專利名稱:頭孢菌素發(fā)酵生產(chǎn)的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
和背景本發(fā)明涉及了發(fā)酵生產(chǎn)的頭孢菌素類化合物的回收。
制備頭孢菌素類的半合成路線大都起始于發(fā)酵產(chǎn)物,如青霉素G、青霉素V和頭孢菌素C,它們被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的β-內(nèi)酰胺母核,例如K.Matsumoto,生物方法技術(shù)(Bioprocess Techn.),16,1993:67-88,J.G.Shewale和H.Sivaraman,生物化學(xué)方法(Process Biochemistry),8,1989:146-154,T.A.Savidge,工業(yè)抗生素生物技術(shù)(Biotechnologyof Industrial Antibiotics)(E.J.Vandamme編)Marcel Dekker,紐約,1984或J.G.Shewale等人,國(guó)際生物化學(xué)方法(Process BiochemistryInternational),6,1990:97-103等文獻(xiàn)中所公開(kāi)的一種方法。隨后獲得的β-內(nèi)酰胺母核通過(guò)偶聯(lián)一個(gè)合適的側(cè)鏈轉(zhuǎn)化成期望的抗生素,如在除了其它之外的EP0 339 751,JP-A-53005185和CH-A-640 240中所述。通過(guò)側(cè)鏈和β-內(nèi)酰胺母核的不同組合可以獲得各種青霉素類和頭孢菌素類抗生素。
已知7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(cephalosporanic acid)(7-ADCA)和7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是藥物工業(yè)中用于抗生素生產(chǎn)最重要的中間體。
例如通過(guò)將苯乙?;?7-ADCA進(jìn)行化學(xué)或酶裂解(去?;?成7-ADCA和苯乙酸而可以獲得7-ADCA。將形成自青霉素G的青霉素G亞砜進(jìn)行化學(xué)處理通??僧a(chǎn)生苯乙酰基-7-ADCA。在這個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中,需要大量化學(xué)物質(zhì)來(lái)保證發(fā)生期望的反應(yīng)。這不但昂貴而且廢物處理的負(fù)擔(dān)很重。此外,此方法的總產(chǎn)量沒(méi)有期望的那樣高。
為克服化學(xué)方法的一些缺點(diǎn),已公開(kāi)了一些用于制備7-ADCA和7-ACA的發(fā)酵方法,包括N-取代的β-內(nèi)酰胺類(如己二?;?7-ADCA或己二?;?7-ACA)的發(fā)酵生產(chǎn),其可由能表達(dá)一種去乙酸基頭孢烷酸合成酶(DAOCS)(也稱擴(kuò)環(huán)酶)的轉(zhuǎn)基因重組產(chǎn)黃青霉菌株進(jìn)行(EP0 532341,EP0 540 210,WO93/08287,WO95/04148,WO95/04149)。該擴(kuò)環(huán)酶可使特定的N-?;嗝雇樗?penicillanic acid)的五元環(huán)擴(kuò)張而由此產(chǎn)生相應(yīng)的N-?;ヒ宜峄^孢烷酸。
已知回收化學(xué)或酶方法制備的青霉烷酸和頭孢烷酸的方法對(duì)回收N-取代的β-內(nèi)酰胺中間體和去?;被?β-內(nèi)酰胺無(wú)效。上述發(fā)酵生產(chǎn)的N-取代的頭孢菌素化合物回收的主要問(wèn)題在于發(fā)酵培養(yǎng)基或培養(yǎng)基濾液的復(fù)雜性。培養(yǎng)基中通常含有各種青霉烷酸,如α-氨基己二?;?6-青霉烷酸、α-羥基己二?;?6-青霉烷酸、6-氨基青霉烷酸(6-APA),各種頭孢烷酸,包括α-氨基己二?;?和α-羥基己二?;?7-ADCA和很多蛋白類物質(zhì)。已知的回收方法就純度而言都不能獲得質(zhì)量可接受的頭孢烷酸產(chǎn)物。
在酶促去?;磻?yīng)中,這可導(dǎo)致一些問(wèn)題,如酶半衰期的縮短,較低的生物轉(zhuǎn)化率和生物轉(zhuǎn)化后較高的回收費(fèi)用和/或無(wú)法接受的污染物水平。而且,在去?;螅@種雜質(zhì)阻止或至少妨礙回收具有期望的特異性的去?;^孢菌素化合物的回收。
因此,已知青霉素類和頭孢菌素類的生產(chǎn)方法無(wú)法得到質(zhì)量可以接受的終產(chǎn)物終產(chǎn)物(如7-ADCA或7-ACA)含有無(wú)法接受的數(shù)量的青霉素成分(雜質(zhì))。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及了一種改進(jìn)的從產(chǎn)頭孢菌素微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中制備去?;?內(nèi)酰胺(如7-ADCA或7-ACA)的方法。
