啶堿基，能有效地提高酶的活性。
可以直接利用培養(yǎng)出的菌體作為粗菌體，也可以采用通過常規(guī)方法得到的粗酶。
節(jié)細菌屬(Arthrobacter sp.)YGK 222(FERM BP-5907)巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)YGK 252(FERM BP-5908)假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)YGK 443(FERM BP-5909)紅球菌屬(Rhodococcus erythropolis)JCM 3132紅球菌屬(Rhodococcus erythropolis)JCM 3191JCM記號表示所提供的菌株是理化研究所微生物系統(tǒng)保存機構(gòu)保存的菌株。這些菌株可以通過上述保存機構(gòu)得到。其它菌株(YGK222(FERM BP-5907)、YGK 252(FERM BP·5908)、YGK 443(FERMBP-5909))寄存在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所特許微生物寄存中心。這些微生物、YGK 222(FERM BP-5907)、YGK252(FERM BP-5908)以及YGK 443(FERM BP-5909)的寄存是根據(jù)專利程序上的微生物寄存國際認定的布達佩斯條約在1997年4月11日進行的。這些菌株分別以括號內(nèi)的寄存編號來寄存。
這些寄存菌株的菌學(xué)性質(zhì)按照バ-ジエイス·マニユアル·オブ·デタ-ミナテイブ·バクテリオロジ-第8版(1975年)、バ-ジエイス·マニユアル·オブ·デタ-ミナテイ ブ·バクテリオロジ-第1卷(1984年)以及第2卷(1986年)檢測的結(jié)果如下。試驗主要以長谷川武治編著的改訂版「鑒定微生物的分類系統(tǒng)」(學(xué)會出版中心，1985年)記載的方法進行。這些文獻構(gòu)成參考文獻作為本說明書的一部分。
節(jié)球菌屬YGK 2221．形態(tài)的性質(zhì)(1)細胞的大小0.5～0.7×1.0～5.0微米的桿菌(2)革蘭染色性陰性(3)細胞的多形性發(fā)現(xiàn)在生活環(huán)境中伴隨有球菌～桿菌的明顯的多形性。
(4)運動性有(在酵母提取物加肉汁的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～24個小時可看見有運動性)
(5)鞭毛的著生狀態(tài)有，1～2個側(cè)毛(6)孢子的有無無(7)抗酸性無2．培養(yǎng)的性質(zhì)(1)肉汁瓊脂的平板培養(yǎng)在30℃經(jīng)過24小時的培養(yǎng)，形成乳白色半透明的表面呈不光滑的圓形的波紋狀菌叢。
(2)肉汁瓊脂的斜面培養(yǎng)在整個培養(yǎng)基上呈淡黃色半透明狀擴展，發(fā)育良好。
(3)肉汁液體培養(yǎng)生長遲緩。加入了酵母提取物，在振動培養(yǎng)基上生長良好。
(4)肉汁明膠穿刺培養(yǎng)表面液化。
(5)石蕊乳不變化3．生理學(xué)的性質(zhì)(1)硝酸鹽的還原陰性(2)脫氮反應(yīng)陰性(3)MR測試 陰性(4)VP測試 陰性(5)吲哚的生成 陰性(6)硫化氫的生成陰性(7)檸檬酸的利用·克理斯蒂森培養(yǎng)基 陰性·克薩培養(yǎng)基 陰性(8)無機氮源的利用·硝酸鹽 陽性·銨鹽 陰性(9)色素的生成 無(10)尿素酶 陰性(11)氧化酶 陰性(12)過氧化氫酶 陰性(13)生長的范圍·pH區(qū)域 5.5～9.5·溫度區(qū)域 19～38℃(14)對氧的態(tài)度 需氧性
