專利名稱：抑制血管形成因子1、其衍生物及其應用的制作方法
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本發(fā)明涉及一種新的人血管抑制因子，稱為IAF-1，其克隆重組表達和一組該因子的衍生物以及它們的制備方法，本發(fā)明還涉及所述的IAF-1在制備治療各種腫瘤和各種血管異常性疾病的有效的新的生物制劑中的應用，也涉及IAF-1結(jié)合的受體及受體的分離克隆，同時，本發(fā)明還涉及IAF-1的抗體，包括多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體及人源化抗體。
血管的形成和發(fā)展在人體許多重要生理過程中起著重要的作用，如胎兒發(fā)育，傷口愈合，黃體生成，器官再生等，這種生理性的血管生成過程一般是較短暫，并受機體嚴格的調(diào)節(jié)。相反，無控制的血管生成在許多病理性疾病中起著重要的作用，如風濕性關節(jié)炎，糖尿病性視網(wǎng)膜病，動脈粥樣硬化，血管增生性血管瘤，黃斑性青光眼等等，阻斷無序血管的生成能有效地治療這些疾病。
血管形成在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中也起著重要的作用。惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康和生命，目前其死亡率居所有疾病死亡的第二位，人們始終不斷地探索，力圖尋找出有效的治療手段。目前，現(xiàn)有的手術、放療、化療三大常規(guī)治療沒有明顯地降低腫瘤的死亡率，近十年來發(fā)展起來的各種生物療法，因多種限制因素，其療效仍不如人意。
早在1973年Folkman首先提出了腫瘤的生長轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關，并推測抑制腫瘤血管的生成將導致腫瘤生長的抑制。20多年的研究進一步證明了新生血管的生成是腫瘤賴以生長和轉(zhuǎn)移的必需條件，沒有新血管的生成，腫瘤不可能獲得血供及營養(yǎng)長到比豌豆大，也不可能發(fā)生擴散轉(zhuǎn)移。因此，阻斷新生血管的生成就能建立強力有效的治療腫瘤的新型療法。
血管生成過程主要包括血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、侵潤，內(nèi)皮細胞質(zhì)的形成，相連及管腔形成等步驟，研究表明這一過程可能是由兩類多肽因子(或蛋白)所調(diào)節(jié)的。一類是能促進血管生成的正調(diào)節(jié)因子，如纖維母細胞生長因子(FGF)，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)等；另一類是能抑制血管生成的負調(diào)節(jié)因子，兩類因子間的平衡決定著新血管是否形成，導致血管形成在極大程度上取決于所產(chǎn)生的血管生成抑制因子的數(shù)量是否減少。在正常組織或腫瘤克隆生長期(腫瘤小于2mm)時，血管生成抑制因子起主導作用，無血管生成的刺激作用血管不能形成，腫瘤也不能長大。當腫瘤受到某種因素的誘發(fā)，血管生成抑制因子表達下調(diào)，分泌減少或活性喪失，促血管生成因子表達上調(diào)，分泌過度，活性增加起主導作用，促進新血管的形成，腫瘤由新生血管獲得血供和營養(yǎng)迅速長大，腫瘤形成的新生血管管壁薄通透性大，腫瘤細胞及易進入血液而發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，增加血管生成抑制因子的表達和數(shù)量，減少或阻斷促血管生成因子的表達分泌，封閉其活性都能阻斷腫瘤新血管的形成截斷腫瘤的血供，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。同理也發(fā)生在其他血管異常增生性疾病過程中，通過抑制血管形成或稱為抗血管生成療法，也能有效地治療血管異常增生的疾病。鑒于抗血管療法是針對腫瘤新生血管，因此與其他多種抗癌療法相比有以下特點(1)抗血管生成療法并非著力于殺滅癌腫，而是通過限制或阻斷癌腫血供的現(xiàn)有的異常毛細血管網(wǎng)，因此既能治療腫瘤，也能預防腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移(2)抗血管生成劑針對的是血管內(nèi)皮細胞，而非殺滅腫瘤細胞，從而克服了以腫瘤細胞為靶的化療藥物及抑制劑難以進入內(nèi)部高壓的腫瘤組織的缺點(3)血管內(nèi)皮細胞突變率小，通常不含對血管生成抑制劑產(chǎn)生耐藥，而且是特異地作用于腫瘤新生血管對正常靜止的血管內(nèi)皮細胞依賴于同一血管獲取營養(yǎng)抑制血管形成，將使大量腫瘤細胞死亡，療效好(5)幾乎所有的實體瘤均以相同的方式依賴于血管生成而生長和轉(zhuǎn)移，因此，一種血管生成抑制劑可用于多種腫瘤的治療(6)血管生成抑制劑與針對腫瘤細胞本身的化療和放療聯(lián)合應用，聯(lián)合兩種不同的抗癌機制，將會大大提高療效，也有可能減少化療、放療的劑量達到同樣的療效，從而克服目前放、化療單用時的嚴重毒副作用。到目前為止尚無任何血管生成抑制劑獲準用于腫瘤患者的治療，僅有幾種正在進行實驗室研究或臨床試用，包括TNP-470(煙曲霉素的合成類似物)、α-干擾素、血細胞介素-12，或聚糖多聚硫酸鹽，酞胺哌啶酮，血小板因子-4等，它們除具有抑制血管生成的作用外，還有其他的生物學作用，是一類非專一性的血管生成抑制劑，最近報道的從小鼠腫瘤或腫瘤細胞中分離的抗血管生成因子(Angiostantin)是血管內(nèi)皮細胞專一的抑制劑，證明能抑制小鼠腫瘤，尚未證明對人腫瘤生長的作用。
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的抑制血管形成因子，稱為IAF-1，以及包含其編碼序列的重組載體和用所述載體基因工程化的宿主細胞。
本發(fā)明的第二個目的在于提供抗所述抑制血管形成因子的抗體，包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體。
本發(fā)明的第三個目的在于所述的抑制血管形成因子在制備治療和診斷血管異常增生性疾病和各種腫瘤和腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移的藥物中的應用，以及包含所述的抑制血管形成因子及化療藥物的藥物組合物。
本發(fā)明以人的IAF-1的例子來描述，但這些原則可用于其他物種包括小鼠。下面以人的IAF-1為實例說明本發(fā)明，但這些原則可類似地應用于克隆和表達其它物種，包括鼠的IAF-1。
(一)IAF-1編碼序列本發(fā)明的人的抑制血管生成因子的核苷酸編碼序列以及推導出的氨基酸序列被描述在圖5。人的抑制血管生成因子的核苷酸序列或其功能的來自其他物種的類似物，可用于產(chǎn)生IAF-1的重組體，下文稱這一因子為IAF-1。
在本文所公開的一個特定的實施方案中，根據(jù)膠原XVIII C末端非膠原區(qū)的部分氨基酸序列，設計一對寡核苷酸引物進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，分離出IAF-1因子編碼序列。具體方法是采用5月的胎兒肝臟，提取其RNA后，用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA，以此為模板進行PCR擴增反應，將PCR產(chǎn)物回收純化，經(jīng)Hind III和BamH I酶切。再與已經(jīng)Hind III和BamH I酶切并回收純化的克隆載體pUC18在T4連接酶作用下連接后，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，采用酶切法篩選鑒定含有目的基因片段的重組克隆。隨機選擇三個陽性克隆進行核苷酸序列測定。結(jié)果三個克隆具有相同的核苷酸序列(圖5)。
本發(fā)明也涉及由其他物種，如小鼠等分離的IAF-1基因片段，具有IAF-1的活性。本文以IAF-1的氨基酸序列及功能活性的等同定義IAF-I族的成員。這些成員與IAF-1氨基酸序列應有80％的同源性。人的IAF-1克隆片斷經(jīng)放射標記后可用作篩選噬菌體cDNA庫以及基因組DNA庫的探針分離人的全長IAF-1的cDNA和DNA序列，包括IAF-1的啟動子、增強子、內(nèi)含子等。放射標記的人IAF-1探針也可用于篩選其他物種(如小鼠)的組織噬菌體cDNA庫和DNA庫，分離小鼠的IAF-1全長基因。同時也可根據(jù)人IAF-1編碼的核苷酸序列設計簡并或含簡并的寡核苷酸引物，用于PCR或RT-PCR擴增分離其他物種的IAF-1，可使用該PCR片斷放射標記的探針篩選噬菌體cDNA庫或DNA基因庫以分離出全長IAF-1的cDNA克隆或DNA克隆(其克隆方法見Maniatis 1989.Molecular Cloning.ALaboratory Mannal，cold springs Harbor press N.Y；and Ausubelet al.1989.Current Protocols in Molecular biology(GreenPublishing Associates and Wiley Interscience N.Y.).
