專利名稱：以綠熒光蛋白(gfp)為標(biāo)記的腫瘤轉(zhuǎn)移模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤發(fā)展的研究。具體地說(shuō)，涉及用于研究脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中腫瘤轉(zhuǎn)移的模型系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
一直以為，腫瘤組織的轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤威脅生命的主要原因。轉(zhuǎn)移即在不同于原發(fā)腫瘤的部位長(zhǎng)出了繼發(fā)腫瘤。這樣，雖然手術(shù)去除了原發(fā)腫瘤，但卻不能阻止病情的發(fā)展。理解轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)出控制繼發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的方法是至關(guān)重要的。為了理解轉(zhuǎn)移機(jī)制，需要提供一種模型，它能夠在大量的宿主細(xì)胞背景下鑒定出少量的腫瘤細(xì)胞，從而在實(shí)際病程發(fā)展中發(fā)現(xiàn)繼發(fā)腫瘤栓和微轉(zhuǎn)移。
已經(jīng)有人用外部熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞在體外證實(shí)了腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的外滲和最初的播種步驟。Khokha，R等，Cancer Metastasis Rev(1995)14279-301；Koop，S.等，Cancer Rev(1995)552520-2523。而且，Margolis，L.B.等，In VitroCell Dev Biol.(1995)31221-226顯示外部熒光標(biāo)記的肺腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)的宿主小鼠肺中的遷移。然而，在所有情況下由于外源熒光標(biāo)記的限制而不能作長(zhǎng)時(shí)間的觀察。已知，用逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)轉(zhuǎn)移綠熒光蛋白基因(GFP)能在體外產(chǎn)生人癌癥細(xì)胞(Levy，J.P.等，Nature Biotechnol(1996)14610-614)和造血細(xì)胞(Grignani，F(xiàn).等，Cancer Res(1998)5814-19 & Cheng，L.等，Gene Therapy(1997)41013-1022)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。
曾經(jīng)嘗試提供以β-半乳糖苷酶基因?yàn)闃?biāo)記的模型(Lin，W.C.等，CancerRes.(1990)502808-2817；Lin，W.C.等，Invasion and Metastasis(1992)12197-209)。但是，這一標(biāo)記被證實(shí)不理想，因?yàn)椴荒苁褂眯迈r或處理過(guò)的組織。本發(fā)明提供了一種標(biāo)記，它能夠顯示活的新鮮組織中腫瘤的的入侵和微轉(zhuǎn)移。而且，采用合適的對(duì)比介質(zhì)，本發(fā)明方法可用于顯示已形成和正在生長(zhǎng)的腫瘤中的血管生成。本發(fā)明方法不僅可以用來(lái)作為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的模型，而且利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還可以用于獲得腫瘤患者體內(nèi)的臨床信息。
本發(fā)明用綠熒光蛋白(GFP)作為標(biāo)記。美國(guó)專利5,491,084揭示了該蛋白的異源表達(dá)，主要用于監(jiān)測(cè)融合DNA的表達(dá)。該專利說(shuō)明了GFP在大腸桿菌和C.elegans中的表達(dá)，還假設(shè)一般細(xì)胞都可以經(jīng)修飾來(lái)表達(dá)GFP。根據(jù)該專利，這樣的表達(dá)不僅是監(jiān)測(cè)融合DNA表達(dá)的方法，而且還是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的方法。
本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移模型方面的內(nèi)容已在許多出版物中報(bào)道和描述過(guò)。Chrishima，T.等，Cancer Research(1997)572042-2047說(shuō)明的是構(gòu)建含有人源化綠熒光蛋白(GFP)基因和二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的二順?lè)醋虞d體。該載體轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞而得到克隆-38?？寺?38表現(xiàn)出穩(wěn)定的GFP表達(dá)，在氨甲蝶呤(MTX)存在下維持?？寺?38細(xì)胞注射給小鼠獲取腫瘤片段，然后通過(guò)外科正位移植(OSI)將片段移植到裸鼠的卵巢絨毛膜上?？梢栽谠撃Ｐ椭懈欈D(zhuǎn)移。
Chishima，T.等Proc Natl Acad Sci USA(1997)9411573-11576說(shuō)明的是用來(lái)自Clontech的hGFP-S65T克隆的優(yōu)化密碼子轉(zhuǎn)染Anip 973人肺腺癌制備克隆-26?？寺?26靜脈注射給裸鼠，然后在組織培養(yǎng)物中跟蹤生成的腫瘤。
Chishima，T.等Clin.Exp.Metastasis(1997)15547-552和Chishima，T.等Anticancer Res(1997)172377-2384說(shuō)明了用克隆-26進(jìn)行的類似的工作，其中，所述細(xì)胞被皮下接種給裸鼠，導(dǎo)致生成腫瘤，然后將所得的腫瘤通過(guò)SOI移植到裸鼠的胸膜臟層。還在該模型中觀察到了腫瘤轉(zhuǎn)移。
