專利名稱：電流型生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及生物傳感器；從傳感器結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，它涉及成夾心式電極的結(jié)構(gòu)；用該生物傳感器可直接測(cè)量全血等生物體液中的葡萄糖、膽固醇等生理重要成分。
測(cè)量生物體液如人或動(dòng)物血液，食品及飲料等物質(zhì)中的葡萄糖等含量非常重要。據(jù)此，一方面可以考察與這些指標(biāo)相關(guān)的人或動(dòng)物的健康情況，另一方面可考察出這些飲食供消費(fèi)時(shí)可能帶給人們的影響。所以，這類測(cè)量在醫(yī)學(xué)上或工業(yè)中都是很重要的。
電流型葡萄糖生物傳感器是一種達(dá)到快速分析人血，動(dòng)物血和其它生物體液中葡萄糖水平的工具，它已取得不同程度的成功。過(guò)去，這種分析方法利用單個(gè)氧化還原介體(以下簡(jiǎn)稱氧還介體或介體，redoxmediators)以及氧化酶與水解酶。例如Zhao等人(Biosenors &Bioelectronics，Vol.8，PP483-490，1993)利用四硫富瓦烯(TTF，Tetrathiafulvalene)溶于硅油中作為一種介體，并浸入石墨盤(pán)狀電極，將葡萄糖氧化酶(GOX)固定其上。Matthews等人(The Lancet，PP778-779，1987)敘述了利用二茂鐵(ferrocene)作介體在附積葡萄糖氧化酶的測(cè)試條上完成對(duì)葡萄糖的單次即用即棄式的測(cè)定。Cass等人的早期工作(Analytical Chemistry，Vol.56，PP 661-667，1984)亦介紹以二茂鐵作介體的電流型葡萄糖酶電極。Persson等人(Biosensors &Bioelectronics，Vol.8，PP 81-88，1993)描述在碳糊電極上利用NADH作電子轉(zhuǎn)移介體的電流型生物傳感器；Atanasov等人(Biosensors &Bioelectronics，Vol.7，PP361-365，1992)推薦用碳黑作載體，用二甲基二茂鐵或二茂鎳，或四氰二甲苯醌作介體的葡萄糖氧化酶電極。還可見(jiàn)Marcin Keviciene等人(Biosensors & Bioelectronics，Vol.8 PP 209-212，1993)利用亞鐵氰化物作的條型葡萄糖生物傳感器。
總的說(shuō)來(lái)，目前包括市售的葡萄糖生物傳感器在內(nèi)，已有數(shù)種測(cè)定葡萄糖的方法，但仍缺乏一種既簡(jiǎn)單、直接、又快速而準(zhǔn)確；響應(yīng)濃度范圍又寬、靈敏度又高、重現(xiàn)性又好、而且易于微型化又便宜生產(chǎn)的分析工具。市售的葡萄糖傳感器不能綜合上述所有特點(diǎn)。大型光度分析儀亦有其不足之處，比如價(jià)格昂貴，分析費(fèi)時(shí)。
再有，生物體液中測(cè)定膽固醇常常是很困難的，且有的樣品析前要作很費(fèi)時(shí)的予處理；其分析儀器十分昂貴，且使用流程復(fù)雜，需用標(biāo)準(zhǔn)液作逐次校正等。這在臨床測(cè)試時(shí)往往造成病患療程的后延。一般，從醫(yī)院抽血到得到分析結(jié)果至少需要24小時(shí)，有時(shí)甚至數(shù)日至一周。電流型膽固醇生物傳感器的研究曾有報(bào)導(dǎo)，例如Crumbliss等(Biosensors &Bioelectronics，Vol.8，PP 331-337，1993)利用玻碳電極上附積辣根過(guò)氧化物酶、膽固醇酯酶與膽固醇氧化酶(固定于海藻類植物的水膠上)作為敏感電極，氧化還原介體用的是二茂鐵或羧酸二茂鐵，參比電極是銀絲，全血或血清樣需予先作1∶25至1∶100的稀釋才能檢出。Tatsuma等人(Analytica Chimica Acta Vol.242，PP 85-89，1991)將辣根過(guò)氧化物酶與膽固醇氧化酶固定于氧化錫(IV)極表面之雙層內(nèi)作為分析膽固醇的敏感電極，參比電極為Ag/AgCl，在PH5.9的0.1M的檸檬酸緩沖液中，羧酸二茂鐵作為氧化還原介體，其最大響應(yīng)電流強(qiáng)度僅為20nA/cm2。Kajiya等人(Journal of Electroanalytical Chemistry，Vol.301，PP 155-164，1991)將膽固醇氧化酶及酯酶富集于聚吡咯膜內(nèi)，此膜內(nèi)還含有羧酸二茂鐵作為介體，參比電極為甘汞電極，其線性檢出范圍為0-0.5毫摩爾/升。
上述單介體系統(tǒng)僅能給出相當(dāng)窄的低濃度膽固醇線性檢出圍。一方面靈敏度極差，另一方面它又低于或大大低于人的血膽固醇生理濃度(正常人血膽固醇的濃度為5毫摩爾/升或以下，即≤200mg/dl)。一般人們罹患冠心病中度風(fēng)險(xiǎn)的全血膽固醇濃度為5-6毫摩爾/升，即200-240mg/dl，而罹患冠心病高風(fēng)險(xiǎn)的全血膽固醇濃度為高于6毫摩爾/升，即＞240mg/dl。商品膽固醇生物傳感器應(yīng)包括可直接檢測(cè)上述全血膽固醇的濃度范圍。
