專利名稱：基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因a蛋白抗原制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程和疾病診斷防治技術(shù)，屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基因工程表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HelicobacterPylori-Cytotoxin associated gene A，簡稱CagA)蛋白抗原的制備工藝，以及在消化道疾病的診斷預(yù)報和預(yù)防治療中的制備應(yīng)用。
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，簡稱HP)是一種造成人類胃及十二指腸疾患的重要致病性病原體。幽門螺桿菌的感染已是個世界問題，據(jù)報道，在發(fā)達(dá)國家30歲以下人群感染率低于20％，60歲以上人群感染率超過50％，而在包括我國在內(nèi)的發(fā)展中國家，20歲以上人群感染率已達(dá)80％以上。
近年來，國內(nèi)外已經(jīng)建立了一些具有高靈敏度和特異性的幽門螺桿菌(HP)診斷方法，這些方法總的可分為兩大類一類是需要使用內(nèi)窺鏡的侵入法；另一類是不需要內(nèi)窺鏡的非侵入法?，F(xiàn)分述于下一.侵入性的診斷試驗這類試驗的特點是使用內(nèi)窺鏡，在取得胃活檢組織后進(jìn)行檢測，試驗的方法主要有快速尿酶試驗、組織學(xué)染色鑒別及細(xì)菌培養(yǎng)法。
1.快速尿酶試驗快速尿酶試驗是利用胃活檢組織中存在一定量的幽門螺桿菌，其菌膜上存在的尿酶使尿素產(chǎn)生氨氣，引起pH值的改變，通過顏色的變化來顯示結(jié)果。該試驗具有簡便快速的特點，它是檢測胃活檢組織幽門螺桿菌常用的方法，但對于近期使用過降低胃部細(xì)菌量或直接抑制酶活性的藥物的樣品應(yīng)避免使用，同時在成功地根治幽門螺桿菌感染后，由于尚未建立快速尿酶法的準(zhǔn)確性指標(biāo)，故也不應(yīng)使用該試驗。
2.組織學(xué)染色一般胃鏡活檢組織經(jīng)過快速尿酶試驗檢測為陰性時，為了對未治療病人進(jìn)行確診，可進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，取2份以上胃竇活檢組織用蘇木精和伊紅染色，其它特殊染色還有Genta，Giemsa，Warthin-Starry等。在未治療病人胃活檢中存在慢性活動性胃炎，是幽門螺桿菌感染的有力證據(jù)。從組織學(xué)上若不存在慢性粘膜(mucosal)炎癥，則可以排除幽門螺桿菌感染。但不同病理學(xué)家間的觀察會存在差異，它對于腸道化生及胃萎縮的樣品診斷具有一定困難。在成功地根治性治療后6周內(nèi)，慢性活動性胃炎會緩慢恢復(fù)其組織形態(tài)，因此也不能作為繼續(xù)感染的標(biāo)志。
3.細(xì)菌培養(yǎng)一般胃活檢組織進(jìn)行幽門螺桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)較少，因為該細(xì)菌需要復(fù)雜的營養(yǎng)，且費用昂貴。但對于病人在治療中產(chǎn)生抗藥性時，應(yīng)該進(jìn)行幽門螺桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗。
4.其它方法其它方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及相差顯微鏡檢查等，前者可用作分型(I型幽門螺桿菌和II型幽門螺桿菌)及研究用，后者需暗視野，且操作者需一定訓(xùn)練，因此臨床上使用是有限的。
以上這些方法由于均需采用胃活檢組織，因此對醫(yī)院和臨床醫(yī)師、病理學(xué)家等均有一定的要求，同時采用內(nèi)窺鏡也會造成病人的痛苦及醫(yī)療費的負(fù)擔(dān)，因此常在較嚴(yán)重的胃十二指腸疾患的病中采用。
二.非侵入性的診斷試驗這類試驗的主要特點是不需要使用內(nèi)窺鏡，從而可避免病人反復(fù)做胃鏡的痛苦及發(fā)生其它類型的感染，試驗方法主要包括下述尿素呼吸試驗和抗體檢測。
1.尿素呼吸試驗(UBT)碳標(biāo)記尿素呼吸試驗(UBT)不隸屬于免疫應(yīng)答，它是根據(jù)幽門螺桿菌尿酶水解口服的碳標(biāo)記尿素的原理設(shè)計的一種試驗方法。當(dāng)一個感染幽門螺桿菌的病人咽下同位素標(biāo)記的尿素時，由于幽門螺桿菌表面的尿酶水解尿素釋放標(biāo)記CO2，并吸收到血液中，然后在呼氣中捕獲并測定之。13C是一種穩(wěn)定的無放射性同位素，14C是放射性同位素，二者都可用來標(biāo)記尿素。碳標(biāo)記尿素呼吸試驗具有操作簡單的特點，但作為商品的碳標(biāo)記尿素呼吸試驗試劑盒的預(yù)期費用雖比內(nèi)窺鏡價格低些但遠(yuǎn)比抗體檢測試驗貴，而且會造成大量的同位素污染，因此尚難以此法作為常規(guī)檢測未治療的病人。至于對病人的確診根治也須在治療后至少一個月后采用，對新近用抗生素、鉍劑或質(zhì)子泵抑制劑治療的病人可能會引起碳標(biāo)記尿素呼吸試驗假陰性結(jié)果，先前有胃切除的病人碳標(biāo)記尿素呼吸試驗靈敏度也會下降。
2.抗體檢測慢性幽門螺桿菌感染可引起病人產(chǎn)生局部或全身性的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致IgG和IgA抗體的產(chǎn)生，而其抗體的水平又能較準(zhǔn)確地反映幽門螺桿菌感染的狀態(tài)，因此在病人血清中檢測幽門螺桿菌抗體是幽門螺桿菌感染的可信指標(biāo)。
