專利名稱：磷酸二酯酶8a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說，本發(fā)明涉及命名為PDE8A的磷酸二酯酶的一個(gè)家族以及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷酸二酯酶(PDEs)水解3′，5′環(huán)核苷酸生成它們各自的5′單磷酸核苷酸。環(huán)核苷酸cAMP和cGMP分別由腺苷酰和鳥苷酰環(huán)化酶合成，并作為許多細(xì)胞信號(hào)通路中的第二信使。第二信使信號(hào)的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度是環(huán)核苷酸合成速率和分解速率的函數(shù)。
已鑒定了PDEs的各個(gè)家族。命名系統(tǒng)包括表示PDE家族的第一個(gè)數(shù)。到目前為止，已知7個(gè)家族(PDE1-7)，它們通過(i)一級(jí)結(jié)構(gòu)；(ii)底物優(yōu)選性；(iii)對(duì)不同調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)，(iv)對(duì)特異抑制劑的敏感性；和(v)調(diào)節(jié)方式來分類[Loughney和Ferguson，關(guān)于磷酸二酯酶抑制劑，Schudt，等(編輯)，學(xué)術(shù)出版社紐約，紐約(1996)pp.1-19]。表示家族的數(shù)后面是表示不同基因的大寫字母，大寫字母后面的第二個(gè)數(shù)，表示特異剪接變異體或使用獨(dú)特轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的特異轉(zhuǎn)錄子。
到目前已鑒定的所有哺乳PDEs的氨基酸序列。包括位于蛋白羧基端一半的大約270個(gè)氨基酸的高度保守區(qū)域[Charbonneau等，美國國家科學(xué)院院刊(美國)839308-9312(1986)]。保守結(jié)構(gòu)域包括cAMP和/或cGMP水解的催化位點(diǎn)和兩個(gè)推定的鋅結(jié)合位點(diǎn)以及家族特異的決定簇[Beavo，生理評(píng)論75725-748(1995)；Francis等，生物化學(xué)雜志26922477-22480(1994)]。各種PDEs的氨基端區(qū)域是高度可變的，包括其它家族特異決定簇例如(i)鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)(PDE1)；(ii)非催化環(huán)GMP結(jié)合位點(diǎn)(PDE2、PDE5、PDE6)；(iii)膜靶向位點(diǎn)(PDE4)；(iv)疏水的膜相關(guān)位點(diǎn)(PDE3)；和(v)對(duì)鈣調(diào)蛋白-依賴的激酶II(PDE1)、cAMP-依賴的激酶(PDE1、PDE3、PDE4)或者cGMP依賴的激酶(PDE5)的磷酸化位點(diǎn)[Beavo，生理評(píng)論75725-748(1995)；Manganiello等Arch.Biochem.Acta 3221-13(1995)；Conti等，生理評(píng)論75723-748(1995)]。
鈣-鈣調(diào)蛋白可以激活PDE1家族的許多成員。已鑒定三個(gè)基因PDE1A和PPE1B優(yōu)選水解cGMP而PDE1C已表明對(duì)cAMP和cGMP都有高度親和力。PDE2家庭特征是可以特異地由cGMP活化[Loughney和Ferguson，同上]。已經(jīng)鑒定只有一個(gè)基因，PDE2A，其酶產(chǎn)物可以由紅-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)特異抑制。PDE3家族中的酶類被cGMP特異性抑制。已知兩個(gè)基因，PDE3A和PDE3B，對(duì)cAMP和cGMP都有高度親和力，盡管對(duì)cGMP水解的Vmax足夠低，以至cGMP作為cAMP水解的競爭抑制劑。甲氰吡酮和依諾西酮 特異抑制PDE3酶[Loughney和Ferguson，同上]。PDE4家族影響cAMP水解，并包括4個(gè)基因，PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D，每一個(gè)都有多個(gè)剪接變異體?？?抑郁的藥環(huán)戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮特異抑制這個(gè)家族的成員。PDE5家族的成員在非催化位點(diǎn)結(jié)合cGMP，并優(yōu)先水解cGMP。只有一個(gè)基因，PDE5A得到鑒定。光感受器PDE6酶特異水解cGMP[Loughney和Ferguson，同上]。除了伴有三個(gè)較小蛋白以形成錐部的PDE的PDE6C，基因包括PDE6A和PDE6B(其蛋白產(chǎn)物二聚體化并結(jié)合兩拷貝的較小γ抑制亞單位以形成桿部的PDE。PDE7家族影響cAMP水解，但與PDE4家族相比較，不受環(huán)戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮抑制[Loughney和Ferguson，同上]。只有一個(gè)基因，PDE7A，已得到鑒定。
已知cAMP和cGMP在細(xì)胞內(nèi)第二信使信號(hào)中的重要性，因而本領(lǐng)域存在持續(xù)的需要以鑒定另外的PDE種類。至今PDEs未知家族以及其基因和剪接變異體的鑒定將提供另外的藥理學(xué)途徑，以治療環(huán)核苷酸途徑異常的病態(tài)以及在某些細(xì)胞類型中想要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP和/或cGMP水平的病態(tài)。
發(fā)明簡述簡而言之，本發(fā)明提供命名為PDE8的新PDE家族的多肽和其多核苷酸。本發(fā)明包括自然發(fā)生的和非自然發(fā)生的PDE8多核苷酸和其多肽產(chǎn)物。自然發(fā)生的PDE8產(chǎn)物包括PDE8家族內(nèi)的不同基因和多肽的種類(即PDE8A)；這些種類包括在相同動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的以及在其它動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的對(duì)應(yīng)種的同系物。在每一個(gè)PDE8種類中，發(fā)明進(jìn)一步提供由相同多核苷酸編碼的剪接變異體，但它們產(chǎn)生于不同的mRNA轉(zhuǎn)錄子(即PDE8A1和PDE8A2)。非自然發(fā)生的PDE8產(chǎn)物包括自然發(fā)生產(chǎn)物的變異體如類似物(即其中一個(gè)或更多個(gè)的氨基酸得到添加、置換或刪除)以及包括共價(jià)修飾(即融合蛋白、糖基化變異體、Met-1PDE8s、Met-2Lys-1-PDE8s、Gly-1PDE8s等等)的那些PDE8產(chǎn)物。PDE8家族不同于以前已知的PDE家族，對(duì)cAMP和cFMP的水解都表現(xiàn)高親和，但對(duì)其它家族特異的酶抑制劑有相對(duì)低的敏感性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如SEQ ID NO1中所陳述序列的多核苷酸。本發(fā)明也包括編碼如SEQ ID NO2中所陳述氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明目前優(yōu)選的多肽包括如SEQ ID NO2中所陳述的氨基酸序列。本發(fā)明提供兩個(gè)剪接變異體cDNA，它產(chǎn)生兩個(gè)命名為PDE8A1和PDE8A2的多肽。PDE8A1和PDE8A2多肽以及編碼多肽的多核苷酸，在此處作為本發(fā)明所包括的PDE8酶家族的代表討論。
本發(fā)明提供編碼人PDE8s的新純化和分離的多核苷酸(如DNA序列和包括其剪接變異體的RNA轉(zhuǎn)錄子、正義和互補(bǔ)反義鏈)。本發(fā)明的DNA序列包括基因組和cDNA序列以及全部或部分化學(xué)合成的DNA序列。如此處所用的“合成的”，在本領(lǐng)域理解為是指與酶學(xué)方法相反的用于合成多核苷酸的純化學(xué)方法?！叭俊焙铣傻腄NA序列因而完全由化學(xué)方法合成，而“部分”合成的DNAs包括那些其中只有部分DNA由化學(xué)方法合成。編碼人PDE8多肽的優(yōu)選DNA序列如SEQ IDNO1中所陳述。也優(yōu)選的是編碼SEQ ID NO2的PDE8多肽的多核苷酸以及SEQ ID NOS6和4中分別陳述的PDE8A1和PDE8A2的剪接變異體多肽。編碼PDE8A1和PDE8A2的優(yōu)選多核苷酸，分別在SEQ ID NOs5和3中陳述。本發(fā)明進(jìn)一步包括種，優(yōu)選人PDE8 DNA的哺乳類同系物。
本發(fā)明也包括在適度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NOs1、3和5中多核苷酸的非編碼鏈或互補(bǔ)雜交的編碼PDE8種的DNA序列。本發(fā)明考慮能雜交但遺傳密碼多余的編碼PDE8A多肽的DNA序列。典型的適度雜交條件如下在65℃、3×SSC、0.1％肌氨酰和20mM磷酸鈉pH6.8中雜交，并在65℃帶有0.1％SDS的2×SSC中洗滌。在本領(lǐng)域中應(yīng)該理解通過如Ausebel等(主編)，分子生物學(xué)方法，John Wiley&Sons(1994)；PP.6.0.3至6.4.10所描述的改變溫度和緩沖液或鹽濃度可以取得同嚴(yán)格的條件。
根據(jù)探針鳥嘌呤/胞嘧啶(GC)堿基對(duì)的長度和百分率可以經(jīng)驗(yàn)確定或精確計(jì)算修約雜交條件中。如Sambrook等(主編)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社冷泉港，紐約(1989)，pp.9.47至9.51所描述的可以計(jì)算雜交條件。
也提供自動(dòng)復(fù)制重組表達(dá)構(gòu)建物如帶有PDE8序列的質(zhì)粒和病毒DNA載體。也提供表達(dá)構(gòu)建物，其中PDE8-編碼多核苷酸與內(nèi)源或外源表達(dá)控制DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止子可操作性連接。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，也提供宿主細(xì)胞，包括用本發(fā)明的DNA序列以允許本發(fā)明PDE8多肽，穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)的方式的原核和真核細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞是免疫原有價(jià)值的來源用于發(fā)展特異地與PDE8免疫反應(yīng)的抗體。本發(fā)明的宿主細(xì)胞在大量合成PDE8多肽的方法中也明顯是有用的，其中細(xì)胞生長在合適的培養(yǎng)基中，所要的多肽產(chǎn)物從細(xì)胞或從細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中通過例如免疫親和純化來分離。
PDE8 DNA序列的知識(shí)允許修飾細(xì)胞從允許或增加內(nèi)源PDE8的表達(dá)。通過用全部或部分異源啟動(dòng)子全部或部分置換自然發(fā)生的PDE8啟動(dòng)子修飾細(xì)胞(如通過同源重組)以提供增高的PDE8表達(dá)，以便細(xì)胞在高水平表達(dá)PDE8。異源啟動(dòng)子以此方式插入以便它與PDE8編碼序列可操作連接。見例如PCT國際申請(qǐng)?zhí)朩O94/12650、PCT國際申請(qǐng)?zhí)朩O92/20808和PCT國際申請(qǐng)?zhí)?1/09955。本發(fā)明也考慮除了異源啟動(dòng)子DNA之外，可擴(kuò)增的標(biāo)記DNA(如編碼磷酸甲氨酰合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和氨甲酰天冬氨酸脫水酶的ada、dhfr和多功能CAD基因)和/或內(nèi)含子DNA也可以與異源啟動(dòng)子DNA一起插入。如果與PDE8編碼序列連接在一起，通過標(biāo)準(zhǔn)選擇方法的標(biāo)記DNA的擴(kuò)增會(huì)在細(xì)胞中產(chǎn)生PDE8編碼序列的共擴(kuò)增。
