專利名稱：煙草花葉病毒外殼蛋白三個突變體基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用蛋白質(zhì)工程方法。根據(jù)煙草花葉病毒TMV外殼蛋白的三維結構和病毒離子組裝的特點制備出TMV外殼蛋白基因突變體，這些突變體具有抗性強，且不會產(chǎn)生異源包被問題，還涉及將這些基因插入轉化載體。及將它用于生產(chǎn)對TMV抗病毒感染具有高抗轉基因植物。
現(xiàn)有技術煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus-TMV)，可以侵染50多科的上百種植物，并引起多種作物的病毒病，給農(nóng)業(yè)、園藝和經(jīng)濟作物造成嚴重的損失，煙草花葉病毒是植物病毒中研究最多的一個病毒，在形態(tài)、粒子結構、化學組成、組裝、重組，外殼蛋白亞基間、亞基與RNA之間的相互作用及基因組一級結構與功能、核酸復制和蛋白翻譯，病毒在細胞間運動，抗病毒基因工程等多方面為病毒學提供了一個非常經(jīng)典的例子。(一)基因組結構該病毒基因組由一單鏈正鏈RNA組成，分子量為2×106，由6395核苷酸組成?；蚪M結構于功能研究的較為清楚?；蚪M5′端第一個ORF可以編碼一個126kDa蛋白。試驗證明這個126kDa ORF的終止密碼子UAG可以被通讀，并編碼一個分子量更大的蛋白183kDa。這個通讀蛋白的最后5個密碼子與第三個ORF重疊。第三個ORF可以編碼一個分子量為30kDa的蛋白位于第三個終止密碼子下游兩個核苷酸處是第四個ORF的啟始密碼子，該ORF位于TMV基因組的RNA的3′端，可以編碼一個分子量為17.6kDa的病毒外殼蛋白，ORF3和4有TMV兩個亞基組分RNA編碼。TMV基因組RNA3′端非翻譯區(qū)可以折疊成一個類似tRNA的結構，能夠接收組氨酸。(二)外殼蛋白介導的抗病毒基因工程研究1986年Powell等首先利用CaMV35S啟動子在煙草中高水平表達了TMV外殼蛋白基因，當這些轉基因植物受到TMV-U1及相關成員攻擊時，表現(xiàn)出明顯的抗性。目前外殼蛋白介導的抗性在多種病毒于植物組合中得到廣泛的應用，如馬鈴薯，小麥，玉米，番茄，木瓜，苜蓿，等的抗病毒基因工程。外殼蛋白介導的抗性機理還不清楚，目前面臨的另一個更大的問題是利用外殼蛋白介導的抗性存在的潛在的異源包被問題，尤其是對那些在轉基因植物中表達這種蟲傳病毒的外殼蛋白基因如黃瓜花葉病毒CMV，馬鈴薯病毒PVX，馬鈴薯病毒Y PVY，大麥黃矮病毒BYDV，馬鈴薯卷葉病毒PLRV。這一問題已引起許多科學家關注，即如有A、B兩種較相近的病毒，例如A病毒是蟲傳病毒，B是非蟲傳病毒，如在植物中大量表達A病毒野生外殼蛋白，而B病毒正好侵染這些轉基因植物，那么就完全有可能A病毒外殼包被B病毒的核酸，所形成的雜合病毒就獲得了被蟲傳播的特性，B病毒就可以被蟲傳播。
發(fā)明目的為了利用外殼蛋白介導的抗性而避免出現(xiàn)異源包被問題，我們以TMV和煙草為模式病毒和植物，通過蛋白質(zhì)工程手段突變TMV外殼蛋白中一些與核酸結合的位點，加強外殼蛋白與核酸的結合，同時突變一些蛋白亞基間的相互作用位點達到突變后的突變體外殼蛋白形成的例子的穩(wěn)定性降低，他的侵染性將會減弱。在植物中大量表達這種突變體外殼蛋白基因，既干擾了病毒的裝配和復制，達到抗病毒的目的，又解決了異源包被的問題。
發(fā)明的優(yōu)點及效果本發(fā)明創(chuàng)立的新型基因工程方法獲得大量對TMV高抗性、經(jīng)濟價值高、抗病毒轉基因植物，又解決了異源包被問題，有廣泛的農(nóng)業(yè)利用價值。提供了三種含有TMV-U1的不同外殼蛋白突變體基因、花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子、以及花椰菜花葉病毒35S基因的多腺苷酸信號的植物轉化載體。