目前國內(nèi)外已有多種幽門螺桿菌抗體檢測盒上市，其中多以用經(jīng)培養(yǎng)的幽門螺桿菌體抽提物作為抗原，采用如膠乳凝集試驗、血球凝集試驗、熒光免疫檢測試驗和酶免疫檢測試驗等免疫學(xué)方法檢測人血清中(或血漿、全血、唾液等)的幽門螺桿菌抗體。其中用得較多的是定性或定量酶免疫檢測(EIA)幽門螺桿菌抗體檢測盒，它的檢測能顯示人群中的幽門螺桿菌感染率，但由于幽門螺桿菌在包括我國在內(nèi)的發(fā)展中國家的高感染率，因此對幽門螺桿菌抗體的檢測在臨床上不常用作診斷工具，而多用于流行病學(xué)調(diào)查。
隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，對于幽門螺桿菌是不是產(chǎn)細(xì)胞毒素，在臨床上分為兩種型別I型幽門螺桿菌為產(chǎn)細(xì)胞毒素；II型幽門螺桿菌為不產(chǎn)細(xì)胞毒素。其中約占50％～60％幽門螺桿菌為I型感染。I型幽門螺桿菌即VacA(+)和CagA(+)幽門螺桿菌(VacA空泡細(xì)胞毒素；CagA細(xì)胞毒素相關(guān)基因蛋白抗原)，它是造成胃、十二指腸潰瘍病的重要致病原。檢測產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌能為消化道疾病的防治工作提供確切的實驗室依據(jù)，尤其是對含高滴度CagA抗體的患者進(jìn)行積極的根治性治療有著重要的指導(dǎo)意義。
產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗體檢測目前尚屬研究階段，文獻(xiàn)檢索顯示1.HP菌具有高度異源性，不同來源的CagA基因顯示大量核苷酸取代現(xiàn)象，根據(jù)已報道的美國和意大利的CagA核苷酸序列相比，其異源性達(dá)21％。(Infectionand Immunity 61(5)1799-1801 1993；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905791-57951993)2. 1993年10月報道采用重組128KDa CagA蛋白檢測CagA-IgG抗體的檢測試劑(Eur.J.Clin.Microbio.Infect.Dis 12(10)739-745 1993)，但至今尚未見到上市產(chǎn)品。
3.CagA蛋白(128KDa)的抗原性是由CagA近C末端的核苷酸編碼(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 905791-5795 1993)，但至今也尚未見到上市產(chǎn)品。
目前在臨床上應(yīng)用的幽門螺桿菌抗體檢測盒(包括EIA試劑、膠乳試劑等)均采用培養(yǎng)的幽門螺桿菌菌體的抽提物制備而成，在我國臨床樣品的幽門螺桿菌抗體(HP-IgG)的檢測結(jié)果絕大多數(shù)均為陽性，這樣造成了臨床醫(yī)師的無所適從，因此對于胃腸道患者的診斷治療仍主要依靠傳統(tǒng)胃鏡及活檢報告。HP-IgG的檢測尚不適合我國臨床診斷的需要。
幽門螺桿菌按臨床可分為產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌和不產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌兩類，它們在胃和十二指腸潰瘍疾病中所造成的后果不一樣感染了不產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌后，雖然能復(fù)蓋在部份胃粘膜上，并使人體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)(HP-IgG為陽性)，但不能侵人胃上皮細(xì)胞，一般可長期(數(shù)十年乃至終身)無臨床癥狀。與此相反，感染了產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌后，由于細(xì)胞毒素的作用造成胃上皮細(xì)胞空泡、損傷、壞死和潰瘍，因此感染這類幽門螺桿菌與胃、十二指腸潰瘍及胃癌密切相關(guān)。國外研究結(jié)果顯示，90％以上的十二指腸潰瘍及75％胃潰瘍病人均感染了產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌，同時80％以上胃癌病人也與此相關(guān)，因此臨床上迫切需要檢測特異性的產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌試劑。現(xiàn)研究結(jié)果進(jìn)一步表明，大約占50％～60％幽門螺桿菌能產(chǎn)生細(xì)胞毒素活性，其中細(xì)胞毒素的表達(dá)與暴露在幽門螺桿菌表面的細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(Cytotoxin associatedgene A簡稱CagA)密切相關(guān)，該基因表達(dá)的蛋白僅存在于產(chǎn)細(xì)胞毒素的幽門螺桿菌中，并具有良好的免疫原性。現(xiàn)已認(rèn)為，CagA蛋白抗體與胃潰瘍、十二指腸潰瘍及胃癌密切相關(guān)，。
本發(fā)明的目的是提供一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，它采用基因工程表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HP-CagA)蛋白抗原，能為臨床消化道疾患的診斷及預(yù)報提供依據(jù)，應(yīng)用于免疫學(xué)診斷方法中。