本發(fā)明提供的DNA序列信息也使得通過如同源重組或“敲除”策略[Capecchi，科學(xué)2441288-1292(1989)]發(fā)展成為可能，該策略是得到不能表達(dá)功能PDE8或表達(dá)PDE8變異體的動(dòng)物。這樣的動(dòng)物作為研究PDE8體內(nèi)活性和PDE8調(diào)節(jié)劑的模型是有用的。
本發(fā)明也提供純化的和分離的哺乳類PDE8多肽。目前優(yōu)選的PDE8A多肽陳述于SEQ ID NOs4和6中。最優(yōu)選的是含有陳述于SEQ ID NO2中的氨基酸序列的PDE8多肽。本發(fā)明的PDE8多肽可以從天然細(xì)胞來源中分離或化學(xué)合成，但優(yōu)選通過包括本發(fā)明宿主細(xì)胞的重組方法來合成。哺乳類宿主細(xì)胞的使用期望提供這些翻譯后修飾(如糖基化、截短、脂質(zhì)化和磷酸化)，需要這些修飾以便對(duì)本發(fā)明的重組表達(dá)產(chǎn)物賦于最佳生物活性。本發(fā)明的PDE8產(chǎn)物可以是全長多肽、生物活性片段或保留特異的PDE8生物活性的其變異體。變異體可以包括PDE8多肽類似物，其中刪除或置換一個(gè)或多個(gè)特異的(即自然編碼)的氨基酸，或者其中加入一個(gè)或多個(gè)非特異的氨基酸(1)不丟失對(duì)PDE8特異的一個(gè)或多個(gè)生物活性或免疫特征；或者(2)PDE特定生物活性的特異殘失。
本發(fā)明的變異體產(chǎn)物包括成熟的PDE8A產(chǎn)物，即其中去除前導(dǎo)或信號(hào)序列的PDE8產(chǎn)物，具有附加的氨基端殘基?？紤]在-1位具有附加甲硫氨酸殘基的PDE8產(chǎn)物(Met-1-PDE8)，以及在-2和-1位具有附加的甲硫氨酸和賴氨酸的PDE8產(chǎn)物(Met-2-Lys-1-PDE8)。這些類型的變異體，對(duì)在細(xì)菌細(xì)胞類型中重組蛋白合成尤其有用。
本發(fā)明也包括具有附加氨基酸殘基的PDE8變異體，這些氨基酸殘基產(chǎn)生于特異表達(dá)系統(tǒng)。例如使用商業(yè)可獲得載體表達(dá)所需要多肽如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合產(chǎn)物的所需多肽，該多肽在-1位具有附加甘氨酸殘基，結(jié)果能從所需多肽上切除GST成分。也考慮在其它載體系統(tǒng)中表達(dá)所產(chǎn)生的變異體。
本發(fā)明進(jìn)一步包括修飾以包括一個(gè)或多個(gè)水溶多聚體附著物的PDE8產(chǎn)物。尤其優(yōu)選的是和具有聚乙二醇(PEG)亞單位共價(jià)修飾的PDE8產(chǎn)物。水溶多聚體可以在特定位置如PDE8產(chǎn)物的氨基末端鍵合，或隨機(jī)附著在多肽的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈上。
本發(fā)明也包括抗體(如單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體等等)和對(duì)PDE8產(chǎn)物或其片段特異的其它結(jié)合蛋白。使用分離或重組的PDE8產(chǎn)物、PDE8變異體或表達(dá)這些產(chǎn)物的細(xì)胞發(fā)展特異結(jié)合蛋白。使用已知的免疫方法，結(jié)合蛋白對(duì)純化PDE8產(chǎn)物和在流體和組織樣品中檢測(cè)或定量PDE8產(chǎn)物是有用的。結(jié)合蛋白在調(diào)節(jié)(即阻斷、抑制或激活)PDE8的生物活性，尤其是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的那些活性是明顯有用的。也考慮對(duì)抗-PDE8抗體特異的抗-獨(dú)特型抗體。
通過本發(fā)明DNA和氨基酸序列的披露所貢獻(xiàn)的信息的科學(xué)價(jià)值是明顯的。鑒于一系列的實(shí)施例，PED8A cDNA序列的了解使得通過使用Southern雜交或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定編碼PDE8以及PDE8表達(dá)控制調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子、抑制子等等的基因組DNA序列成為可能。在適度至高度嚴(yán)格的條件下用本發(fā)明的DNA序列進(jìn)行的DNA/DNA雜交過程也預(yù)期允許分離編碼PDE8A等位變異體的DNAs，本領(lǐng)域已知等位變異體包括對(duì)PDE8A特異的一個(gè)或多個(gè)生物和/或免疫特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白。相似地，編碼與PDE8A同源蛋白的非人類種基因，也可以通過Southern和/或PCR分析得到鑒定。因?yàn)橐粋€(gè)可選擇的、互補(bǔ)研究對(duì)鑒定其它人PDE8產(chǎn)物以及享有一個(gè)或多個(gè)PDE8A生物特性的非人類蛋白和編碼蛋白的DNA是有用。
本發(fā)明的多核苷酸，在用以檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)PDE8能力的雜交實(shí)驗(yàn)中也是有用的。本發(fā)明的多核苷酸也是用于鑒定PDE8位點(diǎn)中遺傳改變的診斷方法的基礎(chǔ)，而PDE8位點(diǎn)中遺傳改變是造成疾病狀態(tài)的根本原因。
本發(fā)明也可以得到的是識(shí)別并與編碼PDE8的多核苷酸雜交的反義多核苷酸。提供全長和片段反義多核苷酸。反義多核苷酸通過表達(dá)PDE8mRNA的那些細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)PDE8的表達(dá)尤其相關(guān)。
本發(fā)明提供的DNA和氨基酸序列信息也使得系統(tǒng)分析PDE8s的結(jié)構(gòu)和功能成為可能。PDE8的DNA和氨基酸序列信息也允許鑒定與PDE8A相互作用的分子。通過將推定的調(diào)節(jié)劑與PDE8溫育并確定推定調(diào)節(jié)劑對(duì)PDE8磷酸二酯酶活性的影響可以鑒定調(diào)節(jié)(即增加、降低或阻斷)PDE8活性的藥劑。通過將它對(duì)PDE8的活性與它對(duì)其它PDE酶活性相比較，可以評(píng)估調(diào)節(jié)PDE8活性的化合物的選擇性。本發(fā)明考慮以細(xì)胞為基礎(chǔ)的方法，如雙雜交實(shí)驗(yàn)和斷裂雜交實(shí)驗(yàn)以及體外方法，包括固定多肽或它的結(jié)合伙伴的實(shí)驗(yàn)和溶液實(shí)驗(yàn)。
選擇性調(diào)節(jié)劑可以包括如抗體和其它與PDE8或PDE8核酸特異結(jié)合的蛋白或肽、與PDE8或PDE8核酸特異結(jié)合的寡核苷酸、以及與PDE8或編碼PDE8的核酸特異反應(yīng)的其它非肽化合物(如分離的或合成的有機(jī)分子)。本發(fā)明也考慮影響野生型PDE8酶活性或細(xì)胞定位的PDE8突變形式。目前用于發(fā)展選擇性調(diào)節(jié)劑的優(yōu)選目標(biāo)包括(1)和其它蛋白聯(lián)系和/或細(xì)胞內(nèi)定位PDE8的PDE8區(qū)域，(2)結(jié)合底物的PDE8區(qū)域，(3)PDE8的變構(gòu)環(huán)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，(4)PDE8的磷酸化位點(diǎn)和(5)參與PDE8亞單位多聚化的PDE8區(qū)域。PDE8活性的調(diào)節(jié)劑對(duì)治療已知PDE活性參與的廣泛的疾病和生理狀態(tài)是治療上有用的。
本發(fā)明進(jìn)一步考慮PDE8A酶活性的小分子調(diào)節(jié)劑。至少有三種不同類型的文庫用以鑒定小分子調(diào)節(jié)劑。這包括(1)化學(xué)制劑文庫、(2)天然產(chǎn)物文庫和(3)包含隨機(jī)肽、寡核苷酸或有機(jī)分子的組合文庫。
化學(xué)制劑文庫由已知化合物的結(jié)構(gòu)類似物或通過天然產(chǎn)物篩選鑒定為“hits”或“Leads”的化合物。天然產(chǎn)物文庫是微生物、動(dòng)物、植物或海洋生物的集合，它們通過(1)來自土壤、植物或海洋微生物的液體培養(yǎng)基發(fā)酵和提取或(2)植物或海洋生物的提取制造混合物用于篩選。組合文庫包括大量的肽、寡核苷酸或有機(jī)化合物作為混合物。通過傳統(tǒng)自動(dòng)合成方法、PCR、克隆或者專有的合成方法它們相對(duì)容易制備。尤其感興趣的是肽和寡核苷酸組合文庫。感興趣的其它文庫也包括肽、蛋白、肽模擬物、多平行、合成集合、重組的和多肽文庫。對(duì)從那里制的組合化學(xué)和文庫的評(píng)論，見Mysers，生物技術(shù)的現(xiàn)行評(píng)價(jià)8701-707(1997)。
通過使用在此描述的各種文庫調(diào)節(jié)劑的鑒定允許修飾候選的“hit”(或“Lead”)以最優(yōu)選“hit”調(diào)節(jié)活性的能力。
本發(fā)明進(jìn)一步提供方法以鑒定本發(fā)明PDE8A多肽的特異結(jié)合伙伴化合物，包括步驟a)在允許化合物和PDE8A多肽結(jié)合的條件下將PDE8A多肽與化合物接觸；b)檢測(cè)化合物與PDE8A多肽的結(jié)合；和c)鑒定化合物作為PDE8A多肽的特異結(jié)合伙伴。本發(fā)明的方法所鑒定的結(jié)合伙伴通過酶的抑制、活化或加強(qiáng)，優(yōu)選調(diào)節(jié)PDE8A酶活性。
本發(fā)明也提供方法以鑒定本發(fā)明PDE8A多核苷酸的特異結(jié)合伙伴化合物，該方法包括步驟a)在允許化合物和PDE8A多核苷酸結(jié)合的條件下，將PDE8A多核苷酸與化合物接觸；(2)檢測(cè)化合物與PDE8A多核苷酸的結(jié)合；和c)鑒定化合物作為PDE8A多核苷酸的特異結(jié)合伙伴。PDE8A多核苷酸的結(jié)合伙伴通過抑制表達(dá)或者加強(qiáng)表達(dá)。優(yōu)選調(diào)節(jié)PDE8A多核苷酸所編碼的PDE8A多肽的表達(dá)。
本發(fā)明也提供通過本發(fā)明的方法所鑒定的化合物以及包含所鑒定化合物和藥學(xué)可接受載體的組合物。
發(fā)明詳述通過涉及編碼PDE8多肽的多核苷酸的分離以及編碼多肽的表達(dá)和特征的下列實(shí)施例說明本發(fā)明。為了鑒定對(duì)分離本發(fā)明的DNAs潛在有用的探針，實(shí)施例1描述尋找表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫的方法。實(shí)施例2涉及PDE8A-編碼多核苷酸的鑒定。實(shí)施例3說明分離的多核苷酸的序列分析。實(shí)施例4描述PDE8A多核苷酸編碼的多肽的分析。實(shí)施例5說明重組的PDE8A多肽的表達(dá)。實(shí)施例6涉及PDE8A表達(dá)的Northern分析。實(shí)施例7說明編碼PDE8A的基因的染色體定位圖。實(shí)施例8描述證明PDE8A1和PDE8A2是剪接變異體。實(shí)施例9說明重組PDE8A的表達(dá)和特征。實(shí)施例10詳細(xì)說明抗-PDE8A單克隆抗體的合成。實(shí)施例11說明通過原位雜交分析PDE8A表達(dá)的。