按照本發(fā)明，可在合適的宿主細胞中(真核細胞和原核細胞)保存由編碼IAF-1，IAF-1肽片段，IAF-1融合蛋白或功能等同物編碼的IAF-1核苷酸序列構(gòu)建成的重組載體。并表達IAF-1蛋白肽段或融合蛋白。另一方面，在核苷酸雜交試驗，Southern，Northern印跡分析等中可使用IAF-1部分序列進行核苷酸雜交。
由于基因密碼的固有簡并性，在本發(fā)明中可使用基本上編碼相同或功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列克隆和表達IAF-1蛋白，這些DNA序列包括在嚴格條件下能與IAF-1序列雜交的那些序列。
按照本發(fā)明可使用改變了IAF-1的DNA序列及其表達產(chǎn)物。即IAF-1的突變物和類似物，包括不同核苷酸殘基的缺失、添加或取代，結(jié)果產(chǎn)生相同或功能上等同的編碼的序列?？筛鶕?jù)所涉及的殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和兩親性質(zhì)方面的相似性進行這些氨基酸的取代。例如帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，帶正電荷的賴氨酸、精氨酸。具有相似親水性不帶電極性的基團的氨基酸，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯氨酸、酪氨酸。這些突變物和類似物的編碼序列的產(chǎn)生可采用DNA定點變或PCR誘導突變來實現(xiàn)。這些編碼序列表達出功能上與IAF-1相同或類似，但不必具有與相應受體結(jié)合的相同的親和力的蛋白肽段或融合蛋白。
根據(jù)IAF-1的核苷酸序列可設計出多種末端的肽段編碼序列，這包括但不限于基因片段或產(chǎn)物的修飾和表達的改變，例如可使用位點定向突變引入突變，插入新的限制性酶切位點，改變糖基化模式，磷酸化等修飾IAF-1以提高IAF-1的活性和增加多樣性。
本發(fā)明還涉及在IAF-1或經(jīng)修飾的IAF-1的編碼序列中引入異源序列表達含有市購抗體所識別的異源性抗原決定簇(如His6或GST等)和IAF-1的嵌合融合蛋白，以便用于篩選肽庫，也可設計在IAF-1序列和異源蛋白序列間加入分裂位點的序列，從而能通過切割分裂位點使表達的IAF-1能從異源部分中分離出來。
按照本發(fā)明，可采用現(xiàn)有技術中已公開的化學合成方法全部或部分地合成IAF-1、IAF-1片段、類似物、突變物、修飾物的氨基酸序列，并通過高壓液相色譜純化，用氨基酸序列分析證實合成肽的組成。
(二)IAF-1編碼序列的用途可將IAF-1編碼序列用于IAF-1表達異常的各種疾病的診斷，也可用于IAF-1表達異常疾病的基因治療。它包括IAF-1的核苷酸序列、寡核苷酸序列、反義RNA和DNA分子及有抑制IAF-1轉(zhuǎn)錄功能的核酶。
(1)IAF-1編碼序列在診斷疾病中的用途IAF-1 DNA對診斷IAF-1異常表達的疾病有良好的應用價值。以IAF-1 DNA標記同位素或熒光素等，采用Southern、Northern印跡雜交、原位雜交等技術，檢測包括腫瘤在內(nèi)的各種血管異常性疾病組織中IAF-1 DNA存在，及mRNA表達水平的異常來診斷這些疾病，也可根據(jù)IAF-1編碼序列設計特異的寡核苷酸引物，用于PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，原位PCR反應中，檢測血管異常性疾病組織中IAF-1 DNA或mRNA的表達，診斷這些IAF-1表達異常的疾病。如在實施例中所述的在肝癌病例中80％以上的肝癌都有IAF-1的表達。
(2)應用IAF-1編碼序列分析正常血管形成及異常血管增生中血管形成的機理及調(diào)控血管形成的機理。
采用(1)中所述的方法，分析不同發(fā)育階段小鼠胚胎的IAF-1mRNA的表達，研究生理性血管生成的過程及機理，分析腫瘤及其他各種血管異常性疾病發(fā)生發(fā)展各個不同階段IAF-1的表達，進一步闡明在這些疾病的發(fā)生中，IAF-1的作用以及血管生成的機理，有可能尋找診斷這些疾病的新手段。
(3)IAF-1編碼序列用于血管異常增生疾病的基因治療將編碼IAF-1的核苷酸序列克隆到高效真核表達載體中(如啟動子為SV40、CMV、β-actin等的真核表達載體)，構(gòu)建IAF-1重組表達質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體基因槍，受體介導或抗IAF-1受體抗體介導轉(zhuǎn)到IAF-1異常表達(低表達或不表達，或缺乏IAF-1活性)的各種血管異常增生內(nèi)皮細胞表達IAF-1達到治療的目的。
也可將編碼IAF-1的核苷酸序列克隆到各種病毒表達載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒，牛痘病毒、腺病毒相關病毒、皰疹病毒或牛乳頭瘤病毒的表達載體中，構(gòu)建IAF-1重組病毒表達載體，體外包裝成病毒顆粒，由這些病毒介導將IAF-1編碼序列轉(zhuǎn)導到IAF-1異常表達所致的各種血管生成異常性疾病病人體內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞表達IAF-1，達到治療的目的。
(4)應用IAF-1反義RNA、DNA序列及抑制IAF-1轉(zhuǎn)錄功能的核酶構(gòu)建含這些編碼序列的重組真核表達質(zhì)粒，重組病毒表達載體轉(zhuǎn)導入IAF-1異常高表達所致的血管生成異常性疾病人體內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞，治療血管生成異常性疾病。
(三)IAF-1的編碼序列的表達為了表達有生物活性的IAF-1，將上文中所述的編碼IAF-1、IAF-1的片段、突變物、類似物、修飾物、合成物的核苷酸序列或功能等同物插入合適的表達載體，即含有對所插入編碼序列的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯是必要的成份的載體中，導入轉(zhuǎn)化宿主細胞，表達出有功能活性的IAF-1用于各種目的。
1.表達體系采用已公開的體外DNA重組技術，DNA合成技術及體內(nèi)基因重組技術構(gòu)建含有編碼IAF-1及IAF-1的片段、突變物、類似物、修飾物、合成物的核苷酸序列(下文簡稱IAF-1及類似物)的表達載體，這類技術可見Maniatis et al.1989.Molecular cloningA.Laboratory Manncal cold Spring Harbor laboratory N.Y.andAusubel et al 1989.Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates and Wiley mterscience N.Y.
