專利名稱：一種新的抗異種移植抗原位點(diǎn)合成酶反義基因克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的異種移植抗原位點(diǎn)合成酶反義基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種梅山豬異種抗原位點(diǎn)合成酶(α(1，3)半乳糖苷基轉(zhuǎn)位酶)的外顯子大片段的反義基因克隆及其在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)的方法。
人體器官或細(xì)胞終末期衰竭性疾病通過器官或細(xì)胞移植可以得到治愈。用于移植的器官或細(xì)胞必須盡量減少其免疫原性和免疫反應(yīng)性。
八十年代，天然的未經(jīng)生物工程改造的異種器官雖然開創(chuàng)了一代器官移植先河，在世界上首先成功應(yīng)用與臨床心臟移植。但是，由于難于接受的異常劇烈的排斥反應(yīng)的發(fā)生，在臨床長期存活的移植醫(yī)學(xué)中，目前異種器官移植終被同種異體移植代替。然而，人類器官難以獲得，近緣異種動物器官更加難以獲得。用基因工程改造易繁易養(yǎng)的遠(yuǎn)緣異種動物獲取抗超急性排斥反應(yīng)的器官或細(xì)胞在臨床上有廣闊應(yīng)用前景。
1994年以來，已有學(xué)者獲得可用于醫(yī)用移植的重組人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白DAF基因轉(zhuǎn)基因動物，據(jù)稱可獲得抗排效果(G.A.Langford，et alProduction of pigs transgenic for human decay accelerating factor.Transplantation Proceedings 1994，26，3，1400-1401)。但是，目前尚未見臨床應(yīng)用獲滿意效果的研究成果的報告發(fā)表。從生物學(xué)原理看，這種生物工程轉(zhuǎn)基因動物的器官中異種抗原并未消除。這種方式僅僅對抗補(bǔ)體免疫效應(yīng)，補(bǔ)體殺傷以外的許多其它免疫排斥效應(yīng)無法消除。異種器官移植后人的免疫球蛋白與供體器官細(xì)胞表面不斷表達(dá)的異種移植抗原進(jìn)行識別和反應(yīng)后啟動了機(jī)體許多方面超急性反應(yīng)體系，例如凝血系統(tǒng)、激肽系統(tǒng)、炎癥介質(zhì)系統(tǒng)和免疫吞噬系統(tǒng)等，導(dǎo)致兇猛的超急性排斥反應(yīng)發(fā)生，使移植失敗。異種抗原不消除，難免對免疫識別和免疫反應(yīng)防范不全。
為消除移植后受體對異種器官的免疫識別和免疫反應(yīng)，可以用生物工程方法有效干預(yù)異種抗原表達(dá)。本發(fā)明提供一種DNA產(chǎn)品和方法可以有效達(dá)到這個目的。
在發(fā)現(xiàn)中國人-梅山豬之間異種血型表位上半乳糖是人抗豬IgM所針對的主要抗原決定族分子(張良平等用流式細(xì)胞儀觀察半乳糖對異種排斥免疫反應(yīng)的抑制作用。激光醫(yī)學(xué)1996年第6卷2期55-58。)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人發(fā)明了一種方法和產(chǎn)品用于消除供體器官的主要移植抗原的表達(dá)，從而獲得更有效的抗超急性排斥反應(yīng)醫(yī)用移植動物和細(xì)胞。
目前基因工程動物的異種抗原位點(diǎn)合成酶(α(1，3)半乳糖苷基轉(zhuǎn)位酶)基因克隆及其在哺乳動物細(xì)胞或體內(nèi)表達(dá)主要遵循以下方法1、編碼異種抗原位點(diǎn)合成酶DNA片段的獲取主要有兩種方法一種是提取血細(xì)胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫或提取DNA建基因組文庫，用特異引出物篩選克隆；另一種是用特異引物經(jīng)PCR從RNA或DNA擴(kuò)增得到該基因后再連接載體。2、構(gòu)造反義基因常用各種在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)能有組成性表達(dá)做用的啟動子和增強(qiáng)子反向置于目的基因編碼區(qū)某片段的3’端，選用有效保護(hù)轉(zhuǎn)錄核酸的多聚腺苷信號置于目的基因的5’端。3、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的構(gòu)建重組質(zhì)粒用磷酸鈣、脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、電穿孔或顯微注射等方法導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞(包括受精卵或體內(nèi)或離體器官內(nèi))。
本發(fā)明質(zhì)?？捎糜谪i、羊、牛、猴、鼠等多種哺乳動物的細(xì)胞用于消除供體細(xì)胞和器官的主要移種抗原的表達(dá)。細(xì)胞或受精卵或器官轉(zhuǎn)基因后異種抗原表達(dá)缺陷。
本發(fā)明還提供一對正逆向引物，其DNA序列為與(agTL)上游和下游匹配的正向(aL84)和逆向引物(aL82)aL845’cgg gat ccg atacat tga gca tta ctt gga gga gtt ct；aL825′GCGTCGACGGCACAAT-TTAAAGTCAGATGTTATTTCTAACC3。
本發(fā)明還提供一種異種抗原位點(diǎn)合成酶基因片段DNA分子，707bp，第259位堿基為G，已發(fā)表的文獻(xiàn)(Sandrin-GS，McKenzie-IFGal alpha(1，3)Gal，the major xenoantigen(s)recognized in pig by human natural antibodies.Immuno Rcv1994，141169-90.)為T；本發(fā)明還提供一種新的肽片段及其應(yīng)用，包括用作免疫原生成單抗或抗原作檢測試劑或用作免疫耐受原用于移植受體獲得異種移植免疫耐受。