實(shí)施例1與人PDE相關(guān)的EST的鑒定為了鑒定對(duì)新磷酸二酯酶(PDE)基因的鑒定潛在有用的cDNA片段，使用已知的人3′，5′環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的序列，進(jìn)行國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫的搜尋。這個(gè)數(shù)據(jù)庫包含代表從許多組織來源收集的cDNA一端或兩端的DNA序列。在cDNA的一端或兩端進(jìn)行單一序列測(cè)定，DNA序列的質(zhì)量變化巨大。此時(shí)進(jìn)行PDE搜尋，EST序列數(shù)據(jù)庫含有來自許多生物體的超過600000 cDNA序列。
新的PDE序列的搜尋包括3個(gè)步驟。首先通過NCBI可得到的BLASTN程序用于在EST序列數(shù)據(jù)庫中鑒定與編碼已知人PDEs的cDNA同源和DNA序列。程序?qū)⒑塑账崴褜ば蛄信c核苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較。提交15個(gè)已知人PDEs的cDNA序列，并進(jìn)行15次BLASTN搜尋；搜尋PDEs序列包括PDE1A3[Loughney，等，生物化學(xué)雜志，271796-806(1996)]、PDE1B1[Yu等，細(xì)胞信號(hào)，待發(fā)表(1997)]、PDE1C2[Loughney等，生物化學(xué)雜志.271796-806(1996)]、PDE2A3[Rosman等，基因19189-95(1997)]、PDE3A[Meacci等，美國國家科學(xué)院院刊(美國)893721-3725(1992)]、PDE3B[Miki等，基因組36476-485(1996)]、PDE4A5[Bolger等，分子細(xì)胞生物學(xué)136558-6571(1993)]、PDE4B2[Bolger等，分子細(xì)胞生物學(xué)136558-6571(1993)]、PDE4C[Bolger等，分子細(xì)胞生物學(xué)136558-6571(1993)]、PDE4D1和PDE4D3[Bolger等，分子細(xì)胞生物學(xué)136558-6571(1993)]、PDE5A、PDE6A[Pittler等，基因組6272-283(1990)]、PDE6B[Collins等，基因組13698-704(1992)]、PDE6C[Piriev等，基因組28429-435(1995)]和PDE7A1[Michaeli等，生物化學(xué)雜志1712925-12932(1993)]。檢查BLASTN結(jié)果，判斷為與15個(gè)已知PDE cDNAs的每一個(gè)相對(duì)應(yīng)的EST序列得到鑒定并收集進(jìn)表中。用作搜尋的PDE6和PDE6B序列由于在cDNAs的3′未翻譯區(qū)域存在重復(fù)元件而在3′端截短(去除部分3′未翻譯區(qū)域)。
其次，NCBI TBLASTN程序用于檢查15個(gè)已知人PDEs(如上述)的蛋白序列和由每一個(gè)EST DNA序列編碼的6個(gè)不同可能蛋白之間的同源性。在此搜尋中，在6個(gè)框架中翻譯EST序列，產(chǎn)生的氨基酸序列與搜尋PDE氨基酸序列相比較。檢查在氨基酸水平鑒定為同源的序列，去除在上述BLASTN搜尋過程中絕對(duì)確定與已知PDE對(duì)應(yīng)的任何EST序列。
搜尋的第三步包括分析那些并不是已知的PDEs的序列。這些氨基酸序列與已知的PDE同源但不是BLASTN搜尋中鑒定為15個(gè)已知PDE基因的其中一個(gè)。
BLAST搜尋從人肺胎兒肺cDNA文庫中鑒定一個(gè)EST序列(命名WO4835)，為編碼具有與PDE2A、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE5A、桿αPDE6A、桿βPDE6B、椎αPDE6C和PDE7A的催化區(qū)域同源性的氨基酸序列。WO4835的數(shù)據(jù)庫序列陳述于SEQ ID NO7。使用PDE4D序列舉例說明來自如下面討論的數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果。
WO4835 cDNA從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockyille，MD)獲得，它保藏并使得由I.M.A.G.E.(Lawrence Livermore國家實(shí)驗(yàn)室，Livermore，CA)所鑒定和測(cè)定的EST保藏物可公開獲得。一旦收到對(duì)WO4835 DNA進(jìn)行測(cè)序以肯定它的身份并確定與SEQ IDNO7相一致。
由EST序列WO4835的-1閱讀框架編碼的氨基酸序列可以被除了PDE1A、1B和1C之外的所有PDE搜尋cDNA序列識(shí)別。使用PDE4D3的TBLASTN的結(jié)果作一個(gè)例子，檢測(cè)相似的兩個(gè)區(qū)域。第一個(gè)區(qū)域顯示15/37精確匹配或40％相同(19/37相似氨基酸)并包括在所有的搜尋序列中發(fā)現(xiàn)的HD(X)2HXG(X)13A(SEQ ID NO8)基序[Charboneau，分子藥理細(xì)胞調(diào)節(jié)2267-298(1990)]。第二個(gè)區(qū)域顯示9/20精確匹配或45％相同，并包括在大部分搜尋序列中發(fā)現(xiàn)的YHNXXHA基序。WO4835序列BLASTN分析提示它是獨(dú)特的，因?yàn)樗慌cGenbank數(shù)據(jù)庫中的任何其它人DNA序列相同。WO4835的EST數(shù)據(jù)庫登記鑒定此序列與PIRA4879、牛cGMP結(jié)合的、水解cGMP的PDE5A1序列相似。WO4835框架-1的蛋白序列與牛PDE5A1序列比較揭示58/153匹配，38％的完全相同。在此區(qū)域內(nèi)是更大同源性的小區(qū)域；一個(gè)區(qū)域表現(xiàn)12/14相同的氨基酸?？紤]到WO4835序列的獨(dú)特性質(zhì)，與牛PDE5A1的相對(duì)低同源性以及存在在大部分其它已知人PDE氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸基序，WO4835代表一種新的人PDE cDNA。
實(shí)施例2推定PDE cDNA的分離用限制酶EcoRT和Hind III將WO4835 cDNA插入子從pTTT3D載體上消化成為兩個(gè)片段，這兩個(gè)片段用兩個(gè)序列低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化。利用本領(lǐng)域常規(guī)執(zhí)行的方法，兩個(gè)片段用作探針篩選來源于人心臟(Stratagene，La Jolla，CA)和人胎兒腦(Stratagene)的cDNA文庫。篩選來自每一個(gè)文庫的大約5×105噬菌體。雜交于65℃在含有3×SSC、0.1％肌氨酰、20mM磷酸鈉、pH6.8、10×Denhardts溶液和50μg/ml鮭魚精子DNA的緩沖液中過夜進(jìn)行。放射自顯影之前濾膜于65℃在含2×SSC和0.1％SDS的緩沖液中洗滌。
來自胎兒腦cDNA文庫的9個(gè)克隆和來自心臟cDNA文庫的2個(gè)克隆與WO4835探針雜交。部分測(cè)序和定位圖使得從胎兒腦文庫中選擇一個(gè)克隆命名為FB66a以進(jìn)一步分析特征。
使用WO4835 5′部分的1.3kb EcoRI/Hind III片段在第一次篩選所用的條件下第二次篩選來自胎兒腦cDNA文庫的大約7.5×105個(gè)噬菌體，產(chǎn)生19個(gè)另外的cDNA克隆。這些cDNAs中的6個(gè)也與包括WO4835 5′端的256個(gè)核苷酸區(qū)域的WO4835的HindIII/kpn I片段雜交。5個(gè)這些克隆的部分測(cè)序和定位圖使得選擇第2個(gè)克隆命名為FB85C-2做進(jìn)一步分析。
實(shí)施例3FB66a和FB85C-2的DNA序列分析根據(jù)生產(chǎn)者建議的步驟使用下面在SEQ ID NOS9至31中陳述的DNA寡核苷酸引物和Perkin Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng)部門的373ADNA測(cè)序儀對(duì)兩條鏈確定FB66a的DNA序列。根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小計(jì)算用作模板的PCR產(chǎn)物的量，并用帶有Apli Taq DNA聚合酶FS(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)的ABI PRISM Dye TerminatorCycle Sequencing Ready反應(yīng)試劑盒和不對(duì)稱PCR測(cè)序。反應(yīng)產(chǎn)物在AGCT旋轉(zhuǎn)柱(Advanced Genetic Technologies Corp.，Gaithersburg，MD)并干燥。上樣緩沖液加至每一純化的樣品中，混合物于90℃加熱2分鐘。溶液轉(zhuǎn)移到冰上直至加到4％聚丙烯酰胺凝膠上。一旦數(shù)據(jù)收集程序啟動(dòng)則自動(dòng)收集數(shù)據(jù)，并由序列分析程序自動(dòng)分析和閱讀。手工進(jìn)行所有的編輯，在確定一致的序列的地方得到的序列進(jìn)行對(duì)比M13Rev.1GGAAACAGCTATGACCATGSEQ ID NO9W48A2 ACTCTCCAAGGAAATACAGSEQ ID NO10W48A9 CTGTCTCTGCACTAACAC SEQ ID NO11W48A4 TTGGCAAGGCCTCTGCAT SEQ ID NO12W48S1 CCTCTATGAACTGAGCAG SEQ ID NO13W48A1 GAAGGCACTGCCACTGAT SEQ ID NO14W48S6 TCGAGCTGTATCGGCACT SEQ ID NO15W48A5 AGCGTGTGATTGTTCTGAASEQ ID NO16W48S7 TGCTGGCCAAGTAGCAAG SEQ ID NO17W48A6 AAGGTCACAGGCAGTCAT SEQ ID NO18W48S2 GAAGAGTGGCAAGGTCTC SEQ ID NO19W48S3 TCATGACCTGGACCACCAGSEQ ID NO20W48A8 CCTTCTTGAAGAGGTTTGCSEQ ID NO21W48S4 ATGACTGCCTGTGACCTT SEQ ID NO22W48S5 CTGCTATACAACCCTTACCSEQ ID NO23W48S8 GCTAATATTGCTGAGGCC SEQ ID NO24W48A7 TAAGTGAGAGGTGACTGC SEQ ID NO25W48S9 CCTAAAGGGCTGAGATCA SEQ ID NO26W48S10 CGCAGTCACCTCTCACTT SEQ ID NO27M13 TGTAAAACGACGGCCAGT SEQ ID NO28W48A11 ACAAAACGCCTATGGTGG SEQ ID NO29W48A10 TTGATCTCAGCCCTTTAGCSEQ ID NO30W48S11 TCATGTGGCAGGAAACTG SEQ ID NO31陳述于SEQ ID NO3中的FB66a cDNA長度上是4389個(gè)核苷酸，從核苷酸3至核苷酸2411編碼具有大約90 775 Da預(yù)計(jì)分子量的803個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。FB66a推斷的氨基酸序列陳述于SEQ ID NO4中。第一個(gè)甲硫氨酸在核苷酸45編碼；缺少一個(gè)上游框架內(nèi)終止密碼使得此殘基是內(nèi)部甲硫氨酸還是開放閱讀框架的起始不太清楚。
使用引物M13Rev.1、W48A2、W48A9、W48A4、W48S1、W48A1、W48S6、W48A5、W48A6、W48S2、W48S3、W48S4、W48S5、W48S7、W48A8和M13相似地確定FB85c-2(SEQ IDNO5)的DNA序列。FB85c-2好象包括兩個(gè)不同的DNA插入子，只有一個(gè)與WO4835同源。與WO4835同源的區(qū)域大約長2.8kb。插入子5′端精確序列并不確定，因而幾百個(gè)是5′-未翻譯區(qū)域的序列堿基不包括在陳述于SEQ ID NO5的2573個(gè)核苷酸序列中。核苷酸67至核苷酸2406編碼具有預(yù)計(jì)分子量88353Da的具有779個(gè)氨基酸的蛋白(SEQ ID NO6)。框架內(nèi)上游終止密碼子使得有可能核苷酸67位所編碼的甲硫氨酸是起始甲硫氨酸。
