專利名稱：新的人衣被蛋白亞基編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人衣被蛋白ζ亞基即人ζ-COP的cDNA序列，該蛋白是ζ-COP的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
真核生物細(xì)胞中，蛋白質(zhì)在各細(xì)胞器間的運輸是通過運輸小泡的出芽和融合實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中存在兩種不同蛋白組成外殼的有被運輸小泡一種是籠形蛋白(clathin)包被的小泡，內(nèi)吞時從細(xì)胞膜上出芽形成，或從高爾基體成熟面出芽運至其它內(nèi)源細(xì)胞器(Cell 791199-1207，1994)；另一種是衣被蛋白(COP)包被的小泡，定位于高爾基體膜和過渡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(transitional ER)的特殊區(qū)域(Nature362648-652，1993)。這兩種蛋白都是由多個亞基組成(Annu.Rev.Biochem.59415-438，1990；Nature 355409-415，1992)，并且兩者的亞基之間有一定的同源性。另外在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)COPII包被的小泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上產(chǎn)生(Cell 77895-908，1994)。
COP蛋白復(fù)合物于1986年由Orci等人分離純化得到。實驗表明它不含有籠形蛋白，并且承擔(dān)高爾基體囊之間的蛋白運輸功能(Cell 46171-184，1986)。90年代初，Serafini和Stenbeck等人克隆了該復(fù)合物的部分亞基(如α、β’、γ)(Nature349215-220，1991；FEBS Lett.314195-198，1992)。1993年Kuge等人從牛的肝細(xì)胞中分離得到了COP蛋白的又一個亞基ζ(Zeta)-COP蛋白，并克隆了其cDNA序列(J.Cell.Biol.123(6)1727-1734，1993)。1996年，Cosson等人利用遺傳突變研究得到了酵母的ζ(Zeta)-COP同源物(EMBO J.15(8)1792-1798，1996)。
在本發(fā)明公布之前，尚沒有任何人公開過本申請中涉及的人類ζ(Zeta)-COP蛋白和cDNA序列。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼人衣被蛋白ζ亞基即人ζ-COP蛋白，本發(fā)明的基因被命名為人ζ-COP。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的蛋白，該蛋白被命名為人ζ-COP。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人ζ-COP蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種人ζ-COP編碼序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人ζ-COP蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人ζ-COP蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人ζ-COP蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人ζ-COP蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人ζ-COP蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為652個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于18-551位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人ζ-COP蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中18-551位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框18-551位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中18-551位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地，在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人ζ-COP蛋白多肽”指具有人ζ-COP蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人ζ-COP相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人ζ-COP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與人ζ-COP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人ζ-COP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人ζ-COP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人ζ-COP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人ζ-COP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人ζ-COP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人ζ-COP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括人ζ-COP多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人ζ-COP的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有人ζ-COP多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人ζ-COP的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人ζ-COP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人ζ-COP多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人ζ-COP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人ζ-COP基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人ζ-COP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人ζ-COP蛋白的分子，也包括那些并不影響人ζ-COP蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人ζ-COP基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人ζ-COP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人ζ-COP或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人ζ-COP功能的抗體以及不影響人ζ-COP功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人ζ-COP基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與ζ-COP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人ζ-COP與牛ζ-COP的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人ζ-COP與牛ζ-COP的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標(biāo)出。
在本發(fā)明中，人ζ-COP的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-ACCAGCTGCGGGGCAAGATGGAG -3′和反向引物A25′-CCGAGATGACCCTGAGAGCATCG-3′進(jìn)行PCR，獲得652bp的目的片段。測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