本實(shí)用新型專利的目的在于提供一種新型的生物傳感器，它使用了兩種介體，其反應(yīng)原理參見(jiàn)


圖1。它可直接、快速、準(zhǔn)確而靈敏、又廉價(jià)地測(cè)量血液等體液中的葡萄糖、膽固醇等物質(zhì)，而不需對(duì)測(cè)量液作特殊予處理。
本實(shí)用新型的電流型生物傳感器，它包括一片敏感電極和一片參比電極及一試劑條。其特征在于敏感電極導(dǎo)電層內(nèi)含有第一氧化還原介體；參比電極上有一個(gè)加樣區(qū)域；在試劑條中含有底物的氧化酶、過(guò)氧化物酶、第二氧化還原介體；另外還可含有至少一種表面活性物質(zhì)、至少一種穩(wěn)定劑及一種pH緩沖液。
將敏感電極的電導(dǎo)層和參比電極的電導(dǎo)層彼此面對(duì)面，中間夾一層已浸漬過(guò)酶混合物的干試劑條，由此敏感電極-試劑條和參比電極形成夾心結(jié)構(gòu)；將敏感電極的電導(dǎo)層和參比電極的電導(dǎo)層平行放置，其上放置試劑條，外加非導(dǎo)體保護(hù)蓋，由此形成電流型傳感器的肩并肩結(jié)構(gòu)。
本傳感器如遇需要，應(yīng)在加樣區(qū)域處另加紅細(xì)胞分離膜，將它置于試劑條上方，處于試劑條與參比電極之間。
本傳感器之第一氧化還原介體含在敏感電極導(dǎo)電層內(nèi)，它選自以下試劑二茂鐵離子或羧酸二茂鐵、四氰二甲苯醌、四硫富瓦烯、二茂鐵、二甲基二茂鐵、正甲吖啶、四硫并四苯、正甲吩嗪、氫醌或者它們彼此間的混合物。
本傳感器之第二氧化還原介體固定于試劑條中，它選自以下物質(zhì)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，鹽酸甲苯噻唑啉酮腙與二甲氨苯甲酸、鄰聯(lián)茴香胺、鄰甲苯胺、二氯苯酚磺酸脂與氨基非那腙、甲苯并噻唑啉酮腙和甲氧烯丙基苯酚、氨基安替比啉和甲氧萘酚、氨基安替比林與二甲苯胺、氨基安替比林與甲氧萘酚或它們之間的混合物；或無(wú)機(jī)與無(wú)機(jī)絡(luò)離子如CN-、Fe(CN)6-4、I-、Co(NH3)62+、Sn2+、S2-、Tl+，或它們之間的混合物。
本傳感器的表面活性物固定于試劑條中，它選自以下物質(zhì)Triton X-100、聚乙烯乙二醇、月桂硫酸鈉、月桂肌氨酸鈉、羥基丙烯甲基纖維素、四丙烯氧化二苯二硫酸鈉鹽、葵酰兩性羧丙酸酯、聚氧乙烯-2-十六烷醚、四甲葵炔二醇乙氧基化合物、辛酰正甲右旋葡萄糖胺鹽、癸酰正甲右旋葡萄糖胺鹽及其彼此的混合物。
本傳感器之穩(wěn)定劑固定于試劑條中，它自下列物質(zhì)中選出動(dòng)物膠、瓊脂、牛血清白蛋白、谷氨酸鹽、左旋精氨酸聚甲基乙烯馬來(lái)酐、甘露糖醇、阿拉伯樹(shù)膠、低粘度多肽甲基纖維素以及它們之間的混合物。
本傳感器之酸度緩沖劑可由下述物質(zhì)選出檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、正嗎啉代乙磺酸和它們彼此間的混合物。
本傳感器的敏感電極與參比電極均具有非導(dǎo)電體支撐體部件，該支撐體部件以及肩并肩式傳感器上保護(hù)膜蓋都是一種高分子聚合物，例如聚酯化物。
本傳感器中還可包括一全血分離膜，它位于試劑條與參比電極條間，并與兩者有良好的物理接觸，使之在加入全血樣品后有良好的導(dǎo)電性，該膜應(yīng)全部掩蓋住參比電極的加樣區(qū)域。
本傳感器之全血分離膜，它可以是聚砜膜或其上涂有MEGA8的膜、涂有諸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、動(dòng)物膠、乙基纖維或聚乙烯乙二醇硬脂酸鹽的聚碳酸酯膜；涂有諸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、藻酸、動(dòng)物膠、乙基纖維素或聚乙烯乙二醇單硬脂酸鹽的玻璃纖維膜等。
用本傳感器分析全血中底物濃度的全血樣測(cè)試法包括以下步驟1)，制備好該種傳感器。制備好下列部件敏感電極、參比電極、試劑條及全血分離膜，然后將其組裝成測(cè)試片；2)，將全血加到參比電極的加樣區(qū)域；3)，在敏感電極和參比電極之間加一恒定的負(fù)電壓；4)，測(cè)量敏感電極與參比電極之間通過(guò)的電流；5)，建立全血底物濃度對(duì)3)步驟所用電壓下產(chǎn)生電流間的校正關(guān)系曲線，并測(cè)得全血樣中底物(葡萄糖或膽固醇，或其他底物)的濃度。