可使用多種宿主表達載體系統(tǒng)表達IAF-1及類似物的編碼序列，這些系統(tǒng)包括但不限于微生物(1)如重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)化的細菌，(2)含有IAF-1編碼序列的質(zhì)粒DNA表達載體轉(zhuǎn)染的細菌，(3)重組病毒表達載體，例如桿狀病毒感染的昆蟲細胞系統(tǒng)，(4)如腺病毒及腺病毒相關病毒、牛痘病毒重組載體感染的動物細胞，包括在載體中設計加入多次復制的或穩(wěn)定放大的序列和成份的系統(tǒng)(CHO/dhfr)。(5)植物重組病毒表達載體，如花椰菜花葉病毒CaMv，煙草花葉菜病毒TMV或重組質(zhì)粒表達載體Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物細胞體系。
在細菌體系中可選擇一系列表達載體，欲制備大量IAF-1蛋白以產(chǎn)生抗體或篩選肽庫時，應采用能高效表達易于純化的融合蛋白產(chǎn)物的表達載體，這些載體包括但不限于大腸桿菌(E coli.)表達載體PUR278，PIN等等，也可使用表達含有6個組氨酸(His6)或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的異種多肽的融合蛋白的表達載體pET30a(+)和pGE，這些融合蛋白是可溶的，并可通過吸附在抗組氨酸抗體或谷胱甘肽-瓊脂糖珠(柱)，再洗脫而易于從溶解的細菌細胞中純化出IAF-1。同時這些表達載體上還設計有包括但不限于凝血酶或因子Xa蛋白酶分解位點，以便使被克隆表達的IAF-1的多肽(蛋白)與異源肽(His6或GST)分離而進一步純化。
在昆蟲細胞體系中，可選擇但不限于使用AutographaCalifornica核多面體病毒(AcNPV)以及最近公開的一系列BAC-T0-BAC表達載體系統(tǒng)作為表達異種基因的載體，可將IAF-1及類似物編碼序列克隆入病毒的非編碼區(qū)構(gòu)建重組病毒載體，然后用這些重組病毒感染Spodoptera Frugiperda細胞，其中被插入的IAF-1編碼序列被表達。
在哺乳動物宿主細胞中，根據(jù)需要可使用一系列病毒基的表達載體如SV40、BPV、EBV基的表達載體和AdV腺病毒、AAV(腺病毒相關病毒)的表達載體，如使用腺病毒載體，是將IAF-1編碼序列插入病毒基因組非編碼區(qū)，經(jīng)體外包裝形成能感染宿主細胞的重組病毒，這種表達載體有利于用于基因治療。
此外，可以選用對插入序列的表達或修飾及基因產(chǎn)物進行處理的宿主細胞株，蛋白質(zhì)的這類修飾(如糖基化)和處理(如分裂)對蛋白質(zhì)的功能可能是很重要的。不同的宿主細胞對蛋白的翻譯后處理和修飾具有特異性和專一性的機理?？蛇x擇合適的細胞系或宿主體系以保證被表達的蛋白的正確修飾和處理。為此，可使用具有對基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，糖基化和磷酸化進行適當處理的細胞機制的真核宿主細胞。這些哺乳動物細胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、ap3.WI38等等。為了獲得分泌性的表達產(chǎn)物，可在IAF-1目的基因的上游加入真核細胞前導肽序列來實現(xiàn)。還可使用一系列選擇體系進行編碼序列IAF-1的表達，這些體系包括但不限于分別在Tk-、hgprt-、aprt-細胞中使用的單純皰疹病毒、胸苷激酶(Wigleret al 1977.cell 112237.)次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶和腺嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶的基因。利用抗代謝物的抗性作為選擇具有氨甲嘌呤抗性的dhfr(Wigler et al 1980 proc.Natl.Acad.SciUSA.773567)具有霉酚酸抗性的gpt(Mulligan & Berg1981.Proc.Nalt Acad.SciUSA 782072)具有氨基糖苷G-418抗性的neo(COlberre-Garapin etal 1981.J Mol Biol 1501)基因的選擇基因，以及使細胞利用組氨醇(histinol)代替組氨酸的hisD，使細胞利用吲哚代替色氨酸的trpB選擇基因(Hartman & Mulligan1988.Proc.Natl Acad Sci USA.858047)2.表達IAF-1產(chǎn)物的鑒定用以上表達載體表達的IAF-1及IAF-1的類似物至少可通過五種方法進行表達及生物活性的鑒定。(1)首先是血管內(nèi)皮細胞增殖試驗，離體24小時以內(nèi)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞或牛動脈血管內(nèi)皮細胞按揚小平等的方法(中華心血管病雜志，1988，16，5298-300)加以改進培養(yǎng)。加入不同濃度IAF-1表達產(chǎn)物5天后加入3H-TdR，再培養(yǎng)6小時后測培養(yǎng)細胞的放射活性cpm值，血管內(nèi)皮細胞的增殖隨著IAF-1加入濃度的增加而減少，證明IAF-1具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的活性。(2)其次，雞胚絨毛尿囊膜血管形成試驗，參考Tayor和Forkmen(1982)方法(Microvasc Res.1994，47，31-40)，用九天齡的雞胚，在無菌條件下將含有不同濃度的IAF-1的1.5％甲基纖維素經(jīng)卵窗滴加于雞胚絨毛尿囊膜上，48小時后觀察絨毛尿囊膜上血管形成。設促血管形成的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)為對照和PBS對照。雞胚絨毛尿囊膜血管增殖數(shù)目隨IAF-1濃度的增加而減少，證明IAF-1具有抑制血管形成的活性。(3)此外，裸鼠人移植瘤生長動物試驗，接種人的腫瘤細胞(可以是各種腫瘤)于裸鼠皮下，可在接種腫瘤后不同時間(與腫瘤細胞同時接種，接種后5-6天腫瘤開始生長，接種后腫瘤生長＞0.5公分等時間點)，經(jīng)不同途徑(靜脈、腹腔、皮下等)注射IAF-1蛋白，采用持續(xù)或間斷注射不同天數(shù)，觀察接種腫瘤生長情況，小鼠存活情況。設注射PBS對照組，IAF-1的注射可抑制腫瘤的生長，腫瘤組織病例切片證實血管形成受到抑制，血管內(nèi)皮細胞凋亡。(4)IAF-1對腫瘤轉(zhuǎn)移作用的動物實驗，采用能發(fā)生腫瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移的小鼠模型(如IVTA2MA-891乳癌肺轉(zhuǎn)移模型或人結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型)試驗IAF-1對腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，6周齡TA2×615F1小鼠或裸鼠接種IVTA2MA-891乳癌或人結(jié)腸癌細胞系。接種后不同時間經(jīng)不同途徑注射IAF-1蛋白，持續(xù)或間斷治療不同的時間，26-30天后殺死動物，觀察小鼠乳癌的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目或結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及大小，與PBS對照組相比較IAF-1注射組肺轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小判定IAF-1抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。(5)第五種方法是通過Western印跡，免疫測定，如放射免疫，酶聯(lián)免疫測定從免疫學上評價IAF-1蛋白產(chǎn)物的表達及特性。