(15)O-F測試·葡萄糖 沒有變化·蔗糖沒有變化(16)各種碳源的利用·L-阿拉伯糖 ±·D-木糖 +·D-葡萄糖+·D-甘露糖+·D-果糖 +·D-半乳糖+·麥芽糖 +·蔗糖+·乳糖-·海藻糖 +·D-山梨醇+·D-甘露醇+·肌醇+·甘油-·淀粉-4．GC含量(HPLC法測定)G+C(摩爾％)=69.6根據(jù)以上的菌學(xué)性質(zhì)，判斷本菌株屬于節(jié)球菌屬(Arthrobactersp.)。
巨大芽胞桿菌YGK 2521．形態(tài)的性質(zhì)(1)細胞的大小1.6×4.0～9.0微米的桿菌(2)革蘭染色性陽性(3)細胞的多形性沒有(4)運動性有(5)鞭毛的著生狀態(tài)有，周毛(6)孢子的有無有，孢子囊不膨脹，孢子的形狀為橢圓形(7)抗酸性無2．培養(yǎng)的性質(zhì)
(1)肉汁瓊脂平板培養(yǎng)在30℃經(jīng)過24小時的培養(yǎng)，形成乳白色半透明的表面呈不光滑的圓形波紋狀菌叢。
(2)肉汁瓊脂的斜面培養(yǎng)呈淡黃色半透明的表面呈樹皮氣味，周邊沿沖擊呈鋸齒狀良好地生長。
(3)肉汁液體培養(yǎng)基生長遲緩。如果加入酵母提取物，生長良好。
(4)肉汁明膠穿刺培養(yǎng)僅表面液化。
(5)石蕊乳變成微酸性，看見有凝固3．生理學(xué)的性質(zhì)(1)硝酸鹽的還原 陽性(2)脫氮反應(yīng) 陽性(3)MR測試 陽性(4)VP測試 陰性(5)吲哚的生成 陰性(6)硫化氫的生成 陰性(7)檸檬酸的利用·克理斯蒂森培養(yǎng)基陽性·克薩培養(yǎng)基 陽性(8)無機氮源的利用·硝酸鹽 陽性·銨鹽陽性(9)色素的生成 沒有(10)尿素酶陽性(11)氧化酶陽性(12)過氧化氫酶陽性(13)生長的范圍·pH區(qū)域 5.5～10.5·溫度區(qū)域10～43℃(14)對氧的態(tài)度需氧性(15)O-F測試·葡萄糖 沒有變化·蔗糖沒有變化(16)各種碳源的利用
·L-阿拉伯糖 -·D-木糖 -·D-葡萄糖 -·D-甘露糖 -·D-果糖 -·D-半乳糖 -·麥芽糖 -·蔗糖 -·乳糖 -·海藻糖 -·D-山梨醇 -·D-甘露醇 -·肌醇 -·甘油 -·淀粉 +4．GC含量(HPLC法測定)G+C(摩爾％)=34.7根據(jù)以上的菌學(xué)性質(zhì)，判斷本菌株屬于巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)。
假單胞菌屬YGK 4431．形態(tài)的性質(zhì)(1)細胞的大小0.4～0.6×0.6～2.4微米的桿菌(2)革蘭染色性陰性(3)細胞的多形性沒有(4)運動性有(5)鞭毛的著生狀態(tài)有，4～5個極小的鞭毛(6)孢子的有無無(7)抗酸性陰性2．培養(yǎng)的性質(zhì)(1)肉汁瓊脂平板培養(yǎng)在30℃經(jīng)過24小時培養(yǎng)，形成乳白色半透明的表面呈光滑的圓形的波紋狀菌叢。
(2)肉汁瓊脂的斜面培養(yǎng)呈乳白色半透明的光澤，沿著沖擊生長良好。(3)肉汁液體培養(yǎng)可見在振動培養(yǎng)基上良好地生長。(4)肉汁明膠穿刺培養(yǎng)沒有變化(5)石蕊乳堿性，不胨化。3．生理學(xué)的性質(zhì)(1)硝酸鹽的還原 陽性(2)脫氮反應(yīng) 陰性(3)MR測試陰性(4)VP測試陰性(5)吲哚的生成陰性(6)硫化氫的生成 陰性(7)檸檬酸的利用·克理斯蒂森培養(yǎng)基 陽性·克薩培養(yǎng)基 陽性(8)無機氮源的利用·硝酸鹽 陽性·銨鹽 陽性(9)色素的生成沒有(10)尿素酶 陽性(11)氧化酶 陽性(12)過氧化氫酶 陽性(13)生長的范圍·pH區(qū)域 4.2～10.5·溫度區(qū)域 17～43℃(14)對氧的態(tài)度 需氧性(15)O-F測試·葡萄糖 O(氧化的)·蔗糖 沒有變化(16)精酰胺的分解 陰性(17)各種碳源的利用·L-阿拉伯糖 +·D-木糖 +·D-葡萄糖 +·D-甘露糖 +