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1是本實(shí)用新型生物傳感器反應(yīng)原理示意圖；圖2是本實(shí)用新型生物傳感器的測(cè)量原理示意圖；圖3A是本實(shí)用新型三明治結(jié)構(gòu)生物傳感器的頂視圖；圖3B是圖3A該傳感器沿A-A軸看的橫截面圖；圖3C是圖3A該傳感器沿B-B軸看的橫截面圖；圖3D是圖3A該傳感器的部件分解圖；圖3E是本實(shí)用新型肩并肩式生物傳感器之頂視圖；圖3F是本實(shí)用新型肩并肩式生物傳感器沿C-C軸之橫截面圖；圖4是使用亞鐵氰化物作其第二氧化還原介體，DMF作第一氧化還原介體的葡萄糖傳感器的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)曲線(時(shí)間-響應(yīng)電流關(guān)系曲線)；圖5是使用亞鐵氰化物作其第二氧化還原介體，DMF作第一氧化還原介體的葡萄糖傳感器的校正曲線；圖6各種條件下的葡萄糖傳感器的性能比較；圖7是使用亞鐵氰化物作其第二氧化還原介體，DMF作第一氧化還原介體的總膽固醇傳感器的校正曲線；圖8是膽固醇生物傳感器與光度法對(duì)全血所測(cè)結(jié)果之相關(guān)性分析。本實(shí)用新型說(shuō)明書(shū)中使用的部份縮略語(yǔ)DMF二甲(基)二茂鐵TCNQ四氰二甲苯醌TTF四硫富瓦烯TMB四甲基聯(lián)苯胺MBTH-DMAB鹽酸甲苯并噻唑啉酮腙與二甲氨苯甲酸DBE二元酯類(作為稀釋劑)HQ氫醌Nc二茂鎳FCOOH羧酸二茂鐵NMP+正甲吩嗪NMA+正甲吖啶TTT四硫并四苯MEGA8辛酰正甲右旋葡萄糖胺鹽AAP氨基安替比林PVC聚氯乙烯GOX葡萄糖氧化酶HRP辣根過(guò)氧化物酶COX膽固醇氧化酶CEH膽固醇酯酶本實(shí)用新型生物傳感器是基于雙介體，雙或多酶氧化還原系統(tǒng)的電流型生物傳感器。這種生物傳感器具有高靈敏度，寬檢測(cè)范圍且能直接快速測(cè)量生物體液，例如全血、血清、血漿、汗、尿中的葡萄糖、膽固醇等；該傳感器測(cè)量準(zhǔn)確、所需樣品少(30ul或更少)、用時(shí)短、(30秒或60秒)，所施外加電壓為負(fù)值(例如-125mV)。第一氧還介體包含在敏感電極的電導(dǎo)層內(nèi)，而兩電極間所夾試劑層中含第二氧還介體。
這種生物傳感器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是敏感電極與參比電極系面對(duì)面的夾心式結(jié)構(gòu)。由于該結(jié)構(gòu)縮短了電極間矩離，從而提高了靈敏度。反應(yīng)及測(cè)量原理示意如
圖1、2。[術(shù)語(yǔ)“介體或氧還介體”的定義為它是能促進(jìn)氧化還原反應(yīng)中電子流動(dòng)的物質(zhì)，存在這類物質(zhì)時(shí)反應(yīng)可發(fā)生在更低電位下]。
敏感電極的電導(dǎo)層內(nèi)含第一氧還介體，這例如二甲二茂鐵(DMF)、二茂鐵離子、羧酸二茂鐵(FCOOH)、四氰二甲苯醌(TCNQ)、正甲吩嗪(NMP+)、二茂鎳(Nc)、四硫富瓦烯(TTF)、正甲吖啶(NMA+)、四硫并四苯(TTT)、氫醌(HQ)等；第二氧化還原介體含于試劑條內(nèi)，它可包含下列物質(zhì)A)各種可氧化化合物或混合物如各類有機(jī)染料諸如鹽酸甲苯并噻唑啉酮腙和二甲氨苯甲酸(MBTH-DMAB)、甲苯并噻唑啉酮腙和甲氧烯丙基苯酚(MOAP)、氨基安替比林(AAP)和二甲苯胺(DMA)，氨基安替比林和甲氧萘酚，四甲基聯(lián)苯胺、聯(lián)氮雙乙苯并噻唑磺酸酯、鄰二茴香胺(ODAD)、鄰甲苯胺(OTD)、聯(lián)苯胺、二氯苯酚磺酯與氨基非那腙等。
B)各種氧化還原化合物、離子與復(fù)合物如CN-、Fe(CN)6-4、I-、Co(NH3)62+、Sn2+、S2-、Tl+等。
此生物傳感器還可包含一種分離濾膜。它置于試劑條上方，能留住血紅細(xì)胞和其它較大顆粒體，僅讓血漿或血清通過(guò)而到達(dá)下面的試劑條，以消除它們可能對(duì)測(cè)量造成的干擾。
傳感器的工作電極與參比電極均是由聚酯膜非導(dǎo)電層上涂以能導(dǎo)電的涂層構(gòu)成。敏感電極的導(dǎo)電層如石墨層，而參比電極的導(dǎo)電層如Ag/AgCl，參比電極上開(kāi)一小孔，將此二電極面對(duì)面放置，中間夾一試劑條和分離膜，此分離膜應(yīng)接觸參比電極導(dǎo)電層如圖3D所示。而試劑條實(shí)際上是同時(shí)接觸此二電極。一是通過(guò)濾膜間接接觸，一是直接接觸，從而構(gòu)成三明治結(jié)構(gòu)。構(gòu)成三明治結(jié)構(gòu)以后，當(dāng)濾膜上方加入樣品，測(cè)試樣品應(yīng)可經(jīng)濾膜過(guò)濾紅細(xì)胞之類物質(zhì)而到達(dá)試劑條。測(cè)量經(jīng)30秒(測(cè)葡萄糖)或60秒(測(cè)膽固醇)反應(yīng)后兩電極間的電流值，從而達(dá)到測(cè)量其濃度的目的。