特別的,本發(fā)明公開(kāi)了一種改進(jìn)的用于制備7-氨基去?;娜绶肿邮?Ⅰ)的頭孢菌素類的方法,
其中R0是H或C1-3烷氧基;Y是CH2、O、S、或S的氧化形式;且R1是下述任何一個(gè)基團(tuán)H,羥基,鹵素,C1-3烷氧基,選擇性地取代的、選擇性地含有一個(gè)或多個(gè)雜原子、飽和或不飽和、直鏈或支鏈的C1-5烷基,優(yōu)選地為甲基,選擇性地取代的、選擇性地含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的C5-8環(huán)烷基,選擇性地取代的芳基或芳雜環(huán),或選擇性地取代的芐基,在一種側(cè)鏈前體物質(zhì)存在下對(duì)一種產(chǎn)頭孢菌素的微生物進(jìn)行發(fā)酵,將存在于發(fā)酵液或培養(yǎng)基中的N-取代的頭孢菌素化合物萃取到一種有機(jī)溶劑中,反萃取該N-取代的頭孢菌素化合物到水中,用一種二羧酸?;D(zhuǎn)移酶處理該水相,并從水相分離如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素化合物的結(jié)晶,其特征在于在用一種有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液或培養(yǎng)基之前或在進(jìn)一步反萃取處理之前,對(duì)發(fā)酵液或培養(yǎng)基或反萃取物在酸性和升溫的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
本方法的進(jìn)一步改進(jìn)在于對(duì)含有N-取代的頭孢菌素化合物的第一次有機(jī)溶劑萃取物用酸化水進(jìn)行洗滌,和/或用二氧化碳處理在本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)階段中產(chǎn)生的頭孢菌素水溶液,和/或在去酰基化頭孢菌素結(jié)晶之前將酶解釋放的側(cè)鏈物質(zhì)萃取到一種有機(jī)溶劑中。
本發(fā)明方法將產(chǎn)生比目前已知方法更好的總產(chǎn)量和產(chǎn)物質(zhì)量。
在本新穎的回收方法中,可從去?;^孢菌素化合物的N-?;瘜?duì)應(yīng)物獲得去?;^孢菌素化合物,例如從己二酰基-7-ADCA獲得7-ADCA,或從己二酰基-7-ACA獲得7-ACA,下述步驟將作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
可以從任何合適的發(fā)酵方法獲得發(fā)酵培養(yǎng)基,例如如上所述在一種合適的側(cè)鏈前體物質(zhì)存在時(shí)對(duì)產(chǎn)黃青霉菌株的發(fā)酵。
應(yīng)用任何合適的技術(shù)(如離心或過(guò)濾)從發(fā)酵培養(yǎng)基分離生物質(zhì),產(chǎn)生含頭孢菌素的發(fā)酵液。優(yōu)選地應(yīng)用過(guò)濾步驟以獲得該分離物。選擇性地洗滌殘余固體物質(zhì)。
產(chǎn)生N-取代的頭孢烷酸的障礙之一是存在一些非預(yù)期的雜質(zhì)性β-內(nèi)酰胺成分,特別是6-氨基頭孢烷酸(6-APA)、N-取代的6-APA或α-氨基己二酰基-7-ADCA。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,可以通過(guò)下述方法顯著減少污染性雜質(zhì)在酸性和升溫條件下對(duì)在本發(fā)明方法的任何階段產(chǎn)生的含N-取代的頭孢菌素化合物的水溶液進(jìn)行培養(yǎng)。應(yīng)用一種或多種已知酸(如硫酸、鹽酸或硝酸或它們的組合)對(duì)含N-取代的頭孢菌素化合物的水溶液進(jìn)行酸化處理,將其pH調(diào)至低于4,優(yōu)選地低于3。操作溫度范圍是20-140℃,優(yōu)選為60-80℃。在這些條件下停留時(shí)間的范圍從數(shù)天至數(shù)分鐘,優(yōu)選地少于60分鐘,更優(yōu)選地在1-30分鐘。
根據(jù)本發(fā)明上述培養(yǎng)步驟可應(yīng)用于發(fā)酵液或培養(yǎng)基或含N-取代的頭孢菌素的水反萃取物。優(yōu)選地,培養(yǎng)步驟應(yīng)用于發(fā)酵液或培養(yǎng)基。在對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行分離之前或之后都可進(jìn)一步采用該培養(yǎng)步驟。優(yōu)選地,在過(guò)濾之前進(jìn)行培養(yǎng)以有利于過(guò)濾。