本發(fā)明的又一目的是提供一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報和預(yù)防治療中的制備應(yīng)用，用于檢測幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HP-CagA)蛋白抗原的抗原或抗體，以指導(dǎo)患者進(jìn)行根除性治療。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，在基因工程中質(zhì)粒的制備和純化、限制性內(nèi)切酶水解、酶切后DNA純化、DNA連結(jié)、連結(jié)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌、轉(zhuǎn)化子篩選，按一般常規(guī)操作或采用市售商品試劑及試劑盒進(jìn)行操作；
首先選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的質(zhì)粒載體；在確定質(zhì)粒載體后，使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌，以獲得高表達(dá)率的基因工程菌；然后制備目的DNA以CagA陽性菌染色體DNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增目的DNA片段；(1)DNA模板采用國際CagA陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株證實的國內(nèi)外CagA陽性流行菌株的菌體染色體DNA作PCR擴增模板；(2)引物選用

圖1所示的CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根據(jù)載體酶切點的序列設(shè)計引物，使插入目的DNA表達(dá)符合讀格；(3)擴增反應(yīng)在0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合，其中滅菌水 30μl10X擴增緩沖液 10μl4種dNTP混合物，每種濃度1.25m mol/L16μl引物1(溶于5μl水)100p mol引物2(溶于5μl水)100p mol模板DNA1ug加水至終體積100μl其中10X擴增緩沖液500m mol/LKCl100m mol/LTris.HCl(PH8.3室溫)15m mol/LMgCl20.1％明膠(4)擴增參數(shù)上述混合液在94℃加熱5分鐘，加入2u Taq聚合酶，用100μl液體石蠟復(fù)蓋反應(yīng)混合液上，然后按以下參數(shù)進(jìn)行擴增循環(huán)變性退火聚合首輪循環(huán) 94℃5分鐘50℃2分鐘 72℃3分鐘后續(xù)循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃3分鐘末輪循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃10分鐘循環(huán)25～30次；目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌；最后進(jìn)行CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，經(jīng)小量培養(yǎng)篩選表達(dá)率高的重組轉(zhuǎn)化子作為基因工程菌，基因工程菌經(jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)CagA蛋白抗原；基因表達(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原，其分子量大小隨不同菌株而定，為27～38Kda；CagA蛋白抗原的純化需根據(jù)載體的情況使用融合蛋白抗體、相應(yīng)抗體。親和層析柱或HPLC進(jìn)行。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌免疫診斷試劑及試劑盒的制備，它包括檢測產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagA IgG、CagAIgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測試劑及試劑盒、血球凝集檢測試劑及試劑盒、螢光免疫檢測試劑及試劑盒、酶免疫檢測試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測試劑及試劑盒。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于疫苗的制備，包括口服疫苗和注射疫苗的制備。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防及治療中的制備應(yīng)用，制備包括單克隆抗體及多克隆抗體的CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物，用作特異性藥物使之與胃、十二指腸產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌結(jié)合，或作為保健品預(yù)防產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌侵入胃、十二指腸組織。
