專(zhuān)利名稱：制備丙二酸衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備丙二酸單酯的方法，所述丙二酸單酯適用作各種化學(xué)制品、藥物、農(nóng)藥等的合成中的中間體。
常用的一種制備丙二酸單酯的方法是丙二酸二酯的化學(xué)水解。然而，按該方法，難于將生成的丙二酸單酯與未反應(yīng)的丙二酸二酯和副產(chǎn)物丙二酸分離。于是，不可能獲得高純度的丙二酸單酯。
作為獲得高純度的丙二酸單酯的一種方法，已知一種方法應(yīng)用Meldrum′s酸作原料〔例如參見(jiàn)，Matoba Katsuhide等，化學(xué)藥物通報(bào)(Chem.Pharm.Bull.)，31(8)，2955(1983)；或Rigo B.等，四面體通訊(Tetrahedron Lett.)，30(23)，3073(1989)〕。但是，由于該方法應(yīng)用了昂貴的Meldrum′s酸，所以不能說(shuō)它是一種實(shí)際的方法，它不適合工業(yè)生產(chǎn)。
作為獲得高純度的丙二酸單酯的另一種方法，已知這樣一種方法其中應(yīng)用能水解酯鍵的酶或微生物處理丙二酸二酯(日本未審查的專(zhuān)利公開(kāi)No.8-173174)。但是，從成本考慮，應(yīng)用丙二酸二酯作原料是不利的。
因此，需要開(kāi)發(fā)制備高純度丙二酸單酯的高產(chǎn)量方法。
本發(fā)明的目的是提供一種制備丙二酸單酯的高產(chǎn)量方法，其中所述的丙二酸單酯適用作各種化學(xué)制品、藥物、農(nóng)藥等的合成中的中間體。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，當(dāng)應(yīng)用具有腈水解酶活性的微生物的培養(yǎng)物、細(xì)胞或得自該微生物的處理過(guò)的細(xì)胞的產(chǎn)物處理氰基乙酸酯時(shí)，選擇性地生產(chǎn)了丙二酸單酯；按該方法，可制備高純度的丙二酸單酯而沒(méi)有副反應(yīng)(例如酯鍵的水解)。從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明包括如下發(fā)明(1)一種制備由式(II)表示的丙二酸單酯的方法HOOCCH2COOR(II)
其中R是烯基、芳基、芳烷基或C1-20烷基，該方法包括處理由式(I)表示的氰基乙酸酯NCCH2COOR(I)其中R同式(II)中的定義，所述處理是應(yīng)用微生物的培養(yǎng)物、細(xì)胞或得自微生物的處理過(guò)的細(xì)胞的產(chǎn)物進(jìn)行的，所述微生物屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)、戈登氏菌屬(Gordona)或紅球菌屬(Rhodococcus)并具有腈水解酶活性從而水解所述氰基乙酸酯。
(2)前述(1)的方法，其中所述氰基乙酸酯被連續(xù)添加到反應(yīng)溶液中，同時(shí)保持水解期間該溶液中的氰基乙酸酯濃度在0.01～10wt％的范圍內(nèi)。
(3)前述(1)的方法，其中R表示的C1-20烷基是C3-20烷基，并且具有腈水解酶活性的微生物是屬于紅球菌屬的微生物。
(4)前述(3)的方法，其中所述氰基乙酸酯被連續(xù)添加到反應(yīng)溶液中，同時(shí)保持水解期間所述溶液中的氰基乙酸酯濃度在0.01～10wt％的范圍內(nèi)。
(5)前述(1)的方法，其中具有腈水解酶活性的微生物是Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419。
(6)前述(1)的方法，其中具有腈水解酶活性的微生物是土生戈登氏菌(Gordona terrae)MA-1(FERM BP-4535)。
(7)前述(1)的方法，其中具有腈水解酶活性的微生物是紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 33025。
(8)一種制備由式(II′)表示的丙二酸單酯的方法HOOCCH2COOR′(II′)其中R′是烯基、芳基、芳烷基或C3-20烷基，該方法包括處理由式(I′)表示的氰基乙酸酯NCCH2COOR′ (I′)其中R′同式(II′)中的定義，所述處理是應(yīng)用具有腈水解酶活性從而水解所述氰基乙酸酯的微生物的培養(yǎng)物、細(xì)胞或得自該微生物的處理過(guò)的細(xì)胞的產(chǎn)物進(jìn)行的。
(9)前述(8)的方法，其中所述氰基乙酸酯被連續(xù)添加到反應(yīng)溶液中，同時(shí)保持水解期間所述溶液中的氰基乙酸酯濃度在0.01～10wt％的范圍內(nèi)。
下文將詳細(xì)描述本發(fā)明。
式(I)或(II)中R表示的烷基可以具有直鏈結(jié)構(gòu)或支鏈結(jié)構(gòu)。該烷基中的碳原子數(shù)是1～20，優(yōu)選是1～10，更優(yōu)選是2～6。該烷基的具體實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異丁基、正戊基、異戊基、己基、庚基、辛基、2-乙基己基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基。