通過(guò)酸化發(fā)酵液或培養(yǎng)基且隨后萃取N-取代的頭孢菌素化合物到一種有機(jī)溶劑中的方法,就可從水相,即發(fā)酵液或培養(yǎng)基中,分離出N-取代的頭孢菌素化合物。如果發(fā)酵液或培養(yǎng)基沒(méi)有在上述酸化和升溫條件下進(jìn)行培養(yǎng),則典型地酸化在pH低于4,優(yōu)選地低于3下進(jìn)行。為顯著地改善萃取效果,可往發(fā)酵液或培養(yǎng)基中加入一種合適的破乳化劑。
優(yōu)選地,有機(jī)溶劑選自乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、環(huán)己酮、異丁醇或正丁醇。
如上所述用一種有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取時(shí)對(duì)非預(yù)期的β-內(nèi)酰胺產(chǎn)物如α-氨基己二?;?7-ADCA和6-APA沒(méi)有令人滿意的選擇性。因此,在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,應(yīng)用一種洗滌方法來(lái)特異性除去這些化合物。洗滌方法的特征在于將有機(jī)溶劑萃取液和少量酸化水混合,隨后分相。酸化水典型地pH值低于4,優(yōu)選地低于3,更優(yōu)選地低于2。另外,兩相比例典型地在1∶1至1∶20之間(水∶有機(jī)溶劑),優(yōu)選地為1∶2(水∶有機(jī)溶劑)。
在常規(guī)方法中,可以用一種堿性溶液對(duì)有機(jī)相進(jìn)行萃取而將N-取代的頭孢菌素化合物反萃取到水中,獲得的水性反萃取物,其pH范圍為6-9之內(nèi)。典型地,所用兩相比例為1∶10(水∶有機(jī)溶劑)。該堿性溶液是一種含一種常規(guī)礦物堿,如NaOH或NH3的水溶液。
優(yōu)選地在一系列連續(xù)強(qiáng)力接觸萃取器中進(jìn)行萃取、洗滌和反萃取,例如該萃取器可以為一個(gè)強(qiáng)力混合器(如高剪切混合器)與一個(gè)離心分離儀的組合,優(yōu)選地,可以是2-8個(gè),更優(yōu)選地是3-6個(gè),最優(yōu)選地是4-5個(gè)。
在分相后,水相被選擇性地分開(kāi)以除去有機(jī)溶劑。
隨后,一種合適的二羧酸?;D(zhuǎn)移酶與水溶液接觸以使其中的N-取代的頭孢菌素化合物去酰基化。例如,可以從相應(yīng)的N-己二?;苌镄纬?-ADCA或7-ACA。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生二羧酸?;D(zhuǎn)移酶的微生物菌株為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes),節(jié)桿菌屬(Arthrobacter),無(wú)色桿菌屬(Achromobacter),曲霉屬(Aspergillus),不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。更特別地,下述種類的菌株可產(chǎn)生更合適的二羧酸?;D(zhuǎn)移酶木糖氧化無(wú)色桿菌(Achromobacter xylosooxidans),粘節(jié)桿菌(Arthrobacter viscosis),節(jié)桿菌CA128,芽孢桿菌CA78,巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC53667,蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus),側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)J1,擬青霉(Paecilomyces)C2106,缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta sp)N176,缺陷假單胞菌V22,少動(dòng)假單胞菌(Pseudomonas paucimobilis),缺陷假單胞菌BL072,假單胞菌菌株C427,假單胞菌SE83,假單胞菌SE495,卵狀假單胞菌(Pseudomonasovalis)ATCC950,叢毛單胞菌屬(Comamonas sp)SY77,假單胞菌GK16,假單胞菌SY-77-1,假單胞菌A14,泡囊假單胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965,丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae),惡臭假單胞菌(Ps putida)ATCC17390,銅綠假單胞菌(Ps aeroginosa)NCTC10701,普通變形菌(Proteus vulgaris)ATCC9634,脆弱假單胞菌(Ps fragi)DSM3881和枯草芽孢桿菌(B.Subtilus)IFO3025。