Chishima，T.等In Vitro Cell Dev Biol.(1997)33745-747說(shuō)明的是克隆-26的組織培養(yǎng)和利用GFP發(fā)出的熒光顯示其生長(zhǎng)。
以上出版物均在此納為參考。
此外，Chen，L.等，Gene Therapy(1997)41013-1022說(shuō)明的是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子調(diào)控下的GFP基因來(lái)修飾造血干細(xì)胞。雖然，作者稱用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人的干細(xì)胞只是有些困難，但是采用GFP的加強(qiáng)形式，可以獲得令人滿意的亮度。
此外，Grignani，F(xiàn).等，Cancer Res(1998)5814-19報(bào)道，用表達(dá)GFP的EBV/逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)向人造血祖細(xì)胞內(nèi)的高效基因轉(zhuǎn)移。
Clontch出售含有產(chǎn)生各種顏色的GFP各種修飾形式的載體。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的Clontch載體將GFP置于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的調(diào)控下。
本

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的方法能夠在實(shí)際情況下密切關(guān)注原發(fā)腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移。利用綠熒光蛋白(GFP)作為穩(wěn)定而且顯見(jiàn)的標(biāo)記，可以建立這種轉(zhuǎn)移進(jìn)展的模型，并揭示其機(jī)制。
這樣，本發(fā)明內(nèi)容之一涉及跟蹤原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的方法，該方法包括獲取脊椎動(dòng)物的新鮮器官組織，該動(dòng)物已經(jīng)經(jīng)修飾而含有了表達(dá)GFP的腫瘤細(xì)胞，以及觀察組織切片中有否熒光。
此外，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾而含有表達(dá)GFP的腫瘤細(xì)胞的脊椎動(dòng)物。
本發(fā)明所述的脊椎動(dòng)物可以構(gòu)建成模型系統(tǒng)，例如免疫力低下的小鼠，在其體內(nèi)引入了經(jīng)修飾后表達(dá)綠熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞或腫瘤?；蛘?，生物體可以是自發(fā)含有腫瘤的人或其它脊椎動(dòng)物，但是該腫瘤已經(jīng)經(jīng)病毒感染或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染來(lái)產(chǎn)生所述的GFP。
此外，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾能在異源調(diào)控元件調(diào)控下產(chǎn)生GFP的腫瘤細(xì)胞，涉及提供穩(wěn)定細(xì)胞系并含有可見(jiàn)量GFP的無(wú)限繁殖的細(xì)胞，涉及含有產(chǎn)生GFP的轉(zhuǎn)移腫瘤的組織，還涉及含有所述轉(zhuǎn)移腫瘤的組織培養(yǎng)物。
本發(fā)明還包括觀察和跟蹤實(shí)體瘤內(nèi)血管形成的方法，該方法(通常)包括暴露和觀察所述的腫瘤。所述腫瘤將已經(jīng)修飾而表達(dá)GFP的，而生物體將被給予對(duì)照染料來(lái)實(shí)現(xiàn)這種觀察。
附圖簡(jiǎn)述

圖1a和1b顯示了用于本發(fā)明的載體的構(gòu)建。
實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了主要用于研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制和研究實(shí)體瘤內(nèi)血管形成的模型系統(tǒng)。利用了可見(jiàn)標(biāo)記綠熒光蛋白(GFP)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，使得腫瘤在遷移和定位發(fā)展過(guò)程中向遠(yuǎn)離腫瘤的組織內(nèi)的遷移和定位能夠被跟蹤。此外，通過(guò)給予生物體例如羅丹明之類對(duì)比染料，還可以觀察到在GFP標(biāo)記的實(shí)體瘤內(nèi)的血管生成。
本發(fā)明各部分內(nèi)容中采用的標(biāo)記是綠熒光蛋白(GFP)。已經(jīng)由生物發(fā)光的水母Aequorea victoria克隆得到編碼該蛋白的天然基因(Morin，J.等，J.Cell.Physiol(1972)77313-318)。這種基因的獲得使得用GFP作為基因表達(dá)的標(biāo)記成為可能。GFP本是一種283個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其分子量為27KD。為了發(fā)熒光，它不需要其天然來(lái)源的其它蛋白，也不需要只存在于其天然來(lái)源的底物或輔因子。(Prasher，D.C.等，Gene(1992)111229-233；Yang，F(xiàn).等，NatureBiotechnol(1996)141252-1256；Cody，C.W.等，Biochemistry(1993)321212-1218)。GFP基因的突變體被發(fā)現(xiàn)可以用于加強(qiáng)表達(dá)和改善激發(fā)和熒光。GFP-S65T(其中第65位的絲氨酸被蘇氨酸所取代)在本發(fā)明中特別有用，在490nm處具有單一的激發(fā)峰。(Heim，R.等，Nature(1995)373663-664)；美國(guó)專利5,625,048。其它突變基因可以參見(jiàn)Delagrade，S.