專利名稱：蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法
最近幾年人們研究了將甲基營養(yǎng)酵母作為異源蛋白質(zhì)的合適的表達系統(tǒng)。尤其是多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)已被描述成大量外源基因的容易操縱的宿主有機體(可參見綜述Gelissen & Melber 1996以及Gregg & Madden 1988)。由于發(fā)現(xiàn)甲醇代謝中涉及的酶的啟動子很強，所以它們通常被用于控制蛋白質(zhì)的異源表達(見EP 0173378,EP 0299 108,EP 0183 071)。
已知用于培養(yǎng)這些有機體的碳源對啟動子調(diào)節(jié)有巨大影響。Gelissen等(1994)描述了在靠甲醇生長期間，多形漢遜酵母中大量存在甲醇代謝的關(guān)鍵酶。還發(fā)現(xiàn)在甘油生長細胞中可檢測到大量甲醇氧化酶(MOX)和甲酸脫氫酶(FMDH)這些酶，但如果將葡萄糖用作碳源就不存在這些酶(例如見EP 0 299 108)?；谶@些信息，可總結(jié)出這些酶是由甲醇誘導(dǎo)的。在靠甘油生長期間，MOX和FMDH的表達可用啟動子的脫阻抑解釋。在多形漢遜酵母和克勒克酵母菌(Kloeckerasp.)2201的葡萄糖限制的恒化培養(yǎng)物中，F(xiàn)MDH只是在小于0.1h-1的生長速率下被很少量地產(chǎn)生(Egli等1980)。因此，迄今一直將非阻抑碳源用于由甲基營養(yǎng)酵母異源表達蛋白質(zhì)。培養(yǎng)多形漢遜酵母用于按補料分批法生產(chǎn)多種藥物蛋白質(zhì)，該補料分批法或以應(yīng)用甘油的單一碳源方式或以應(yīng)用甘油另加甲醇的兩種碳源方式(Gelissen & Melber1996)。Weydemann等(1995)更詳細地描述了生產(chǎn)水蛭素的一般方法。Chen等(1996)描述了也應(yīng)用甘油作為非阻抑碳源由巴斯德畢赤酵母菌株生產(chǎn)凝血調(diào)節(jié)蛋白的方法。
但是，由于甘油昂貴，所以該方法至今都不適于生產(chǎn)例如飼料酶或工業(yè)酶的低成本蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的一個目的是克服這些障礙并提供一種通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的真核細胞而制備內(nèi)源蛋白質(zhì)或異源蛋白質(zhì)的方法，該方法的特征在于將阻抑基質(zhì)用作碳源，在加料階段限制碳源而在整個培養(yǎng)期間沒有連續(xù)的氧限制；或者這種方法，其中該蛋白質(zhì)是酶，特別是飼料酶，例如肌醇六磷酸酶、纖維素酶、木聚糖酶，或者是工業(yè)酶，例如淀粉酶、蛋白酶、轉(zhuǎn)化酶、脂肪酶、過氧化氫酶、纖維素酶、葡糖氧化酶、醇氧化酶、果膠酶、柚苷酶(naraginase)、膠原酶、過氧化物酶或支鏈淀粉酶；或者這種方法，其中該細胞是甲基營養(yǎng)細胞和/或用DNA序列轉(zhuǎn)化了，該DNA序列包括甲醇代謝中涉及的酶的啟動子，如甲酸脫氫酶(FMD或FMDH)啟動子、甲醇氧化酶(MOX)啟動子或二羥丙酮合酶(DAS或DHAS)啟動子；或者這種方法，其中該細胞是甲基營養(yǎng)酵母，優(yōu)選是漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)或球擬酵母屬(Torulopsis)，例如多形漢遜酵母或巴斯德畢赤酵母；或者這種方法，其中阻抑基質(zhì)占碳源的1-100％，優(yōu)選40-100％或更優(yōu)選90-100％或是唯一的碳源；或者這種方法，其中該基質(zhì)是糖如單糖、二糖、寡糖或多糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、糖原、纖維素或右旋糖或者含糖的混合物，如糖蜜、葡萄糖漿或果糖糖漿；或者這種方法，它以多次補料分批的方式進行。此外，本文中這種方法的特征在于加料速率范圍受限于微生物的代謝特性和生物反應(yīng)器中特別是氧的傳質(zhì)性能。加料速率優(yōu)選保持在允許生產(chǎn)的最小值和避免培養(yǎng)物中氧限制的最大值之間。