二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶可以任何合適的方法從產(chǎn)生其的微生物中獲得,例如在US4,774,179中對(duì)假單胞菌SE83菌株的描述。同樣,如SE83或SY77的二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶的基因可在不同的合適宿主中表達(dá),如大腸桿菌(E.coli),Matsuda等人在細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriology),1987,169:5818-5820中已對(duì)SE83菌株和在US5,457,032中已對(duì)SY77菌株作了報(bào)道。
分離自上述來(lái)源的酶通常被稱作戊二?;;D(zhuǎn)移酶。但是該酶的側(cè)鏈特異性并不局限于戊二?;鶄?cè)鏈,它還同時(shí)適用于較短和較長(zhǎng)的二羧基側(cè)鏈。一些二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶也表達(dá)出γ-谷氨?;D(zhuǎn)肽酶活性,所以有時(shí)這些酶被歸為γ-谷氨?;D(zhuǎn)肽酶。
二羧酸?;D(zhuǎn)移酶可以游離酶形式應(yīng)用,并且也可以任何合適的固定化形式應(yīng)用,如在EP0 222 462中所述。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)在酸性條件下結(jié)晶從該轉(zhuǎn)化液中分離得到去?;^孢菌素化合物,如7-ADCA或7-ACA。典型地,通過(guò)調(diào)整水溶液的pH值從水溶液中獲得去?;^孢菌素化合物結(jié)晶,水溶液pH值的調(diào)節(jié)是通過(guò)加入一種滴定劑使得水溶液的pH值達(dá)到范圍2.5-4.5之內(nèi),優(yōu)選地pH值為3-4。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,從一種水溶液中結(jié)晶去?;^孢菌素化合物是通過(guò)將該水溶液加入到一個(gè)結(jié)晶容器中,應(yīng)用一種合適的滴定劑使該結(jié)晶容器的pH值維持在固定的2.5-4.5的范圍之內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選地實(shí)施方案中,該結(jié)晶化可通過(guò)將水溶液加入到一系列互相連接的結(jié)晶容器中而逐步調(diào)整水溶液的pH值使終值在范圍2.5-4.5之內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn),即將水溶液加入到第一個(gè)結(jié)晶容器中,同時(shí)把第一個(gè)容器中的成分加入到第二個(gè)容器中,同時(shí)將第二個(gè)容器中的加入到第三個(gè)容器中,如此類推,其中應(yīng)用一種合適的滴定劑來(lái)控制互相連接的容器中pH值范圍,始于第一個(gè)器皿中的pH值與含去?;^孢菌素的水溶液的pH值相差約0.5-2個(gè)pH單位,而最后一個(gè)結(jié)晶容器的pH值終止在2.5-4.5范圍之內(nèi)。方便地,可應(yīng)用一系列2-6個(gè)互相連接的結(jié)晶容器來(lái)調(diào)整含去?;^孢菌素的水溶液的pH值到期望的終值。
例如,為了從轉(zhuǎn)化液中獲得去?;^孢菌素的結(jié)晶,可用一種滴定劑(其是一種如硫酸、鹽酸和/或硝酸的酸)應(yīng)用一系列3-4個(gè)互相連接的結(jié)晶容器來(lái)使其pH值范圍從8下降到3。
上述兩個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案優(yōu)選地以一種連續(xù)的方式來(lái)進(jìn)行。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,可在如下述步驟進(jìn)行的結(jié)晶化之前將轉(zhuǎn)化液中的側(cè)鏈、有色產(chǎn)物和痕量未轉(zhuǎn)化的化合物除去。