圖3A是本實(shí)用新型生物傳感器10的頂視圖。它具有面對(duì)面的夾心式結(jié)構(gòu)；圖3B是圖3A在A-A軸上的橫截面圖；圖3C是圖3A在B-B軸上的橫截面圖；圖3D是圖3A夾心式傳感器的部件分解圖；圖3E是本實(shí)用新型生物傳感器的頂視圖；它具有肩并肩的平行性結(jié)構(gòu)。圖3F是圖3E沿C-C軸向的橫截面圖(不包括全血分離膜)。全血分離膜38在傳感器中所處的位置示意如圖3D之38。全血分離膜可以從全血中濾除血紅細(xì)胞。如測(cè)葡萄糖，由于紅細(xì)胞不干擾測(cè)定，或樣品中無(wú)這類細(xì)胞，則此膜可以省去。在本生物傳感器10中一般包括敏感電極20，參比電極30和試劑條16。圖3A至圖3D的圖示中，敏感電極20有一間隙15分開(kāi)它們；突出部分18、19可作為電路接點(diǎn)，試劑條16夾于敏感電極20和參比電極30之間，它同時(shí)與敏感電極20之電導(dǎo)層22及參比電極30之電導(dǎo)層32接觸(如有分離膜38，則為間接接觸)。圖3D中，全血分離膜38插入?yún)⒈入姌O30及試劑條16之間，以過(guò)濾血樣中的紅血球，血樣是通過(guò)開(kāi)孔13進(jìn)入的。測(cè)量時(shí)，敏感電極30和參比電極20通過(guò)全血分離膜38保持電接觸，夾心式結(jié)構(gòu)可通過(guò)粘膠紙維持。墊片40可用來(lái)保持敏感電極20與參比電極30的物理分離，墊片40可以是任何非導(dǎo)電性膠紙，單面或雙面絕緣粘膠紙等。
本實(shí)用新型生物傳感器的另一種型式是敏感電極條20與參比電級(jí)條30肩并肩排列，其間有一個(gè)間隙縫，試劑條置于其上，由于它同時(shí)與兩電極接觸，由此構(gòu)成連接鹽橋，使兩電極導(dǎo)通。
在圖3F中，敏感電極20包括電導(dǎo)層22，實(shí)際是石墨粉均勻分散在一商品樹(shù)脂狀石墨膠汁內(nèi)，它涂飾一均勻薄層在非導(dǎo)體支撐膜12之上，膠汁內(nèi)還含第一氧化還原物質(zhì)；參比電極30包含電導(dǎo)層32。它與敏感電極間的間隙25，一般是0.5-2.5mm(毫米)寬，較佳寬度為0.8-1.5mm，以分開(kāi)電導(dǎo)性條22、23，這能產(chǎn)生較好的電極響應(yīng)。試劑條16置于其上，同時(shí)與兩電極的活性表面接觸而構(gòu)成鹽橋電子通路，非導(dǎo)電保護(hù)蓋11帶有一個(gè)開(kāi)孔42，露出試劑條16以加樣品。如作全血膽固醇，還需在試劑條與保護(hù)蓋間加入血紅細(xì)胞分離膜。保護(hù)蓋應(yīng)是非導(dǎo)體作成，材料可與支撐基膜12相似。
生物傳感器也可組裝成別的形式。當(dāng)然電極20與電極30肩并肩，并處于同一基膜之上時(shí)(如圖3E、3F所示)，是較易組裝制備的。而三明治夾心結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)圖3D)由于縮短了兩電極間的距離，極大地增加其靈敏度，故是本說(shuō)明書(shū)所推薦的。
敏感電極20包括非導(dǎo)電支持部分12以及其上的導(dǎo)電層22，非導(dǎo)電支持體可以是典型的任何有粘著性的非導(dǎo)電體，如任何非導(dǎo)電性膜片，它由聚合物、陶瓷、玻璃、紙卡片等作成。非導(dǎo)電支持物推薦的厚度是0.13-0.33mm；非導(dǎo)電聚合物材料是特別推薦的，因?yàn)樗鼈兛煞奖愕厍懈畛珊线m大小的條狀膜或片。實(shí)際應(yīng)用中，非導(dǎo)電支持體12常是一種聚合物膜片，可以選用任何的聚合物膜片諸如聚氯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、乙酸乙酯共聚物、尼龍、聚丁烯對(duì)苯二酸酯、纖維素丙酸酯、乙烯/丙烯酸共聚物、聚丁二烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酰亞胺、丙烯酸纖維膜、聚氨基甲酸乙酯、聚苯乙烯、聚氟乙烯等。
敏感膜的導(dǎo)電層包含一氧化還原介體之導(dǎo)電層22，導(dǎo)電層可以是導(dǎo)電的碳或石墨、銅、銀、金、鉑、不銹鋼、鐵等或它們的混合物。我們推薦一種含有聚合物材料的石墨汁，例如它由ERCON公司或ACHESONColloids公司生產(chǎn)的，它可以均勻的涂飾在非導(dǎo)電的基膜上形成薄層，厚度約50-100um。這種導(dǎo)電層很容易摻入另外的石墨粉和氧化還原介體。
可摻入導(dǎo)電層之氧化還原介體包括DMF、FCOOH、TCNQ、TTF、Nc、NMA+、NMP+、TTT、HQ等或者它們的混合物。我們推薦TTF或DMF作為第一氧化還原介體，因?yàn)樗梢越o出相當(dāng)容易檢測(cè)到的電流變化。與第二介體結(jié)合使用時(shí)，當(dāng)被測(cè)物濃度發(fā)生變化時(shí)，電導(dǎo)層中第一氧化還原介體的適宜濃度，按導(dǎo)電層總重量計(jì)算，它們應(yīng)是0.2％至15％，而較佳濃度應(yīng)為1-9％之間，例一敘述了一種敏感電極20制造過(guò)程的實(shí)例。