式(I′)或(II′)中R′表示的烷基可以具有直鏈結(jié)構(gòu)或支鏈結(jié)構(gòu)。該烷基中的碳原子數(shù)是3～20，優(yōu)選是3～10，更優(yōu)選是3～6。該烷基的具體實(shí)例包括正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異丁基、正戊基、異戊基、己基、庚基、辛基、2-乙基己基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基。
R表示的烯基可以具有直鏈結(jié)構(gòu)或支鏈結(jié)構(gòu)。該烯基中的碳原子數(shù)是2～20，優(yōu)選是2～6。該烯基的具體實(shí)例包括乙烯基、烯丙基、巴豆基(2-丁烯基)和異丙烯基(1-甲基乙烯基)。
R′表示的烯基可以具有直鏈結(jié)構(gòu)或支鏈結(jié)構(gòu)。該烯基中的碳原子數(shù)是3～20，優(yōu)選是3～6。該烯基的具體實(shí)例包括烯丙基、巴豆基(2-丁烯基)和異丙烯基(1-甲基乙烯基)。
至于R或R′表示的芳基，可以列舉的有芳烴基，例如苯基、1-萘基、2-萘基；芳雜環(huán)基，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、喹啉基、異喹啉基；等等。
至于R或R′表示的芳烷基，可以列舉的有芐基、1-萘基甲基、2-萘基甲基、苯乙基(2-苯基乙基)、1-苯基乙基、苯丙基、苯丁基、苯戊基、苯己基、甲芐基、甲基苯乙基、二甲基芐基、二甲基苯乙基、三甲基芐基、乙基芐基、二乙基芐基等。
在由式(I)表示的氰基乙酸酯中，代表性的化合物例如有氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、氰基乙酸正丙酯、氰基乙酸異丙酯、氰基乙酸正丁酯、氰基乙酸叔丁酯、氰基乙酸2-乙基己酯、氰基乙酸烯丙酯和氰基乙酸芐酯。
在由式(I′)表示的氰基乙酸酯中，代表性的化合物例如有氰基乙酸正丙酯、氰基乙酸異丙酯、氰基乙酸正丁酯、氰基乙酸叔丁酯、氰基乙酸2-乙基己酯、氰基乙酸烯丙酯和氰基乙酸芐酯。
對(duì)應(yīng)用于本發(fā)明中的微生物沒(méi)有特別限制，只要它屬于棒桿菌屬、戈登氏菌屬或紅球菌屬并且具有腈水解酶活性即可。該微生物的具體實(shí)例包括Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419、土生戈登氏菌MA-1(FERM BP-4535)和紫紅紅球菌ATCC 33025。
在這些微生物中，土生戈登氏菌MA-1已被保藏在國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)處，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，以前述登記號(hào)保藏。Corynebacteriumnitrilophilus和紫紅紅球菌都可得自保藏所，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美國(guó)。
當(dāng)式(I)表示的氰基乙酸酯(其中R是烯基、芳基、芳烷基或C3-20烷基)〔即式(I′)表示的氰基乙酸酯〕被用作底物時(shí)，對(duì)應(yīng)用的微生物沒(méi)有特別限制，只要它具有腈水解酶活性即可。除了前述微生物外，本發(fā)明中也可應(yīng)用例如屬于如下屬并具有腈水解酶活性的微生物假單胞菌屬(Pseudomonas)、短桿菌屬(Brevibacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、微球菌屬(Micrococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、枝動(dòng)菌屬(Mycoplana)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)或念珠菌屬(Candida)。
更具體地，可列舉類(lèi)黃假單胞菌(Pseudomonas synxanta)IAM12356、乙酰短桿菌(Brevibacterium acetylicum)IAM 1790、星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)IFO 3384、氧化節(jié)桿菌(Arthrobacteroxydans)IFO 12138、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 21697、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)IFO 3301、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)ATCC 383、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)IFO 3355、斑點(diǎn)氣單胞菌(Aeromonas punctata)IFO 13288、兩形枝動(dòng)菌(Mycoplanadimorpha)ATCC 4297、糞肥纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)IAM12107、草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)IFO 12686或吉利蒙氏念珠菌(Candida guilliermondii)IFO 0566。