將轉(zhuǎn)化液酸化并與一種有機(jī)溶劑接觸,例如乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、環(huán)己酮、異丁醇或正丁醇,以在結(jié)晶化之前除去側(cè)鏈??捎靡环N酸,如硫酸,鹽酸或硝酸或其組合來(lái)進(jìn)行酸化處理,優(yōu)選地為硫酸,以調(diào)整pH值低于3,優(yōu)選地低于2。出人意料地,除了高效除去側(cè)鏈物質(zhì)之外,對(duì)有色雜質(zhì)也獲得了高效清除。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案,污染性青霉素成分,如兩性離子6-APA,其存在于本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)階段產(chǎn)生的含頭孢菌素的水溶液中(如發(fā)酵液或培養(yǎng)基、反萃取物、轉(zhuǎn)化液或含有如分子式(Ⅰ)所示溶于水的去酰基化頭孢菌素的溶液),通過(guò)用CO2接觸含青霉素雜質(zhì)的液體,典型地為pH5-7,可大大減少該污染成分。二氧化碳可以任何合適的形式通入到該溶液中,例如固體或氣體形式或碳酸離子溶液的形式。含頭孢菌素的水溶液在溫度為10-60℃時(shí)通入二氧化碳,優(yōu)選地為20-40℃時(shí),其中用二氧化碳分子飽和該溶液4-10小時(shí)。在減少青霉素成分后,可實(shí)現(xiàn)如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素化合物的純化。
在側(cè)鏈萃取到一種有機(jī)溶劑之后,去?;^孢菌素化合物可以數(shù)種方式從水相結(jié)晶析出,如從上述提到的從水溶液中結(jié)晶去?;^孢菌素化合物。
在一個(gè)優(yōu)選的操作方式中,水相的pH值被增加到2.5-5范圍之內(nèi),優(yōu)選地為3.5-4.5范圍之內(nèi),這可通過(guò)將含去?;^孢菌素化合物的溶液一步加入到一個(gè)維持在期望pH值的結(jié)晶容器中或加入到一系列2-6個(gè)互相連接的結(jié)晶容器中(pH范圍逐漸增加)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些方法可方便地以連續(xù)方式進(jìn)行。
通過(guò)過(guò)濾或離心分離結(jié)晶,并在常規(guī)的連續(xù)或分批式干燥器中干燥。
所有上述步驟,即萃取、洗滌、反萃取和結(jié)晶均可以分批模式或分批補(bǔ)料模式進(jìn)行,但因穩(wěn)定性原因,優(yōu)選的方法是連續(xù)模式。
下述實(shí)施例僅僅意在舉例,且無(wú)論如何也不能把它們看作是一種限制。
實(shí)施例1升己二?;?7-ADCA培養(yǎng)基樣品經(jīng)過(guò)過(guò)濾除去生物質(zhì)。用自來(lái)水洗滌菌絲體獲得終體積約為2升的濾液。
約2升濾液在40℃用250ml6N硫酸酸化至pH為1.5。加入酸化濾液體積2/3的正丁醇,在強(qiáng)力混合后分離。水相應(yīng)用正丁醇再這樣處理兩次。隨后用0.25升pH為2的酸化水洗滌合并的有機(jī)相。所得有機(jī)相再用245ml2N NaOH溶液在20℃進(jìn)行反萃取,待相分層后真空下將水相中痕量正丁醇除去。
135克水相在30℃時(shí)用去離子水稀釋到總體積為650ml,且和4NNaOH混合直至pH為8.5。加入50克固定化去?;?,在30℃,pH8.5條件下,加入了13.5ml4N NaOH兩個(gè)小時(shí)后,收集水相。濾液用3份125mlpH0.4的水飽和正丁醇進(jìn)行萃取。萃取過(guò)程中總共加入50.6ml37%的鹽酸。殘余水相用56.5ml8N NaOH中和,且用6N硫酸使pH降為5.3,便可從水相中獲得沒(méi)有正丁醇的結(jié)晶產(chǎn)物。5分鐘后,溶液pH進(jìn)一步降低到終值3.5??偣彩褂昧?5ml酸。過(guò)濾漿液且用50ml水洗滌結(jié)晶餅,干燥餅而獲得純度為96%的4.1克7-ADCA。
權(quán)利要求
1.一種如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素的制備方法,該頭孢菌素的7-氨基上已經(jīng)去?;?,
通過(guò)在一種側(cè)鏈前體物質(zhì)存在下,發(fā)酵一種產(chǎn)頭孢菌素的微生物,將存在于發(fā)酵液或培養(yǎng)基中的N-取代的頭孢菌素化合物萃取到一種有機(jī)溶劑中,將該N-取代的頭孢菌素化合物反萃取到水中,用一種二羧酸?;D(zhuǎn)移酶處理水相,且通過(guò)結(jié)晶將如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素化合物從如上所得的轉(zhuǎn)化液中分離出來(lái),其特征在于在用一種有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵液或培養(yǎng)基之前,或在進(jìn)一步反萃取處理之前,將發(fā)酵液或培養(yǎng)基或反萃取物在酸性和升溫的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1的方法,其中發(fā)酵液或培養(yǎng)基或反萃取物在pH低于4下培養(yǎng),優(yōu)選地低于3。