參比電極30包括一非導(dǎo)電支撐基膜部件12，其上涂一電導(dǎo)層32，非電導(dǎo)支撐部件可以是一種典型的有附著力的非導(dǎo)體。諸如任何聚合物，陶瓷，玻璃，紙及卡片等，適宜的厚度也是0.13至0.33毫米。參比電極的非導(dǎo)電支撐體的材料選擇與敏感電極完全相同。
參比電極30的電導(dǎo)層32，由Ag/AgCl參比層均勻涂于非導(dǎo)電支撐聚酯膜上構(gòu)成，這種漿汁中含有某些粘著性樹(shù)脂，涂飾后在70℃的烘箱中烘干。也可以是石墨、銅、銀、金、鉑等電導(dǎo)層。
參比電極的另一型式也可用美國(guó)專利No.5401 377(1995)所敘述的電極或特殊工藝標(biāo)準(zhǔn)的甘汞電極作參比。然而基于導(dǎo)電層涂于非導(dǎo)電基膜上的方便方法所作成的參比電極是我們所推薦的。例一說(shuō)明用此法制作這樣的參比電極30的過(guò)程。
試劑條16包括了一種多孔載體(紙或者薄膜)，它承載了一個(gè)酶系統(tǒng)和第二氧化還原介體。對(duì)載體條來(lái)說(shuō)其多孔性或纖維性，能容易地吸收水分是最適宜的。制作時(shí)，它們可浸入含酶系統(tǒng)和氧化還原物質(zhì)的水溶液，測(cè)量時(shí)亦易于吸收含葡萄糖等的溶液樣品。任何能吸收水分的多孔性載體都可作為載體膜。無(wú)論是纖維素或纖維與非纖維素的混合物。只要它們能浸漬酶混合物、第二氧化還原化合物、表面活性劑等。
然而能吸收水分的多孔材料如典型的膜和紙類等組成的載體條，對(duì)底物濃度有線性的電流響應(yīng)相關(guān)關(guān)系，以及較高的靈敏感與重現(xiàn)性，這類吸水物質(zhì)如聚酯類吸水膜或吸水紙等，它包括一個(gè)能吸收水分的載體小條16，能浸上酶系統(tǒng)和氧化還原化合物。試劑條的制備法為浸漬法即將載體膜浸入酶、緩沖劑與相伴試劑的混合溶液中一段時(shí)間，然后取出烘干即可。
某些化合物或幾種化合物的混合物均可作為第二氧化還原介體。它們是一些在HRP或相類似過(guò)氧化物酶的存在下被過(guò)氧化氫氧化的化合物。這些化合物可以是下列物質(zhì)如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，鹽酸甲苯并噻唑啉酮腙-二甲氨苯甲酸(MBTH-DMAB)，鄰聯(lián)茴香胺，聯(lián)苯胺及二氯苯酚磺酸酯-氨基非那腙等；各種氧化還原物質(zhì)，如亞鐵氰化鉀或者它們相互間的混合物。亞鐵氰化物及四甲基聯(lián)苯胺是我們推薦的第二氧還介體。隨著底物濃度在寬范圍內(nèi)變化時(shí)，它們可以產(chǎn)生相對(duì)大的電流變化。此酶系統(tǒng)與氧化還原物質(zhì)一般含量為水溶液混合物的0.1％至5％重量百分?jǐn)?shù)，而以0.2-2.5％較佳。試劑條16的浸液亦包括0.05％至8％的表面活性劑，較佳濃度為0.1-2.5％，諸如膽酸鈉、聚乙二醇、聚氧乙烯、硫酸月桂鈉、月桂肌氨酸鈉、羥丙甲基纖維素(商品名稱40-101級(jí))、四丙烯二苯醚二磺酸鈉、葵酸兩性羧基丙酸酯、聚氧乙烯十六烷基、四甲癸炔二醇乙氧基化合物或者其混合物等。推薦同時(shí)使用兩種表面活性物或可增加生物傳感器響應(yīng)的穩(wěn)定性。
試劑條16浸漬的組分還含有一種水溶性或水不溶性的物質(zhì)，稱為膠凝劑或稠化劑，它們是作為穩(wěn)定劑加入的，含量是所用試劑重量百分比的0.00005％至0.5％，推薦的濃度是0.0005-0.05％。這種稠化劑或膠凝劑可以是如下物質(zhì)，如動(dòng)物膠、牛血清白蛋白、谷氨酸、左旋精氨酸、聚甲乙烯基醚、順式聚丁烯二酐(平均分子約為41000)、甘露糖醇、阿拉伯樹(shù)膠、聚多酞、甲基纖維素和它們相互間的混合物。動(dòng)物膠、甘露糖醇和甲基纖維素以及它們之間的混合物是我們推薦的。然而，任何水溶液或能分散于水的稠化劑或膠凝劑均可以用到該載體條上。較佳含量和組分將使分析結(jié)果快速而且重現(xiàn)性好。試劑條16的另一組分是能保持pH4-8之間的緩沖劑。任何可在這一范圍保持其pH值而又不會(huì)干擾其生物傳感器中電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的緩沖劑均可應(yīng)用。例如，一般知道的如下緩沖劑檸檬酸鹽、丁二酸酯、三-羥基甲基氨基甲烷、磷酸鹽、2-正嗎啉代乙磺酸或者它們的混合物。
對(duì)葡萄糖傳感器而言，推薦檸檬酸緩沖液作為pH緩沖液，它可保持的pH緩沖范圍為4.5至5.5，這正是所需要的。每個(gè)測(cè)試條上含此緩沖液試劑濃度為0.001至0.05毫摩爾，但最好是處于0.002至0.02毫摩爾之間。對(duì)膽固醇生物傳感器而言，推薦磷酸鹽緩沖液，它可保持pH的緩沖范圍6.0-8.0，這正是所需要的；其較佳pH范圍為6.3-7.2，每一膽固醇傳感器上含磷酸鹽緩沖劑0.01-0.0008毫摩爾，最佳含量為0.005-0.0003毫摩爾之間。