FB66a和FB85c-2所編碼的蛋白有不同的氨基端序列，這可能由于可選擇的剪接。從FB66a中核苷酸112及FB85c-2中核苷酸104的5′DNA序列彼此不同。這樣FB85c-2在氨基端有13個(gè)在FB66a蛋白中未發(fā)現(xiàn)的氨基酸。如果起始甲硫氨酸推測(cè)由核苷酸35編碼，F(xiàn)B66a蛋白包括23個(gè)獨(dú)特的氨基端殘基；如果FB66a克隆中開放閱讀框架不完整，蛋白則包括超過37個(gè)獨(dú)特的氨基端殘基。
FB66a序列的BLASTN分析，其中搜尋核苷酸序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫相比較，揭示與Genbank、NCBI、STS、NCBIHTGS、或NCBIGSS數(shù)據(jù)庫中的序列不相同。然而兩個(gè)相同序列在NCBI EST數(shù)據(jù)庫中得到鑒定。
一個(gè)序列是用于鑒定cDNA克隆的WO4835 EST。第二個(gè)，起源于結(jié)腸癌細(xì)胞系KM12C(HCC)的AA307865(SEQ ID NO32)，顯示與FB66a和FB85c-2克隆的3′未翻譯區(qū)域有序列相同性。在鑒定AA307865的搜尋中，另外的EST DNAs得到鑒定推測(cè)它編碼FB66a和FB85c-2所編碼人蛋白的推定小鼠(EST AA386789，SEQ IDNO38)和大鼠(EST H32734，SEQ ID NO33)同系物。小鼠序列與人的序列是86％相同，而大鼠是81％。
實(shí)施例4分析FB85c-2和FB66a蛋白由克隆FB85c-2和FB66a編碼的PDEs分別命名為PDE8A1和PDE8A2。在上面所討論的分岐點(diǎn)以外具有完全氨基酸序列相同性的兩個(gè)PDE8A蛋白與人PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C最相似。表1和表2表明PDE8A和PDE2A、PDE5A及PDE6A之間氨基酸相同的百分率。
PDE8A1和PDE8A2在催化區(qū)域(PDE8A1中氨基酸492至748)與其它PDEs以及PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C的氨基端區(qū)域中保守的推定cGMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域享有同源性。PDE8A的潛在cGMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域從PDE8A1多肽中的氨基酸75延伸至氨基酸445。在PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C的cGMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，有兩個(gè)命名為“a”和“b”的內(nèi)部重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含有一系列保守氨基酸[McAllister-Lucas等，生物化學(xué)雜志26822863-22873(1993)]。在PDE8A的對(duì)應(yīng)“b”重復(fù)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)所有的保守氨基酸；在對(duì)應(yīng)的“a”重復(fù)區(qū)域，只檢測(cè)到一些保守的殘基。表明對(duì)牛PDE5A的cGMP結(jié)合是必需的一個(gè)天冬氨酸殘基[McAllister-Lucas等，生物化學(xué)雜志.2701-9(1995)]不存在于PDE8A的“a”重復(fù)區(qū)域。因而不能肯定PDE8A的此區(qū)域是否有結(jié)合cGMP的功能。
表1在整個(gè)蛋白中PDE8A的相同性PDE 2A5A6A8A2A1001916285A 100 23286A 100 218A 100
表2在催化結(jié)構(gòu)域中PDE8A的相同性PDE2A 5A6A8A2A1003833415A 100 42466A 100 378A 100實(shí)施例5重組PDE8A的表達(dá)產(chǎn)生PDE8A的表達(dá)構(gòu)建物，它包括從PDE8A1和PDE8A2分岐點(diǎn)3′的DNA序列通過終止密碼子。表達(dá)構(gòu)建物包括編碼8個(gè)氨基酸表位標(biāo)簽的DNA。包含陳述于SEQ ID NO34肽序列的所謂“FLAG標(biāo)簽”，加到氨基末端以便蛋白通過Western印跡技術(shù)用抗-FLAGMZ抗體(Eastman Kodak，Rochesterm，NY)得到鑒定，此抗體特異識(shí)別SEQ ID NO34的肽。SEQ ID NO34 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在蛋白的氨基末端也加上編碼起始甲硫氨酸的序列。
作為構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的第一步，用FB66a DNA作為模板，用陳述于SEQ ID NO35(下面)和W48A2(SEQ ID NO10，p14)的引物，在含有2μl每一引物[儲(chǔ)存液100μg/ml]、2μl 10×PCR緩沖液II(Perkin Elmer)/2μl 10X每一核苷酸儲(chǔ)存液(儲(chǔ)存液2mM)、1.2μl MgCl2(儲(chǔ)存液25mM)的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR。0.09μl 5Units/μl taq聚合酶(Perkin Elmer)、FB66a DNA和水加入反應(yīng)混合物中至20μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。在5′引物中(SEQ ID NO35)，NcoI粒點(diǎn)加重，F(xiàn)LAG標(biāo)簽編碼區(qū)域劃線。
SEQ ID NO35CAGTCAGCTAGCCGCCATGGACTACAAGGAC-GACGATGACCAAGTTGACTGATGAAAAGGTG在Perkin Elmer DNA熱循環(huán)儀中在下列條件下進(jìn)行PCR95℃4分鐘，接著94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)。
得到的PCR產(chǎn)物用NcoI和kpnI消化，凝膠純化，并亞克隆進(jìn)入已用相同酶消化的Bluescript SKII-載體中。Bluescript載體已經(jīng)過修飾以包括從YEpC-PADH2d載體上去除的醇脫氫酶2(ADH2)啟動(dòng)子片段(Price等，酶學(xué)方法185308-315(1990))。得到的質(zhì)粒命名為W48pcrl。
含有開放閱讀框架3′部分的kpnI/SstI片段從FB66a cDNA分離，并插入已用kpnI和EcoRV消化的W48pcrl中。得到的質(zhì)粒命名為W485.1。
含有ADH2啟動(dòng)子和PDE8A基因5′部分的SacI/KpnI片段從W49pcrl中分離。含有PDE8A 3′區(qū)域的kpnI/SaII片段從W485.1分離。兩個(gè)片段連接進(jìn)已用SacI和SalI消化的酵母表達(dá)載體YEpC-PADH2d。得到的質(zhì)粒命名為W48-2ADH2，并按照布達(dá)佩斯條約于1997年10月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(A.T.C.C.)，1230IParklawn Drive，Rockville，MD20852。帶有質(zhì)粒W48-2ADH2的細(xì)菌菌種授與保藏號(hào)ATCC98552。確定PCR產(chǎn)生的DNA序列和PDE8/載體結(jié)合處的DNA序列以確保正確的質(zhì)粒構(gòu)建物。一旦確認(rèn)了序列，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)缺少內(nèi)源PDE活性的酵母菌種BJ2-54(ura3-52；trp1；leu2；cir；gal2；pep4-3；prbl-1122；prcl-402；ΔPDE1∷URA3；HIS3；ΔPDE2∷TRP1)。
宿主細(xì)胞在包括2％葡萄糖的SC-leu選擇培養(yǎng)基中過夜生長，稀釋至1-2×105細(xì)胞/ml，接下來在相同的培養(yǎng)基中生長至107細(xì)胞/ml的濃度。即使在非一誘導(dǎo)條件下表達(dá)質(zhì)粒的出現(xiàn)好象將細(xì)胞生長的雙倍時(shí)間增加2至3倍。細(xì)胞經(jīng)離心收集，用包括3％甘油的YEP培養(yǎng)基洗滌，以107細(xì)胞/ml的密度重新懸浮于YEP/3％甘油中，收獲前生長24小時(shí)。細(xì)胞冷凍直至使用。
冷凍的細(xì)胞塊(0.06ml)融解，懸浮于含有100mM MOPS、pH8.0、200mM NaCl、2μM ZnSO4、2mM二硫蘇糖醇、和10μg/ml每一種蛋白酶抑制劑抑胃酶肽、亮抑酰肽和抑蛋白酶酞的0.2ml裂解緩沖液中。大約0.2ml 0.5mm玻璃珠加到細(xì)胞中，這些細(xì)胞然后用4個(gè)30秒劇烈振蕩循環(huán)裂解。吸出裂解物，玻璃珠用0.3ml裂解緩沖液洗滌2次。裂解物和洗滌液合并產(chǎn)生酵母提取液。在一些實(shí)驗(yàn)中，裂解物通過在105000×g離心30分鐘而分成幾部分。
按如下對(duì)含有重組蛋白的酵母提取液進(jìn)行Western分析。蛋白首先在SDS-PAGE上分離，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)移到Immobilon-P(Millipore)上。蛋白印跡于室溫使用存在于20mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05％Tween-20中的5％無脂干牛奶(TBST緩沖液加牛奶)封閉1小時(shí)。印跡與存在于TBST緩沖液加牛奶中的濃度為1μg/ml的抗-FLAG M2抗體(上面討論的)溫育1小時(shí)，之后點(diǎn)跡用TBST緩沖液洗滌4次。印跡然后與偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(HRP)的印跡級(jí)親和純化的山羊抗小鼠IgG抗體溫育1小時(shí)。山羊IgG事先在加牛奶TBST緩沖液中1∶10000稀釋。印跡用TBST洗滌4次，根據(jù)生產(chǎn)商建議的步驟，散射自顯影之前用加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的Renaissance系統(tǒng)(New England Nuclear Life SeieneesProducts)處理。通過抗體檢測(cè)的大部分蛋白是重組蛋白預(yù)期的大小。
如以前所描述的[Loughney等，生物化學(xué)雜志271796-806(1996)]方法，通過檢測(cè)從32P-CAMP或32P-cGMP中釋放的32P-磷酸測(cè)定PDE活性。酵母提取物在也含有0.5mg/ml牛血清白蛋白的0.5X裂解緩沖液中稀釋。20μl酵母提取物或稀釋的酵母提取物，在包括另外的50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、1μM ZnSO4和0.1mg/ml牛血清白蛋白的100μl反應(yīng)體積中測(cè)定。蛋白濃度通過Bradford的方法測(cè)定。
觀察到PDE8A水解cAMP和cGMP。在未分部的裂解物中，對(duì)cAMP的特異活性是3.9nmol/min/mg，對(duì)cGMP的特異活性是7.6nmol/min/mg。分部揭示20-40％的總活性與高速上清部分相關(guān)。用cAMP作為底物的活性動(dòng)力學(xué)分析表明以1∶1活性比率存在酶的高和低km形式。估計(jì)的km值是0.2μM和350μM。高速沉淀塊的分析表明相同種也存在但是以1∶4的高km∶低km活性。用cGMP作為底物的動(dòng)力學(xué)分析表明存在酶的低和高活性的形式。在這些分析中，km值估計(jì)是3μM和300μM。