等，Biotechnology(1995)13151-154；Cormack，B.等，Gene(1996)17333-38和Cramer，A.等，Nature Biotechnol.(1996)14315-319。其它突變體還有美國(guó)專利5,625,048。適當(dāng)修飾可以改變GFP的發(fā)射光譜。所以，雖然本發(fā)明使用“GFP”一詞，但是所包括的蛋白質(zhì)并不一定顯現(xiàn)綠色。各種形式的“GFP”顯現(xiàn)除綠色之外的其它顏色，它們也包涵在“GFP”的定義之中，而且被用于本發(fā)明的方法和材料中。此外，需提出的是，本發(fā)明“GFP”所定義的綠熒光蛋白已經(jīng)從其它生物中分離得到，例如海母，Renilla reriformis。任何合適和適宜形式的GFP基因都可以用來(lái)修飾腫瘤細(xì)胞用于本發(fā)明的方法，和用于逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化內(nèi)源性腫瘤。以下實(shí)施例說(shuō)明使用的是特定的人源化hGFP-S65T克隆。
用GFP標(biāo)記一般細(xì)胞技術(shù)參見(jiàn)美國(guó)專利5,491,084。
在應(yīng)用之一中，本發(fā)明提供了一種模型系統(tǒng)，用于研究各種候選治療方法和物質(zhì)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的作用。
一般說(shuō)來(lái)，所述模型涉及修飾脊椎動(dòng)物，以哺乳動(dòng)物為佳，使之含有腫瘤組織，其中的腫瘤細(xì)胞本身經(jīng)修飾而含有GFP的表達(dá)系統(tǒng)。腫瘤細(xì)胞可以來(lái)自本發(fā)明經(jīng)修飾而含GFP和SV40 T-抗原表達(dá)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系?？梢栽谒龅募棺祫?dòng)物系統(tǒng)中通過(guò)給予含有GFP表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并使得這些細(xì)胞形成腫瘤。通常，這類給予是皮下的，而形成的腫瘤是實(shí)體塊。由此形成的腫瘤可以移植到任何合適的宿主組織內(nèi)并發(fā)展、轉(zhuǎn)移和發(fā)育。
培養(yǎng)初始腫瘤細(xì)胞的合適方法包括透皮注射產(chǎn)生GFP的腫瘤細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、Hela細(xì)胞，癌細(xì)胞細(xì)胞系和肉瘤細(xì)胞系，已建立成熟的細(xì)胞系(例如人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973，含GFP的人乳房癌細(xì)胞系MDA-MB468和MDA-MB435；人前列腺癌細(xì)胞系PC3和DU-145，人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系324，小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16)和本領(lǐng)域可以得到的其它細(xì)胞，還包括本發(fā)明的無(wú)限繁殖化細(xì)胞。給予的細(xì)胞經(jīng)修飾而含有GFP表達(dá)系統(tǒng)。在給予后，實(shí)體瘤逐漸發(fā)展，通常是在皮下注射部位。然后可以取出這些本身具有熒光的腫瘤用于移植到脊椎動(dòng)物模型中。
將已用GFP標(biāo)記的實(shí)體瘤移植到脊椎動(dòng)物中的技術(shù)包括通過(guò)外科正位移植(SOI)直接在所需部位植入，通常即腫瘤細(xì)胞來(lái)源部位。合適的部位包括肺、肝、胰、胃、乳房、卵巢、前列腺、骨髓、腦和其它惡性腫瘤易發(fā)組織。植入實(shí)體瘤后，該脊椎動(dòng)物即成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的模型。然后，令腫瘤發(fā)展和發(fā)育，監(jiān)測(cè)脊椎動(dòng)物，看是否在遠(yuǎn)離原移植部位的地方出現(xiàn)GFP標(biāo)記的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)將動(dòng)物開(kāi)膛并用熒光顯微鏡直接觀察器官對(duì)脊椎動(dòng)物的全身進(jìn)行監(jiān)測(cè)，或者切取組織進(jìn)行顯微鏡檢。有時(shí)，腫瘤具有足夠亮度，因此不需要開(kāi)膛-腫瘤可以透過(guò)皮膚直接被看到。只要GFP能夠被肉眼看到，就不需要染色組織樣品的顯影系統(tǒng)。組織樣品被適當(dāng)加工成大小合適的新鮮樣品切片，通常厚1mm，然后置于顯微鏡下接受檢查。這樣，即使少于10個(gè)細(xì)胞的集落也能被看見(jiàn)。本領(lǐng)域已知各種顯微顯影技術(shù)，任何合適的方法均可使用。
此外，可以在組織培養(yǎng)物中體外研究腫瘤的發(fā)育。這類研究的合適系統(tǒng)包括固相支持培養(yǎng)物，例如維持在膠原凝膠上的細(xì)胞等。
用作模型的脊椎動(dòng)物最好是哺乳動(dòng)物，例如家兔、大鼠、小鼠等常用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物更好。至于更近似人的動(dòng)物，可以采用靈長(zhǎng)類動(dòng)物。特別有用的是特別易發(fā)腫瘤的動(dòng)物，例如免疫系統(tǒng)受損的動(dòng)物，通常如裸鼠或SCID鼠。任何合適的脊椎動(dòng)物都可使用，選擇依據(jù)主要是方便和與最終感興趣的系統(tǒng)的相似性。
可在待移植腫瘤細(xì)胞內(nèi)起效的各種合適的表達(dá)系統(tǒng)均可使用。能夠在各種腫瘤中表達(dá)的許多載體可購(gòu)得。這些載體的特性根據(jù)腫瘤和載體來(lái)源的脊椎動(dòng)物而不同。但是，在使用GFP顯現(xiàn)模型系統(tǒng)內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)，宜采用無(wú)逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子或其它病毒啟動(dòng)子的載體，這些啟動(dòng)子會(huì)使得模型復(fù)雜化。