本發(fā)明還提供一種新的反義基因，其全序列為2550對堿基組成；本發(fā)明提供一種新的反義基因重組質(zhì)粒，其全序列為6375對堿基組成。該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化受精卵轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的異種抗原缺陷細(xì)胞株或轉(zhuǎn)基因動物?；蜃鳛楣┖擞糜谶M(jìn)行克隆動物的核移植，進(jìn)而生產(chǎn)供體細(xì)胞或器官中減免主要異種抗原表達(dá)的有效抗超急性排斥反應(yīng)醫(yī)用移植動物和細(xì)胞。本發(fā)明的質(zhì)粒有傳代穩(wěn)定，抑制效率高。
本發(fā)明還提供一種方法和產(chǎn)品用于消除供體器官的主要移植抗原的表達(dá)，從而生產(chǎn)更有效的抗超急性排斥反應(yīng)醫(yī)用移植動物和細(xì)胞。這些可幫助解決臨床異種移植的相容性。用于治療器官毀損或終末衰竭疾病。
使用本發(fā)明中的可在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)和篩選的含有反義異種抗原位點(diǎn)合成酶的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞或受精卵或作為供核用于進(jìn)行克隆動物的核移植，可產(chǎn)生供體細(xì)胞或器官中減免主要異種抗原表達(dá)的有效抗超急性排斥反應(yīng)醫(yī)用移植動物和細(xì)胞。
實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)是1、設(shè)計(jì)和合成引物，從新鮮血中提取中過梅山豬的外周血單個核細(xì)胞DNA，用上述引物、DNA、rTth DNA合成酶經(jīng)聚合酶鏈法案應(yīng)(PCR)合成和擴(kuò)增梅山豬的異種抗原位點(diǎn)合成酶(α(1，3)半乳糖苷基轉(zhuǎn)位酶)的外顯子大片段(αgal T)。酶切PCR產(chǎn)物，克隆到同酶切過的質(zhì)粒載體pGEM7Z，粘端連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)菌；經(jīng)篩選和限制性內(nèi)切酶鑒定，得到重組分子為pZagTL84。用Sp6引物引導(dǎo)測序分析；2、構(gòu)建反義agTL基因pCN84在agTL基因片段上游側(cè)翼反向構(gòu)筑SV40 polyA信號序列和新霉素選擇基因(表達(dá)G418抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，在下游側(cè)翼反向構(gòu)筑CMV啟動子序列和增強(qiáng)子序列及人造內(nèi)含子序列，用內(nèi)切酶鑒定插入方向正確，名為pCN84。其中反義agTL基因用T7引物引導(dǎo)測序分析正確。
3、豬成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)基因及選擇克隆用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)導(dǎo)線性反義agTL基因。用G418選擇陽性克隆細(xì)胞。提取陽性克隆的RNA，用T7引物與aL82進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測反義基因的轉(zhuǎn)錄效率；測定豬細(xì)胞轉(zhuǎn)基因后異種抗原表達(dá)缺陷。未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作對照組。FCM測定轉(zhuǎn)基因的豬成纖維細(xì)胞表面結(jié)合的人血清IgM試驗(yàn)、測定補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)、測定人血凝集反應(yīng)均證明該質(zhì)粒和方法可用于消除供體器官的主要移植抗原的表達(dá)。
4、羊、牛、鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)基因及選擇克隆同第3，磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)導(dǎo)線性反義agTL基因。用G418選擇陽性克隆細(xì)胞。測定羊、牛、鼠細(xì)胞轉(zhuǎn)基因后異種抗原表達(dá)缺陷。異種的該同源反義基因可以抑制其它哺乳動物同源該基因表達(dá)；反義αgal-T大片段轉(zhuǎn)基因后可以抑制異種移植超急性排斥反應(yīng)抗原表達(dá)。反義異種移植抗原基因的抗超急性排斥作用。這為異種細(xì)胞或器官移植提供了一個好模型。
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例一梅山豬α(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(αgal T)部分編碼序列的擴(kuò)增和測序DNA片段克隆(1)用Beckman Oligo1000M DNA Syntheesizer合成與αgal T外顯子大片段(agTL)上游和下游匹配的正向(aL84)和逆向引物(aL82)aL8484#5’cg-g gat ccg ata cat tga gca tta ctt ggagga gtt ct 38er；aL8282#5′-GC GTCGAC GGC ACA ATT TAA AGT CAGATG TTA TTT CTAACC3′41er；(2)用RT-PCR方法擴(kuò)增agTL用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)5ml梅山豬抗凝血淋巴細(xì)胞經(jīng)典方法[7]提取DNA后，用0.5mlTE溶解。取2μl加100pM引物，并加入2u rTth熱合成酶，在PE公司2400型PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)94℃，3分鐘變性；熱循環(huán)94℃，20秒，56℃20秒，72℃50秒共28次循環(huán)。(3)PCR產(chǎn)物克隆到JM109PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pGEM7Z用BamHI和SalI切成粘端后按文獻(xiàn)進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化限制性內(nèi)切酶鑒定[8]。得到克隆名為pZagTL84。(4)對插入片段agTL測序分析用Sp6引物引導(dǎo)，按熒光標(biāo)記雙脫氧末端終止法Kit(Perkin Elmer Co)說明書操作，上AppliedBiosystems 373 DNA Sequencer Sttretch自動測序儀測序。序列見表1。