使用一套同功酶選擇性PDE抑制劑和非選擇性抑制劑異甲基丁基黃嘌呤(IBMX)確定PDE8A活性抑制的IC50值。因?yàn)榇藴y(cè)定在60nM的cAMP濃度進(jìn)行，IC50值只反映低km形式的抑制。結(jié)果陳述于表3中，值以微摩爾單位顯示。
表3使用同功酶特異的PDE抑制劑的PDE8抑制化合物PDE靶家族 靶家族的IC50PDE8的IC50差異倍數(shù)IC224 PDE1 0.08-0.0082.7 38-338EHNA PDE2 2 65 31Cilostamide PDE3 0.0212750IC197 PDE4 0.0214714DMPPO PDE50.016 1.1 66IBMX 非選擇性 1-40 4.6 0.12-4.6每一種選擇抑制劑對(duì)PDE8的IC50值比對(duì)它們的靶同功酶高至少30倍，這說明PDE8的抑制情況不同于PDEs1-5。cAMP和cGMP的水解將PDE8A的酶活性和PDE6及PDE7A的活性清楚區(qū)別開。非選擇性抑制劑IBMX對(duì)PDE8的IC50值在對(duì)已知人PDEs所觀察的范圍內(nèi)，表明PDE8的催化點(diǎn)與其它人和哺乳類PDEs的相似，并不同于對(duì)IBMX不敏感的更低真核形式。
實(shí)施例6PDE8A表達(dá)的Northern分析使用人多組織點(diǎn)跡(Clontech，Palo Alto，CA)進(jìn)行PDE8A表達(dá)的Northern分析。327個(gè)堿基的探針從SEQ ID NO3中的核酸1767延伸至2293。核糖探針的制備和雜交條件如以前所描述的[Loughney等，同上]。
結(jié)果表明在所有檢查的組織中有9.5kb的mRNA但帶強(qiáng)度有變化。信號(hào)在心臟、腦和腎中最強(qiáng)；信號(hào)在肝、胎盤、胰腺和骨骼肌中較弱。信號(hào)在肺中最弱。
實(shí)施例7人PDE8A的染色體定位圖含有人PDE8A基因的酵母人工染色體(YACs)從購買自遺傳研究公司的一組人YACs中分離并按如下通過PCR篩選。
用兩個(gè)嵌套引物對(duì)篩選YAC的上庫。在第一次篩選反應(yīng)中，正義引物W48S8(SEQ ID NO36)與反義引物W48A10(SEQ IDNO37)配對(duì)。用10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl、2mMMgSO4、0.2mM每一種dNTP、10μg/ml每一種引物、0.5units Taq聚合酶(Perkin-Elmer)以及1.5μl YAC庫DNA作為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94℃1分鐘、60℃2分鐘和72℃4分鐘。首輪擴(kuò)增以后，反應(yīng)產(chǎn)物用內(nèi)部引物對(duì)W48S12(SEQ IDNO36)和W48A12(SEQ ID NO37)再擴(kuò)增。
W48S12 SEQ ID NO36CCAGAAGGGGTACTITTCCW48A12 SEQ ID NO37CATTGTCCTGAGGCTGTGG除了模板是1μl首輪反應(yīng)1∶10稀釋液(在水中)外按上述進(jìn)行反應(yīng)。鑒定產(chǎn)生正確大小PCR產(chǎn)物的上庫，在相同條件下用相同的嵌套引物對(duì)篩選對(duì)應(yīng)的下庫以鑒定含有PDE8A的YACs的獨(dú)特位置。
帶有相關(guān)YACs的酵母菌株從遺傳研究公司購買。為了確證PDE8A基因在各種YACs中存在，從每一菌株中制備DNA，并通過PCR用引物W48S8和W48A10分析。根據(jù)以前描述[Hoffman和Winston，基因57267-272(1987)]但按下面經(jīng)過修改的方法從每一菌株中制備DNA。菌株在含有葡萄糖的YEP培養(yǎng)基中30℃過夜生長。離心沉淀10ml培養(yǎng)物，并在含有10mM Tris-HCl、pH8.0、100mM NaCl、1mM Na2EDTA、1％SDS和2％Triton-X100的200μl水緩沖液中重新懸浮。在200μl酚/氯仿(1∶1混合物)和100μl玻璃珠(425-600μm)的存在下通過劇烈振蕩裂解細(xì)胞。裂解后，加入200μl TE緩沖液(100mM Tris、pH8.0、1mM Na2EDTA)，樣品離心以分相。用200μl水緩沖液再次抽提有相機(jī)。收集的水相用100units牛胰腺PNase(Boehringer Mannheim)37℃處理1小時(shí)，根據(jù)已建立的方法樣品用酚/氯仿抽提，用氯仿再抽提，乙醇沉淀。得到的沉淀重新懸浮在50μl TE緩沖液中。除了反應(yīng)體積是25μl以及模板由1μl相關(guān)酵母DNA制品組成之外，按上述進(jìn)行PCR。
鑒定3個(gè)位置為805B6、919H10和920A3(作為每一個(gè)CEPH命名)含有PDE8基因的人YACs。根據(jù)基因組研究數(shù)據(jù)庫中心的信息(Whitehead)，3個(gè)YACs互相重疊，是人染色體6上單獨(dú)連接的毗連序列群(WC6.16)的部分。在基因組研究中心的工作中此毗連序列群中的兩個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(D6S305和D6S411)放在染色體6遺傳圖譜距離6p端167cM的位置上；在CEPH-Genethon的工作中，D6S305定位于距離6p端173cM的位置上。在CEPH-Genethon通過熒光原位雜交已定位WC6.16毗連序列群中3個(gè)其它YACs(932F1、956B1和947D5)。雜交信號(hào)位于距離6P端0.94和0.99部分長度單位之間。根據(jù)CEPH結(jié)合的總結(jié)圖譜[Chumakov等，自然377(增刊)175-297(1995)]，此區(qū)域?qū)?yīng)于細(xì)胞遺傳區(qū)域6q26-27。
與人基因組這個(gè)區(qū)域相關(guān)的遺傳缺陷包括視網(wǎng)膜錐退化(OMIM數(shù)據(jù)庫)、胰島素依賴的糖尿病[Davies等，自然371130-136(1994)，Luo等，美國人類遺傳雜志，57911-919(1995)]和青少年發(fā)病的帕金森神經(jīng)機(jī)能障礙[Matsumine等，美國人類遺傳雜志60588-596(1997)]。此外，在各種不同的癌細(xì)胞中，包括Burkitt′s淋巴瘤[Parsa等，基因、染色體&癌913-18(1994)]、星形細(xì)胞瘤[Liang等，神經(jīng)病學(xué)44533-536(1994)]、胃癌[Queimado等，基因、染色體&癌1428-34(1995)]、甲狀旁腺瘤[Tahara等，癌癥研究56599-605(1996)和卵巢瘤[Cooke等，基因、染色體&瘤15223-233(1996)]；Saito等，癌癥研究565586-5589(1996)]中在此區(qū)域經(jīng)常觀察到雜合性的丟失(LOH)。LOH表明在受影響的區(qū)域表明存在腫瘤抑制基因[Weinberg，科學(xué)2541138-1146(1991)]。由于它的廣泛表達(dá)，有可能PDE8基因的突變參與所有或者一部分這些遣傳異常。
實(shí)施例8證實(shí)PDE8A1和PDE8A2代表剪接變異體并努力擴(kuò)展PDE8A2的5′序列為了證實(shí)PDE8A1和PDE8A2代表5′剪接變異體，采用兩種方法。首先PCR分析表明，在基因組DNA中，PDE8A1和PDE8A2的序列都不鄰近普通區(qū)域的DNA序列。普通區(qū)域的基因組序列上游存在于第三個(gè)PDE8A cDNA，F(xiàn)B74b中，它在與實(shí)施例2中所述探針OW4835的5′端雜交的6個(gè)最初克隆的一組中得到鑒定。克隆FB74b的部分序列(3′端755個(gè)核苷酸)陳述于SEQ ID NO39。FB74b cDNA在FB85c-2和FB66a彼此分岐的相同位置與FB85c-2和FB66a分岐，但FB74b克隆不保留開放閱讀框架。在FB74b序列5′至與FB66a和FB85c-2克隆序列分岐點(diǎn)，一個(gè)框架內(nèi)終止密碼子比起始甲硫氨酸密碼子更接近分岐點(diǎn)表明，如果FB74b代表cDNA而不是未剪接前體，起始甲硫氨酸有必要位于對(duì)FB66a和FB85c-2都普通的序列中。
使用FB74b上游序列中命名為FB74bS1(SEQ ID NO40)的一個(gè)引物和對(duì)FB74b、FB66a和FB85c-2共同的序列內(nèi)命名為W48A9(SEQ ID NO11)的第二個(gè)引物進(jìn)行PCR分析。
FB74bS1GTTAGATGAGAGGTTGCTGGSEQ ID NO40使用1μg人基因組DNA作為模板，擴(kuò)增一條帶，與用FB74b作為模板擴(kuò)增的帶具有同樣大小，表明FB74b所獨(dú)特的序列和共同區(qū)域在基因組DNA中是鄰近的。這樣FB74b序列可以代表未剪接內(nèi)含子或者代表編碼具有共同區(qū)域內(nèi)起始甲硫氨酸蛋白的第三個(gè)剪接變異體。在兩種情況下，F(xiàn)B85c-2和FB66a序列推測(cè)由剪接產(chǎn)生。
第二，使用從人皮質(zhì)、小腦、心臟、肝、肺組織分離的RNA進(jìn)行5′RACE分析。按所描述的[Loughney等，生物化學(xué)雜志271796-806(1996)]從冷凍組織片段中分離RNA，用使用Fast TrackTMmRNA分離系統(tǒng)(Invitrogen)選擇polyA+mRNA。使用5μg polyA+mRNA和cDNA合成試劑盒(Boehringer Mannheim)制備雙鏈cDNA。cDNA連接到通過退火寡核苷酸L15(SEQ ID NO41)和L30(SEQ ID NO42)形成的接頭上。
L15 GTATGCTAATCTCAG SEQ ID NO41L30 CAACTCGAATTCCTTGACAGATTAGCATACSEQ ID NO42對(duì)5′RACE，使用寡核苷酸L18(SEQ ID NO43)和W48A13(SEQ ID NO44)通過PCR擴(kuò)增接頭所連接的cDNA。
L18 CAACTCGAATTCCTTGACSEQ ID NO43W48A13 GTTGTTCTTCCTCTTCAGCC SEQ ID NO44在25ul的反應(yīng)體積中反應(yīng)含有10mM Tris-HCl、pH8.3、50mMKCl、1.5mM MgCl2、0.2mM每一種dNTP、10μg/ml每一種引物和1μg接頭所連接的cDNA。94℃加熱步驟后，加入0.1unit Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)起始PCR，PCR繼續(xù)30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃1分鐘、60℃2分鐘和72℃4分鐘。
PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用水稀釋10倍，并在如上述相同條件下使用寡核苷酸L21(SEQ ID NO45)和W48A9S(SEQ ID NO46)的第2個(gè)PCR反應(yīng)中用作模板。
L21CAACTCGAATTCCTTGACAGA SEQ ID NO45W48A9S GATCGTCGACCTGTCTCTGCACTAACACSEQ ID NO46在第2個(gè)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的DNA用EcoRI和SalI切割，并連接進(jìn)已經(jīng)用相同的酶消化的載體Bluescript(stratagene)中。
開始，檢查來自每一組織來源的5個(gè)質(zhì)粒中DNA序列，并發(fā)現(xiàn)PDE8A1和PDE8A25′都在所分離的cDNA中。也可以獲得FB74b5′序列，它是幾個(gè)序列，每一人只分離一次，代表另外的剪接變異體或不相關(guān)DNA序列。
因?yàn)闊oPDE8A2一樣cDNA比最初FB66a cDNA向5′延伸更長，為了試圖延伸5′端序列分析另外的PDE8A2 RACE克隆。鑒定并測(cè)序另外5個(gè)肺PDE8A2 cDNA，但沒有一個(gè)延伸PDE8A2序列。