為了提供有助于建立用于此類模型系統(tǒng)的腫瘤的細(xì)胞系，宜使用向細(xì)胞提供SV40-T抗原的表達(dá)載體。該抗原的存在確保培養(yǎng)物的無(wú)限繁殖。所以，本發(fā)明中特別有用的是包含如下表達(dá)系統(tǒng)的載體同時(shí)產(chǎn)生GFP和SV40-T抗原。
為了轉(zhuǎn)染和修飾能夠產(chǎn)生腫瘤的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，各種合適的轉(zhuǎn)染方法都可以使用，例如脂質(zhì)體、磷酸鈣沉淀法、電穿孔和使用基因槍。以脂轉(zhuǎn)染為佳。
相對(duì)而言，如果本發(fā)明方法用來(lái)顯現(xiàn)生物體例如人癌癥患者體內(nèi)自發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移，宜使用含逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒啟動(dòng)子的載體。使用這類載體能夠?qū)FP表達(dá)系統(tǒng)插入到已經(jīng)存在的腫瘤內(nèi)。此外，該表達(dá)系統(tǒng)可含有編碼其他有用蛋白的核苷酸序列，所述的蛋白例如治療蛋白，從而能夠同時(shí)診斷轉(zhuǎn)移和進(jìn)行治療。這些合適的蛋白質(zhì)包括甲硫氨酸酶(參見(jiàn)PCT/US93/1131和PCT/US96/09935)。這類蛋白可以利用二順?lè)醋颖磉_(dá)系統(tǒng)生成與GFP的融合蛋白，或者用分別表達(dá)治療蛋白和GFP的相互獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生成獨(dú)立的蛋白。
Grignani，F(xiàn).等，Cancer Res.(1998)5814-19和Cheng，L.等，GeneTherapy(1997)41013-1022已經(jīng)說(shuō)明了基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的GFP表達(dá)系統(tǒng)。在這些報(bào)道中，逆轉(zhuǎn)錄病毒本身被用來(lái)轉(zhuǎn)染造血祖細(xì)胞，或者用包裝細(xì)胞來(lái)提供含病毒的上清液，然后直接用上清液感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這樣，在本發(fā)明方法中，脊椎動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤通常用經(jīng)修飾和包裝而含有GFP表達(dá)系統(tǒng)的病毒來(lái)感染。利用病毒的原位感染使得腫瘤獲得產(chǎn)生GFP的能力并有效標(biāo)記了自身。
各種用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。例如市售的載體和包裝系統(tǒng)，例如Clontech，San Diego，California的產(chǎn)品，包括它們的逆轉(zhuǎn)錄-X載體pLNCX和pLXSN，它們能夠通過(guò)在多克隆位點(diǎn)插入在多種啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)GFP。這些載體含有ψ*(延伸病毒包裝信號(hào))和用于選擇的抗生素抗性基因。許多此類系統(tǒng)已經(jīng)被用于基因治療，其中包括如下載體，它們具有一個(gè)夾在源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的5’和3’LTR之間的多克隆位點(diǎn)，因此可用于標(biāo)記人患者的腫瘤。
這樣，可以將如圖1a-1b所示的這類基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞內(nèi)，并直接傳遞給目標(biāo)腫瘤細(xì)胞，或可以用包裝細(xì)胞的上清液以逆轉(zhuǎn)錄病毒感染腫瘤細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒與包裝細(xì)胞的優(yōu)選組合包括包裝細(xì)胞內(nèi)的GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEIN在PT-67。包裝細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞的共培養(yǎng)使得GFP-逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移給了癌細(xì)胞。
已經(jīng)證明，利用組織培養(yǎng)技術(shù)和產(chǎn)生GFP-pLEIN病毒的PT-67包裝細(xì)胞上清液，能夠成功修飾人癌組織以顯示與GFP相關(guān)的熒光。體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，宜將病毒給予腫瘤局部，然后可以在注射包裝細(xì)胞或含病毒上清液后數(shù)小時(shí)內(nèi)觀察到病毒。惡性癌細(xì)胞可以通過(guò)其綠色來(lái)鑒定，有時(shí)綠色足夠亮從而可以透過(guò)皮膚直接看到腫瘤。
此外，除了在模型系統(tǒng)或脊椎動(dòng)物(通常是哺乳動(dòng)物，更多時(shí)是人腫瘤患者)中直接觀察腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)，本發(fā)明方法還可以用來(lái)觀察實(shí)體瘤內(nèi)的血管形成。如上所述，腫瘤本身含有GFP標(biāo)記。然后通常通過(guò)注射，以靜脈注射為佳，給予生物體對(duì)比染料，使得腫瘤內(nèi)的血管能被看到。合適的染料包括羅丹明及其它對(duì)比染料。形成與GFP的綠色相對(duì)比的顏色的各種染料都可以使用。較好的是，染料與惰性聚合物例如聚乙二醇偶聯(lián)，以此延長(zhǎng)染料滯留在血管中的時(shí)間。給予足量的染料以便于觀察；所需的染料量取決于所選的染料、腫瘤的部位、背景GFP的特性和觀察方法。數(shù)分鐘內(nèi)，可以觀察到腸系膜、結(jié)腸壁和網(wǎng)膜等區(qū)域內(nèi)實(shí)體瘤中生長(zhǎng)的血管。觀察可以持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，例如，用該方法數(shù)小時(shí)后的血管生長(zhǎng)仍可以觀察到。