(四)IAF-1表達產(chǎn)物的用途1.抑制異常血管增生，治療血管異常性疾病基于IAF-1基因表達的產(chǎn)物IAF-1因子具有抑制內(nèi)皮細胞增殖，抑制血管形成的活性。IAF-1通過抑制血管的生成能治療多種血管異常增生性疾病，包括風濕性關節(jié)炎，視網(wǎng)膜炎，牛皮癬，動脈粥樣硬化以及依賴血管形成而生長的惡性腫瘤及惡性腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移，包括肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、膀胱癌、腎癌等等。本發(fā)明的IAF-1可以與化療藥物如順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺等組成藥物組合物，對腫瘤的治療更有效。
2.篩選抑制血管形成的類似物或拮抗物可采用一系列方法篩選合成的，天然的和其他潛在的生物活性材料來源的抑制血管生成的類似物或拮抗劑，如采用放射競爭抑制，酶聯(lián)競爭抑制試驗測定這些類似物或拮抗劑對血管內(nèi)皮細胞增殖，血管生成的作用。篩選出IAF-1的促進物、類似物或拮抗劑。
3.用IAF-1篩選肽庫分離IAF-1受體IAF-1作用于血管內(nèi)皮細胞，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，可能是通過與血管內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合來實現(xiàn)的，用人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的全部cDNA噬菌體肽庫，用表達的含有His或GST及IAF-1的融合蛋白分離篩選肽庫，在IAF-1與肽庫中特定肽結(jié)合形成復合物后，洗去未結(jié)合的肽，再加入市場可購得的標記的抗His6或抗GST的抗體反應，完成IAF-1肽復合體的檢測。一旦分離后可通過測定連接在載體上的肽序而獲得能與IAF-1結(jié)合的血管內(nèi)皮細胞的受體。
4.抗體的產(chǎn)生和篩選現(xiàn)有技術中已知的各種方法都可用于產(chǎn)生抗重組表達的IAF-1的抗體，這些抗體包括，但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈抗體，F(xiàn)ab表達庫產(chǎn)生的肽段及人源化抗體，并且優(yōu)選那些有中和IAF-1活性的體外作為IAF-1的拮抗劑的抗體。這些抗體均能應用到血管異常性疾病的診斷和治療。
為了產(chǎn)生多克隆抗體，可通過注射IAF-1蛋白，對各種宿主動物作免疫接種獲得有結(jié)合活性的免疫動物血清，這些動物包括，但不限于兔、小鼠、大鼠、羊等等，可根據(jù)宿主種類使用各種佐劑以增強免疫應答，這些佐劑包括，但不限于弗氏佐劑(完全和不完全佐劑)、無機凝膠、氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑，匙孔嘁血藍蛋白、二硝基苯酚，以及潛在對人體有用的佐劑，如卡介苗(BCG)。
抗IAF-1單克隆抗體可通過從傳代細胞的培養(yǎng)物中提取抗IAF-1單克隆抗體分子，其中包括制備提取這些抗體分子的任何技術，但不限于Kohler and Milstein最早公開的雜交瘤技術(Hybridoma)(Nature 1975.256495-497)，人體細胞雜交瘤技術(Kosber et al，1983 Immumlogy Today，472；Cote et al，1983 Proc Nalt，Acad.Sci 802026-2023)和EBV雜交瘤技術(Cloe et al，1985.MonoclonalAntibolier and cancer Therapy，Alan R.Inc pp 77-96)。
本發(fā)明還包括通過使用來自小鼠抗IAF-1抗體的可變區(qū)與編碼有生物活性的人源性抗體分子的基因(恒定區(qū))連結(jié)后構(gòu)建人鼠“嵌合抗體”真核和原核表達載體(Morrison et al，1984，Proc.Nalt.Acad，Sci，816851-6855；Neuberger et al.Nature 1985312604-608)并在真核細胞如sp2/0、CHO、YB10、COS等細胞中表達，也可在原核細胞(Ecoli)中表達IAF-1嵌合抗體。
為產(chǎn)生IAF-1單鏈抗體，可采用單鏈抗體制造技術(AmericanPatent 4 946 778)；即用分子生物學手段，將小鼠抗IAF-1的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)連接在一起，以表達一種只編碼抗體輕重鏈的單鏈抗體。也可應用多聚酶鏈反應(PCR)技術，通過合成適當引物將單克隆抗體的輕重鏈可變區(qū)基因擴增出來，插入表達載體中，測序驗證之后，在大腸桿菌中表達。通過已知技術可產(chǎn)生含有特定IAF-1結(jié)合位點的抗體片段，這些片段包括，但不限于通過胃蛋白酶消化單克隆而產(chǎn)生F(ab)2片段和通過減少F(ab’)2的二硫鍵而產(chǎn)生Fab片段。也可構(gòu)建Fab表達庫以快速方便地鑒別有結(jié)合IAF-1特異性的Fab片段。還可采用PCR技術從單克隆抗體分子擴增分離Fab，用DNA重組技術將這些Fab片段克隆到原核表達載體以表達有功能活性的重組單鏈抗體。
盡管嵌合抗體的恒定區(qū)是人源的，但仍有約35％的序列源于鼠抗體，為了進一步減少抗體的異源性反應，可將鼠單抗可變區(qū)的超變區(qū)(CDR)移植到人抗體的骨架區(qū)(FR)，再與人的恒定區(qū)連接構(gòu)建全人源化抗體。也可應用表位印模選擇(Epitope ImprintedSelection EIS)或稱抗原表位定向選擇技術(EGS)篩選人源化抗體基因(Jespers L.et al.1994.BioTechnology 12899-903)。該技術采用鼠單抗重鏈可變區(qū)基因與人輕鏈可變區(qū)基因(VL)配對，構(gòu)建雜合抗體的噬菌體抗體庫，以固相抗原進行篩選，得到可與鼠VH組合并識別特異抗原的人VL基因，再用篩到的人抗體VL去配人VH基因庫，再次構(gòu)建噬菌體抗體庫，經(jīng)篩選獲得完全人源性的抗體基因，再克隆到真核或原核表達載體中表達人源化抗IAF-1抗體。
(五)IAF-1的拮抗劑1.人工化學合成IAF-1拮抗劑。IAF-1能夠抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，抑制血管的形成，IAF-1的拮抗劑則可以促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，促進血管生成。根據(jù)對IAF-1蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的研究，以及IAF-1結(jié)構(gòu)域與功能活性關系的研究資料，采用計算機模擬技術設計出多種IAF-1的拮抗劑，用化學合成的技術合成出一系列IAF-1的拮抗劑藥物，用于血管生成異常的疾病治療。