·D-果糖+·D-半乳糖 +·麥芽糖+·蔗糖 +·乳糖 -·海藻糖+·D-山梨醇 -·D-甘露醇 +·肌醇 +·甘油 +·淀粉 -4．GC含量(HPLC法測定)G+C(摩爾％)=62.3根據(jù)以上的菌學(xué)性質(zhì)，判斷本菌株屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。實施例下面通過制造例、試驗例和實施例更詳細地說明本發(fā)明。
制造例1 制備含有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的菌株懸濁液按下面的順序培養(yǎng)作為嘌呤核苷磷酸化酶(下面稱為PYNP)和嘧啶核苷磷酸化酶(下面稱為PYNP)的生產(chǎn)菌株的芽胞桿菌屬脂肪嗜熱桿菌(Bacillus stearothermopHilus)JTS 859(FERM P-9666)。
細菌培養(yǎng)采用由バクトトリプトン10克、酵母浸汁5克、葡萄糖3克、食鹽3克、肌苷1克以及水1升構(gòu)成的pH為6.2的培養(yǎng)基。在1.5升這種培養(yǎng)基中加入3×107個芽胞桿菌屬脂肪嗜熱桿菌JTS859(FERM P-9666)的孢子，采用帶有攪拌葉片(直徑70毫米，上下各一只)的3升容積的發(fā)酵缸，以500rpm的速度旋轉(zhuǎn)攪拌葉片，在通氣量1vvm，培養(yǎng)溫度65℃,pH6.0～6.4條件下培養(yǎng)5個小時。
培養(yǎng)完成之后，通過離心分離菌體(10000G,4℃,15分)進行收集，將得到的20克濕菌體在30毫升10mM的磷酸鉀溶液(pH7)中形成的懸濁液作為含有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的菌體的懸濁液(下面稱為PUNP·PYNP酶溶液)。制備例2 制備具有尿嘧啶和胸腺分解活性的菌體懸濁液按照下面的順序制備具有尿嘧啶以及胸腺分解活性的節(jié)細菌屬YGK222(FERM BP-5907)、巨大芽胞桿菌YGK 252(FERM BP-5908)、假單胞菌屬YGK443(FERM BP-5909)、紅球菌屬JCM 3132、紅球菌屬JCM3191的菌體懸濁液。
細菌培養(yǎng)采用由尿嘧啶2克、磷酸二氫鉀1克、磷酸氫二鉀3克、酵母提取物6克以及水1升制成的pH為7.0的培養(yǎng)基。在加入了500毫升上述各培養(yǎng)基的2升容積的三角燒瓶中分別加入上述微生物的菌體或者3×107個孢子，以200rpm的速度旋轉(zhuǎn)，在35℃的溫度下培養(yǎng)15個小時。
培養(yǎng)完成之后，通過離心分離菌體(10000G,4℃,15分)收集，將得到的濕菌體在6毫升10mM磷酸鉀溶液(pH7)中懸浮，制成懸濁液(下面稱為尿嘧啶·胸腺分解酶溶液)。實施例1 由微生物生產(chǎn)尿嘧啶以及胸腺分解酶含有均為0.05毫升的50mM尿嘧啶或者50mM胸腺嘧啶中的任意一個、100mM磷酸緩沖溶液(pH7)以及由制備例2制備的各個菌株得來的尿嘧啶·胸腺分解酶溶液中任意一個的總量為1毫升的反應(yīng)溶液，在35℃反應(yīng)15分鐘，對反應(yīng)溶液中的尿嘧啶以及胸腺分解活性采用高速液體色譜分離法進行定量分析。結(jié)果列于表1。
在此分解活性U是在35℃每1分鐘分解1微摩爾基質(zhì)(尿嘧啶或者胸腺嘧啶)的酶活性的量。
表1
實驗例2 尿嘧啶·胸腺分解酶生產(chǎn)菌的生產(chǎn)酶使含有均為0.05毫升的50mM尿嘧啶、100mM磷酸緩沖溶液(pH7)以及制備例2制備的由各菌株得來的尿嘧啶·胸腺分解酶溶液中任意一個的總體為1毫升的反應(yīng)溶液在35℃反應(yīng)15～30分鐘。對反應(yīng)溶液中的尿嘧啶胸腺脫氫酶、巴比土酶、二氫尿嘧啶脫氫酶以及二氫核苷酶的存在、巴比土酸以及二氫尿嘧啶的生成和消失通過高速液體色譜分離法追蹤進行檢測。其結(jié)果列于表2。+表示檢測有酶，-表示沒有檢測出酶。