使用L21引物(SEQ ID NO45)和引物W48A14S(SEQ IDNO47)重復(fù)RACE PCR的第2輪。
W48A14S SEQ ID NO47GATCGTCGACAAGCACTCGGTCAGCCTTCG通過PCR篩選得到的克隆，選擇最長的一個(gè)用于測(cè)序。只有兩個(gè)克隆比最初FB66a cDNA長，它們?cè)谖捶g區(qū)域分別延伸5′序列8和12bp。用5′-CCCAGGGCGCCA使FB66a序列得到延伸。FB66a最遠(yuǎn)5′端是GC非常豐富的，這也許決定了困難得到全長cDNA。
實(shí)施例9PDE8A的表達(dá)和特征描述實(shí)施例5中所描述重組PDE8A在酵母提取液中以低親和和高親和形式存在。因?yàn)橛锌赡艿陀H和形式代表部分未活化酶，在sf9和COS細(xì)胞中進(jìn)行PDE8A表達(dá)以試圖或者獲得同型酶或者確定是否兩種動(dòng)力學(xué)形式總是從cDNA表達(dá)。
用來自質(zhì)粒W4851(實(shí)施例5中所述)3′KpnI-SalI片段和按如下PCR產(chǎn)生的5′片段產(chǎn)生PDE8A sf9表達(dá)構(gòu)建物。引物FLAG-1(SEQ ID NO48)和W48A4(SEQ ID NO12)用在PDE8COS-1 DNA(在下面描述)作為模板的PCR中。
FLAG-1GATCGGATCCACCATGGACTACAAGGSEQ ID NO48除了2mM MgSO4置換MgCl2使用并用0.02μ Taq聚合酶之外，按實(shí)施例8中所述進(jìn)行PCR。94℃4分鐘初始溫育后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94℃1分鐘、50℃1分鐘和72℃2分鐘。5′擴(kuò)增產(chǎn)物用BamHI和KpnI切割、凝膠純化并與3′片段連接進(jìn)已用BanHI和SalI消化的載體pFASTBC(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。得到的質(zhì)粒命名為pFBRPDE8。通過測(cè)序確證所有的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和所有新的結(jié)合物。
根據(jù)生產(chǎn)商所建議的步驟使用FastBac系統(tǒng)(Gibco BRL)產(chǎn)生重組病毒株，并按如下進(jìn)行蛋白表達(dá)。sf9細(xì)胞于27℃生度在含50μ/ml氨芐青霉素和50μg/ml硫酸鏈霉素(Gibco)的CCM3培養(yǎng)基(Hyclone，Logan，UT)中生長。指數(shù)生長的細(xì)胞以大約每個(gè)細(xì)胞兩個(gè)病毒的倍數(shù)感染并培養(yǎng)48小時(shí)。離心收集細(xì)胞，用CMF-PBS(2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、8.1mM Na2PO4)洗滌，冷凍沉淀細(xì)胞并于-80℃保藏至使用。在等體積玻璃珠(酸洗滌，0.5mm，Sigma)存在時(shí)通過劇烈振蕩在緩沖液(50mM MOPS pH7.2、10μM硫酸鋅、1mM DTT、2mM苯扎明、10μg/ml抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑蛋白酶肽以及20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和鈣蛋白酶抑制劑II)中裂解細(xì)胞，并如實(shí)施例5中所描述的確定PDE活性。
在sf9提取物中，對(duì)cAMP水解(100μM底物)檢測(cè)到45.4nmol/min/mg PDE活性，對(duì)cGMP水解(100μm底物)檢測(cè)到69.4nmol/min/mg PDE活性。背底PDE活性是可以忽略的。PDE8A活性好象是實(shí)施例5中所描述的如在酵母提取液中所檢測(cè)到的高和低親和形式的混和物。
對(duì)在COS細(xì)胞中的表達(dá)，通過聯(lián)合來自質(zhì)粒W485.1(實(shí)施例5)3′KpnI/SalI片段和切割PCR擴(kuò)增產(chǎn)物獲得的NheI/KpnI片段產(chǎn)生PDE8COS-1，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物來自包括FB66a cDNA作為模板使用引用W48A2(SEQ ID NO10)和ATG(SEQ ID NO35)的反應(yīng)。PCR的條件包括在Perkin Elmer Cetus DNA熱循環(huán)儀中，94℃4分鐘的初始溫育，接著30個(gè)循環(huán)，94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃2分鐘。得到的5′片段和上述3′片段連接進(jìn)已用NheI和SalI消化的載體pClneo(Promega，Aadison，WI)中。
生長在15cm培養(yǎng)皿中的半融合COS細(xì)胞用25ml DMEM(Dulbeccos修改的Eagle培養(yǎng)基，100U/ml氨芐青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素，GIBCO)洗滌1次，之后14ml DMEM/DEAE-dextran/氯奎加到每個(gè)培養(yǎng)皿中。DMEM/DEAE-dextran/氯奎包括75mlDMEM和30μl存在于PBS(2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、8.1mM Na2PO4、0.9mM CaCl2、0.5mMMgCl2)中的0.25M氯奎與0.75ml 50μg/ml DEAE-dextran(Pharmacia，Uppsala，瑞典)。存在于135μl Tris/EDTA緩沖液(TE)中的20μg質(zhì)粒DNA加入每一培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿于37℃在5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)。去除培養(yǎng)基，加入12ml 10％DMSO/PBS1分鐘并去除。細(xì)胞用25ml DMEM洗滌1次，之后另外25ml含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的DMEM加入，細(xì)胞于37℃在5％CO2中過夜培養(yǎng)。去除培養(yǎng)基并用25ml CMF-PBS洗滌單層細(xì)胞。加入6ml含有0.05％胰蛋白酶/0.5mM EDTA(Gibco)的溶液。細(xì)胞于37℃溫育5分鐘。通過研磨從培養(yǎng)皿中取出細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到園錐形離心管中。培養(yǎng)皿用6ml完全DMEM洗滌以收獲任何剩余的細(xì)胞，洗滌溶液加到離心管中。通過在大約340×g下離心5分鐘沉淀細(xì)胞，在5ml完全DMEM中重新懸浮，移至含20ml完全DMEM的15cm組織培養(yǎng)皿中，于5％CO2中過夜培養(yǎng)。
單層細(xì)胞用CMF-PBS洗滌兩次，在維爾烯(0.5mMNa2EDTA·2H2O、137mM NaCl、2.68mM KCl、8.1mMNa2HPO4、1.1mM葡萄糖、pH7.4)中于37℃溫育5分鐘，并按上述收獲。沉淀的細(xì)胞用CMF-PBS洗滌，在干冰中冷凍，并保藏于-80℃直至使用。在緩沖液(50mM MOPS、pH7.2、10μM硫酸鋅、1mM DTT、2mM苯扎明10μg/ml抑胃酶肽、亮抑酶肽、抑蛋白肽和20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和鈣蛋白酶抑制劑II)中于20000psi通過French壓力細(xì)胞(SLM儀器)裂解細(xì)胞，如實(shí)施例5中所描述的方法確定PDE活性。
PDE8A的表達(dá)在COS細(xì)胞提取液中是低的，由于來自內(nèi)源PDEs的高水平背景活性，不能精確確定其特征。為了更完全確定COS細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的特征，根據(jù)生產(chǎn)商建議的步驟，使用抗-FLAG M2親和柱(Sigma)從細(xì)胞提取液100000xg上清中純化包括在氨基端FLAG標(biāo)簽的酶(實(shí)施例5)。為了更精確確定酵母PDE8A活性的特征，如實(shí)施例5中所描述的為了獲得同型蛋白進(jìn)行氨基端截短但保留催化區(qū)域的重組蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例10抗-PDE8A抗體的合成在大腸桿菌中合成GST融合蛋白以提供產(chǎn)生抗PDE8A單克隆抗體的抗原。來自FB70a(包括FB85c-2的核苷酸182-1330的一個(gè)PDE8AcDNA，它是最初鑒定的與實(shí)施例2中所述全長WO4835探針雜交的9個(gè)克隆之一)的EcoRI片段插入pGEX5XI(Pharmacia)的EcoRI位點(diǎn)，得到的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株XL1 Blue。用IPTG誘導(dǎo)此構(gòu)建物產(chǎn)生包括來自PDE8A 382個(gè)氨基酸的GST-PDE8融合蛋白。用SDS-PAQE分離融合蛋白，用冷0.4M KCl染色后從凝膠中取出合適大小的帶，并通過電洗脫從丙烯酰胺中獲得蛋白。洗脫產(chǎn)物逆著PBS透析，注射進(jìn)小鼠之前用Centriprep 10和Centricon柱(Amicon，BeverlyMA)濃縮。
第0天，4只Balble小鼠預(yù)先出血，并用200μl總體積中在完全弗氏佐劑中包括30μg/小鼠GST-PDE8融合蛋白的抗原皮下注射。在第3周和第9周在不完全弗氏佐劑中重復(fù)相同的注射。最后一次免疫后10天，獲得檢測(cè)血樣，并通過抗原捕獲ELISA和Western分析來篩選。
在ELISA中，Immulon 4培養(yǎng)板(Dynex，Cambridge，Massachusetts)于4℃用50μl/孔于50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6中含2μg/ml GST-PDE8的溶液來包被。培養(yǎng)板用0.5％魚皮明膠(Sigma)封閉30分鐘，加入在PBS加5％Tween20(PBST)中稀釋的50μl血清。血清稀釋液范圍從1∶100至1∶102400，通過一系列加倍稀釋獲得。37℃溫育30分鐘并用PBST洗滌3次，加入50μl偶聯(lián)辣根過氧化物酶的山羊-抗小鼠IgG(fc)抗體(Jockson)(在PBST中以1∶1000稀釋)。如上述溫育培養(yǎng)板并用PBST洗滌4次。加入四甲基聯(lián)苯胺(Sigma Chemical，St.Louis，Missouri)檢測(cè)抗體，加入50μl15％H2SO45分鐘后終止顏色反應(yīng)。在培養(yǎng)板閱讀儀上測(cè)量450nm的吸收值。
對(duì)Western分析，用大約10μg酵母PDE8提取物和大約200ng凝膠純化的GST-PDE8跑SDS-PAGE凝膠，并且蛋白轉(zhuǎn)移至Immobilon-PVDF上。使用BioRad山羊抗小鼠IgG辣根過氧化酶作為二抗進(jìn)行一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)Western印跡方法。
