專利名稱：惡病質(zhì)的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及惡病質(zhì)的治療劑，它包括作為活性組分的能抑制甲狀旁腺素(PTHrP)與其受體之間結(jié)合的物質(zhì)。
背景技術(shù)：
在晚期癌患者中可見(jiàn)的惡病質(zhì)是惡性腫瘤的一種常見(jiàn)綜合癥，其特征為系統(tǒng)紊亂，主要癥狀為厭食、體重減輕、貧血、電解質(zhì)失衡和免疫功能降低。癌患者中惡病質(zhì)的發(fā)展導(dǎo)致死亡和晚期癥狀、損害患者的生活質(zhì)量(QOL)并對(duì)患者及其家屬和周圍的人們帶來(lái)強(qiáng)烈的心理、物質(zhì)和社會(huì)的影響。
最近發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是癌癥惡病質(zhì)的致病因素的惡病質(zhì)素與腫瘤壞死因子(TNF)相同。其后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子(如白介素(IL)-1、IL-6、LTF、IFN)也具有與惡病質(zhì)素同樣的作用，因而惡病質(zhì)是由多種因子的組合作用所誘導(dǎo)。
已知從人口腔癌得到的OCC-1細(xì)胞系能產(chǎn)生涉及腫瘤惡病質(zhì)的多種液體因子。注射OCC-1細(xì)胞的裸鼠發(fā)展出包括惡病質(zhì)的多種癥狀(Kajimura N.et al.，Cancer Chemother.Pharmacol.，1996，38 Suppl.pS48-52；Tanaka R.et al.，Jpn.J.Clin.Oncology Apr.1996，26(2)p88-94)。據(jù)信這是因?yàn)樽⑸溥M(jìn)裸鼠的OCC-1細(xì)胞系在細(xì)胞的生長(zhǎng)中產(chǎn)生了多種細(xì)胞因子(如G-CSF、IL-6、LTF、IL-11、PTHRP)，這些因子在裸鼠中的組合作用導(dǎo)致了這些癥狀。
在注射OCC-1細(xì)胞系的裸鼠中發(fā)現(xiàn)的癥狀與人晚期癌癥患者表現(xiàn)出的癥狀高度相似。然而，還沒(méi)有涉及惡病質(zhì)的藥物和治療劑的報(bào)告。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的目的是要提供惡病質(zhì)的治療劑，它包括作為活性組分的能抑制甲狀旁腺素(PTHrP)與其受體之間結(jié)合的物質(zhì)。
本發(fā)明人為發(fā)現(xiàn)這些治療劑進(jìn)行了廣泛和深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)能抑制PTHrP與其受體之間結(jié)合的物質(zhì)能達(dá)到如此效果。該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
也就是，本發(fā)明涉及惡病質(zhì)的治療劑，它包括作為活性組分的能抑制PTHrP與其受體之間結(jié)合的物質(zhì)。
在本發(fā)明中，“惡病質(zhì)”包括由癌癥帶來(lái)的那些癥狀。
本發(fā)明涉及惡病質(zhì)的治療劑，它包括作為活性組分的能抑制甲狀旁腺素(此后稱為“PTHrP”)與其受體(此后稱為“PTHrP受體”)之間結(jié)合的物質(zhì)。
在此使用的“PTHrP受體”是指能與PTHrP結(jié)合的任何受體(例如那些在日本國(guó)家階段公開(kāi)的No.6-506598中描述的那些受體)，而不管PTHrP受體是否在靶器官(如骨、腎)上。
在此使用的“能抑制PTHrP與其受體(PTHrP受體)之間結(jié)合的物質(zhì)”是指能結(jié)合到PTHrP上以阻止PTHrP與PTHrP受體結(jié)合的任何物質(zhì)如抗-PTHrP抗體、能結(jié)合到PTHrP受體上以阻止PTHrP受體與PTHrP結(jié)合的任何物質(zhì)如對(duì)抗PTHrP受體的拮抗劑(PTHrP拮抗劑)，特別是由PTHrP肽置換或缺失至少一個(gè)氨基酸殘基而得的肽或由部分PTHrP肽序列組成的肽，或它們的組合。
抗-PTHrP抗體包括那些已知的任何種類，如人源化抗體、人抗體(WO 96/33735)或嵌合抗體(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)No.4-228089)?？贵w可是多克隆型或單克隆型，但優(yōu)選為單克隆型。PTHrP拮抗劑包括多肽或低分子量物質(zhì)。PTHrP拮抗劑包括以對(duì)抗PTHrP的拮抗方式與PTHrP受體結(jié)合的物質(zhì)，如在日本專利申請(qǐng)公開(kāi)No.7-165790；肽(Peptides)(美國(guó))，1995，6(6)1031-1037；生物化學(xué)(Biochemistry)(美國(guó))Apr.281992，31(16)4026-4033和日本國(guó)家階段公開(kāi)No.5-509098中描述的具有PTHrP拮抗活性的一種多肽。這些多肽可以有至少一個(gè)氨基酸殘基的缺失、置換、增加或插入，只要它們能保持相當(dāng)?shù)腜THrP拮抗活性，也被包括在本發(fā)明的PTHrP拮抗劑之中。
下面，本發(fā)明將要在用一種抗-PTHrP抗體作為“能抑制PTHrP與PTHrP受體之間的結(jié)合的物質(zhì)”的示范中被詳細(xì)描述。
1.抗-PTHrP抗體在本發(fā)明中應(yīng)用的抗-PTHrP抗體可以是能表現(xiàn)對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的任何一種抗體，不管它的來(lái)源、類型(單克隆或多克隆)和構(gòu)型。
在本發(fā)明中應(yīng)用的抗-PTHrP抗體可以由任何已知的多克隆或單克隆抗體方法生產(chǎn)。優(yōu)選地，抗-PTHrP抗體是來(lái)自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。從哺乳動(dòng)物來(lái)的單克隆抗體包括那些從雜交瘤中和通過(guò)基因工程技術(shù)從用載有此抗體基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主中生產(chǎn)的抗體。在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體能結(jié)合到PTHrP上以阻止PTHrP與PTH/PTHrP受體的結(jié)合，因而阻止PTHrP的信號(hào)傳導(dǎo)，其結(jié)果是阻止PTHrP的生物學(xué)活性。