至于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法，已經(jīng)用DNA序列或包括編碼這種異源蛋白質(zhì)(例如在本案中的肌醇六磷酸酶)的DNA序列的載體轉(zhuǎn)化真核細胞。分子生物學領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟悉制備這類轉(zhuǎn)化的真核細胞的方法，例如參見本案例EP684313或歐洲專利申請No.97810175.6的具體實施例。
本發(fā)明上下文中的“培養(yǎng)”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的普通含義。具體培養(yǎng)條件將取決于應(yīng)用的細胞和待生產(chǎn)的蛋白質(zhì)及其表達系統(tǒng)。發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)領(lǐng)域中的技術(shù)人員也熟悉這類條件。此外，應(yīng)懂得就本發(fā)明的實施來說，在短的分批階段即細胞的生長階段中，可應(yīng)用阻抑的或非阻抑的碳源，分別如葡萄糖或甘油。在補料分批階段即所需蛋白質(zhì)的生產(chǎn)階段中，培養(yǎng)過程是按本發(fā)明提供的方式進行的。
此外，實施本發(fā)明的令人感興趣的甲基營養(yǎng)酵母例如可得自EP173378，第37和38頁。


圖1表示加料階段中應(yīng)用甘油或葡萄糖作唯一碳源培養(yǎng)多形漢遜酵母的時間過程比較；圖2表示多次補料分批培養(yǎng)循環(huán)，加料溶液中葡萄糖比例遞增；其中CDM表示細胞干質(zhì)量。
實施例實施例1應(yīng)用甘油或葡萄糖作為主碳源由多形漢遜酵母生產(chǎn)煙曲霉(A.fumigatus)肌醇六磷酸酶為了比較應(yīng)用甘油或葡萄糖作加料基質(zhì)的肌醇六磷酸酶的生產(chǎn)，在15l反應(yīng)器中用多形漢遜酵母菌株進行兩個補料分批實驗，該多形漢遜酵母菌株含有得自煙曲霉的在FMD啟動子控制下的野生型肌醇六磷酸酶基因(Pasamontes等，1997)的大約80個拷貝。
搖瓶培養(yǎng)始于將保持在-70℃下的1ml甘油儲備細胞懸浮液接種入50ml下列組成的培養(yǎng)基30.0g/l甘油；2.5g/l KH2PO4；5g/lNH4H2PO4；2.25g/l MgSO4·7H2O；2.5g/l (NH4)2SO4；1.15g/l KCl；0.25g/l NaCl；0.375g/l CaCl2·2H2O；0.25mg/l H3BO3；0.05g/l(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；4mg/l CuSO4·5H2O；15mg/l ZnSO4·7H2O；20mg/l MnSO4·H2O；0.05g/l Na-EDTA；0.5mg/l NiSO4·6H2O；0.5mg/l CoCl2·6H2O；0.5 mg/l Na2MoO4·2H2O；0.5mg/l KI；0.05g/l鹽酸硫胺素；0.15mg/l生物素。將它們在30℃和200rpm下培養(yǎng)24h，將30ml轉(zhuǎn)至具有300ml相同培養(yǎng)基的第二個搖瓶階段，又在30℃和200rpm下培養(yǎng)24h。
將300ml該種子培養(yǎng)物用作含5l包括下列物質(zhì)的初始培養(yǎng)基的15l發(fā)酵罐的接種物10.0g/l甘油；5.0g/l KH2PO4；10g/l NH4H2PO4；4.5g/l MgSO4·7H2O；5.0g/l (NH4)2SO4；2.3g/l KCl；0.5g/lNaCl；0.2ml/l消泡劑；0.75g/l CaCl2·2H2O；0.5mg/l H3BO3；0.1g/l(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；8mg/l CuSO4·5H2O；30mg/lZnSO4·7H2O；40mg/l MnSO4·H2O；0.1g/l Na-EDTA；1.0mg/lNiSO4·6H2O；1.0mg/l CoCl2·6H2O；1.0mg/l Na2MoO4·2H2O；1.0mg/l KI；0.1g/l鹽酸硫胺素；0.3mg/l生物素。