本發(fā)明采用基因工程表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HP-CagA)蛋白抗原，并應(yīng)用于診斷預(yù)報檢測試劑盒的制備、疫苗制備、藥品及保健品的制備中。本發(fā)明中的CagA蛋白抗原可應(yīng)用于免疫學(xué)診斷方法中各種診斷試劑及試劑盒的制備，包括檢測產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagA IgG、CagAIgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測試劑及試劑盒、血球凝集檢測試劑及試劑盒、螢光免疫檢測試劑及試劑盒、酶免疫檢測試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測試劑及試劑盒等，用來檢測CagA抗體，能為臨床胃部疾患的診斷及預(yù)報提供依據(jù)，尤其對含高滴度CagA抗體的胃、十二指腸患者進(jìn)行積極的抗菌素根除性治療有著重要的指導(dǎo)意義，對45歲以下的CagA抗體檢測陰性的患者可免除胃鏡檢查的痛苦。本發(fā)明中的CagA蛋白也可用作制備預(yù)防消化道疾病的疫苗；同時，CagA抗體可應(yīng)用于特異性治療消化道疾病及預(yù)防消化道疾病的藥物和保健品。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作進(jìn)一步描述。
圖1表示了CagA基因核苷酸序列。
圖2表示出HP-CagA蛋白表達(dá)及純化。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，在基因工程中質(zhì)粒的制備和純化、限制性內(nèi)切酶水解、酶切后DNA純化、DNA連結(jié)、連結(jié)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌、轉(zhuǎn)化子篩選，按一般常規(guī)操作或采用市售商品試劑及試劑盒進(jìn)行操作。
1.質(zhì)粒載體的使用可選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的各種質(zhì)粒載體。
使用產(chǎn)生融合蛋白的載體有表達(dá)lacZ融合基因的載體系統(tǒng)如PUR載體、PMR載體及PEX載體等。表達(dá)6XHis融合蛋白的載體系統(tǒng)有PQE系統(tǒng)等，還有其它融合蛋白的載體系統(tǒng)。
表達(dá)完全天然CagA蛋白抗原也可采用PKC載體等。
2.大腸桿菌受體菌的使用在確定質(zhì)粒載體后，可使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌，如K12 71/18、JM103、XL1 Blue、JM109、TG1、M15[PREP4]或SG13009[PREP4]等以獲得高表達(dá)率的基因工程菌。
3.目的DNA的制備以CagA陽性菌染色體DNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增目的DNA片段。
(1)DNA模板采用國際CagA陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株證實的國內(nèi)外CagA陽性流行菌株的菌體染色體DNA作PCR擴增模板。
(2)引物參見Tummum et al報道的CagA核苷酸序列(Infection and Immunity61(5)1799-1809 1993)(參見圖1)，選用圖中核苷酸2229-3018bp序列及根據(jù)載體酶切點的序列設(shè)計引物，使插入目的DNA表達(dá)符合讀格。圖2中條1為誘導(dǎo)前細(xì)胞電泳圖譜，條2為IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞電泳圖譜，條3為純化蛋白電泳圖譜，條4為標(biāo)準(zhǔn)分子量(MW＝29000)電泳圖譜。
(3)擴增反應(yīng)在0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合，其中滅菌水30μl10X擴增緩沖液 10μl4種dNTP混合物，每種濃度1.25m mol/L16μl引物1(溶于5μl水)100p mol引物2(溶于5μl水)100p mol模板DNA1ug加水至終體積100μl其中10X擴增緩沖液500m mol/LKCl100m mol/LTris.HCl(PH8.3室溫)15m mol/LMgCl20.1％明膠(4)擴增參數(shù)上述混合液在94℃加熱5分鐘，加入2u Taq聚合酶，用100μl液體石蠟復(fù)蓋反應(yīng)混合液上，然后按以下參數(shù)進(jìn)行擴增循環(huán)變性退火聚合首輪循環(huán) 94℃5分鐘50℃2分鐘 72℃3分鐘后續(xù)循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃3分鐘末輪循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃10分鐘循環(huán)25～30次。
目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