這些微生物中，具有ATCC號(hào)的微生物可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美國(guó)；具有IAM號(hào)的那些可得自IAM培養(yǎng)物保藏中心，細(xì)胞和分子研究中心，分子和細(xì)胞生物科學(xué)研究所，東京大學(xué)，1-1，Yayoi 1-chome，Bunkyo-ku，Tokyo，日本；具有IFO號(hào)的那些可得自發(fā)酵研究所，Osaka，17-85，Jusohonmachi 2-chome，yodogawa-ku，Osaka-shi，Osaka，日本。
所述微生物可在液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。應(yīng)用的培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)睾ǔ？杀晃⑸锿奶荚春偷?、維生素、礦物質(zhì)等。還可往所述培養(yǎng)基中加入少量腈或內(nèi)酰胺化合物以便改善所述微生物的水解能力。該腈化合物是C1-12直鏈或支鏈脂族腈或芳族腈。例如可列舉丙腈、異戊腈、己腈、丙烯腈、己二腈、芐腈、2-吡啶腈等。作為內(nèi)酰胺化合物，例如可列舉γ-丁內(nèi)酰胺、δ-戊內(nèi)酰胺或ε-己內(nèi)酰胺。是在微生物能生長(zhǎng)的一定的溫度和一定的pH值下進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，是在應(yīng)用的微生物菌株的最適培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。為了促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，可采取通氣攪拌。
在本發(fā)明中，無(wú)需任何處理即可應(yīng)用通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)前述具有腈水解酶活性的微生物而獲得的培養(yǎng)物。也可應(yīng)用通過(guò)離心或其它操作從培養(yǎng)物收獲的微生物的細(xì)胞。此外，還可應(yīng)用得自處理過(guò)的微生物細(xì)胞的產(chǎn)物。得自處理過(guò)的細(xì)胞的產(chǎn)物具體實(shí)例包括用丙酮、甲苯等處理過(guò)的細(xì)胞；破裂的細(xì)胞；得自破裂的細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞提取物；以及從細(xì)胞中分離的粗酶或純化酶。可以在反應(yīng)之后再循環(huán)這些細(xì)胞或產(chǎn)物，方法是在將這些細(xì)胞或產(chǎn)物截留/固定于交聯(lián)丙烯酰胺凝膠等或者通過(guò)物理或化學(xué)方法將它們固定于固體載體(例如離子交換樹(shù)脂、硅藻土等)之后再應(yīng)用這些細(xì)胞或產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，優(yōu)選地可通過(guò)如下操作制備丙二酸單酯。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將氰基乙酸酯(底物)加到反應(yīng)介質(zhì)中而溶解或懸浮該酯。在所述底物的添加之前或之后往該反應(yīng)介質(zhì)中加入將起催化劑作用的所述微生物的培養(yǎng)物等。然后進(jìn)行水解反應(yīng)，同時(shí)控制反應(yīng)溫度和(如果必要的話)該反應(yīng)溶液的pH。作為反應(yīng)介質(zhì)，例如可應(yīng)用去離子水或緩沖液。反應(yīng)溫度通常是0～70℃，優(yōu)選是10～35℃?？蔀樵摲磻?yīng)選擇能增強(qiáng)所述微生物細(xì)胞等的腈水解酶活性的溫度。反應(yīng)溶液的pH取決于應(yīng)用的微生物的酶的最適pH。一般說(shuō)來(lái)，優(yōu)選在pH6～9下進(jìn)行反應(yīng)，因?yàn)樵谶@樣的pH值下可抑制由化學(xué)水解引起的副反應(yīng)。反應(yīng)溶液中，細(xì)胞或得自處理過(guò)的細(xì)胞的產(chǎn)物的濃度以干重表示通常是0.01～5wt％。對(duì)反應(yīng)溶液中的底物濃度沒(méi)有特別限制，只要它在0.01～70wt％的范圍內(nèi)即可。優(yōu)選地，所述底物濃度在0.1～15wt％的范圍內(nèi)。