在整個過程中，溫度、pH和通氣分別保持恒定在30℃、pH4.6和5l/h。pH是通過加入25％NH3而控制的。通過控制攪拌器速率和壓力(0～0.5巴)將氧飽和度維持在反應(yīng)器中20％飽和度這一最小值。培養(yǎng)基中初始甘油的全部消耗導(dǎo)致pO2值的迅速增大，指示分批階段的結(jié)束。此時，開始加料700g/l甘油或葡萄糖的溶液。首批18h加料中初始加料速率為每小時25g溶液，然后將速率增高到50g/h。由于加料約6升碳源溶液而使培養(yǎng)物體積增大到培養(yǎng)結(jié)束時的約11升。
就加料葡萄糖的培養(yǎng)而言，在培養(yǎng)過程中代謝的全部碳源的98％是葡萄糖，余下的2％相當于分批期間應(yīng)用的甘油。在整個過程中，上清液中沒有定量分析出葡萄糖。
165h操作時間之后，應(yīng)用Bradford蛋白質(zhì)測定法對取自用甘油培養(yǎng)的樣品定量分析出5.86g/l肌醇六磷酸酶。從用葡萄糖培養(yǎng)160小時操作時間后的樣品用同樣方法測定出7.12g/l肌醇六磷酸酶。這些結(jié)果證實，葡萄糖的阻抑效果可應(yīng)用保證加料階段中嚴格的碳限制的加料法來避免。圖1示出應(yīng)用甘油和應(yīng)用葡萄糖作為主碳源進行培養(yǎng)的時間過程比較。
實施例2應(yīng)用蔗糖作為主碳源由多形漢遜酵母生產(chǎn)煙曲霉肌醇六磷酸酶在本實施例中，應(yīng)用與實施例1中相同的菌株在15l生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)物和主要培養(yǎng)條件與實施例1的完全相同，只是加料溶液所含的是700g/l蔗糖。在操作期間，上清液樣品中的蔗糖濃度決不高于1g/l，而同樣的樣品中既檢測不到葡萄糖也檢測不到果糖。167h培養(yǎng)期后，應(yīng)用Bradford蛋白質(zhì)測定法可測知培養(yǎng)基中5.27g/l的肌醇六磷酸酶。
實施例3應(yīng)用葡萄糖作為唯一碳源由多形漢遜酵母生產(chǎn)煙曲霉肌醇六磷酸酶在本實施例中，應(yīng)用與實施例1和2的相同菌株在15l生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)物是在與實施例1和2相同條件下獲得的。在生物反應(yīng)器中用5l與實施例1中所述相同組成的初始培養(yǎng)基開始進行主培養(yǎng)，只是初始10g/l甘油被10g/l葡萄糖代替。加料溶液由700g/l葡萄糖組成，它是在與實施例1中所述完全相同的條件下加入培養(yǎng)物中的。160h操作時間之后，由Bradford法可測知培養(yǎng)基中7.21g/l肌醇六磷酸酶。
實施例4應(yīng)用多次補料分批方式由多形漢遜酵母生產(chǎn)煙曲霉肌醇六磷酸酶在本實施例中，在15l反應(yīng)器中應(yīng)用與實施例1、2和3中相同的多形漢遜酵母菌株進行多次補料分批培養(yǎng)。第一次培養(yǎng)時，種子培養(yǎng)物是這樣獲得的，即將1ml保持在-70℃的甘油儲備細胞懸浮液接種入300ml具有下列組成的培養(yǎng)基30.0g/l甘油；13.3g/l NH4H2PO4；3.0g/lMgSO4·7H2O；6.7g/l(NH4)2SO4；3.3g/l KCl；0.33g/l NaCl；1.0g/lCaCl2·2H2O；0.67mg/l H3BO3；0.067g/l(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；5.3g/l CuSO4·5H2O；20mg/l ZnSO4·7H2O；26mg/l MnSO4·H2O；0.067g/l Na-EDTA；0.67mg/l NiSO4·6H2O；0.67mg/l CoCl2·6H2O；0.67mg/l Na2MoO4·2H2O；0.67mg/l KI；0.13g/l鹽酸硫胺素；0.4mg/l生物素。