表1.質(zhì)粒pZagTL84中的agTL插入片段DNA序列g(shù)atacattga gcattacttg gaggagttct taatatctgc aaatacatacttcatggttg gccacaaagt catctttaac atcatggtgg atgatatctccaggatgcct ttgatagagc tgggtcctct gcgttccttt aaagtgtttgagatcaagtc cgagaagagg tggcaagaca tcagcagtat gcgcatgaagaccatcgggg agcacatcct ggcccacatc cagcacgagg tggacttcctcttctgcatg gacgtggatc aggtcttcca aaacaacttt ggggtggagaccctgggcca gtcggtggct cagctacagg cctggtggta caaggcacatcctgacgagt tcacctacga gaggcggaag gagtccgcag cctacattccgtttggccag ggggattttt attaccacgc agccattttt gggggaacacccactcaggt tctaaacatc actcaggagt gcttcaaggg aatcctccaggacaaggaaa atgacataga agccgagtgg catgatgaaa gccatctaaacaagtatttc cttctcaaca aacccactaa aatcttatcc ccagaatactgctgggatta tcatataggc atgtctgtgg atattaggat tgtcaagatagcttggcaga aaaaagagta taatttggtt agaaataaca tctgactttaaattgtgcc
709對堿基來自模板。第683-685對為終止碼。
根據(jù)測定的DNA序列，推導(dǎo)出梅山豬異種抗原位點(diǎn)合成酶基因(α(1，3)半乳糖苷基轉(zhuǎn)位酶(α[1，3]galactosyl-transferase))羧基端的230個氨基酸序列，見表2.。
表2.梅山豬異種抗原位點(diǎn)合成酶基因(α(1，3)半乳糖苷基轉(zhuǎn)位酶(α[1，3]galactosyltransferase))羧基端的230個氨基酸序列YIEHYLEEFL ISANTYFMVG HKVIFNIMVD DISRMPLIEL GPLRSFKVFEIKSEKRWQDI SSMRMKTIGE HILAHIQHEV DFLFCMDVDQ VFQNNFGVETLGQSVAQLQA WWYKAHPDEF TYERRKESAA YIPFGQGDFY YMAAIGGTTPTQVLNITQEC FYGILQDYEN DIEAEWHDES HLNKYFLLNK PTKILSPEYCWDYHIGMSVD IRIVKIAWGK KEYNLVRNNI4、反義agTL基因的構(gòu)建(1)用BamHI切開pZagTL84質(zhì)粒，Klenow片段酶補(bǔ)平3’端。然后用Xbal切開。低溶點(diǎn)瓊脂糖回收721b插入片段。再連接進(jìn)入pTargetT載體的Nhel和EcoRV位點(diǎn)間。轉(zhuǎn)化JM109菌并篩選克隆，用內(nèi)切酶鑒定插入方向。得到質(zhì)粒名為pCN84；菌種名為JM109+pCN84；(2)克隆質(zhì)粒pCN84中反義agTL基因測序分析用T7引物引導(dǎo)。按上述方法用自動測序儀測序。其序列見表3.。質(zhì)粒pCN84DNA全序列見表4。
表3.質(zhì)粒pCN84中的反義編碼agTL基因插入片段DNA序列g(shù)ctagactcg acggcacaat ttaaagtcag atgttatttc taaccaaattatactctttt ttctgccaag ctatcttgac aatcctaata tccacagacatgcctatatg ataatcccag cagtattctg gggataagat tttagtgggtttgttgagaa ggaaatactt gtttagatgg ctttcatcat gccactcggcttctatgtca ttttccttgt cctggaggat tcccttgaag cactcctgagtgatgtttag aacctgagtg ggtgttcccc caaaaatggc tgcgtggtaataaaaatccc cctggccaaa cggaatgtag gctgcggact ccttccgcctctcgtaggtg aactcgtcag gatgtgcctt gtaccaccag gcctgtagctgagccaccga ctggcccagg gtctccaccc caaagttgtt ttggaagacctgatccacgt ccatgcagaa gaggaagtcc acctcgtgct ggatgtgggccaggatgtgc tccccgatgg tcttcatgcg catcatgctg atgtcttgccacctcttctc ggacttgatc tcaaacactt taaaggaacg cagaggacccagctctatca aaggcatcct ggagatatca tccaccatga tgtaaaagatgactttgtgg ccaaccatga agtatgtatt tgcagatatt aagaactcctccaagtaatg ctcaatgtat cggatcatct ttcccggggg taccgtcgactgcggccgcg aattccaagc ttga774對堿基。表4.含有反義異種抗原位點(diǎn)合成酶的質(zhì)粒pCN84全DNA序列共6375個堿基對。tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca100*atattggcta ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtacatttatattg gctcatgtcc aatatgaccg ccatgttggc attgattatt200gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccatatatggaggt ccgcgttaca taacttcgg taaatggccc gcctggctga300ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccatagtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac400ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccgccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca500gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattagtcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt600ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgtcaatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc700gtaacaactg cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtgtacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc800actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagtcagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt gactctctta900aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaaggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc 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gatgctcgtc aggggggcgg agcctatggaaaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgcttgcct6375*tttgctcaca tggctcgaca gatct
5、梅山豬成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)基因及選擇克隆用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)導(dǎo)線狀反義agTL基因質(zhì)粒純化的pCN84按1μg/μl加Scal內(nèi)切酶1°，在37℃的1倍緩沖液中切開，純化待用。
豬成纖維細(xì)胞培養(yǎng)將梅山豬麻醉后無菌切取皮下組織1×0.5×0.3cm。剪碎洗滌后培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，其中含20％小牛血清，培養(yǎng)于5％CO2、37℃環(huán)境。傳代3-5代后用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。用即時配制的磷酸鈣液0.5ml加入去培養(yǎng)液的豬成纖維細(xì)胞皿中，靜止20-30分鐘，再加5ml培養(yǎng)液培養(yǎng)48-60小時后測轉(zhuǎn)錄效率。以后用選擇培養(yǎng)液(500μg/ml G418)培養(yǎng)三天換一次液。10天后挑選單個陽性克隆轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶。6，測定細(xì)胞轉(zhuǎn)基因后反義基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和異種抗原表達(dá)缺陷提取陽性克隆的RNA，用T7引物與aL82進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測反義基因的轉(zhuǎn)錄效率取20μlRNA加100pM引物，并加入200MMLV逆轉(zhuǎn)錄合成酶，在PE公司2400型PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)42℃，15分，56℃15分。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl作模板，同上加樣到100μl進(jìn)行PCR反應(yīng)熱循環(huán)94℃3分充分變性后每循環(huán)94℃變性20秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒共28次循環(huán)。陽性克隆RT-PCR反應(yīng)陽性。FCM測定轉(zhuǎn)基因的豬成纖維細(xì)胞表面結(jié)合的人血清lgM試驗(yàn)胰蛋白酶消化散開的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用PBS洗滌三次，調(diào)節(jié)到106/ml濃度，加等量的人AB滅活血清，37℃反應(yīng)1小時，然后加FITC標(biāo)記的抗人IgM單抗(DAKO公司，滴度1∶100)4℃溫育30分后再用PBS洗滌三次，定容到600μl，用流式細(xì)胞儀(FACStar Plus)檢測(488nm，150mW)，與未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對照，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞熒光標(biāo)記率與空白相似，而未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞熒光標(biāo)記率高。測定證明該質(zhì)粒和方法可用于消除供體器官的主要移植抗原的表達(dá)。