三種含有植物轉化載體的細菌細胞，它們均含有TMV-U1的不同外殼蛋白突變體基因、花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子、以及花椰菜花葉病毒35S基因的多腺苷酸信號。
三種含有TMV-U1的不同外殼蛋白突變體基因、花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子、以及花椰菜花葉病毒35S基因的多腺苷酸信號的轉化植物細胞。
三種含有轉化細胞的植物，轉化細胞中含有TMV-U1的不同外殼蛋白突變體基因、花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子、以及花椰菜花葉病毒35S基因的多腺苷酸信號。本發(fā)明的轉化植物包括煙草，茄科(辣椒、西紅柿等)的植物。
一種產(chǎn)生抗病毒植物的方法，包括繁殖三種表達TMV外殼蛋白突變體基因的植物。特別是產(chǎn)生茄科植物的方法。
發(fā)明的技術路線圖1-圖5用來表示本發(fā)明的構成。采用一些常規(guī)方法，圖示質(zhì)粒和DNA片段。
在實施本發(fā)明中所采用的大部分重組DNA的方法是該領域中專業(yè)人員所熟知的標準方法。酶是由商業(yè)來源得到的，并按照說明書建議的方式使用。各種試劑、緩沖劑和培養(yǎng)條件業(yè)都是該領域中的專業(yè)人員公知的。包括這些標準技術的一般參考資料有以下文獻T.Maniatis等(1982)，Molecular CloningA Laboratory Manual；Matthews(1991)，PlantVirology，Academic Press.
實施例1 TMV-U1 RNA的分離在煙草植物中繁殖煙草花葉病毒病毒株U1(TMV-U1)，并用Li等人(Journal ofPhytopathology 134121-132.1992)的方法分離RNA。
實施例2 TMV-U1外殼蛋白突變體基因的獲得1.首先選擇點突變的位點，選擇依據(jù)主要根據(jù)以下幾個原則(1)選擇在病毒粒子組裝中保守并且有重要作用的位點；(2)強化RNA于蛋白的結合；(3)減弱蛋白相鄰亞基之間某些位點的結合能力，如離子鍵、共價鍵、氫鍵轉變成δ-與δ+；(4)將空間結構小的殘基變成空間結構大的殘基，增加結合障礙等。2.分子設計(1)分子模型與分子設計在計算機圖形工作站分析，利用計算機模擬煙草花葉病毒外殼蛋白的三維結構，選擇合適的突變位點A.TMV外殼蛋白有很高比例的二級結構，50％的殘基形成α-螺旋，10％的殘基為β-片狀結構，此外還有數(shù)處的回轉結構(reverse turns)。B.外殼蛋白的N-端和C-端均暴露在離子的表面，除了C-末端的4個殘基外(aa155-158)，其他的殘基都形成了很有序的結構(Namba et al，1989)。C.外殼蛋白亞基之間及亞基與RNA的相互作用使得外殼蛋白緊密地堆積在病毒RNA周圍形成了完整的病毒顆，蛋白亞基于亞基、蛋白亞基與核酸的相互作用可歸為以下幾個方面a.磷酸基團與蛋白質(zhì)側鏈的靜電作用；b.堿基和蛋白之間的疏水作用；
c.RNA中，5碳糖(D-核糖)2位OH與蛋白質(zhì)的作用；d.相鄰亞基之間的相互作用。D.水分子在TMV結構中的作用Namba等(1989)研究結果表明水分子分布于外殼蛋白亞基表面，病毒粒子的內(nèi)表面以及亞基之間的界面，對穩(wěn)定病毒粒子也有作用。E.TMV外殼蛋白與它的RNA裝配是特異的，不與含有裝配啟始位點的任何DNA組裝，這種特異性可能是設計五碳糖2′-OH與蛋白的特異相互作用。正是由于這些相互作用形成了TMV穩(wěn)定的棒狀結構。另外，在分析煙草花葉病毒組不同成員外殼氨基酸序列的同源性時發(fā)現(xiàn)只有很少一部分氨基酸殘基是保守的，在這些保守殘基中主要有位于上述提到相互作用的位點，大約有1/3的位點是維持蛋白質(zhì)的疏水結構，通過不同的突變體可以得到對病毒結構的穩(wěn)定產(chǎn)生不同的影響。