3.如權(quán)利要求1或2的方法,其中發(fā)酵液或培養(yǎng)基或反萃取物在20-140℃的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng),優(yōu)選地為60-80℃。
4.如權(quán)利要求2或3的方法,其中在酸性和升溫條件下的培養(yǎng)時(shí)間少于60分鐘。
5.如權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法,其進(jìn)一步特征在于在進(jìn)行反萃取之前,將含有N-取代的頭孢菌素化合物的有機(jī)溶劑萃取物用pH低于4優(yōu)選地低于3,更優(yōu)選地低于2的酸化水洗滌。
6.如權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的方法,其進(jìn)一步特征在于在如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素化合物結(jié)晶之前,存在于轉(zhuǎn)化液中的側(cè)鏈被萃取到一種有機(jī)溶劑中。
7.如權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法,其進(jìn)一步特征在于一個(gè)或多個(gè)階段中的含頭孢菌素的水溶液,如發(fā)酵液或培養(yǎng)基、反萃取物、轉(zhuǎn)化液或含如分子式(Ⅰ)所示的溶于水的頭孢菌素化合物溶液與二氧化碳接觸。
8.如權(quán)利要求7的方法,其中二氧化碳是固體或氣體形式或是一種碳酸根離子溶液。
9.如權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的方法,其中有機(jī)溶劑是乙酸戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、環(huán)己酮、異丁醇或正丁醇。
10.如權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的方法,其中通過(guò)將水溶液或水相加入到一種結(jié)晶容器中將如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素化合物從轉(zhuǎn)化液或水相中結(jié)晶,用一種合適的滴定劑使該結(jié)晶容器pH值保持在固定的2.5-4.5范圍之內(nèi)。
11.如權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的方法,其中通過(guò)將水溶液或水相加入到一系列互相連接的結(jié)晶容器中將如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素化合物從轉(zhuǎn)化液或水相中結(jié)晶,同時(shí)用一種合適的滴定劑來(lái)控制容器中的pH范圍,第一個(gè)容器中的起始pH值與6-APA溶液的pH值相差約0.5-2個(gè)pH單位,而最后一個(gè)結(jié)晶容器中最終pH值在范圍2.5-4.5之內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的制備7-氨基基團(tuán)去?;念^孢菌素的方法,通過(guò):在一種側(cè)鏈前體物質(zhì)存在下對(duì)一種產(chǎn)頭孢菌素微生物進(jìn)行發(fā)酵,萃取存在于發(fā)酵液或培養(yǎng)基中的N-取代的頭孢菌素化合物到一種有機(jī)溶劑中,反萃取該N-取代的頭孢菌素化合物到水中,用一種二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶處理該水相,從上述轉(zhuǎn)化液中分離如分子式(Ⅰ)所示的頭孢菌素化合物的結(jié)晶,其特征在于在將該N-取代的頭孢菌素化合物萃取到一種有機(jī)溶劑中之前,在酸性和升溫的條件下培養(yǎng)發(fā)酵液或培養(yǎng)基。本方法的進(jìn)一步改進(jìn)通過(guò)用酸化水洗滌第一次有機(jī)溶劑萃取物,和/或?qū)⒃搨?cè)鏈萃取到一種有機(jī)溶劑中,和/或用二氧化碳對(duì)在本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)階段中產(chǎn)生的頭孢菌素溶液進(jìn)行處理。
文檔編號(hào)C12P35/00GK1224470SQ98800521
公開(kāi)日1999年7月28日 申請(qǐng)日期1998年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月22日
發(fā)明者J·克里格斯曼, J·W·H·斯米特斯, H·E·A·德布拉爾, E·德弗魯姆, H·P·法瑟爾 申請(qǐng)人:吉斯特-布羅卡迪斯有限公司