圖表說明

圖1.質(zhì)粒pCN84的結(jié)構(gòu)示意圖pCN84質(zhì)粒結(jié)構(gòu)CMVe/p CMV增強(qiáng)子 1-659CMV啟動子 669-750內(nèi)含子 890-1022T7啟動子 1227-1251反向agIT 梅山豬agTL基因反義編碼區(qū) 1276-2034SV40pA 多聚腺苷酸加尾信號片段2140-2460NEO-r新酶素抗性基因2965-4286AMP-r氨芐青霉素抗性基因4683-5543ScaI4989
權(quán)利要求
1.一對正逆向引物，其特征為(1)DNA序列與(agTL)上游和下游匹配的正向(aL84)和逆向引物(aL82)aL8484#5’cgg gat ccg ata cat tga gca tta ctt gga gga gtt ctaL8282#5′GCGTCGACGGCACAATTTAAAGTCAGATGTTATTTCTAACC
2.一種異種抗原位點(diǎn)合成酶基因片段DNA分子(agTL)，其特征為(1)其全序列為gatacattga gcattacttg gaggagttct taatatctgc aaatacatacttcatggttg gccacaaagt catctttaac atcatggtgg atgatatctccaggatgcct ttgatagagc tgggtcctct gcgttccttt aaagtgtttgagatcaagtc cgagaagagg tggcaagaca tcagcagtat gcgcatgaagaccatcgggg agcacatcct ggcccacatc cagcacgagg tggacttcctcttctgcatg gacgtggatc aggtcttcca aaacaacttt ggggtggagaccctgggcca gtcggtggct cagctacagg cctggtggta caaggcacatcctgacgagt tcacctacga gaggcggaag gagtccgcag cctacattccgtttggccag ggggattttt attaccacgc agccattttt gggggaacacccactcaggt tctaaacatc actcaggagt gcttcaaggg aatcctccaggacaaggaaa atgacataga agccgagtgg catgatgaaa gccatctaaacaagtatttc cttctcaaca aacccactaa aatcttatcc ccagaatactgctgggatta tcatataggc atgtctgtgg atattaggat tgtcaagatagcttggcaga aaaaagagta taatttggtt agaaataaca tctgactttaaattgtgcc由709對堿基組成。第260位堿基為G，已發(fā)表的文獻(xiàn)為T；相應(yīng)的氨基酸殘基為Met即甲硫氨酸，已發(fā)表的文獻(xiàn)為Ile即異亮氨酸。
3.一種新的反義基因，其特征為(1)全序列為tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca100atattggcta ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtacatttatattg gctcatgtcc aatatgaccg ccatgttggc attgattatt200gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccatatatggaggt ccgcgttaca taacttcgg taaatggccc gcctggctga300ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccatagtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac400ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccgccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca500gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattagtcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt600ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgtcaatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc700gtaacaactg cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtgtacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc800actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagtcagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt gactctctta900aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaaggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac1000agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatccactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccagttca attacagctc1100ttaaaaattg gatctccatt cgccattcag gctgcgcaac tgctgggaaggacgatcaga gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaagggacg1200tggcaagcaa ggcgattaag ttgagttacg ccaggatttt cccagtcacgacgttgtaaa acgacggcca gagaattata atacgactca ctatagggcg1300aattcggatc cttgctagac tcgacggcac aatttaaagt cagatgttatttctaaccaa attatactct tttttctgcc aawctatctt gacaatccta1400atatccacag acatgcctat atgataatcc cagcagtatt ctggggataagattttagtg ggtttgttga gaaggaaata cttgtttaga tggctttcat1500catgccactc ggcttctatg tcattttcct tgtcctggag gattcccttgaagcactcct gagtgatgtt tagaacctga gtgggtgttc ccccaaaaat1600ggctgcgtgg taataaaaat ccccctggcc aaacggaatg taggctgcggactccttccg cctctcgtag gtgaactcgt caggatgtgc cttgtaccac1700caggcctgta gctgagccac cgactggccc agggtctcca ccccaaagttgttttggaag acctgatcca cgtccatgca gaagaggaag tccacctcgt1800gctggatgtg ggccaggatg tgctccccga tggtcttcat gcgcatcatgctgatgtctt gccacctctt ctcggacttg atctcaaaca ctttaaagga1900acgcagagga cccagctcta tcaaaggcat cctggagata tcatccaccatgatgtaaaa gatgactttg tggccaacca tgaagtatgt atttgcagat2000attaagaact cctccaagta atgctcaatg tatcggatca tctttcccgggggtaccgtc gactgcggcc gcgaattcca agcttgagta ttctatcgtg2100tcacctaaat aacttggcgt aatcatggtc atatctgttt cctgtgtgaaattgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag2200tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgttgcgcgatgct tccattttgt gagggttaat gcttcgagaa gacatgataa2300gatacattga tgagtttgga caaaccacaa caagaatgca gtgaaaaaaatgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat2400aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttcaggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac2500aaatgtggta aaatccgata aggatcgatt ccggagcctg aatggcgaat由2550對堿基組成。
4.一種新的反義基因重組質(zhì)粒，其特征為(1) 該質(zhì)粒由表1.的6370個堿基組成；(2) 該質(zhì)粒中的第1～2550個堿基為權(quán)利3中的DNA分子(3) 該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化哺乳動物受精卵或細(xì)胞，得到穩(wěn)定的異種抗原缺陷的細(xì)胞株或轉(zhuǎn)基因動物，或轉(zhuǎn)化細(xì)胞作為供核用于進(jìn)行克隆動物的核移植，進(jìn)而生產(chǎn)供體細(xì)胞或器官。該細(xì)胞或器官或動物體內(nèi)缺乏主要異種抗原表達(dá)。用于臨床能有效防止超急性排斥反應(yīng)。本發(fā)明的質(zhì)粒有傳代穩(wěn)定，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平高、對哺乳動物細(xì)胞的異種抗原位點(diǎn)合成酶基因(α(1，3)半乳糖苷基轉(zhuǎn)位酶(α[1，3]galactosyltransferase))抑制效率高的特點(diǎn)。
5.使用本發(fā)明的方法制備反義異種抗原位點(diǎn)合成酶基因；
6.使用本發(fā)明的方法制備反義異種抗原位點(diǎn)合成酶基因生產(chǎn)的細(xì)胞、器官(包栝所有哺乳動物的)和相應(yīng)產(chǎn)品。
7.第2條權(quán)力所述基因相對應(yīng)的肽片段及其應(yīng)用，包括用作免疫耐受原等。
全文摘要
一種有抗異種排斥反應(yīng)作用的反義基因克隆及其在哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化和篩選的方法。其特點(diǎn)是提取梅山豬DNA,經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增克隆編碼異種抗原位點(diǎn)合成酶基因片段反向連入載體,得到有可轉(zhuǎn)錄反義基因質(zhì)粒pCN84,用于動物細(xì)胞、受精卵或器官得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞株或轉(zhuǎn)基因器官、動物,或轉(zhuǎn)化細(xì)胞作核卵移植用于克隆動物,所得細(xì)胞或器官缺乏主要異種移植抗原,避免異種免疫識別和結(jié)合及免疫攻擊,有效對抗移植后超急性排斥反應(yīng)。
文檔編號C12N15/56GK1255550SQ9812205
公開日2000年6月7日 申請日期1998年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月30日
發(fā)明者張良平 申請人:張良平