此外，可以通過(guò)在水解反應(yīng)期間連續(xù)添加所述氰基乙酸酯而高濃度地積累丙二酸單酯。此時(shí)，為了將底物對(duì)酶的鈍化作用降至最小，以這種方式添加底物，即保持反應(yīng)溶液中的底物濃度優(yōu)選在0.01～10wt％，更優(yōu)選在0.1～5wt％。
在反應(yīng)完成后，通過(guò)離心、過(guò)濾等除去用作催化劑的所述微生物細(xì)胞。然后，可通過(guò)用溶劑(例如己烷、乙酸乙酯等)提取所得溶液回收未反應(yīng)的氰基乙酸酯。在用酸(例如硫酸、鹽酸等)將提取后的殘余物的pH調(diào)節(jié)到1～2后，用溶劑(例如己烷、乙酸乙酯等)提取該殘余物，于是得反應(yīng)產(chǎn)物丙二酸單酯。
下文將參照如下實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明。但是，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1將土生戈登氏菌MA-1(FERM BP-4535)接種入3ml已滅菌的LB培養(yǎng)基(1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)并在振蕩下在30℃下培養(yǎng)24小時(shí)。將一毫升所得細(xì)胞培養(yǎng)液接種入100ml下列已滅菌的培養(yǎng)基A并在30℃下培養(yǎng)48小時(shí)。
培養(yǎng)基A(pH7.2)甘油 1.0％異戊腈 0.2％酵母提取物 0.02％KH2PO40.2％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O 0.02％FeSO4·7H2O 10ppmCoCl2·4H2O 10ppmCaCl2·2H2O 1ppmMnCl2·4H2O 7ppm在完成培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液離心分離。用去離子水洗滌全部體積的生成的細(xì)胞，然后懸浮于100ml 50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。該細(xì)胞懸浮液的濁度是OD630＝5.5。往該細(xì)胞懸浮液中加入1.00g作為底物的氰基乙酸乙酯并在30℃下反應(yīng)1小時(shí)。通過(guò)高效液相色譜(HPLC；柱TSK凝膠ODS-120A(Tosoh Corp.)，4.6mm I.D.×25cm；流動(dòng)相5％乙腈，95％水，0.1％磷酸；流速0.5ml/min；檢測(cè)UV220nm)分析形成的反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部底物已被轉(zhuǎn)化成丙二酸單乙酯。在反應(yīng)完成后，通過(guò)離心除去細(xì)胞。然后，往形成的溶液中添加2N HCl而調(diào)節(jié)pH至2.0。隨后用乙酸乙酯從該溶液中提取反應(yīng)產(chǎn)物丙二酸單乙酯。往形成的有機(jī)層中添加無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水，再通過(guò)蒸餾除去溶劑。結(jié)果得1.05g丙二酸單乙酯(產(chǎn)率89.9％)。
實(shí)施例2按與實(shí)施例1中相同的方法獲得丙二酸單乙酯(1.07g，產(chǎn)率91.6％)，不同的是應(yīng)用Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419作所述微生物。
實(shí)施例3按與實(shí)施例1中相同的方法獲得丙二酸單甲酯(0.97g，產(chǎn)率81.4％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸甲酯作底物。
實(shí)施例4
按與實(shí)施例1中相同的方法獲得丙二酸單正丙酯(1.05g，產(chǎn)率91.3％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸正丙酯作底物。
實(shí)施例5按與實(shí)施例1中相同的方法獲得丙二酸單異丙酯(1.02g，產(chǎn)率88.7％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸異丙酯作底物。
實(shí)施例6按與實(shí)施例1中相同的方法獲得丙二酸單正丁酯(1.06g，產(chǎn)率93.4％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸正丁酯作底物。在HPLC分析中，將40％乙腈、60％水和0.1％磷酸用作流動(dòng)相。
實(shí)施例7按與實(shí)施例6中相同的方法獲得丙二酸單叔丁酯(1.05g，產(chǎn)率92.5％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸叔丁酯作底物。
實(shí)施例8按與實(shí)施例6中相同的方法獲得丙二酸單烯丙酯(1.02g，產(chǎn)率87.2％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸烯丙酯作底物。