4.CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，經(jīng)小量培養(yǎng)篩選表達(dá)率高的重組轉(zhuǎn)化子作為基因工程菌?；蚬こ叹?jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)CagA蛋白抗原。具體操作參見MolecularCloningA Laboratory Manual(Sambrook et al 1989)或Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel et al 1995)。
基因表達(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原，其分子量大小隨不同菌株而定，為27～38Kda。
CagA蛋白抗原的純化可根據(jù)載體的情況使用融合蛋白抗體、相應(yīng)抗體。親和層析柱或HPLC進(jìn)行，純化結(jié)果參見圖2。
本發(fā)明的基因工程表達(dá)CagA蛋白抗原1.本發(fā)明所采用的中國流行株為醫(yī)960818為經(jīng)國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637(14)(HP-CagA(+))及NCTC 12908(01)(HP-CagA(-))核對過為HP-CagA(+)株。
2.分別采用HP-CagA(+)的國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC 11637(14)和中國流行株醫(yī)960818染色體DNA為模板，自行設(shè)計產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌CagA基因片段引物，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增其編碼CagA蛋白抗原近C端基因片段作為插入片段。
3.采用表達(dá)載體[如PUR、PMR、PQE等表達(dá)載體]，按常規(guī)操作(見Molecular Cloninga Laboratory Manual(Sambrook et al 1989)或Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel et al 1995)將插入片段與載體多克隆酶切位點連結(jié)，使插入片段表達(dá)符合讀格，然后轉(zhuǎn)化至受體菌(如K12 71/18，JM103 XL1蘭、JM109、TG1、M15[pREP4]或SG 13009[pREP4]等大腸桿菌受體菌)中，并獲得表達(dá)率高的基因工程菌。
4.基因工程菌經(jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CagA蛋白抗原經(jīng)相應(yīng)的親和層析柱純化后獲得純化CagA蛋白抗原。
本發(fā)明的基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌免疫診斷試劑及試劑盒的制備，它包括檢測產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagA IgG、CagAIgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測試劑及試劑盒、血球凝集檢測試劑及試劑盒、螢光免疫檢測試劑及試劑盒、酶免疫檢測試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測試劑及試劑盒。
實施例產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測試劑盒的制備產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測試劑盒中，固相載體可包括聚苯乙烯板(孔)、聚苯乙烯珠、聚丙烯板(孔)等。酶可采用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、尿酶等。底物可根據(jù)不同酶標(biāo)記物選用相應(yīng)的底物。以下用聚苯乙烯板為固相載體，以辣根過氧化物酶制備酶標(biāo)結(jié)合物，用3，3’、5，5’四甲基聯(lián)苯胺為底物制備試劑盒。
產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測試劑盒包括產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA蛋白抗原)包被反應(yīng)板條一袋；抗人-IgG-HRP酶標(biāo)結(jié)合物一瓶；樣品稀釋液一瓶；產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體陰、陽性對照血清各一管；底物A液一瓶；底物B液一瓶；終止液一瓶；20倍濃縮洗滌液一瓶。
產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測試劑盒是非侵入型臨床診斷檢測幽門螺桿菌IgG抗體并能達(dá)到幽門螺桿菌(HP)分型目的的唯一方法，能特異性地檢出引發(fā)胃、十二指腸潰瘍和胃癌的產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌感染，將為我國在產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌的流行病研究、潰瘍病的實驗室檢測、潰瘍病治療療效考核及幽門螺桿菌疫苗的研制提供有效的工具。