2.采用現(xiàn)有已知的各種技術，制備具有中和IAF-1因子生物活性的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體及人源化抗體(方法如(四)4.所述)，這些抗體能中和IAF-1抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，血管形成的活性。
3.采用(四)4.所述的技術制備抗IAF-1受體的抗體，它們包括多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體和人源化抗體，這些抗體與IAF-1受體結(jié)合抑制IAF-1與受體的結(jié)合，解除IAF-1對血管內(nèi)皮細胞的抑制作用及對血管形成的抑制作用，可用于診斷治療血管異常性疾病。
(六)IAF-1受體的分離及重組表達
1.用免疫組化法鑒定IAF-1受體的存在部位將培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞、腫瘤組織分別制備成涂片和切片，在4℃與帶有His標記的重組IAF-1孵育，若有受體存在，則IAF-1結(jié)合到受體上，再用抗His抗體或自制抗IAF-1多抗結(jié)合，經(jīng)HRP標記的二抗顯色，則可鑒定出IAF-1受體的存在部位和細胞。
2.IAF-1受體的分離●同位素方法該法為受體分離最常用的方法，將IAF-1用放射性同位素I125標記，與存在受體的細胞孵育(如內(nèi)皮細胞)，將細胞裂解，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮蘭染色，凝膠干燥，與X光片接觸，曝光，顯影，即可分離出與IAF-1結(jié)合的受體，并可知受體的分子量。
●Eastern印跡法與同位素法相似，將具有IAF-1受體的細胞裂解，經(jīng)雙向SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白，經(jīng)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。先與重組IAF-1孵育，再用抗his6抗體或自備抗IAF-1多抗孵育，加標記二抗顯色，即可分離到與IAF-1結(jié)合的受體，并可知受體的分子量。
3.IAF-1受體的克隆及重組表達將分離到的受體蛋白變性，用Edman降解法聯(lián)合質(zhì)譜分析法，測定C末端和N末端序列。據(jù)C末端和N末端氨基酸序列，推導出相應的核苷酸序列。據(jù)此合成兩端的引物從cDNA文庫中或采用RT-PCR擴增出IAF-1受體的全長cDNA，將獲得的cDNA克隆到pET30a(+)中誘導表達，方法同IAF-1的重組表達。
4.用重組的IAF-1受體，采用(四)4.中所述的各種方法制備抗IAF-1的多克隆抗體，單克隆抗體，嵌和抗體，小分子抗體(如scFv)及人源化抗體，用于各種血管異常性疾病的診斷，治療及發(fā)生機理的研究。
附圖描述

圖1為人胎兒肝臟總RNA的電泳照片，其中泳道1為λDNA/Hind III分子量標記，泳道2和3為胎肝總RNA。
圖2是根據(jù)實施例1所述經(jīng)RT-PCR擴增的胎肝中IAF-1片段的電泳照片，其中泳道1為λDNA/Hind III分子量標記，泳道2是擴增出的580bp IAF-1。
圖3示出了含IAF-1的重組pUC18克隆載體。
圖4示出了含IAF-1的重組pUC18克隆載體的鑒定。其中泳道1為λDNA/Hind III分子量標記，泳道2為pUC18質(zhì)粒DNA，泳道3為非重組質(zhì)?？寺。镜?、5、6和7為重組質(zhì)粒克隆。
圖5示出了IAF-1的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。
圖6示出了含IAF-1的重組原核表達載體pET30a(+)。
圖7示出了含IAF-1的重組原核表達載體pET30a(+)的鑒定。其中泳道1、2和3為重組克隆，泳道4為λDNA/Hind III分子量標記。
圖8為根據(jù)實施例1所述進行的IAF-1原核表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳照片。其中泳道1為Promega公司的蛋白分子量標記，泳道2為含IAF-1的重組克隆誘導表達產(chǎn)物，泳道3為含空載體的細菌的誘導表達產(chǎn)物，泳道4為BL21DE3細菌的空菌誘導表達產(chǎn)物。
圖9為圖8所示的IAF-1原核表達產(chǎn)物的Western印跡分析圖。其中各泳道的物質(zhì)如圖8的描述。
圖10為根據(jù)實施例1所述進行的INF-1對人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞的抑制作用的示意圖。
圖11為根據(jù)實施例3所述進行的IAF-1對乳癌原發(fā)瘤生長的影響實驗的結(jié)果的示意圖。
圖12為圖11所示實驗的瘤重照片。
圖13為根據(jù)實施例3所述進行的IAF-1對乳癌肺轉(zhuǎn)移灶的影響實驗的結(jié)果的示意圖。
實施例1血管形成抑制因子IAF-1編碼序列的克隆、高效表達及活性研究許多證據(jù)表明實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤內(nèi)的血管形成，因此抑制血管的生長可有效地抑制腫瘤地生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤血管的生長由一系列的正負調(diào)節(jié)因子的平衡決定，本研究從胎兒的肝臟組織中克隆到一種有效抑制血管生成的因子，經(jīng)Genebank和蛋白序列比較為無抑制血管生成活性的膠原XVIII C-末段非膠原區(qū)的一部分，該因子能有效地抑制血管內(nèi)皮細胞的生長、血管生成，稱為血管抑制因子IAF-1。
1.實驗材料(1)正常胎兒肝臟組織來源于5個月流產(chǎn)胎兒，購自北京垂楊柳醫(yī)院婦產(chǎn)科(2)RNA提取試劑盒TRIzol試劑，Gibco BRL公司(3)MMLV(逆轉(zhuǎn)錄酶)，Gibco BRL公司(4)Taq+pfu DNA多聚酶，Sangon公司(5)DNA快速純化試劑盒，ClonTech公司(6)限制性內(nèi)切酶Hind III、BamH I，Biolab公司(7)T4DNA連接酶，Promega公司(8)pUC18克隆質(zhì)粒本室保藏；pET30a(+)，原核細胞表達型質(zhì)粒，Novagen公司(9)質(zhì)粒DNA提取試劑盒Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司(10)ABI全自動DNA測序儀，PE公司2.實驗方法(1).用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)從胎兒肝臟中擴增出TAF-1
①.胎兒肝臟組織總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄為cDNA?？俁NA的提取按TRIzol Reagent試劑盒的說明書進行。取10ug總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應如下總反應體積25ul，含5×緩沖液5ul；0.1mol/L DTT 2.5ul；2.5mmol/L 4dNTP 5ul；Oligod(T)15 1.5ul；RNA 5ul(10ug)；去離子水5ul?；旌仙鲜龇磻铮?0℃水浴10分鐘，冰浴2分鐘，加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 200單位，37℃保溫60分鐘。沸水煮5分鐘終止反應。