(2)利用設計引物、鏈式聚合酶擴增法得到突變體基因；A.根據(jù)計算機模擬的外殼蛋白三維結構數(shù)據(jù)以及TMV蛋白質(zhì)之間和蛋白與RNA之間的相互作用，我們設計了三個突變體，分別為M37Thr37-Arg(ACA→AGA)M42Thr42-Trp(ACT→TGG)M123Ser123-Glu(AGC→GAA)根據(jù)TMV外殼蛋白基因堿基序列(見圖1)，采用植物偏愛的密碼子，設計了三對突變體引物，分別為Thr42-Trppm42a 5′-ACAACAAGCTCGATGGGTCGTTCAAAGACA-3′pm42b 5′-TGTCTTTGAACGACCCATCGAGCTTGTTGT-3′Thr37-Argpm37a 5′-AAATCAGTTTCAAAGACAACAAGCTCGAAC-3′pm37b 5′-GTTCGAGCTTGTTGTCTTTGAAACTGATTT-3′Ser123-Glupm123a 5′-GGTGGCCATAAGGGAAGCGATAAATAATTT-3′pm123b 5′-AAATTATTTATCGCTTCCCTTATGGCCACC-3′B.根據(jù)基因工程方法我們設計了PCR-Directed突變法，采用了合適的條件，得到了突變體外殼蛋白基因。
試驗方法如下(PCR-Directed突變方法見附圖2)通過PCR方法得到突變CP基因后(見圖3)，用Klenow酶補平，插入pBS質(zhì)粒EcoRV位點。由于PCR方法在DNA擴增過程中，Taq聚合酶缺乏校正功能，因此可能引入錯配堿基。所以通過α互補篩選(藍白篩選)，通過電泳進行質(zhì)粒大小差異鑒定及酶切鑒定得到重組質(zhì)粒后，進行DNA序列測定(Sanger etal.1977)，篩選出含有正確突變基因的克隆。
實施例3 包含TMV外殼蛋白突變體基因的植物表達載體克隆的構建PCR-Directed突變法得到的基因克隆入克隆載體pT-vector(由Promega公司購得)采用雙脫氧法對序列測定，確定所得的突變體為目的突變體。
將突變體基因采用合適的限制性內(nèi)切酶(XhoI和BamHI)釋放出來，克隆入帶有35S啟動子的真核表達載體pE3(用XhoI和BglII兩種酶切開)中。經(jīng)過壯觀霉素篩選以及酶切鑒定后確認得到了真核表達質(zhì)粒pE3TMVm37，pE3TMVm42，pE3TMVm123(見圖4、5)。
實施例4 利用土壤農(nóng)桿菌將目的基因導入模式植物—煙草通過感受態(tài)法將三個突變體的表達質(zhì)粒轉化入農(nóng)桿菌LBA4404。采用Dot Blotting的方法對轉化的農(nóng)桿菌進行篩選，得到三個轉化菌株TMVm37，TMVm42，TMVm123。用組培無菌煙草葉片為材料，采用葉盤侵染法，用農(nóng)桿菌菌株分別轉化。通過組織培養(yǎng)得到轉基因植株；采用PCR法、卡那霉素篩選法得到植物愈傷組織，經(jīng)過誘導得到轉基因再生植株。


圖1煙草花葉病毒外殼蛋白突變體基因圖2 PCR-Directed的方法獲得外殼蛋白突變體基因圖3突變TMV-CP基因構建的主要步驟圖4植物表達載體pE3MCP的構建圖5植物表達載體pE3MCP示意圖
權利要求
1.一種制備具下列三種不同序列的煙草花葉病毒U1(TMV-U1)外殼基因突變體基因的方法(三個突變位點)1ATGTCTTACAGTATCACTAC TCCATCTCAG TTCGTGTTCT41 TGTCATCAGCGTGGGCCGAC CCAATAGAGT TAATTAATTTM3781 ATGTACTAATGCCTTAGGAA ATCAGTTTCA
M42121