在制備雜交瘤時(shí)，來自上面ELISA和/或Western點(diǎn)雜交方面給出陽性結(jié)果的小鼠脾細(xì)胞使用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)通過標(biāo)準(zhǔn)方法以5∶1的比率與NS-1融合(Harlow和Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)。融合細(xì)胞重新懸浮于200ml含15％FBS、100mM次黃嘌呤鈉、0.4mM氨基喋呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25units/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106小鼠胸腺細(xì)胞/ml的RPMI中，并以200μl/孔分配至10個(gè)96孔平底組織培養(yǎng)板中(Corning，United kingdon)。通過用18G針(Becton Dickinson)從每一孔中吸出大約100μl，并加入除含有10units/ml IL-6和缺少胸腺細(xì)胞之外的上述100μl/孔鋪板培養(yǎng)基在融合后第2、4和6天飼養(yǎng)細(xì)胞。在第9至12天，通過使用GST和GST-PDE8的抗原捕獲ELISA和上述ELC Western分析篩選來自融合孔的上清。
使用小鼠血在Western雜交的兩個(gè)泳道上獲得預(yù)期大小的陽性信號(hào)，在隨后的融合中獲得與酵母重組蛋白具有弱反應(yīng)性的單克隆抗體。使用50μg抗原/小鼠重復(fù)整個(gè)過程以獲得更強(qiáng)免疫反應(yīng)的單克隆抗體。
實(shí)施例11通過原位雜交分析PDE8A的表達(dá)通過如下述的原位雜交在組織切片中檢查PDE8A的表達(dá)。探針的制備來自cDNA FB70a的XhoI/EcoRI限制酶片段(對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO1的核苷酸571至1226)亞克隆進(jìn)Bluescript載體(Stratagene，LaJolla，CA)以產(chǎn)生命名為PDE8XR2A的表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒用XhoI切割并用T3聚合酶轉(zhuǎn)錄(見下面)以產(chǎn)生反義探針。用EcoRI切割PDE8XR2A并用T7聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正義探針。使用RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)在含有5μl 5X轉(zhuǎn)錄緩沖液(Stratagene)、30mMDTT(Stratagene)、0.8mM每一種ATP、CTP、GTP(10mM(Stratagene)、40U Rnase Block II(Stratagene)、12.5U T3或T7聚合酶(Stratagene)、和300ng線性化質(zhì)粒模板、50μCi35S-UTP(大于1000Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL)的反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄PDE8A模板?；旌衔镉?7℃溫育1小時(shí)，之后加入1μl無RNase的DNase I(Stratagene)并于37℃溫育15分鐘去除模板DNA。60℃下加入4μl 1M NaHCO3和6μl 1M Na2CO322分鐘分解探針，通過加入25μl含有100ul 3M乙酸鈉、5μl乙酸(VWR，So.Plainfield，NJ)和395μl dH2O的溶液中和反應(yīng)混合物。根據(jù)生產(chǎn)商建議的方法制備一個(gè)Quick Spin G50 RNA柱(5′→3′Inc.，Boulder，Co)。探針放在柱子中心，柱子在桌子高離心機(jī)中于1000rpm離心4分鐘。柱子的流經(jīng)液體與50μl H2O、2μl 10mg/ml tRNA溶液、10μl 3M乙酸鈉和200μl 100％乙醇(VWR)混和，得到的混合液于-20℃下溫育過夜。探針溶液于4℃微量離心15分鐘，去除上清，沉淀重新懸浮于含有1μl 0.1M DTT的40μl 1X TBE中。探針保藏于-70℃直至進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)。組織樣品的制備和原位雜交。
組織(國立疾病研究交流中心，Philadephia，PA和合作的人組織網(wǎng)絡(luò)，Philadephia，PA)以6μm切片，并放置于Super frost Plus切片(VWR)上。切片4℃于4％低聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)中固定20分鐘。載玻片在1X CMF-PBS中洗3次，在用70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇的3次連續(xù)洗滌中脫水，于室溫干燥30分鐘。載玻片在存在于2X SSC中的70％甲酰胺(J.T.Baker)中于70℃放置2分鐘，于4℃在2X SSC中沖洗，通過70％、95％和100％乙醇洗滌而脫水，并室溫下干燥30分鐘。
將載玻片放置在避光盒子中，盒子中含有用存在于4X SSC中50％甲酰胺(J.T.Baker)的盒子緩沖液飽和的一張濾紙。每一個(gè)切片用100μl由10％硫酸葡聚糖(Sigma)、50％甲酰胺(J.T.Baker，Phillpsburg，NJ)100mM DTT(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、0.3M NaCl(Sigma)、20mM Tris、pH7.5、5mM EDTA(Sigma)、和1×Denhardt′s溶液(Sigma)組成的rHB2緩沖液覆蓋，載玻片于42℃溫育1小時(shí)。通過將4×105cpm/每個(gè)組織切片與每個(gè)切片5μl 10mg/ml tRNA溶液混合并于95℃加熱混合物3分鐘制備如上述的探針。加入冰冷rHB2緩沖液使終體積為20μl/每個(gè)切片。含有探針的溶液(20μl/切片)加到以前加入的100μl rHB2緩沖液中。載玻片于55℃溫育12至16小時(shí)。雜交后，載玻片用含有10mM DTT的4×SSC于室溫下洗滌1小時(shí)，在50％去離子甲酰胺(J.T.Baker)、1×SSC、和1mM DTT中于60℃洗40分鐘，于2×SSC中室溫下洗30分鐘，在0.1×SSC于室溫下洗30分鐘。切片通過70％、95％和100％乙醇洗滌而脫水，空氣干燥30分鐘。載玻片浸在KodakNTB2核乳膠中，于黑暗中室溫干燥1至3小時(shí)，并在黑暗中于4℃下用干燥劑保藏直至顯影時(shí)間。載玻片在4℃ Kodak Dektol顯影液中顯影4分鐘，在4℃dH2O中浸泡4次，在4℃Kodak定影液中放置4分鐘。載玻片用dH2O沖洗，按如下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)H&E染色。
載玻片在dH2O中沖洗，并通過載玻片的轉(zhuǎn)移經(jīng)過下列一系列用蘇木精和曙絲染色在甲醛/乙醇(100ml甲醛、900ml 80％乙醇)中5分鐘；于水中洗滌3次總共2分鐘；在0.75％Harris蘇木精(Sigma)中5分鐘；在水中洗滌3次總共2分鐘；4次浸泡在1％碳酸鋰中；在水中10分鐘；在0.5％曙紅(Sigma)中2分鐘；在水中洗3次總共2分鐘；在70％乙醇中2分鐘；在95％乙醇中3次1分鐘洗滌；在100％乙醇中兩次1分鐘洗滌；兩次2分鐘在二甲苯洗滌。用Cytoseal 60(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)封閉載玻片。
用反義PDE8A探針獲得的信號(hào)與正義PDE8A探針產(chǎn)生的對(duì)照信號(hào)相比較，對(duì)反義探針特異的信號(hào)可認(rèn)為代表PDE8A的表達(dá)。在整個(gè)小腦的大部分、睪丸輸精小管的一個(gè)細(xì)胞亞群中、骨骼肌仍未確定來源的分散細(xì)胞中、卵巢粒膜細(xì)胞和卵巢基質(zhì)中、腎Henle襻的上皮細(xì)胞中和心臟一些小動(dòng)脈的平滑肌中檢測(cè)到PDE8A的信號(hào)。
這些結(jié)果不同于通過實(shí)施例6中所述Northern雜交所獲得的結(jié)果，因?yàn)橛蒒orthern雜交在心臟檢測(cè)到中等信號(hào)，而使用此心臟樣品的原位數(shù)據(jù)給出弱信號(hào)。這種不一致反應(yīng)來自不同個(gè)體組織中的差異或者兩種方法固有的測(cè)檢差異的水平。卵巢中的信號(hào)和腎中的信號(hào)表明PDE8A分別參與排卵或鹽和/或水自身穩(wěn)定。
對(duì)本領(lǐng)域的那些熟練技術(shù)人員預(yù)期發(fā)生如在上面說明的實(shí)施例中所陳述的本發(fā)明的許多修改和變化方法。因而只有出現(xiàn)在附加權(quán)利說明中的限制應(yīng)放在本發(fā)明中。
序列表<110>Loughney，Kate<120>磷酸二酯酶8A<130>27866/35047<140><141><150>08/951,648<151>1997-10-16<160>48<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2298<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(2298)<220><221>misc_feature<222>(868)..(870)<223>核苷酸868-870所編碼的氨基酸是Pro或Leu<400>1ttg aca gat gaa aaa gtg aag gca tat ctt tct ctt cac ccc cag gta 48Leu Thr Asp Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser Leu His Pro Gln Val1 5 10 15tta gat gaa ttt gta tct gaa agt gtt agt gca gag aca gta gag aaa 96Leu Asp Glu Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala Glu Thr Val Glu Lys20 25 30tgg ctg aag agg aag aac aac aaa tca gaa gat gaa tcg gct cct aag 144Trp Leu Lys Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp Glu Ser Ala Pro Lys35 40 45gaa gtc agc agg tac caa gat acg aat atg cag gga gtt gta tat gaa 192Glu Val Ser Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln Gly Val Val Tyr Glu50 55 60cta aac agc tat ata gaa caa cgg ttg gac aca gga gga gac aac cag 240Leu Asn Ser Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr Gly Gly Asp Asn Gln65 70 75 80cta ctc ctc tat gaa ctg agc agc atc att aaa ata gcc aca 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Phe Ser Ile Glu Lys Gly Ile Ala Gly Gln305 310 315 320gta gca aga aca ggg gaa gtc ctg aac att cca gat gcc tat gca gac1008Val Ala Arg Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Ala Asp325 330 335cca cgc ttt aac aga gaa gta gac ttg tac aca ggc tac acc acg cgg1056Pro Arg Phe Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr Thr Gly Tyr Thr Thr Arg340 345 350aac atc ctg tgc atg ccc atc gtc agc cga ggc agc gtg