本實(shí)用新型傳感器還可包括全血分離器件，它能用來(lái)分離血漿與紅血球，它們可以是商品膜，如PrimeCare膜(簡(jiǎn)寫(xiě)成PC)、Gelman Cytosep 1660膜、核微孔膜或由纖維素制造的其它膜。這些可以生成膜的纖維素有聚酰胺、聚砜類、纖維素衍生物、聚酯、聚乙烯醇以及其共聚物等。其制作工藝是將它們以溶液或熔鑄方式制作。任何能透過(guò)全血中的液體組分而保留血紅細(xì)胞者都可用作此目的。
除葡萄糖、膽固醇傳感器外，用同一原理可制備乳酸、葡萄糖蛋白、三酸甘油酯以及尿酸、氨基酸、乙醇、維生素C等的生物傳感器。制備時(shí)，需對(duì)酶試劑系統(tǒng)作相應(yīng)的適當(dāng)調(diào)整。例一，生物傳感器的制作A，制作敏感電極惰性基體支撐體上用聚合物基石墨汁，石墨粉及一種氧化還原介體來(lái)制作敏感電極。將足量石墨汁(如來(lái)自Ercon有限公司或Acheson Colloids公司)和石墨粉(如來(lái)自Fisher科學(xué)公司)混合，溶于適量有機(jī)溶劑中(如甲苯/乙醇1∶1混合物，甲苯和/或DBE的混合物)，后者與前者彼此互混得到一種具有恒定粘度以及可分散的稠度好，混合也好的石墨/DMF混合物，將其鋪在基膜上(例如PVC膜)，用鋼模刮刀刮平，其縫隙寬為52.4微米，在40℃的烘箱中烘干90分鐘，使其烘干得到凈厚為約17微米的石墨涂層B，制作參比電極Ag/AgCl汁鋪在基膜支撐體(如美國(guó)Mylar膜)上，使用不銹鋼質(zhì)刮刀，以25微米的縫寬制薄層，此參比涂層在70℃烘箱中烘1小時(shí)烘干，其干層厚約為15微米。
C，試劑條的制作對(duì)葡萄糖生物傳感器而言用能吸收水的纖維紙或纖維膜，浸漬一水溶液酶系統(tǒng)與含一氧還介體化合物等的混合物。浸漬液的組成是每毫升含800單位(IU/ml)GOX，80單位HRP，1％亞鐵氰化鉀，0.5％MEGA8，動(dòng)物膠0.0005％，0.4毫摩爾檸檬酸鹽緩沖劑，將40×80mm2的Whatman醫(yī)用紙浸入此液20分鐘，然后轉(zhuǎn)入尼龍網(wǎng)上在40度烘箱烘烤40分鐘，然后再重復(fù)一次上述操作，經(jīng)40度烘箱干燥至恒重。
對(duì)膽固醇生物傳感器而言2ml 0.01mM PH6.8的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含0.05毫克動(dòng)物膠，15毫克無(wú)水膽酸鈉，20毫克亞鐵氰化鉀，96單位膽固醇酯酶，240單位膽固醇氧化酶和48單位過(guò)氧化氫酶，將42×52mm2美國(guó)Whatman醫(yī)用紙浸入此液20分鐘后取出，置于尼龍網(wǎng)上于40℃時(shí)烘干40分鐘，然后再重復(fù)一次上述操作至恒重。同時(shí)，切成適當(dāng)大小(例如7×10mm2)備用。
D，全血分離膜的制作全血分離膜可通過(guò)一張聚砜膜(如荷蘭商品PrimeCare膜，PolySulfone Membrane)在0.2％MEGA8溶液中浸漬10小時(shí)，取出后烘干而制得。
E，制備全血分離膜的替代方法
將核微孔聚碳酸酯膜或美國(guó)Whatman玻璃纖維膜通過(guò)涂飾一層聚合物而達(dá)到改型。這些聚合物是聚乙烯吡啶烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、藻酸、動(dòng)物膠、乙基纖維素、聚乙烯甘醇硬酯酸等，其中聚乙烯吡啶烷酮與聚乙烯醇是較好的涂飾物。將膜浸漬在聚合物水溶液中過(guò)夜，然后烘干。其較佳濃度為0.1％至10％，最佳濃度范圍為0.2％-1.0％。由此法所得膜的有效孔徑大小范圍是1微米至10微米。
配件ABCD或E組裝成夾心式面對(duì)面的傳感器，示圖為3A至圖3D，它是另一種型式的傳感器。由于樣品非全血而無(wú)須分離紅血球，或由于紅細(xì)胞不干擾測(cè)定，則其全血分離膜38可省掉，因此可以僅將ABC組裝即可。如配件ABCD或E組裝成肩并肩式的傳感器，應(yīng)按示圖3E與圖3F組裝。例二，測(cè)量血清試樣中的血糖葡萄糖可用例一中所述的本發(fā)明生物傳感器進(jìn)行電流值測(cè)定，測(cè)定時(shí)施以-125mV的電壓，在規(guī)定的時(shí)間用手工或電子儀器去抓取數(shù)據(jù)(如用IEEE-488電子儀器)，此時(shí)間過(guò)程以加樣到生物傳感器開(kāi)始計(jì)算。樣品體積約為15至45微升，由酶氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流由電導(dǎo)儀表或微微安培計(jì)(皮安計(jì))來(lái)檢測(cè)，使用適合的儀器，此系統(tǒng)可在計(jì)測(cè)表上直接讀出葡萄糖濃度，檢出的線性范圍用四個(gè)不同濃度的商品葡萄糖血清標(biāo)液(如美國(guó)Verichem公司產(chǎn)品)來(lái)標(biāo)定，范圍從25-375毫克/分升(mg/dl)，從15秒到55秒都得到濃度響應(yīng)電流的線性關(guān)系，如圖4和圖5所示。例三，生物傳感器中存在單介體與雙介體時(shí)響應(yīng)性能上的差異使用如例一中所述的夾心結(jié)構(gòu)葡萄糖傳感器，敏感電極中第一介體為DMF，而試劑條中存在第二介體是亞鐵氰化鉀。使用血清葡萄糖樣品，觀察到25mg/dl至375mg/dl之間有一線性響應(yīng)曲線。另一方面，如果系統(tǒng)里僅存在DMF(敏感電極中)則對(duì)葡萄糖樣品的響應(yīng)值幾乎為零，系統(tǒng)中如無(wú)