實施例產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體金標(biāo)檢測試劑盒的制備產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體金標(biāo)檢測試劑盒中由于制備工藝的不同，可有滲濾金標(biāo)斑點法檢測試劑盒、免疫金標(biāo)層析試驗檢測試紙條等。下面描述滲濾金標(biāo)斑點法檢測試劑盒的制備方法。
該試劑盒包括滲濾法檢測塑料小盒20個，抗人IgG-金標(biāo)記溶液一瓶及洗滌液一瓶。
1.滲濾法檢測塑料小盒的制備濾膜制備(1)點樣在孔徑為0.22～0.45μ的濾膜上(可采用硝酸纖維素膜、醋酸-硝酸纖維素膜、尼龍膜及預(yù)活化濾膜等)，點樣一定濃度CagA純化蛋白抗原1～2μl作樣品檢測，另在距此2mm處點樣人IgG 0.5μl作為陰性對照用，待干。
(2)封膜將濾膜浸入含5％去脂奶粉的PBS液中封閉1小時取出待干。
(3)包裝將濾膜裝入滲濾檢測用塑料小盒中，濾膜下鋪有吸水紙墊。
2.抗人-IgG金標(biāo)記溶液的制備(1)在潔凈的硅烷化后的三角燒瓶中，加入雙蒸水1000ml，煮沸，然后加入1％檸檬酸三鈉10ml，煮沸。
(2)加入2％氯金酸5ml，搖勻，繼續(xù)煮沸20分鐘，顏色改變顯示膠體金形成，當(dāng)紅-紫紅色時膠體金顆粒大小在20-40nm，冷卻至室溫。
(3)加1％PEG 20,000 2ml以穩(wěn)定金溶膠，用0.1M K2CO3校正pH值至中性。
(4)在上述金溶膠中加入適量已透析去鹽的抗人IgG，混勻，放置10分鐘。
(5)用0.1M K2CO3校正pH值至中性，置室溫5分鐘。
(6)加入1％BSA封閉金溶膠。
(7)離心，13,500rpm離心1小時，棄上清液，收集金溶膠標(biāo)記物。
(8)加入含0.2％PEG 20,000-1％BSA溶液100ml。
(9)校正抗人IgG-金溶膠濃度使之檢測HP-CagA符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
(10)分裝抗人IgG-金溶膠。
3.洗滌液(1)配制0.1M Tris-HCl(pH8)-100mM NaCl-2％PEG4000-1％吐溫20-0.1％NaN3。
(2)分裝小瓶。
本發(fā)明的基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于疫苗的制備，包括口服疫苗和注射疫苗的制備。
實施例疫苗的制備本發(fā)明所制備的CagA蛋白抗原經(jīng)高度純化后可以用作疫苗免疫原，用來預(yù)防胃及十二指腸潰瘍或幽門螺桿菌感染的其它并發(fā)癥(如慢性胃炎、萎縮性胃炎、胃癌等)。
免疫劑量的決定可先按標(biāo)準(zhǔn)程序給予動物不同量的抗原并測定其抗體反應(yīng)情況。
疫苗中的成份還應(yīng)包括適當(dāng)?shù)淖魟?br> 給予疫苗的途徑可通過口服，也可通過注射。
由于疫苗為主動免疫過程，它對疾病的預(yù)防和治療都起作用，因此本發(fā)明對預(yù)防和治療幽門螺桿菌的感染及其引起的胃、十二指腸潰瘍等疾患是有效的方法。
本發(fā)明的基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防及治療中的制備應(yīng)用，制備包括單克隆抗體及多克隆抗體的CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物，用作特異性藥物使之與胃、十二指腸產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌結(jié)合，或作為保健品預(yù)防產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌侵入胃、十二指腸組織。
實施例制備CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物CagA抗體或CagA蛋白拮抗物能與產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌特異性結(jié)合，使產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌與宿主胃、十二指腸化生細(xì)胞的受體結(jié)合受到競爭性抑制，從而起到被動免疫的作用。
本發(fā)明所制備的CagA蛋白通過免疫動物制備的多克隆抗體或單克隆抗體，通過口服途徑使感染產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌病人達(dá)到治療目的，對未感染幽門螺桿菌健康人起到保健預(yù)防作用。
權(quán)利要求
1.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，在基因工程中質(zhì)粒的制備和純化、限制性內(nèi)切酶水解、酶切后DNA純化、DNA連結(jié)、連結(jié)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌、轉(zhuǎn)化子篩選，按一般常規(guī)操作或采用市售商品試劑及試劑盒進(jìn)行操作；其特征在于，首先選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的質(zhì)粒載體；在確定質(zhì)粒載體后，使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌，以獲得高表達(dá)率的基因工程菌；然后制備目的DNA以CagA陽性菌染色體DNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增目的DNA片段；(1)DNA模板采用國際CagA陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株證實的國內(nèi)外CagA陽性流行菌株的菌體染色體DNA作PCR擴增模板；(2)引物選用CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根據(jù)載體酶切點的序列設(shè)計引物，使插入目的DNA表達(dá)符合讀格；(3)擴增反應(yīng)在0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合，其中滅菌水30μl10X擴增緩沖液 