在這種情況下，例如，如果二氫核苷酶的活性比二氫尿嘧啶脫氫酶的活性強，就檢測不出生成物二氫尿嘧啶。但是，表2的-記號不表示該酶100％的不存在。
表2
實施例1 通過PUNP·PYNP酶溶液和尿嘧啶·胸腺分解酶溶液的作用制備嘌呤核苷使含有20mM脫氧胸腺嘧啶核苷、20mM鳥嘌呤、1.25mM磷酸鉀、制備例1制備的PUNP·PYNP酶溶液2毫升、制備例2制備的由節(jié)細菌屬YGK 222制備的尿嘧啶胸腺分解酶溶液0.5毫升、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的總量為100毫升的水溶液(pH7)在35℃反應(yīng)110小時，測定反應(yīng)溶液中所含的基質(zhì)以及生成物的濃度。其結(jié)果如圖1所示。
而且除了不加入尿嘧啶·胸腺分解酶溶液之外，全部與上述在同一個條件下進行反應(yīng)，測定反應(yīng)溶液中所含的基質(zhì)和生成物的濃度。其結(jié)果如圖2所示。
在圖1和圖2中，白色四角形表示脫氧胸腺嘧啶核苷，涂黑的菱形表示脫氧鳥嘌呤核苷，涂黑的三角形表示胸腺嘧啶，白色三角形表示5-甲基巴比土酸。
在圖1中，可見生成5-甲基巴比土酸，進一步說明由于該酸分解消失，在這種尿嘧啶·胸腺分解酶溶液中至少有尿嘧啶胸腺脫氫酶以及巴比土酶存在。在這種(圖1)情況下，可見稍有原料鳥嘌呤殘存，脫氧胸腺嘧啶核苷基本上消失。生成14.9mM(產(chǎn)率為75％)脫氧鳥嘌呤核苷。與不存在尿嘧啶·胸腺分解酶溶液的情況(圖2)相比，可見目的產(chǎn)物的脫氧鳥嘌呤核苷的產(chǎn)量非常高。實施例2～11采用各種原料核苷和各種原料嘌呤堿基制備嘌呤核苷出來采用表3所示的嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基之外，在與實施例1相同的條件下在35℃反應(yīng)90小時。在反應(yīng)溶液中所含的基質(zhì)和生成物的濃度的定量結(jié)果在表3表示。除了加入0.5毫升蒸餾水來代替尿嘧啶·胸腺分解酶溶液之外，在與上述相同的條件下進行反應(yīng)來對照。通過加入尿嘧啶·胸腺分解酶溶液，提高了嘌呤核苷的產(chǎn)率，特別是其效果對鳥嘌呤核苷和脫氧鳥嘌呤核苷的生成有顯著影響。
表3
實施例12對生成由各菌株得來的尿嘧啶·胸腺分解酶溶液的嘌呤核苷化合物的效果制備含有20mM脫氧胸腺嘧啶核苷、20mM鳥嘌呤、1.25mM磷酸鉀、制備例1制備的PUNP·PYNP2毫升、制備例2制備的由各菌株得來的尿嘧啶·胸腺分解酶溶液0.5毫升、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的總量為100毫升的溶液(pH7)。除了加入0.5毫升蒸餾水來代替尿嘧啶·胸腺分解酶溶液之外，在與上述相同的條件下反應(yīng)進行對照。
將這些溶液在35℃下反應(yīng)100小時，測定反應(yīng)溶液中所含的菌株和生成物的濃度。結(jié)果列于表4。
可確定任何由菌株得來的尿嘧啶·胸腺分解酶溶液都提高了脫氧鳥嘌呤核苷的生成效率。
表4
實施例13反應(yīng)中間體(核糖-1-磷酸)的穩(wěn)定化和抑制磷酸酶的分解使含有5mM核糖-1-磷酸、表5所示的穩(wěn)定劑(EDTA為4mM，其它以100mM的濃度使用)、制備例1制備的PUNP·PYNP酶溶液0.02毫升、制備例2制備的由節(jié)細菌屬YGK222得來的尿嘧啶·胸腺分解酶溶液0.01毫升的總量為1毫升的水溶液(pH7)在35℃反應(yīng)72小時，在反應(yīng)溶液中所含的核糖-1-磷酸和分解生成物的核糖通過薄層色譜分離法測定的結(jié)果列于表5。測定法是Ishii的方法(Agric.Biol.Chem.,53(12),3209-3218(1989))。該文獻作為參考文獻是本說明書的一部分。除了加入三(羥甲基)氨基甲鹽酸(下面稱為“三”)100mM，不加入兩種酶溶液之外，將與上相同制備的溶液作為“三”(對照)。表中的+表示核糖-1-磷酸分解，-表示不分解。