②.PCR擴增IAF-1PCR的引物序列設計合成如下有義引物5’ATACTACCATGGGATCCCACAGCCACCG CGACTTCCA3’反義引物5’ATCTGGAAGCTTCTACTACTTGGAGG CAGTCATGAAGC3’PCR的反應條件為總體積50ul，含10×Taq Plus I緩沖液5ul；2.5mM 4dNTP 4ul；IAF-1有義引物25pmol(1ul)；反義引物25pmol(1ul)；①.中反轉(zhuǎn)錄的cDNA 3ul；無離子水35ul?；靹蚝螅?5℃先孵育8分鐘，加入Taq+pfu多聚酶2.5單位，混勻，加50ul礦物油開始PCR循環(huán)。95℃變性1分鐘，60℃變性1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定定量。
(2).IAF-1的克隆及序列測定PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA快速純化試劑盒，回收純化580bp左右大小的目的帶。純化方法按試劑盒的說明書進行。
將目的片段和pUC18載體分別用Hind III和BamH I酶切，酶切后電泳分離，用DNA快速純化試劑盒分別回收目的基因片段和載體片段。用T4DNA連接酶，將目的基因和pUC18載體進行定向連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α。重組克隆用Hind III和BamH I雙酶切鑒定陽性克隆。含有目的基因的三個陽性克隆，用DNA純化柱(QIAGEN公司的Miniprep)提取大量高純度的DNA，用雙脫氧末端終止法在ABI的自動測序儀上進行測序分析。
(3)IAF-1原核表達載體的構(gòu)建及表達將已經(jīng)測序鑒定的IAF-1的序列克隆到表達載體pET30a(+)上，并在宿主菌BL21中高效表達。用Hind III和BamH I酶切含有經(jīng)測序鑒定的IAF-1的重組的pUC18質(zhì)粒DNA，電泳回收580bp大小IAF-1片段帶。同時用BamH I和Hind III酶切載體pET30a(+)后，用T4DNA連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。重組克隆用BamHI和Hind III進行酶切篩選鑒定。
經(jīng)鑒定正確的陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA再轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21，經(jīng)擴大培養(yǎng)后，用IPTG進行誘導表達，誘導表達的培養(yǎng)物經(jīng)超聲破菌。10000rpm離心15分鐘，沉淀包涵體。用SDS-PAGE電泳和Westernblot鑒定表達產(chǎn)物。沉淀下的細菌包涵體，用包涵體洗滌緩沖液(2mMEDTA，10mMTris·Cl，1％Triton，50mM NaCl)洗滌三次。經(jīng)洗滌的包涵體溶于PBS中，分光光度計定量，調(diào)整為5mg/ml的溶液，用于動物抑瘤實驗。另取經(jīng)洗滌的包涵體20mg，用Ni親和柱(Gibco公司)純化，純化方法見試劑說明書，經(jīng)純化的包涵體，用于免疫動物制備多克隆抗體。
(4).IAF-1生物活性測定①.IAF-1對人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞的作用人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)，按楊小平法進行，將離體24小時內(nèi)的人臍帶靜脈血管無菌沖洗凈，胰酶消化靜脈血管內(nèi)皮細胞(HuVEC)，收集HuVEC，PBS洗滌后，用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液稀釋為2×104個細胞/ml接種于已用0.01％多聚賴氨酸處理過的96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200ul，每孔細胞為4×103個細胞，培養(yǎng)24-48小時，加入濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ug/ml經(jīng)誘導表達、變性、復性、變性處理的IAF-1可溶性蛋白，每一濃度設3個平行孔，設內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)6天后，加入3H-Tdr(北京原子能研究所)1uci/孔，6小時后用多頭吸樣器收集樣品，在Backman IL-3801型β液閃儀，測cpm值，每一濃度均3孔的均值。
②.IAF-1對血管生成的作用，采用雞胚絨毛尿囊膜血管形成實驗分析檢測，將九天齡雞胚在無菌條件下的卵殼空氣腔初開一0.5×1cm2的卵窗，用無菌注射器針頭刺破殼膜滴加生理鹽水使雞胚絨毛尿囊膜與殼膜分離下沉。用1.5％的甲基纖維素10ul與10ul不同濃度的可溶性表達IAF-1因子(0.01、0.05、0.1、0.5、1、10ug/ml等濃度)混合后滴加于雞胚絨毛尿囊膜上，同時設生理鹽水陰性對照和促血管形成的VEGF對照。72小時后觀察雞胚絨毛尿囊膜上血管形成情況。
3.實驗結(jié)果(1)RT-PCR技術從胎兒肝臟中擴增出IAF-1取2mg人胎兒肝組織提取總RNA經(jīng)0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢定，可見清晰的28s和18s RNA 2條帶，且28s RNA約為18sRNA的2倍，表明RNA的純度、質(zhì)量較好，見圖1。經(jīng)紫外分光光度計定量2mg人胎兒肝組織中總RNA為260ug，用去離子水調(diào)整為2ug/ul備用。取5ul總RNA(10ug)在25ul的反應體積中進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA。取3ul cDNA做為模板，在50ul的反應體系中，加入合成的引物各25pmol進行PCR反應。取5ul PCR反應產(chǎn)物，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖2，從胎兒肝臟cDNA中擴增出大約580bp的一條帶。
(2)IAF-1的克隆及核苷酸序列測定從瓊脂糖凝膠電泳中用DNA快速純化試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物中580bp大小的帶，用Hind III和BamH I進行酶切，與經(jīng)Hind III和BamH I酶切回收的pUC18載體連接構(gòu)建重組克隆載體(圖3)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，獲得40個轉(zhuǎn)化克隆。挑取7個克隆，用快提法提取DNA，用Hind III和BamH I酶切鑒定含有IAF-1外源基因片段的重組克隆(圖4)，共獲得6個陽性重組克隆。選擇其中3個克隆用QIAGEN minipre試劑盒提取質(zhì)粒DNA。用雙脫氧鏈終止法在ABI自動測序儀上進行序列測定。測得3個克隆序列相同，其核苷酸序列及相應的氨基酸序列見圖5。(3)IAF-1重組表達載體的構(gòu)建及表達用BamH I和Hind III酶切已測序的IAF-1重組pUC18載體，用DNA快速純化試劑盒回收IAF-1片段，與經(jīng)BamH I和Hind III酶切的pET 30a(+)載體連接，將IAF-1定向克隆到pET30a(+)的BamH I下游(圖6)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，共獲30個轉(zhuǎn)化克隆，挑取3個轉(zhuǎn)化克隆，快速法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamH I和HindIII酶切鑒定重組克隆，三個克隆均為含有外源基因IAF-1的重組克隆(圖7)。