10μ14種dNTP混合物，每種濃度1.25mmol/L16μl引物1(溶于5μl水)100pmol引物2(溶于5μl水)100pmol模板DNA1ug加水至終體積100μl其中10X擴增緩沖液500m mol/LKCl100m mol/LTris.HCl(PH8.3室溫)15m mol/LMgCl20.1％明膠(4)擴增參數(shù)上述混合液在94℃加熱5分鐘，加入2u Taq聚合酶，用100μl液體石蠟復(fù)蓋反應(yīng)混合液上，然后按以下參數(shù)進(jìn)行擴增循環(huán)變性退火聚合首輪循環(huán) 94℃5分鐘50℃2分鐘 72℃3分鐘后續(xù)循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃3分鐘末輪循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃10分鐘循環(huán)25～30次；目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌；最后進(jìn)行CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，經(jīng)小量培養(yǎng)篩選表達(dá)率高的重組轉(zhuǎn)化子作為基因工程菌，基因工程菌經(jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)CagA蛋白抗原；基因表達(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原，其分子量大小隨不同菌株而定，為27～38KdaCagA蛋白抗原的純化需根據(jù)載體的情況使用融合蛋白抗體、相應(yīng)抗體。親和層析柱或HPLC進(jìn)行。
2.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報中的制備應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌免疫診斷試劑及試劑盒的制備，它包括檢測產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagAIgG、CagA IgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測試劑及試劑盒、血球凝集檢測試劑及試劑盒、螢光免疫檢測試劑及試劑盒、酶免疫檢測試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測試劑及試劑盒。
3.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防中的制備應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于疫苗的制備，包括口服疫苗和注射疫苗的制備。
4.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防及治療中的制備應(yīng)用，其特征在于，制備包括單克隆抗體及多克隆抗體的CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物，用作特異性藥物使之與胃、十二指腸產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌結(jié)合，或作為保健品預(yù)防產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌侵入胃、十二指腸組織。
全文摘要
本發(fā)明首先選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的質(zhì)粒載體;在確定質(zhì)粒載體后,使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌,以獲得高表達(dá)率的基因工程菌;然后制備目的DNA;目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌;最后進(jìn)行CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化?；虮磉_(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原,其分子量大小隨不同菌株而定,為27～38Kda。本發(fā)明應(yīng)用于消化道疾病的診斷預(yù)報和預(yù)防治療的制備中,能為臨床消化道疾患的診斷及預(yù)報提供依據(jù)。
文檔編號C12N15/10GK1255545SQ9812205
公開日2000年6月7日 申請日期1998年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月30日
發(fā)明者郭春祥, 李建林, 郭錫瓊 申請人:上海晶瑩生物技術(shù)有限公司