衣被運輸小泡(COP-coated vesicles)外的蛋白復(fù)合物主要由ADP核糖基化因子(ARF)和衣被蛋白(coatomer)組成(FEBS Lett..36989-92，1995)。當(dāng)高爾基體膜形成小泡時，首先結(jié)合胞液中ARF，當(dāng)它們結(jié)合了GTP并在膜表面達(dá)到飽和后，衣被蛋白開始結(jié)合于小泡表面，并促進(jìn)衣被小泡的最終形成(Curr.Opin.Cell.Biol.5621-627，1993)。當(dāng)ARF水解了GTP后，被膜小泡的衣被蛋白開始解體，小泡與目標(biāo)膜融合(J.Cell.Biol.1221365-1371，1993)。研究表明，衣被蛋白是由七個亞基的一個復(fù)合物(Nature 349248-251，1991)，ζ-COP是其中最小的一個亞基，并不直接和高爾基體膜上的衣被蛋白結(jié)合位點作用(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。它在復(fù)合物中和γ-COP有相互作用，可以在體外免疫共沉淀實驗中被共同沉淀下來(J.Bio.Chem.270(52)31364-31371，1995)。ζ-COP在胞液中可以是可溶性單體，也可以與衣被蛋白相結(jié)合。當(dāng)ζ-COP與衣被蛋白結(jié)合，它就開啟了衣被蛋白的功能，反之衣被蛋白就處于無活性狀態(tài)。ζ-COP的這種特性表明它具有調(diào)節(jié)衣被裝配、進(jìn)而調(diào)節(jié)生物合成的蛋白質(zhì)的運輸速率的功能(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。衣被運輸小泡不僅參與蛋白質(zhì)在高爾基體中的正向運輸，也能將其從高爾基體反向運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(EMBO J.15(8)1792-1798，1996)。另外，在有絲分裂時，衣被小泡也是高爾基體降解分裂的主要產(chǎn)物，提示COP不僅在蛋白質(zhì)運輸方面而且在細(xì)胞器形成方面都具有極為重要的作用(FEBS Lett.38966-69，1996)。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人ζ-COP的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸引物——A15′-ACCAGCTGCGGGGCAAGATGGAG-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸A25′-CCGAGATGACCCTGAGAGCATCG-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片段，A1/A2為652bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜霁@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共652bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于18-551位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人ζ-COP的氨基酸序列，共177個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例2同源比較用人ζ-COP的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundantGenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與牛ζ-COP基因及其編碼蛋白具有極高同源性，用PCGENE軟件比較發(fā)現(xiàn)，它們在核酸水平上的同一性達(dá)到94.5％(圖1)，在蛋白水平上的同一性達(dá)到98.9％(圖2)。因此，確定它們構(gòu)成了一個家族，而且本發(fā)明的人ζ-COP具有與同一家族中其他成員相同或相似的功能。
衣被運輸小泡(COP-coated vesicles)外的蛋白復(fù)合物主要由ADP核糖基化因子(ARF)和衣被蛋白(coatomer)組成。這些蛋白成分的重要作用有1)使扁平膜變成芽；2)防止小泡未成熟或隨機(jī)的融合；3)對泡內(nèi)裝載蛋白起到分揀和集中的作用(FEBS Lett..36989-92，1995)。當(dāng)高爾基體膜形成小泡時，首先結(jié)合胞液中ARF，ARF是一類小型GTP結(jié)合蛋白，當(dāng)它們結(jié)合了GTP并在膜表面達(dá)到飽和后，衣被蛋白開始結(jié)合于小泡表面，并促進(jìn)衣被小泡的最終形成(Curr.Opin.Cell.Biol.5621-627，1993)。當(dāng)ARF水解了GTP后，被膜小泡的衣被蛋白開始解體，小泡與目標(biāo)膜融合(J.Cell.Biol.1221365-1371，1993)。研究表明，衣被蛋白是由七個亞基的一個復(fù)合物(Nature 349248-251，1991)，復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)和各亞基的作用尚不明了，已知ζ-COP是其中最小的一個亞基，并不直接和高爾基體膜上的衣被蛋白結(jié)合位點作用(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。它在復(fù)合物中和γ-COP有相互作用，可以在體外免疫共沉淀實驗中被共同沉淀下來(J.Bio.Chem.270(52)31364-31371，1995)。不同于其它亞基，ζ-COP被發(fā)現(xiàn)在胞液中可以是可溶性單體。ζ-COP也可以與衣被蛋白相結(jié)合，使得每個衣被蛋白復(fù)合物中ζ-COP的平均分子數(shù)小于1。當(dāng)ζ-COP與衣被蛋白結(jié)合，它就開啟了衣被蛋白的功能，反之當(dāng)它解離下來，衣被蛋白就處于無活性狀態(tài)。ζ-COP的這種特性表明它具有調(diào)節(jié)衣被裝配、進(jìn)而調(diào)節(jié)生物合成的蛋白質(zhì)的運輸速率的功能(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。各種實驗結(jié)果表明，衣被運輸小泡不僅參與蛋白質(zhì)在高爾基體中的正向運輸，它也能識別蛋白質(zhì)上的雙賴氨酸標(biāo)志，將其從高爾基體反向運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(EMBO J.15(8)1792-1798，1996)。另外，在有絲分裂時，衣被小泡也是高爾基體降解分裂的主要產(chǎn)物，大約有60％的高爾基體膜碎片組成了衣被運輸小泡，使高爾基體能在兩個子細(xì)胞中平均分配，這提示了COP不僅在蛋白質(zhì)運輸方面而且在細(xì)胞器形成方面都具有極為重要的作用(FEBS Lett.38966-69，1996)。
本發(fā)明的人ζ-COP除了可作為該家族亞基一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人ζ-COP還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人ζ-COP的N端與牛ζ-COP的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的亞基和/或蛋白。
針對本發(fā)明人ζ-COP的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
實施例3人ζ-COP在大腸桿菌中的表達(dá)在該實施例中，將編碼人ζ-COP的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人ζ-COPcDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-AGTTGTCGACATGGAGGCGCTGATTTTGG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人ζ-COP編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-AAGGAAGCTTTCACCGAAGGAGTGACCAC-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和人ζ-COP的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證人ζ-COP的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人ζ-COP。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人ζ-COP。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘呤褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為l0％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約20KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人ζ-COP在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實施例中，將編碼人ζ-COP的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人ζ-COP cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-CGTTAAGCTTATGGAGGCGCTGATTTTGG-3′(SEQ ID NO.7)