取其中的一個重組克隆，快提環(huán)化質(zhì)粒DNA，取10ng轉(zhuǎn)化BL21DE3菌株，共獲60個轉(zhuǎn)化克隆。挑取其中的一個克隆，接種于2ml含30ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6，離心沉淀細菌，再接種到50ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.6-1之間，加入IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)振蕩3小時。同時挑取1個不含載體的BL21空菌菌落和1個轉(zhuǎn)化有pET30a(+)空載的BL21菌落，按上述同樣的方法進行培養(yǎng)，誘導。培養(yǎng)結(jié)束，各取20ul菌體直接進行15％SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明重組克隆高表達IAF-1融合蛋白，分子量約26KD，表達量約占整個菌體的20-30％。將50ml培養(yǎng)物離心沉淀，用超聲緩沖液重懸細菌，超聲3分鐘裂解細菌細胞，10000rpm離心沉淀包涵體，包涵體用4ml PBS重懸，取4ul進行SDS-PAGE電泳分析，包涵體可達總蛋白量的80％(圖8)。將SDS-PAGE分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用抗(His)6抗體做Western印跡分析。結(jié)果表明重組克隆表達IAF-1，分子量為26KD，出現(xiàn)少量二聚體約54KD(見圖9)。SDS-PAGE電泳分析和Western印跡分析均表明BL21空菌和含pET30a(+)空載的BL21菌沒有26KD的重組蛋白表達。經(jīng)分光光度計測定，重組克隆表達的包涵體蛋白總量約為110ug/ml，其中IAF-1的蛋白占包涵體總蛋白的80％，故IAF-1的表達產(chǎn)量為88ug/ml菌液。
(4)IAF-1對人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞HuVEC的抑制作用用3H-TdR摻入法測定IAF-1對HuVEC細胞生長增殖的作用結(jié)果如圖10。內(nèi)皮細胞培養(yǎng)對照的HuVEC的cpm值，隨著IAF-1濃度的增加，cpm值逐漸下降，當IAF-1為1ug/ml時抑制HuVEC的生長約65％，當5ug/ml時抑制78％，表明IAF-1具有抑制人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞增殖的作用。
雞胚絨毛尿囊膜血管形成實驗也表明原核表達的IAF-1在5ug/ml濃度時抑制絨毛尿囊膜血管的形成。
實施例2IAF-1在昆蟲細胞中的表達及純化將克隆在pUC18上的IAF-1片段用BamH I和Hind III雙酶切下，回收純化。同時將桿狀病毒載體pFast BacHTb用BamH I和Hind III酶切，用T4 DNA連接酶將IAF-1片段定向連接在表達載體pFastBacHTb的BamHI位點下游。轉(zhuǎn)化DH5α鑒定出重組克隆。提取重組DNA轉(zhuǎn)化到DH10BAC細胞中，以通過轉(zhuǎn)座產(chǎn)生大質(zhì)粒(bacmid)，分離白色的重組克隆(bacmid)DNA，用Lipofectin轉(zhuǎn)染昆蟲細胞sf9，收獲重組病毒，用噬斑法測定病毒滴度。收獲轉(zhuǎn)染細胞，用裂解緩沖液裂解細胞，離心去除細胞碎片，收集上清。用SDS-PAGE電泳和Western印跡鑒定IAF-1的表達情況。用Ni親和柱純化上清中的IAF-1，用于內(nèi)皮細胞抑制實驗和體內(nèi)抑瘤實驗。
實施例3
IAF-1體內(nèi)抑制腫瘤生長實驗采用小鼠乳癌自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型IVTA2 MA-891試驗IAF-1對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，將IVTA2 MA-891腫瘤研磨制成單個腫瘤細胞接種12只TA2×615小鼠后腿皮下，1×106細胞/只，2天后隨機分為2組，每組6只，一組皮下注射誘導表達經(jīng)洗滌后的IAF-1包涵體800ug/只，隔天注射一次，持續(xù)30天，另一組皮下注射與IAF-1同量的空載體，隔天一次，持續(xù)30天，當空載體對照組長出原發(fā)瘤后，每3天用游標卡尺測量并記錄腫瘤的大小，稱體重，停止注射IAF-1或空載體后2天殺死動物，稱取小鼠體重、原發(fā)瘤重、肺重，計數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目并觀察其大小。
實驗結(jié)果如圖11所示，當腫瘤原發(fā)瘤長出以后，每隔3天測量腫瘤大小，結(jié)果IAF-1治療組件腫瘤生長的平均直徑明顯地小于對照組，腫瘤增大緩慢，兩組p值小于0.01，有明顯的統(tǒng)計學差異。治療30天后殺死小鼠，稱取原發(fā)瘤瘤重，結(jié)果，如表1和圖12，IAF-1治療組原發(fā)瘤瘤重平均為1.58克，對照組平均瘤重為2.96克，IAF-1對原發(fā)瘤生長的抑制率達46.6％(P值＜0.01)IAF-1對小鼠乳癌肺轉(zhuǎn)移灶的影響如表2和圖13所示。IAF-1治療組肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目平均為15個。而對照組肺轉(zhuǎn)移灶平均為41個(P值＜0.01)。IAF-1對肺轉(zhuǎn)移灶的抑制率達63.4％。以上結(jié)果表明，IAF-1對腫瘤原發(fā)瘤的生長和腫瘤轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。
表1. IAF-1因子對乳癌原發(fā)瘤瘤重的抑制作用動物編號 1 2 3 4 5 6 XSD 抑瘤率 P值IAF-1治療組(g) 1.1 1.3 1.7 1.5 2.0 1.9 1.58 0.35 46.6％ p＜0.01空載體對照組(g)3.2 1.8 2.5 2.5 3.8 4.0 2.96 0.85
表2.IAF-1因子對乳癌肺轉(zhuǎn)移生長數(shù)量的抑制作用動物編號 1 2 3 4 5 6 X SD 抑瘤率 P值IAF-1治療組(g) 8 13 8 11 19 29 15 8 63.4％ p＜0.01空載體對照組(g) 91 18 20 39 37 79 41 29實施例4血管形成抑制因子IAF-1在哺乳動物細胞CHO細胞中的高效表達在哺乳動物細胞表達重組蛋白，其表達產(chǎn)物保持了天然構(gòu)象，并有翻譯后加工，具有良好的生物學活性，因而優(yōu)于在原核細胞以及昆蟲細胞中表達重組蛋白。哺乳動物細胞CHO細胞因其具有擴增性，已成為最重要的一種用于表達重組蛋白的哺乳動物細胞。本例是將IAF-1克隆到pSV2-neo真核表達載體中在CHO細胞中表達。
1、實驗材料(1)細胞系、質(zhì)粒與抗體CHO-dhfr-細胞、含IAF-1 cDNA的pUC18質(zhì)粒，本室構(gòu)建。真核表達載體pSV2-neo，本室構(gòu)建。