以下實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1制備產(chǎn)生GFP的腫瘤細(xì)胞Zolotukhin，S.等在J Virol(1996)704646-4654中所述的人源化hGFP-S65T克隆被用作綠熒光蛋白編碼序列。這一密碼子優(yōu)化了的基因購(gòu)自Clontech Laboratories，Inc.(PaloAlto，CA)，將其連接到表達(dá)二順?lè)醋虞d體(pED-mtx1)，該載體購(gòu)自Genetics Institute，Cambridge，MA，參見(jiàn)Kaufman，R.J.等，Nucleic Acid Res(1991)194485-4490。用HindIII消化hGFP-S65T，并截平末端；用XbaI切取完整的hGFP編碼區(qū)，然后單向亞克隆到pED-mtx1內(nèi)，后者先已用PstI消化、截平末端并再用XbaI消化。
在含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100μM非必需氨基酸的DMEM中培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞。接近鋪滿的細(xì)胞與LipofectAMINETM試劑(GIBCO)和飽和量質(zhì)粒的沉淀混合物一起培育6小時(shí)，然后補(bǔ)充以新鮮的培養(yǎng)基。48小時(shí)后，用胰蛋白酶/EDTA收獲細(xì)胞，按照1∶15傳代到含1.5μM氨甲蝶呤(MTX)的選擇培養(yǎng)基中。在含MTX的培養(yǎng)基中挑選出穩(wěn)定整合了質(zhì)粒的細(xì)胞，用EDTA用克隆離心機(jī)(Bel-Art Products，Pequannock，NJ)分離。擴(kuò)增和轉(zhuǎn)移后，克隆-38因其高強(qiáng)度的GFP熒光和穩(wěn)定性被挑選出來(lái)。
以類似以上培育CHO-K1細(xì)胞的方法，培育得自Harbin Medical University，China的人肺癌細(xì)胞系，所不同的是，用RPMI164(GIBCO)代替DMEM。如上所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染、選擇和擴(kuò)增及轉(zhuǎn)移?？寺?26因其高強(qiáng)度的GFP熒光和穩(wěn)定性被挑選出來(lái)。
實(shí)施例2使用修飾后CHO細(xì)胞的小鼠模型該模型中使用的是在1.5μM MTX中穩(wěn)定且增殖速度與親代CHO-K1細(xì)胞相同(通過(guò)比較倍增時(shí)間來(lái)確定)的克隆-38。
給3只6周齡的Balb/C nu/nu雌性小鼠皮下注射單劑量107個(gè)克隆-38細(xì)胞，所述細(xì)胞利用胰蛋白酶消化回收并用低溫含血清培養(yǎng)液洗滌3次后保持在冰上。細(xì)胞在收獲后40分鐘內(nèi)以0.4ml的總體積注射，在注射后第3周處死裸鼠。小鼠全都患有皮下腫瘤，直徑為13.0mm至18.5mm(平均值＝15.2mm±2.9mm)。腫瘤組織發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。從培養(yǎng)的克隆-38細(xì)胞中抽提的GFP與由腫瘤制備的克隆-38細(xì)胞中抽提的相比，兩種細(xì)胞內(nèi)的GFP產(chǎn)生水平相同。
為了構(gòu)建這種模型，將上述培養(yǎng)的裸鼠皮下克隆-38腫瘤的片段(1mm3)通過(guò)外科正位移植術(shù)(SOI)移植到6個(gè)裸鼠的卵巢絨毛膜上，方法如Fu，X.等，AnticancerRes.(1993)13283-286，該文獻(xiàn)在此納為參考。簡(jiǎn)而言之，用異呋喃吸入法麻醉小鼠，沿左下腹直腸旁線至腹膜切開(kāi)，暴露出左卵巢和部分絨毛膜，用鑷子刮取。用8-0尼龍線將4份1mm3的腫瘤切片固定在刮取位置，然后將卵巢送回腹腔。用6-0絲線將腹壁和皮膚縫合。
4周后，將小鼠處死，取出肺及其它各種器官。將新鮮樣品制成約1mm厚的切片，在熒光和共焦顯微鏡下直接觀察。另外制備樣品，用于熒光和常規(guī)染色的組織學(xué)檢測(cè)。制備冷凍切片用磷酸鹽緩沖液洗滌樣品條，在4℃固定10分鐘；加入10％甲醛和0.2％戊二醛以及PBS，并用PBS洗滌樣品條。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用蘇木精和伊紅染色固定后的組織。
用配有Xenon燈源和GFP濾光器(Chromotechnology Corp.，Brattleboro，VT)的Nikon顯微鏡進(jìn)行光顯微和熒光顯微鏡檢。共焦顯微鏡即，在Nikon顯微鏡上裝一MR-600共焦造影系統(tǒng)(Bio-Rad)，使用氬激光儀。
在處死時(shí)，小鼠卵巢內(nèi)腫瘤的直徑為18.7mm至25.3mm(平均值＝21.9±3.1mm)。對(duì)組織不加處理，在熒光顯微鏡下觀察新鮮的器官組織，顯示腫瘤在整個(gè)腹腔內(nèi)播種，包括結(jié)腸(6/6小鼠)、盲腸(5/6)、小腸(4/6)、脾臟(1/6)和腹壁(6/6)。在全部小鼠的肺中都檢測(cè)到了許多微轉(zhuǎn)移，而且，在肝(1/6)、腎(1/6)、另一側(cè)卵巢(3/6)、腎上腺(2/6)、主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)(5/6)和胸膜(5/6)也檢測(cè)到多處微轉(zhuǎn)移。前文所述的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)技術(shù)無(wú)法測(cè)出單細(xì)胞微轉(zhuǎn)移，甚至難以測(cè)出多個(gè)細(xì)胞的集落。隨著集落的發(fā)育，病灶中心腫瘤細(xì)胞的密度顯著下降。