實(shí)施例9按與實(shí)施例6中相同的方法獲得丙二酸單2-乙基己酯(1.01g，產(chǎn)率91.8％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸2-乙基己酯作底物。
實(shí)施例10按與實(shí)施例6中相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸芐酯作底物。在酶反應(yīng)完成后，有10％氰基乙酸芐酯未反應(yīng)。用乙酸乙酯提取未反應(yīng)的氰基乙酸芐酯而將它脫除。提取后，將2N HCl加入形成的水層而調(diào)節(jié)pH至2.0。然后，用乙酸乙酯提取該反應(yīng)產(chǎn)物丙二酸單芐酯。將無(wú)水硫酸鈉加到形成的有機(jī)層中進(jìn)行脫水，再通過(guò)蒸餾除去溶劑。結(jié)果獲得0.89g丙二酸單芐酯(產(chǎn)率80.3％)。
實(shí)施例11～19往按實(shí)施例1中相同方法制備的細(xì)胞懸浮液中添加氰基乙酸乙酯而給出5～50wt％的濃度并在25℃下反應(yīng)20小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)完成后，通過(guò)液相色譜法測(cè)定產(chǎn)率。結(jié)果示于表1中。
表1
實(shí)施例20往100ml按與實(shí)施例1中相同方法制備的細(xì)胞懸浮液中添加5g氰基乙酸乙酯并在25℃下反應(yīng)。然后，進(jìn)一步分批地往反應(yīng)溶液中添加30g氰基乙酸乙酯，同時(shí)測(cè)定該溶液中的底物濃度，使它不超過(guò)5wt％。30小時(shí)后，產(chǎn)率是100％。
實(shí)施例21將紫紅紅球菌ATCC 33025接種入3ml已滅菌的LB培養(yǎng)基(1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)并在振蕩下在30℃下培養(yǎng)24小時(shí)。將一毫升所得細(xì)胞培養(yǎng)液接種入100ml下列已滅菌的培養(yǎng)基A并在30℃下培養(yǎng)48小時(shí)。
培養(yǎng)基A(pH7.2)甘油 1.0％異戊腈 0.2％酵母提取物 0.02％KH2PO40.2％NaCl 0.1％MgSO4·7H2O 0.02％FeSO4·7H2O 10ppmCoCl2·4H2O 10ppm
CaCl2·2H2O1ppmMnCl2·4H2O7ppm在完成培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液離心分離。用去離子水洗滌全部體積的生成的細(xì)胞，然后懸浮于100ml 50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。該細(xì)胞懸浮液的濁度是OD630＝5.6。往該細(xì)胞懸浮液中加入1.00g作為底物的氰基乙酸正丙酯并在30℃下反應(yīng)1小時(shí)。通過(guò)高效液相色譜(HPLC；柱TSK凝膠ODS-120A(Tosoh Corp.)，4.6mm I.D.×25cm；流動(dòng)相5％乙腈，95％水，0.1％磷酸；流速0.5ml/min；檢測(cè)UV220nm)分析形成的反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部底物已被轉(zhuǎn)化成丙二酸單正丙酯。在反應(yīng)完成后，通過(guò)離心除去細(xì)胞。然后，往形成的溶液中添加2N HCl而調(diào)節(jié)pH至2.0。隨后用乙酸乙酯從該溶液中提取反應(yīng)產(chǎn)物丙二酸單正丙酯。往形成的有機(jī)層中添加無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水，再通過(guò)蒸餾除去溶劑。結(jié)果得1.06g丙二酸單正丙酯(產(chǎn)率89.9％)。
實(shí)施例22按與實(shí)施例21中相同的方法獲得丙二酸單異丙酯(1.01g，產(chǎn)率88.6％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸異丙酯作底物。
實(shí)施例23按與實(shí)施例21中相同的方法獲得丙二酸單正丁酯(1.05g，產(chǎn)率93.3％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸正丁酯作底物。在HPLC分析中，將40％乙腈、60％水和0.1％磷酸用作流動(dòng)相。
實(shí)施例24按與實(shí)施例23中相同的方法獲得丙二酸單叔丁酯(1.04g，產(chǎn)率92.4％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸叔丁酯作底物。
實(shí)施例25按與實(shí)施例23中相同的方法獲得丙二酸單烯丙酯(1.04g，產(chǎn)率87.1％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸烯丙酯作底物。