(2)Taq+pfu DNA多聚酶，Sangon公司(3)DNA快速純化試劑盒，Clontech公司(4)各種限制性內(nèi)切酶，Biolab公司(5)T4NA連接酶，Promega公司(6)質(zhì)粒DNA提取試劑盒Plasmid Midi Kit QIAGEN公司(7)細胞培養(yǎng)試劑，Gibco BRL公司2、實驗方法(1)IAF-1真核表達載體的構(gòu)建；
以含有經(jīng)測序鑒定的IAF-1的重組的pUC18質(zhì)粒DNA作模板，采用重疊PCR技術在580bp大小IAF-1片段前加上分泌所必需的引導肽序列以及合適的酶切克隆位點。酶切真核表達載體pSV2-neo以及重疊PCR產(chǎn)物，回收相應的片段，用T4 DNA連接酶進行連接，接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。重組克隆用酶切篩選鑒定。
(2)IAF-1在哺乳動物細胞OHO中的表達接種1×106CHO-dhfr-細胞于25cm2培養(yǎng)瓶中，使用DMEM完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、0.03mmol/l次黃嘌呤(H)、0.03mmol/l胸腺嘧啶脫氧核苷(T)、0.1mmol/l脯氨酸、0.1mmol/l甘氨酸(Gly)、100u/ml青鏈霉素、2mmol/l谷氨酰胺)，5％CO、37℃培養(yǎng)36小時。采用LipofectAMINE試劑轉(zhuǎn)染，按其使用說明書進行。轉(zhuǎn)染后的細胞采用不含H、T、Gly的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)進行篩選。
轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)上清用Western印跡分析鑒定IAF-1的表達情況。
3、實驗結(jié)果(1)IAF-1真核表達載體的構(gòu)建連接入表達載體后，從12個克隆中篩選到6個重組克隆。經(jīng)酶切后可切出相應的IAF-1片段，證明其確為完整的IAF-1表達載體。
(2)IAF-1在哺乳動物細胞CHO中的表達取4μgIAF-1的表達載體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞，加選擇培養(yǎng)液篩選后，10天后可見克隆生長，共獲得311個克隆。收集培養(yǎng)上清，Western印跡分析證實上清中有IAF-1的表達。
權(quán)利要求
1.一種抑制血管形成因子，其具有如下氨基酸序列NH-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-G1y-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Leu-leu-Phe-Pro-Ser-Trp-Glu-Ala-Leu-Phe-Ser-Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Leu-Lys-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Lys-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Thr-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Asn-Gly-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Ser-Tyr-Cys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Gly-Gly-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-Val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ala-Ser-Lys-COOH。
2.一種編碼權(quán)利要求1的抑制血管形成因子的多核苷酸。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其為基因組DNA。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸，其為cDNA。
5.一種包括權(quán)利要求2的多核苷酸的重組載體。
6.權(quán)利要求5的重組載體，其還含有調(diào)控宿主中基因表達的調(diào)節(jié)序列。
7.權(quán)利要求5的重組載體，其為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體。
8.權(quán)利要求5的重組載體，其為重組腺病毒載體。
9.權(quán)利要求5的重組載體，其為重組腺病毒相關病毒載體。
10.一種用權(quán)利要求5-9任一項所述的重組載體基因工程化的宿主細胞。
11.如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其為原核細胞。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細胞，其為大腸桿菌細胞。
13.如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其為昆蟲細胞。
14.如權(quán)利要求13所述的宿主細胞，其為昆蟲細胞sf9。
15.如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其為哺乳動物細胞。
16.如權(quán)利要求15所述的宿主細胞，其為CHO細胞。
17.一種抗權(quán)利要求1所述的抑制血管形成因子的抗體。
18.如權(quán)利要求11所述的抗體，其為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體。
19.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的抑制血管形成因子的方法，包括在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的宿主細胞，使細胞產(chǎn)生抑制血管形成因子蛋白，從細胞培養(yǎng)物中回收所述的蛋白，最后純化蛋白。
20.權(quán)利要求1的抑制血管形成因子在制備治療和診斷血管異常增生性疾病和各種腫瘤和腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移的藥物中的應用。
21.權(quán)利要求1的抑制血管形成因子的受體。
22.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1的抑制血管形成因子及化療藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人血管抑制因子,稱為IAF－1,其克隆重組表達和一組該因子的衍生物以及它們的制備方法,本發(fā)明還涉及所述的IAF－1在制備治療各種腫瘤和各種血管異常性疾病的有效的新的生物制劑中的應用,也涉及IAF－1結(jié)合的受體及受體的分離克隆,同時,本發(fā)明還涉及IAF－1的抗體,包括多克隆抗體,單克隆抗體,嵌合抗體,單鏈抗體及人源化抗體。
文檔編號C12N5/10GK1244536SQ98117150
公開日2000年2月16日 申請日期1998年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月10日
發(fā)明者楊治華, 郭文忠 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所