在另一實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)尾靜脈給裸鼠注射5×106個(gè)克隆-38細(xì)胞，兩分鐘后處死小鼠。用熒光顯微鏡分析新鮮的內(nèi)臟器官，顯現(xiàn)在腹壁血管內(nèi)有熒光細(xì)胞，它們?cè)诜?、肝、腎、脾、卵巢、腎上腺、胸腺和腦毛細(xì)血管內(nèi)形成栓。
這樣，用以上技術(shù)，隨播種細(xì)胞進(jìn)入相關(guān)靶器官內(nèi)發(fā)展成集落，可以觀察到微轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。而且，對(duì)微轉(zhuǎn)移的搜索可以在所有系統(tǒng)器官中快捷地進(jìn)行。
實(shí)施例3使用人肺癌細(xì)胞的鼠模型過(guò)程大致如實(shí)施例2所述，所不同的是，用如實(shí)施例1所述制備的克隆-26細(xì)胞代替克隆-38CHO細(xì)胞。
A.如實(shí)施例2所述，在6周齡的Balb/C nu/nu雄性小鼠內(nèi)培育腫瘤給小鼠皮下注射單劑量0.4ml 107個(gè)克隆-26細(xì)胞，40分鐘內(nèi)用胰蛋白酶消化收獲，用冷的含血清培養(yǎng)液洗滌3次。注射前，細(xì)胞保持在冰上。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到約1.2cm時(shí)處死動(dòng)物。直徑1.2cm的腫瘤形成于約5周后。
B.如Astoul，P.等，Anticancer Research(1994)1485-92；Astoul，P.J.Cell.Biochem(1994)569-15(在此納為參考)所述，將1mm3的腫瘤切片通過(guò)ISO移植到8個(gè)小鼠的左胸膜臟層。簡(jiǎn)而言之，用異呋喃吸入麻醉小鼠，在左胸橫切開(kāi)1cm，通過(guò)第4肋間間隔，使得整個(gè)肺萎陷(collapse)。用7-0尼龍手術(shù)線將5片腫瘤樣本縫合在一起，并固定成一個(gè)結(jié)。用鑷子將肺夾起，用單線將腫瘤縫入肺的下部，然后將肺放回胸腔，用單層6-0絲線將肌肉和皮膚縫合。用23號(hào)針抽除胸腔內(nèi)的氣體，使肺重新膨脹。
C.4周后處死4個(gè)小鼠，8周后處死另4個(gè)。4周組的隔膜腫瘤大244.40mm3-522.88mm3；8周組的隔膜腫瘤大1279.08mm3-2714.40mm3。這表示，平均值為371mm3和1799mm3。切取1mm厚的組織樣本，在配有Xenon燈源的Nikon顯微鏡和配有汞燈源和GFP濾光器的Leica立體熒光顯微鏡直接觀察。所有動(dòng)物都表現(xiàn)出胸壁侵入，和腫瘤的局部和區(qū)域性擴(kuò)散，但是在8周組的小鼠中，所有腫瘤都涉及縱隔和對(duì)側(cè)胸膜腔，以及在胸膜臟層和壁層上的轉(zhuǎn)移。在4周組的小鼠中有3個(gè)的肺門淋巴結(jié)有腫瘤，8周組的小鼠都患有腫瘤。8周組中有一小鼠測(cè)得頸淋巴結(jié)有腫瘤，但是沒(méi)有觀察到其它轉(zhuǎn)移。還在切取組織之前直接觀察動(dòng)物。在正常肺組織內(nèi)入侵的腫瘤邊緣可以測(cè)到GFP熒光，在腫瘤邊緣可以看到小血管在發(fā)展。
D.在另一實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)尾靜脈給8個(gè)裸鼠注射單劑量107個(gè)克隆-26細(xì)胞，這些細(xì)胞用胰蛋白酶消化收獲，用低溫含血清培養(yǎng)液洗滌3次。注射量為0.8ml，在收獲后40分鐘內(nèi)注射。同樣，4周時(shí)處死4只小鼠，8周時(shí)處死另外4只，獲取組織樣本，如前所述，用顯微鏡研究。在兩組的整個(gè)肺組織中都觀察到許多微轉(zhuǎn)移集落，4周組的直徑為5.2μm至32.5μm，8周組的直徑為5.5μm至178.3μm。8周組的集落與4周組的相比，沒(méi)有表現(xiàn)出進(jìn)一步的發(fā)展。在兩組小鼠的肺表面檢測(cè)到許多少于10細(xì)胞的小集落，在4周組的1只小鼠和8周組的2只小鼠的腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。8周組中有1個(gè)小鼠在腦內(nèi)、顎下腺、全肺、胰臟內(nèi)、兩側(cè)腎上腺內(nèi)、腹膜內(nèi)和肺門淋巴結(jié)內(nèi)有系統(tǒng)性轉(zhuǎn)移。
E.在另一實(shí)驗(yàn)中，與上一段相似，通過(guò)尾靜脈給小鼠注射107個(gè)克隆-26細(xì)胞，在第4周，第8周和第12周將小鼠處死，并如前所述地進(jìn)行組織檢查。與在第4周處死的相比，第8周處死的小鼠內(nèi)的大多數(shù)集落沒(méi)有明顯進(jìn)一步發(fā)展，但是在肺表面發(fā)現(xiàn)許多少于10個(gè)細(xì)胞且大小為5.5μm-110μm的少量細(xì)胞。在第12周，雖然其它集落到此時(shí)已經(jīng)廣泛生長(zhǎng)，它們的大小達(dá)到1100μm，但是主要是許多小的轉(zhuǎn)移集落，這表示在肺部存在著異質(zhì)性、優(yōu)勢(shì)性活性腫瘤集落。
實(shí)施例4克隆-26腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中的生長(zhǎng)給6周齡的SCID/SCID小鼠靜脈注射單劑量7.5×107個(gè)克隆-26細(xì)胞，該細(xì)胞如前所述通過(guò)胰蛋白酶消化收獲，用低溫含血清培養(yǎng)液洗滌3次，并保持在冰上。在細(xì)胞收獲后40分鐘內(nèi)，取0.5ml進(jìn)行注射。3周后，在整個(gè)肺組織內(nèi)觀察到許多微轉(zhuǎn)移集落，直徑達(dá)約550μm。5周后，將小鼠處死，植有克隆-26的小鼠肺被取出，采用Leighton，J.Cancer Res.(1957)17929-941；Leighton，J.等，Cancer Res.(1960)20575-597；Hoffman，R.M.Cancer Cells(1991)386-92所的組織培養(yǎng)法將其培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)凝膠上。腫瘤集落在肺組織內(nèi)迅速擴(kuò)散，1周后，腫瘤細(xì)胞開(kāi)始侵入支持用膠原海綿凝膠上并在其上形成集落。2周后，在遠(yuǎn)離肺組織內(nèi)原發(fā)集落的海綿凝膠內(nèi)，腫瘤細(xì)胞形成衛(wèi)星集落，這樣，在組織培養(yǎng)中比在SCID小鼠內(nèi)生長(zhǎng)得更快。腫瘤集落可以在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)一個(gè)月以上。