實(shí)施例26按與實(shí)施例23中相同的方法獲得丙二酸單2-乙基己酯(1.00g，產(chǎn)率91.7％)，不同的是應(yīng)用氰基乙酸2-乙基己酯作底物。
實(shí)施例27
按與實(shí)施例23中相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，不同的是將氰基乙酸芐酯用作底物。在酶反應(yīng)完成后，有10％氰基乙酸芐酯未反應(yīng)。用乙酸乙酯提取未反應(yīng)的氰基乙酸芐酯而將它脫除。提取后，將2N HCl加入形成的水層而調(diào)節(jié)pH至2.0。然后，用乙酸乙酯提取該反應(yīng)產(chǎn)物丙二酸單芐酯。將無(wú)水硫酸鈉加到形成的有機(jī)層中進(jìn)行脫水，再通過(guò)蒸餾除去溶劑。結(jié)果獲得0.88g丙二酸單芐酯(產(chǎn)率80.2％)。
實(shí)施例28～36往按實(shí)施例21中相同方法制備的細(xì)胞懸浮液中添加氰基乙酸正丙酯而給出5～50wt％的濃度并在25℃下反應(yīng)20小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)完成后，通過(guò)液相色譜法測(cè)定產(chǎn)率。結(jié)果示于表2中。
表2
實(shí)施例37往100ml按與實(shí)施例21中相同方法制備的細(xì)胞懸浮液中添加5g氰基乙酸正丙酯并在25℃下反應(yīng)。然后，進(jìn)一步分批地往反應(yīng)溶液中添加20g氰基乙酸正丙酯，同時(shí)測(cè)定該溶液中的底物濃度，使它不超過(guò)5wt％。30小時(shí)后，產(chǎn)率是100％。
按本發(fā)明，有可能以高生產(chǎn)率制備適用作各種化學(xué)制品、藥物、農(nóng)藥等合成中的中間體的丙二酸單酯。
權(quán)利要求
1.一種制備由式(II)表示的丙二酸單酯的方法HOOCCH2COOR(II)其中R是烯基、芳基、芳烷基或C1-20烷基，該方法包括處理由式(I)表示的氰基乙酸酯NCCH2COOR (I)其中R同式(II)中的定義，所述處理是應(yīng)用微生物的培養(yǎng)物、細(xì)胞或得自微生物的處理過(guò)的細(xì)胞的產(chǎn)物進(jìn)行的，所述微生物屬于棒桿菌屬、戈登氏菌屬或紅球菌屬并具有腈水解酶活性從而水解所述氰基乙酸酯。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述氰基乙酸酯被連續(xù)添加到反應(yīng)溶液中，同時(shí)保持水解期間所述溶液中的所述氰基乙酸酯濃度在0.01～10wt％的范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中R表示的所述C1-20烷基是C3-20烷基，并且所述具有腈水解酶活性的微生物是屬于紅球菌屬的微生物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述氰基乙酸酯被連續(xù)添加到反應(yīng)溶液中，同時(shí)保持水解期間所述溶液中的所述氰基乙酸酯濃度在0.01～10wt％的范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有腈水解酶活性的微生物是Corynebacterium nitrilophilus ATCC 21419。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有腈水解酶活性的微生物是土生戈登氏菌MA-1(FERM BP-4535)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有腈水解酶活性的微生物是紫紅紅球菌ATCC 33025。
8.一種制備由式(II′)表示的丙二酸單酯的方法HOOCCH2COOR′(II′)其中R′是烯基、芳基、芳烷基或C3-20烷基，該方法包括處理由式(I′)表示的氰基乙酸酯NCCH2COOR′(I′)其中R′同式(II′)中的定義，所述的處理是應(yīng)用具有腈水解酶活性從而水解所述氰基乙酸酯的微生物的培養(yǎng)物、細(xì)胞或得自該微生物的處理過(guò)的細(xì)胞的產(chǎn)物進(jìn)行的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述氰基乙酸酯被連續(xù)添加到反應(yīng)溶液中，同時(shí)保持水解期間所述溶液中的所述氰基乙酸酯濃度在0.01～10wt％的范圍內(nèi)。
全文摘要
一種生產(chǎn)由如下通式(Ⅱ)表示的丙二酸單酯的方法:HOOCCH
文檔編號(hào)C12P7/62GK1251137SQ98803574
公開(kāi)日2000年4月19日 申請(qǐng)日期1998年2月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月20日
發(fā)明者尾崎英司, 榎本兼彥, 遠(yuǎn)藤隆一 申請(qǐng)人:三菱麗陽(yáng)株式會(huì)社