HRP或也無(wú)COX，則其響應(yīng)靈敏度也極低，各響應(yīng)曲線均請(qǐng)參見(jiàn)圖6。
例四，雙介體三酶總膽固醇傳感器的一個(gè)特例在其外加電壓為-125毫伏，在試劑條內(nèi)第二介體為亞鐵氰化鉀，第一介體在石墨電極即敏感電極內(nèi)為二甲基二茂鐵(DMF)時(shí)，從其校正曲線可知本傳感器在0到400mg/dl濃度范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，其響應(yīng)靈敏度為1.07uA/10mg，測(cè)定可在一分鐘內(nèi)用一滴指血(≥25ul)完成(參見(jiàn)圖7)。
例五，用本法與光度法同時(shí)測(cè)全血結(jié)果的相關(guān)性分析對(duì)兩種方法測(cè)定全血膽固醇的分析結(jié)果作了統(tǒng)計(jì)分析，證明用本發(fā)明用后即棄式的傳感器及一手握型儀器所獲數(shù)據(jù)與大型儀器光度法(如Hitachi 7170A)的測(cè)試結(jié)果相當(dāng)一致(參見(jiàn)下列圖8及表1)，其相關(guān)系數(shù)(R)為0.995，彼此關(guān)系曲線的斜率為1.008。說(shuō)明此小型手握式儀器-傳感器測(cè)試法已與大型儀器測(cè)試法結(jié)果相當(dāng)。
表1，本法與光度法同時(shí)測(cè)量全血膽固醇含量結(jié)果的對(duì)比
例六，兩種傳感器結(jié)構(gòu)兩種靈敏度此例說(shuō)明比之于肩并肩結(jié)構(gòu)的傳感器(即敏感電極與參比電極彼比平行排列)，電流型傳感器以面對(duì)面夾心式結(jié)構(gòu)(即敏感電極的電導(dǎo)表面與參比電極的電導(dǎo)表面面對(duì)面，且中間夾一層試劑條)(如圖3A-D所示)可以提高其靈敏度。表2列出了此兩種電極的靈敏度。
表2，面對(duì)面夾心式結(jié)構(gòu)電流型傳感器對(duì)靈敏度的提高
由上表可見(jiàn)，面對(duì)面夾心結(jié)構(gòu)的電流型傳感器對(duì)其相應(yīng)肩并肩結(jié)構(gòu)電流型傳感器來(lái)說(shuō)，其靈敏度都有明顯提高(大約3至8倍)。
本實(shí)用新型葡萄糖傳感器，它消除了樣品的稀釋與濃縮等予處理過(guò)程，可直接用來(lái)測(cè)量血糖40-400mg/dl(即2.2-22.2毫摩爾/升)濃度、甚至可直接用來(lái)測(cè)量尿糖含量，既可用作醫(yī)生臨床檢測(cè)的輔助工具，又能用作患者自測(cè)監(jiān)控。一次測(cè)量?jī)H需一滴血并在30秒內(nèi)完成。
本實(shí)用新型膽固醇生物傳感器，它可直接檢測(cè)90-350mg/dl(即2.4-10.4毫摩爾/升)全血膽固醇，檢測(cè)僅需一滴血，經(jīng)60秒鐘即可讀數(shù)，完成一次測(cè)定。由此可直接評(píng)估人們罹患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)程度。
本實(shí)用新型生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)是能直接測(cè)量全血，血清或者血漿中的葡萄糖或膽固醇的含量，無(wú)需樣品處理或稀釋，從而可評(píng)價(jià)糖尿病患者現(xiàn)時(shí)的血糖狀況或人們罹患冠心痛的風(fēng)險(xiǎn)程度。另一優(yōu)點(diǎn)是能夠隨處檢測(cè)與分析，如在家里、醫(yī)療診所和醫(yī)院。再一優(yōu)點(diǎn)是該生物傳感器成本低廉，用后即丟。
進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是由于外加電壓低而且是負(fù)值，故由此可大大減少干擾的可能性，實(shí)際上該傳感器消除了抗壞血酸干擾可能引致的錯(cuò)誤讀數(shù)；而且能在一分鐘或更少的時(shí)間里快速評(píng)價(jià)病患現(xiàn)時(shí)的狀態(tài)。這種測(cè)試簡(jiǎn)單、方便而且便宜。大夫、護(hù)士、病患本人以及病患者家人均能完成這類測(cè)定。
本實(shí)用新型生物傳感器可配一套測(cè)試器件包括電子器具等，以完成自動(dòng)計(jì)算或圖示出病患者現(xiàn)有的血糖等的狀態(tài)。