實(shí)施例5GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和標(biāo)記腫瘤細(xì)胞系的制備圖1a和1b顯示的是受SV40啟動(dòng)子調(diào)控的GFP表達(dá)載體的構(gòu)建。該結(jié)構(gòu)物使用購(gòu)自Clontech的pEGFP系列載體。細(xì)菌和哺乳動(dòng)物載體都有，它們除了GFP之外還產(chǎn)生其它蛋白，它們或者以融合蛋白的形式產(chǎn)生，或者在二順?lè)醋酉到y(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生。圖1a顯示的是表達(dá)載體pGFP/Met的構(gòu)建，它用于產(chǎn)生GFP與甲硫氨酸酶的融合蛋白；圖1b顯示的是載體pGFP/SV40的構(gòu)建，用于產(chǎn)生GFP與SV40T抗原的融合蛋白。
購(gòu)得的載體含有采用實(shí)施例6中的pLEIN系統(tǒng)的具有理想光譜特征的GFP編碼序列，將它們轉(zhuǎn)染到來(lái)自腫瘤的細(xì)胞系內(nèi)，所述腫瘤例如人乳房癌腫瘤、人前列腺癌腫瘤、人惡性膠質(zhì)瘤和鼠黑色素瘤。用這種方式建立起帶綠熒光蛋白標(biāo)記的人乳房癌細(xì)胞系MF-7、MDA-MB468和MDA-MB435、人前列腺癌細(xì)胞系PC3和DU145、人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系324、人肺癌細(xì)胞Anip-73和H460、人結(jié)腸癌細(xì)胞系Colo-205、HCT-15和WiDr、人胃癌細(xì)胞系NVGC-4、人腎癌細(xì)胞系SN12C、人舌癌細(xì)胞系SCC-25、人黑色素瘤LOX和SK-mel-5、來(lái)自細(xì)胞系CHO-K1的標(biāo)記的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞和鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16。
SV-40T抗原被用來(lái)使培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)限繁殖化，以便建立永久性細(xì)胞系。所以，將pGFP/SV40載體轉(zhuǎn)染到一系列腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中提供發(fā)熒光的無(wú)限繁殖細(xì)胞系。
實(shí)施例6體內(nèi)標(biāo)記已建立的腫瘤用無(wú)標(biāo)記Anip973細(xì)胞代替克隆-26細(xì)胞，用實(shí)施例3中A段和B段的方法在小鼠內(nèi)建立人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973的無(wú)標(biāo)記腫瘤。然后給小鼠注射1×107個(gè)包裝細(xì)胞，后者為含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體GFP-逆轉(zhuǎn)錄病毒pLEIN的PT67細(xì)胞。該病毒包裝系統(tǒng)購(gòu)自Clontech，SanDiego，California。pLEIN含有EGFP編碼序列插入片段，EGFP是GFP野生型的一種紅移變異體，已經(jīng)過(guò)優(yōu)化可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更亮的熒光和更高的表達(dá)。它的最大激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為507nm。這一突變蛋白具有兩處氨基酸取代，第64位的Phe變成Leu，第65位的Ser變成Thr。參見(jiàn)Comack，B.等，Gene(1996)17331-38。按照Haas，J.等，CurrBiol(1996)6315-324所述，為了使人密碼子的使用偏性最大化，應(yīng)有超過(guò)190處的沉默堿基改變。這樣，pLEIN含有上述GFP的編碼序列，該序列插入在pLXIN的多克隆位點(diǎn)內(nèi)，獲得一個(gè)二順?lè)醋颖磉_(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠協(xié)調(diào)GFP和新霉素抗性的翻譯。將細(xì)胞注射入小鼠腹腔后3天，在亮視野顯微鏡下和熒光顯微鏡下可以觀察到精囊內(nèi)的腫瘤。
實(shí)施例7血管形成的觀察如實(shí)施例1所述，將含有1×107個(gè)克隆-38細(xì)胞的懸浮液注入小鼠的腹腔。5天后，從小鼠的尾部注射羅丹明，然后將其麻醉，打開(kāi)腹腔，開(kāi)口大至足以看到腫瘤。由以上手術(shù)恢復(fù)是很容易的。有時(shí)，不需要打開(kāi)腹腔，因?yàn)橥ㄟ^(guò)完好的皮膚可以直接看到腹腔內(nèi)的腫瘤。根據(jù)羅丹明的熒光，可以看到腹腔內(nèi)的腫瘤，血管形成也很明顯。在小腸壁網(wǎng)膜中和腸系膜中可以看到類似的結(jié)果。
在類似的實(shí)驗(yàn)中，如實(shí)施例1所述將含有1×107個(gè)克隆-26細(xì)胞的懸浮液注入小鼠的腹腔。1天后，腫瘤在腸系膜和結(jié)腸壁上出現(xiàn)。將小鼠麻醉后作最小的腹腔開(kāi)口可以觀察到以上情況。第3天對(duì)類似處理的小鼠的觀察發(fā)現(xiàn)，除了小腸壁和網(wǎng)膜外，還在節(jié)腸壁和腸系膜內(nèi)有腫瘤。第5天，給類似處理的小鼠從尾部注射100μl 2×10-3M羅丹明，在生長(zhǎng)于腸系膜內(nèi)的腫瘤內(nèi)可以看到少量血管。60天后，在生長(zhǎng)于結(jié)腸壁的腫瘤內(nèi)可以看到大量血管。
權(quán)利要求