在30℃和200rpm下將搖瓶培養(yǎng)30h，將300ml用作含下列物質(zhì)的15l生物反應(yīng)器中主培養(yǎng)物的接種物150.0g甘油；100.0gNH4H2PO4；22.5g MgSO4·7H2O；50.0g (NH4)2SO4；25g KCl；2.5gNaCl；7.5g CaCl2·2H2O；5mg H3BO3；0.5g (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；40mg CuSO4·5H2O；150mg ZnSO4·7H2O；40mg MnSO4·H2O；0.5g Na-EDTA；5.0mg NiSO4·6H2O；5.0mg CoCl2·6H2O；5.0mgNa2MoO4·2H2O；5.0mg KI；1g鹽酸硫胺素；3mg生物素，初始體積為7.5l培養(yǎng)基。
在整個過程中，溫度、pH和通氣分別保持恒定在30℃、5.0和9.0l/min。pH是通過加入25％NH3而控制的。通過控制攪拌器速率和壓力(0～0.5巴)將氧飽和度維持在反應(yīng)器中20％飽和度這一最小值。培養(yǎng)基中初始甘油的全部消耗導(dǎo)致pO2值的迅速增大，指示分批階段的結(jié)束。此時，開始加料含40％葡萄糖和60％甘油的溶液至總碳源濃度為700g/l。在整個加料階段將加料速率控制在45g/h。
至于下面的多次補料分批培養(yǎng)，操作結(jié)束時將上一輪的0.5～1l培養(yǎng)液保持在該生物反應(yīng)器中作為下一輪的接種物。將含相同總量上述鹽但不含碳源的新無菌培養(yǎng)基加入該生物反應(yīng)器達規(guī)定的初始體積。因此，不存在分批階段且如上所述立即開始加料。加料溶液含總計700g/l碳源。應(yīng)用下面給出的甘油和葡萄糖的各種比例以及初始體積第2次循環(huán)-66％葡萄糖，34％甘油，7.5l初始體積第3次循環(huán)-90％葡萄糖，10％甘油，7.5l初始體積第4和第5次循環(huán)-100％葡萄糖，5l初始體積如圖2所示，第1至第5次循環(huán)的每次循環(huán)結(jié)束時達到的肌醇六磷酸酶濃度分別為4.7g/l、3.9g/l、4.3g/l、6.0g/l和4.4g/l。在第4次循環(huán)中，生長階段結(jié)束時，更慢、更長久的加料方式導(dǎo)致更高的產(chǎn)物濃度。
實施例5由多形漢遜酵母生產(chǎn)共有(consensus)肌醇六磷酸酶在本實施例中，在15l生物反應(yīng)器中應(yīng)用與實施例1中所述相同的培養(yǎng)基和相同的條件培養(yǎng)含大約40個拷貝的在FMD啟動子控制之下的共有肌醇六磷酸酶基因的多形漢遜酵母菌株(歐洲專利申請No.97810175.6)，補料分批階段應(yīng)用含700g/l葡萄糖的加料溶液。165h培養(yǎng)期之后，由Bradford法測得培養(yǎng)基中肌醇六磷酸酶濃度為13.1g/l。
參考文獻J.M.Cregg和K.R.Madden(1988)開發(fā)甲基營養(yǎng)酵母即巴斯德畢赤酵母作為生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的宿主系統(tǒng)，工業(yè)微生物學進展(Developments in Industrial Microbiology)29,33-41Gelissen和K.Melber(1996)作為重組藥物生產(chǎn)有機體的甲基營養(yǎng)酵母多形漢遜酵母，藥物研究(Drug Res.),46,943-948G.Gelissen,C.P.Hollenberger,Z.A.Janowicz(1994)甲基營養(yǎng)酵母中的基因表達。參見Smith A.