GTCGTTCAAA GACAATTCAG TGAGGTGTGG161 AAACCTTCACCACAAGTAAC TGTTAGGTTC CCTGACAGTG201 ACTTTAAGGTGTACAGGTAC AATGCGGTAT TAGACCCGCT241 AGTCACAGCACTGTTAGGTG CATTCGACAC TAGAAATAGA281 ATAATAGAAGTTGAAAATCA GGCGAACCCC ACGACTGCCG321 AAACGTTAGATGCTACTCGT AGAGTAGACG ACGCAACGGTM123361 GGCCATAAGG
ATAATTTAAT AGTAGAATTG401 ATCAGAGGAACCGGATCTTA TAATCGGAGC TCTTTCGAGA441 GCTCTTCTGGTTTGGTTTGG ACCTCTGGTC CTGCAACTTG Atranslation＝″MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQ
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VVQRQFSEVWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQANPTTAETLDATRRVDDATVAIR
AINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWTSGPAT″*□所指為突變位點M37Thr37-Arg (ACA→AGA)M42Thr42-Trp (ACT→TGG)M123Scr123-Glu(AGC→GAA)該方法包括如下步驟提取分離TMV RNA，合成外殼蛋白的cDNA；計算機分析煙草花葉病毒的外殼蛋白三維結構，選擇合適的突變位點；合成三對帶有突變氨基酸密碼子的引物；通過PCR-Directed突變法獲得三個外殼蛋白突變體基因；
2.將突變體基因連接入克隆載體、植物表達載體，該方法包括以下步驟PCR-Directed突變法得到的基因克隆入克隆載體pT-vector，經(jīng)過序列測定，確定所得的突變體為目的突變體，可以進行下一步工作；將突變體基因采用合適的限制性內(nèi)切酶釋放出來，克隆入帶有CaMV35S啟動子的植物表達載體中，該載體另外至少含有一個多腺苷酸信號和一個植物可以表達的NPTII基因，從而使突變體外殼蛋白基因位于啟動子的上游和多腺苷酸信號下游；經(jīng)過鑒定后確認得到了真核表達質(zhì)粒pE3TMVm37，pE3TMVm42，pE3TMVm123；
3.制備植物轉化載體的細菌細胞的方法，該方法包括如下步驟按照權利要求2制備一個植物轉化載體；將該植物轉化載體轉移到土壤農(nóng)桿菌中；
4.制備含有突變體基因的轉化植物細胞的方法，該方法包括如下步驟按照權利要求3的方法制備含植物轉化載體的細菌細胞；將該植物轉化載體轉移到植物細胞中；
5.一種制備含TMV外殼蛋白突變體基因的轉基因植物的方法，該方法包括如下步驟按照權利要求4制備含突變體基因的轉化植物細胞；由該轉化植物再生植物；
6.一種制備病毒抗性植物的方法，該方法包括如下步驟按照權利要求5的方法制備轉基因植物；繁殖該轉基因植物。
全文摘要
利用計算機模擬TMV外殼蛋白結構選擇合適的氨基酸位點,采用蛋白質(zhì)工程方法使之突變?yōu)樗璧陌被?從而得到比表達野生型外殼蛋白基因更強的抗煙草花葉病毒植株,并且不會產(chǎn)生異源包被現(xiàn)象,有廣泛的農(nóng)業(yè)利用價值。本發(fā)明包括利用基因工程方法獲得新型的抗病毒植株的方法涉及分子設計、預測,定點突變位點的選擇,突變體的獲得,基因轉化,轉基因植物的再生及電鏡技術等,采用本發(fā)明可以得到大量對TMV高抗性、經(jīng)濟價值高的作物。
文檔編號C12N15/40GK1254757SQ9812511
公開日2000年5月31日 申請日期1998年11月24日 優(yōu)先權日1998年11月24日
發(fā)明者李毅, 陳章良, 周北雁, 李恩虎, 俞立 申請人:北京大學