該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人ζ-COP編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-AAGTGAGCTCTCACCGAAGGAGTGACCAC-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有SacI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人ζ-COP的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(f1 ori)、一個病毒復(fù)制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和SacI分別消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證人ζ-COP的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為20KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人ζ-COP基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海新黃浦復(fù)旦基因工程有限公司(ii)發(fā)明名稱新的人衣被蛋白亞基編碼序列、其編碼的多肽及制備方法(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1ACCAGCTGCGGGGCAAGATGGAG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.2CCGAGATGACCCTGAGAGCATCG 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度652bp
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 ACCAGCTGCG GGGCAAGATG GAGGCGCTGA TTTTGGAACC TTCCCTGTAT ACTGTCAAAG61 CCATCCTGAT TCTGGACAAT GATGGAGATC GACTTTTTGC CAAGTACTAT GACGACACCT121 ACCCCAGTGT CAAGGAGCAA AAGGCCTTTG AGAAGAACAT TTTCAACAAG ACCCATCGGA181 CTGACAGTGA AATTGCCCTC TTGGAAGGCC TGACAGTGGT ATACAAAAGC AGTATAGATC241 TCTATTTCTA TGTGATTGGC AGCTCCTATG AAAATGAGCT GATGCTTATG GCTGTTCTGA301 ACTGTCTCTT CGACTCATTG AGCCAGATGC TGAGGAAAAA TGTAGAAAAG CGAGCACTGC361 TGGAGAACAT GGAGGGGCTG TTCTTGGCTG TGGATGAAAT TGTAGATGGA GGGGTGATCC421 TAGAGAGTGA TCCCCAGCAG GTGGTACACC GGGTGGCATT AAGGGGTGAA GATGTCCCCC481 TTACGGAGCA GACCGTGTCT CAGGTGCTGC AGTCAGCCAA AGAACAGATC AAGTGGTCAC541 TCCTTCGGTG AAGACCTCAC TGTTCCTGGC TCTTCATCCT CTTCAAAAAA TTTGCATGTC601 TGCTGTGAAT TTTCATCTAG TTCCCCAATC GATGCTCTCA GGGTCATCTC GG(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度177個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Glu Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Val Lys Ala16 Ile Leu Ile Leu Asp Asn Asp Gly Asp Arg Leu Phe Ala Lys Tyr31 Tyr Asp Asp Thr Tyr Pro Ser Val Lys Glu Gln Lys Ala Phe Glu46 Lys Asn Ile Phe Ash Lys Thr His Arg Thr Asp Ser Glu Ile Ala61 Leu Leu Glu Gly Leu Thr Val Val Tyr Lys Ser Ser Ile Asp Leu76 Tyr Phe Tyr Val Ile Gly Ser Ser Tyr Glu Asn Glu Leu Met Leu91 Met Ala Val Leu Asn Cys Leu Phe Asp Ser Leu Ser Gln Met Leu106 Arg Lys Asn Val Glu Lys Arg Ala Leu Leu Glu Asn Met Glu Gly121 Leu Phe Leu Ala Val Asp Glu Ile Val Asp Gly Gly Val Ile Leu136 Glu Ser Asp Pro Gln Gln Val Val His Arg Val Ala Leu Arg Gly151 Glu Asp Val Pro Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Gln Val Leu Gln166 Ser Ala Lys Glu Gln Ile Lys Trp Ser Leu Leu Arg(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5AGTTGTCGACATGGAGGCGCTGATTTTGG 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6AAGGAAGCTTTCACCGAAGGAGTGACCAC 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7CGTTAAGCTTATGGAGGCGCTGATTTTGG29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8AAGTGAGCTCTCACCGAAGGAGTGACCAC29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列是SEQ ID NO.3中核苷酸18-551位的序列。
4.一種分離的人ζ-COP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人ζ-COP蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人ζ-COP蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人ζ-COP蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人ζ-COP蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸18-551位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的人ζ-COP蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及人衣被蛋白ζ亞基即人ζ－COP的cDNA序列,該蛋白是ζ－COP的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12P21/00GK1248624SQ9811974
公開日2000年3月29日 申請日期1998年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月22日
發(fā)明者余龍, 屠強(qiáng), 傅強(qiáng), 張宏來, 趙壽元 申請人:上海新黃浦復(fù)旦基因工程有限公司