在不添加酶溶液的“三”(對照)中，由于不進行到分解的程度，可見酶溶液中含有磷酸酶。由于認為在硼酸和EDTA的添加溶液中核糖-1-磷酸不分解，這些物質(zhì)抑制了酶溶液中磷酸酶的活性，可見賦予了核糖-1-磷酸具有穩(wěn)定性。
由這些結(jié)果可見，與實施例13所示的硼酸和EDTA類似的配位體形成化合物的結(jié)合，具有抑制核糖-1-磷酸的分解和穩(wěn)定化的效果，并且證明提高了嘌呤核苷化合物的生成效率。
表權(quán)利要求
1．嘌呤核苷化合物的制備方法，其特征在于嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基在含有磷酸離子的水溶液中，通過嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的作用進行堿基交換反應(yīng)，生成的嘧啶堿基通過微生物或者由該微生物生成的酶的作用，轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物。
2．嘌呤核苷化合物的制備方法，其特征在于在權(quán)利要求1所述的嘌呤核苷化合物的制備方法中，作為在堿基交換反應(yīng)時生成的反應(yīng)中間體的核糖-1-磷酸或者脫氧核糖-1-磷酸的穩(wěn)定劑是選自氨基乙酸、亞氨二乙酸、氨基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇(2-氨基乙醚)四乙酸以及它們的鹽中的至少一種的化合物和硼酸和其鹽。
3．權(quán)利要求1或2所述的嘌呤核苷化合物的制備方法，其中微生物選自節(jié)細菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬的微生物。
4．權(quán)利要求1或2所述的嘌呤核苷化合物的制備方法，其中嘧啶核苷化合物是選自尿核苷、脫氧尿核苷、5-甲基尿核苷以及脫氧胸腺嘧啶核苷的化合物。
5．權(quán)利要求1或2所述的嘌呤核苷化合物的制備方法，其中嘌呤堿基是選自腺嘌呤、鳥嘌呤、5-羥基嘌呤、鹵化嘌呤以及氨基化嘌呤的化合物。
6．權(quán)利要求1或2所述的嘌呤核苷化合物的制備方法，其中由微生物得來的酶是尿嘧啶胸腺分解酶或者二氫尿嘧啶脫氫酶。
7．權(quán)利要求1、2或3所述的嘌呤核苷化合物的制備方法，其中微生物是節(jié)細菌屬YGK 222(FERM BP-5907)、巨大芽胞桿菌YGK252(FERM BP-5908)、假單胞菌屬YGK 443(FERM BP-5909)、紅球菌屬JCM 3132或者紅球菌屬JCM 3191。
8．產(chǎn)生尿嘧啶胸腺分解酶或者二氫尿嘧啶脫氫酶的微生物是選自節(jié)細菌屬YGK 222(FERM BP-5907)、巨大芽胞桿菌YGK 252(FERMBP-5908)以及假單胞菌屬YGK 443(FERM BP-5909)的微生物。
全文摘要
本發(fā)明提供制備嘌呤核苷化合物的方法,包括通過在含有磷酸離子的水溶液中使嘧啶核苷化合物和嘌呤堿基在嘧啶核苷磷酸化酶或者嘌呤核苷磷酸化酶的作用下進行堿基交換反應(yīng),生成的嘧啶堿基在微生物和由該微生物產(chǎn)生的酶的作用下轉(zhuǎn)變成不在嘧啶核苷磷酸化酶或者嘌呤核苷磷酸化酶的基質(zhì)中形成的化合物以及產(chǎn)生尿嘧啶胸腺分解酶或者二氫尿嘧啶脫氫酶的微生物。
文檔編號C12P19/40GK1207417SQ9811713
公開日1999年2月10日 申請日期1998年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月4日
發(fā)明者三上洋一, 松本清一郎, 吉中信二, 須永陽之助, 長谷川綾美 申請人:有機合成藥品工業(yè)株式會社