1.一種跟蹤原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的方法，該方法包括可選性地對(duì)經(jīng)修改而含有表達(dá)綠熒光蛋白(GFP)的腫瘤的脊椎動(dòng)物進(jìn)行開(kāi)膛，并觀察組織中有否熒光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的動(dòng)物被開(kāi)膛。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中至少有些組織被切除。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的被切除組織接受顯微鏡鏡檢。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的脊椎動(dòng)物經(jīng)修飾后含有通過(guò)手術(shù)正位移植法植入的表達(dá)GFP的腫瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性原發(fā)腫瘤經(jīng)修飾后含有GFP的表達(dá)系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的表達(dá)系統(tǒng)包含一個(gè)病毒啟動(dòng)子；而且/或所述的脊椎動(dòng)物是人；而且/或所述的表達(dá)系統(tǒng)還含有編碼治療蛋白的核苷酸序列。
8.一種脊椎動(dòng)物，經(jīng)修飾后含有表達(dá)GFP的腫瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的脊椎動(dòng)物，它是哺乳動(dòng)物；而且/或所述的動(dòng)物是免疫力低下的；而且/或所述的腫瘤是肺腫瘤或卵巢腫瘤；而且/或所述的GFP是hGFP-ST65T；而且/或其中，表達(dá)GFP的腫瘤是通過(guò)手術(shù)移植表達(dá)GFP的前體腫瘤到如下組織或器官部位而得到的，腫瘤所含的細(xì)胞即來(lái)自所述的前體腫瘤含有的細(xì)胞，或者，所述的表達(dá)GFP的腫瘤是通過(guò)將GFP表達(dá)系統(tǒng)提供給所述動(dòng)物的內(nèi)源腫瘤得到的。
10.一種經(jīng)修飾而能產(chǎn)生GFP的腫瘤細(xì)胞，其中的腫瘤細(xì)胞被如下表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，該載體包含在異源調(diào)控序列調(diào)控下的編碼所述GFP的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，它是無(wú)限繁殖化細(xì)胞系。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞系，它是人乳房癌細(xì)胞系、人前列腺癌細(xì)胞系、人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系、人肺癌細(xì)胞系、人結(jié)腸癌細(xì)胞系、人胃癌細(xì)胞系、人腎癌細(xì)胞系、人舌癌細(xì)胞系、人黑色素瘤細(xì)胞系、小鼠黑色素瘤細(xì)胞系或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系。
13.經(jīng)修飾而能產(chǎn)生GFP的腫瘤細(xì)胞，所述的腫瘤細(xì)胞被含有如下核苷酸序列的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染，所述核苷酸序列編碼GFP還編碼治療蛋白或無(wú)限繁殖化蛋白。
14.制備含有表達(dá)GFP的腫瘤的脊椎動(dòng)物的方法，所述方法包括給脊椎動(dòng)物皮下注射權(quán)利要求10所述的腫瘤細(xì)胞，注射量足以在所述動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生腫瘤，該方法或者包括在所述動(dòng)物體內(nèi)引入所述GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)。
15.一種含有轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的脊椎動(dòng)物組織或由這種組織制得的組織培養(yǎng)物，其中所述的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生GFP。
16.一種觀察脊椎動(dòng)物腫瘤中血管形成的方法，該方法包括可選性地暴露出所述動(dòng)物的組織并觀察所述腫瘤中的血管，其中所述的血管通過(guò)對(duì)比染料的存在而可以看見(jiàn)，所述的腫瘤已經(jīng)經(jīng)修飾而能表達(dá)GFP。
17.一種無(wú)限繁殖細(xì)胞系，其中的細(xì)胞是經(jīng)修飾而含有SV40-T抗原和可視量GFP的細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種跟蹤原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的方法,該方法包括取出脊椎動(dòng)物的新鮮器官組織,所述動(dòng)物經(jīng)修飾已經(jīng)含有表達(dá)GFP的腫瘤細(xì)胞,觀察切取的組織中有否熒光。也可以原位觀察熒光。含有產(chǎn)生GFP的腫瘤的脊椎動(dòng)物主體可用作研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的模型。此外,可以處理已經(jīng)具有腫瘤的動(dòng)物,將內(nèi)源性腫瘤修飾成含有GFP。這可以用于臨床。最后,給含有GFP－標(biāo)記的腫瘤的動(dòng)物注射對(duì)比染料可以直接觀察腫瘤內(nèi)的血管形成。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1264429SQ98804513
公開(kāi)日2000年8月23日 申請(qǐng)日期1998年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月28日
發(fā)明者譚玉英, 千島隆司 申請(qǐng)人:抗癌股份有限公司 被以下專利引用 (2),