(編輯)重組微生物中的基因表達(Gene expression in recombinant microorganisms),Dekker,NewYork,195-239Weydemann,P.Keup,M.Piontek,A.W.M.Strasser,J.Schweden,G.Gelissen,Z.A.Janowicz(1995)多形漢遜酵母高水平分泌水蛭素，應(yīng)用微生物學及生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)44,377-385Th.Egli,J.P.Van Dijken,M.Veenhuis,W.Harder,A.Fiechter(1980)酵母中的甲醇代謝分解代謝酶合成的調(diào)節(jié)，微生物學文獻(Arch.Microbiol.124,115-121Y.Chen,J.Krol,和D.Freedman(1996)從巴斯德畢赤酵母發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)凝血調(diào)節(jié)蛋白，化學技術(shù)與生物技術(shù)雜志(J.Chem.Tech.Biotechnol.)67,143-148L.Pasamontes,M.Haiker,M.Wyss,M.Tessier,A.P.G.M.VanLoon(1997)得自煙曲霉真菌的熱穩(wěn)定性肌醇六磷酸酶的基因克隆、純化和鑒定，應(yīng)用環(huán)境微生物學(APPl.Environ.Microbiol.)63,1696-1700。
權(quán)利要求
1．通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的真核細胞而制備內(nèi)源蛋白質(zhì)或異源蛋白質(zhì)的方法，該方法的特征在于將阻抑基質(zhì)用作碳源，在進料階段限制碳源而在整個培養(yǎng)期間沒有連續(xù)的氧限制。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的蛋白質(zhì)是酶，特別是飼料酶，例如肌醇六磷酸酶、纖維素酶、木聚糖酶，或者是工業(yè)酶，例如淀粉酶、蛋白酶、轉(zhuǎn)化酶、脂肪酶、過氧化氫酶、纖維素酶、葡糖氧化酶、醇氧化酶、果膠酶、柚苷酶、膠原酶、過氧化物酶或支鏈淀粉酶。
3．權(quán)利要求1或2的方法，其中的細胞是甲基營養(yǎng)細胞和/或用DNA序列轉(zhuǎn)化了，該DNA序列包括甲醇代謝中涉及的酶的啟動子，如甲酸脫氫酶(FMD或FMDH)啟動子、甲醇氧化酶(MOX)啟動子或二羥丙酮合酶(DAS或DHAS)啟動子。
4．權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求的方法，其中的細胞是甲基營養(yǎng)酵母，優(yōu)選是漢遜酵母屬如多形漢遜酵母，畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母，假絲酵母屬或球擬酵母屬。
5．權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求的方法，其中的阻抑基質(zhì)占碳源的1-100％，優(yōu)選40-100％或更優(yōu)選90-100％或是唯一的碳源。
6．權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求的方法，其中的阻抑基質(zhì)是糖如單糖、二糖、寡糖或多糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、糖原、纖維素或右旋糖或者含糖的混合物如糖蜜、葡萄糖漿或果糖糖漿。
7．權(quán)利要求1到6中任一權(quán)利要求的方法，其中該方法是以多次補料分批的方式實施的。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過將阻抑基質(zhì)用作碳源培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的真核細胞而制備內(nèi)源蛋白質(zhì)或異源蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C12P21/02GK1218112SQ9811899
公開日1999年6月2日 申請日期1998年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月1日
發(fā)明者K·海爾穆斯, R·羅派茨－尤里巴利, A·F·梅爾, H·W·施里克, A·范倫 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司