權(quán)利要求1，電流型生物傳感器，它包括敏感電極敏感電極包括一導(dǎo)電層，該導(dǎo)電層包含第一氧化還原介體；參比電極，它包括一導(dǎo)電層，該參比電極具有一加樣區(qū)域；一試劑條，該試劑條含有一載體條，它包含底物氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、第二氧化還原介體；或還可包括一全血分離膜，其特征在于將敏感電極的電導(dǎo)層和參比電極的電導(dǎo)層彼此面對(duì)面，中間夾一層已浸漬酶混合物的試劑條，由此敏感電極-試劑條和參比電極形成夾心結(jié)構(gòu)；或?qū)⒚舾须姌O的電導(dǎo)層和參比電極的電導(dǎo)層平行放置，其上放置試劑條，外加非導(dǎo)體保護(hù)蓋，由此形成電流型生物傳感器的肩并肩結(jié)構(gòu)。
2，權(quán)利要求1中的任一種傳感器，可包括一全血分離膜，將其置于試劑條與參比電極條間，并與它們有良好的物理接觸，使之在加入全血樣品后有良好的導(dǎo)電性，該膜應(yīng)全部掩蓋住參比電極之加樣區(qū)域。
3，權(quán)利要求1-2中的任一種傳感器，它的第一氧化還原介體含在敏感電極導(dǎo)電層內(nèi)，第一氧還介體選自二茂鐵離子或羧酸二茂鐵、四氰二甲苯醌、四硫富瓦烯、二茂鐵、二甲基二茂鐵、正甲吖啶、四硫并四苯、正甲吩嗪、氫醌或者它們彼此間的混合物。
4，權(quán)利要求1-2中的任一種傳感器，其第二氧化還原介體固定于試劑條中，它選自以下物質(zhì)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，鹽酸甲苯噻唑啉酮腙與二甲氨苯甲酸、鄰聯(lián)茴香胺、鄰甲苯胺、二氯苯酚磺酸脂與氨基非那腙、甲苯并噻唑啉酮腙和甲氧烯丙基苯酚、氨基安替比啉和甲氧萘酚、氨基安替比林與二甲苯胺、氨基安替比林與甲氧萘酚及它們之間的混合物；或無(wú)機(jī)或無(wú)機(jī)絡(luò)離子CN-、Fe(CN)6-4、I-、Co(NH3)62+、Sn2+、S2-、Tl+及它們之間的混合物。
5，權(quán)利要求1-2中的任一種傳感器，其表面活性物固定于試劑條中，它選自以下物質(zhì)Triton X-100、聚乙烯乙二醇、月桂硫酸鈉、月桂肌氨酸鈉、羥基丙烯甲基纖維素、四丙烯氧化二苯二硫酸鈉鹽、葵酰兩性羧丙酸酯、聚氧乙烯-2-十六烷醚、四甲葵炔二醇乙氧基化合物、辛酰正甲右旋葡萄糖胺鹽、癸酰正甲右旋葡萄糖胺鹽及其彼此的混合物。
6，權(quán)利要求1-2中的任一種傳感器，其中之穩(wěn)定劑固定于試劑條中，它可以從下列物質(zhì)中選擇動(dòng)物膠、瓊脂、牛血清白蛋白、谷氨酸鹽、左旋精氨酸聚甲基乙烯馬來(lái)酐、甘露糖醇、阿拉伯樹(shù)膠、低粘度多肽甲基纖維素、以及它們之間的混合物。
7，權(quán)利要求1-2中的任一種傳感器，其中的試劑條上還含有酸度緩沖劑，可由下述物質(zhì)選出檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、正嗎啉代乙磺酸和它們彼此間的混合物。
8，權(quán)利要求1-2中的任一種傳感器，其中敏感電極和參比電極均具有非導(dǎo)電體支撐體部件，該支撐體部件和肩并肩式傳感器上的保護(hù)膜蓋，都是一種高分子聚合物。
9，權(quán)利要求1-2中的傳感器，其中之全血分離膜是聚砜膜或其上涂有MEGA8、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、動(dòng)物膠、乙基纖維或聚乙烯乙二醇硬脂酸鹽的聚砜膜，或聚碳酸酯膜；涂有選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、藻酸、動(dòng)物膠、乙基纖維素或聚乙烯乙二醇單硬脂酸鹽的玻璃纖維膜。
專利摘要一種高靈敏度的雙介體基雙(或多)酶生物傳感器。傳感器是由敏感電極、試劑條、(或加紅血球過(guò)濾膜)和參比電極構(gòu)成。它是在一定外加電壓下進(jìn)行測(cè)量的。其中,敏感電極的導(dǎo)電層中含有第一介體,試劑載體條為多孔性纖維層,它浸有所需各種酶、第二介體以及分散劑、穩(wěn)定劑、pH緩沖劑。由這種組成并構(gòu)成夾心式結(jié)構(gòu)的傳感器是一類新型的,高靈敏度、高準(zhǔn)確性又能長(zhǎng)期穩(wěn)定的實(shí)用型生物傳感器。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK2372689SQ982449
公開(kāi)日2000年4月5日 申請(qǐng)日期1998年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月8日
發(fā)明者郭鼎力, 謝國(guó)雄, E·高德博格 申請(qǐng)人:美國(guó)生物醫(yī)學(xué)有限公司