ata ggt gtg1104Asn Ile Leu Cys Met Pro Ile Val Ser Arg Gly Ser Val Ile Gly Val355 360 365gtg cag atg gtc aac aaa atc agt ggc agt gcc ttc tct aaa aca gat1152Val Gln Met Val Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ala Phe Ser Lys Thr Asp370 375 380gaa aac aac ttc aaa atg ttt gcc gtc ttt tgt gct tta gcc tta cac1200Glu Asn Asn Phe Lys Met Phe Ala Val Phe Cys Ala Leu Ala Leu His385 390 395 400tgt gct aat atg tat cat aga att cgc cac tca gag tgc att tac cgg1248Cys Ala Asn Met Tyr His Arg Ile Arg His Ser Glu Cys Ile Tyr Arg405 410 415gta acg atg gaa aag ctg tcc tac cat agc att tgt act tca gaa gag1296Val Thr Met Glu Lys Leu Ser 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200 205Val Ala Thr Ala Ash Leu Ala Trp Ala Ser Val Ala Ile His Gln Val210 215 220Gln Val Cys Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr Glu Leu Asn Asp Phe Leu225 230 235 240Leu Asp Val Ser Lys Thr Tyr Phe Asp Asn Ile Val Ala Ile Asp Ser245 250 255Leu Leu Glu His Ile Met Ile Tyr Ala Lys Asn Leu Val Asn Ala Asp260 265 270Arg Cys Ala Leu Phe Gln Val Asp His Lys Asn Lys Glu Leu Tyr Ser275 280 285Asp Xaa Phe Asp Ile Gly Glu Glu Lys Glu Gly Lys Pro Val Phe Lys290 295 300Lys Thr Lys Glu Ile Arg Phe Ser Ile Glu Lys Gly Ile Ala Gly Gln305 310 315 320Val Ala Arg Thr Gly Glu Val Leu Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Ala Asp325 330 335Pro Arg Phe Asn Arg Glu Val Asp Leu Tyr Thr Gly Tyr Thr Thr Arg340 345 350Asn Ile Leu Cys Met Pro Ile Val Ser Arg Gly Ser Val Ile Gly Val355 360 365Val Gln Met Val Asn Lys Ile Ser Gly Ser Ala Phe Ser Lys Thr Asp370 375 380Glu Asn Asn Phe Lys Met Phe Ala Val Phe Cys Ala Leu Ala Leu His385 390 395 400Cys Ala Asn Met Tyr His Arg Ile Arg His Ser Glu Cys Ile Tyr Arg405 410 415Val Thr Met Glu Lys Leu Ser Tyr His Ser Ile Cys Thr Ser Glu Glu420 425 430Trp Gln Gly Leu Met Gln Phe Thr Leu Pro Val Arg Leu Cys Lys Glu435 440 445Ile Glu Leu Phe His Phe Asp Ile Gly Pro Phe Glu Asn Met Trp Pro450 455 460Gly Ile Phe Val Tyr Met Val His Arg Ser Cys Gly Thr Ser Cys Phe465 470 475 480Glu Leu Glu Lys Leu Cys Arg Phe Ile Met Ser Val Lys Lys Asn Tyr485 490 495Arg Arg Val Pro Tyr His Asn Trp Lys His Ala Val Thr Val Ala His500 505 510Cys Met Tyr Ala Ile Leu Gln Asn Asn His Thr Leu Phe Thr Asp Leu515 520 525Glu Arg Lys Gly Leu Leu Ile Ala Cys Leu Cys His Asp Leu Asp His530 535 540Arg Gly Phe Ser Asn Ser Tyr Leu Gln Lys Phe Asp His Pro Leu Ala545 550 555 560Ala Leu Tyr Ser Thr Ser Thr Met Glu Gln His His Phe Ser Gln Thr565 570 575Val Ser Ile Leu Gln Leu Glu Gly His Asn Ile Phe Ser Thr Leu Ser580 585 590Ser Ser Glu Tyr Glu Gln Val Leu Glu Ile Ile Arg Lys Ala Ile Ile595 600 605Ala Thr Asp Leu Ala Leu Tyr Phe Gly Asn Arg Lys Gln Leu Glu Glu610 615 620Met Tyr Gln Thr Gly Ser Leu Asn Leu Asn Asn Gln 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1.一種純化和分離的PDE8多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，包括SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，包括SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的多肽，包括SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列。
5.編碼要求1、2、3或4的多肽的多核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，包括SEQ ID NO1中所示的序列的多核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，包括SEQ ID NO3中序列的多核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，包括SEQ ID NO5中序列的多核苷酸。
9.編碼人PDE8多肽的多核苷酸，選自a)根據(jù)權(quán)利要求5的多核苷酸；和b)在適度嚴(yán)格條件下與(a)的多核苷酸雜交的DNA。
10.編碼人PDE8多肽的多核苷酸，選自a)根據(jù)權(quán)利要求6、7和8中任一項(xiàng)的多核苷酸；和b)在適度嚴(yán)格條件下與(a)的多核苷酸雜交的DNA。
11.權(quán)利要求5的多核苷酸，它是一個(gè)DNA分子。
12.權(quán)利要求11的DNA，它是一個(gè)cDNA分子。
13.權(quán)利要求11的DNA，它是一個(gè)基因組DNA分子。
14.權(quán)利要求11的DNA，它是全部或部分化學(xué)合成的DNA分子。
15.一種特異地與權(quán)利要求5的多核苷酸的互補(bǔ)雜交的反義多核苷酸。
16.一種包含根據(jù)權(quán)利要求5的多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建物。
17.一種用根據(jù)權(quán)利要求16的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
18.一種產(chǎn)生PDE8多肽的方法，該方法包括步驟a)在適合PDE8多肽表達(dá)的條件下生長根據(jù)權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞和b)從來自生長培養(yǎng)基的宿主細(xì)胞分離PDE8多肽。
19.一種與根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4的多肽能特異免疫反應(yīng)的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的抗體，它是單克隆抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20分泌抗體的雜交瘤。
22.能與根據(jù)權(quán)利要求19的抗體特異免疫反應(yīng)的抗獨(dú)特型抗體。
23.一種鑒定PDE8A多肽的特異性結(jié)合配偶體化合物的方法，包括步驟a)在允許化合物和PDE8A多肽結(jié)合的條件下將PDE8A多肽和化合物接觸；b)檢測(cè)化合物與PDE8A多肽的結(jié)合；和c)鑒定化合物為PDE8A多肽的特異性結(jié)合配偶體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中特異性結(jié)合配偶體調(diào)節(jié)PDE8A多肽的活性。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中化合物抑制PDE8A多肽的活性。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中化合物增強(qiáng)PDE10多肽的活性。
27.一種鑒定PDE8A多核苷酸的特異性結(jié)合配偶體化合物的方法，包括步驟a)在允許化合物和PDE8A多核苷酸結(jié)合的條件下將PDE8A多核苷酸與化合物接觸b)檢測(cè)化合物與PDE8A多核苷酸的結(jié)合；c)鑒定化合物作為PDE8A多核苷酸的特異性結(jié)合配偶體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中特異性結(jié)合配偶體調(diào)節(jié)由PDE8A多核苷酸編碼的PDE8A多肽的表達(dá)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中化合物抑制PDE8A多肽的表達(dá)。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中化合物加強(qiáng)PDE10多肽的表達(dá)。
31.由根據(jù)權(quán)利要求23或27的方法所鑒定的化合物。
32.包含權(quán)利要求31的化合物以及藥物可接受載體的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了人PDE8多肽,編碼該多肽的多核苷酸,包括該多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體,用該表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;產(chǎn)生PDE8多肽的方法;反義多核苷酸;以及特異性與PDE8多肽起免疫反應(yīng)的抗體。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1248291SQ98802581
公開日2000年3月22日 申請(qǐng)日期1998年10月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月16日
發(fā)明者K·洛格內(nèi) 申請(qǐng)人:艾科斯有限公司