此類抗體的一個(gè)具體例子是#23-57-137-1抗體，它可從雜交瘤克隆#23-57-137-1中被生產(chǎn)出來(lái)。
雜交瘤克隆#23-57-137-1被命名為“鼠-鼠雜交瘤#23-57-137-1”并按照《布達(dá)佩斯條約》于1996年8月15日被保存在日本的日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，其保藏編號(hào)為No.FERM BP-5631。
2.產(chǎn)生抗體的雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可由任何已知技術(shù)生產(chǎn)。那就是，依據(jù)通常的免疫方法，將PTHrP用作抗原而進(jìn)行免疫反應(yīng)。得到的免疫細(xì)胞與已知的親本細(xì)胞按通常的細(xì)胞融合方法融合，用通常的篩選方法從融合細(xì)胞中篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
更具體地講，產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞可以下述的程序來(lái)制備。
第一步，被用作用于生產(chǎn)抗體的致敏抗原的人PTHrP通過(guò)表達(dá)由Suva，L.J.等在Science(1987)237，893中公開(kāi)的PTHrP基因/氨基酸序列而得到。即將編碼PTHrP的核苷酸序列嵌入到任何已知的表達(dá)載體中去，再用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中或從被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中用已知方法分離和純化PTHrP蛋白質(zhì)。
第二步，把純化的PTHrP蛋白質(zhì)用作致敏抗原?；蛘撸蓪THrPN-末端的34個(gè)氨基酸的肽用作致敏抗原，該肽可被化學(xué)合成。
可用致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物不被特別地限制。然而，由于考慮到其與用于融合的親代細(xì)胞的相容性而優(yōu)先選擇哺乳動(dòng)物。一般地，嚙齒類動(dòng)物(如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔)或猴可被應(yīng)用。
用致敏抗原免疫哺乳動(dòng)物，可按任何已知的方法完成，例如，腹腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原給哺乳動(dòng)物。更具體地，將致敏抗原用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水適度稀釋并懸浮于其中，接著把得到的懸浮液與適量的佐劑(如弗氏完全佐劑)混合得到乳濁液。以4到21天的間隔幾次注射乳濁液給哺乳動(dòng)物。在此免疫中，可將致敏抗原連接到合適載體上。
免疫后，檢測(cè)血清抗體水平。當(dāng)血清抗體水平被確定已達(dá)到期望的水平時(shí)，從哺乳動(dòng)物中分離出免疫細(xì)胞并用于細(xì)胞融合。優(yōu)選的免疫細(xì)胞為脾細(xì)胞。
用作細(xì)胞融合的親本細(xì)胞(即與免疫細(xì)胞融合的細(xì)胞)是從哺乳動(dòng)物而來(lái)的骨髓瘤細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞可是任何一種已知的細(xì)胞系，例如可以是P3(P3x63Ag8.653)(免疫學(xué)雜志(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(當(dāng)前微生物學(xué)和免疫學(xué)中的論題Current Topicsin Microbiology and Immunology)(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler，G.AndMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies，D.H.et al.，細(xì)胞(Cell)(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，自然(Nature)(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)或R210(Galfre，G.et al.，自然(Nature)(1979)277，131-133)。
免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合基本依據(jù)任何已知的方法進(jìn)行，如Milstein等的方法(Kohler，G.and Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)就可被優(yōu)選應(yīng)用。
更具體地講，例如，使細(xì)胞融合在有細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在的普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。細(xì)胞融合促進(jìn)劑可以是聚乙二醇或仙臺(tái)病毒(日本血凝病毒，HVJ)。如果需要，為提高融合效率，也可加入二甲亞砜。
用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞間的比例可以是任意的。例如，所用的免疫細(xì)胞比骨髓瘤細(xì)胞多1-10倍。用于細(xì)胞融合的培養(yǎng)基是例如適合骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的RPMI 1640培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基或其他通常被用來(lái)培養(yǎng)這些細(xì)胞的培養(yǎng)基。如果需要，血清如胎牛血清可被加到培養(yǎng)基中。
細(xì)胞融合如下進(jìn)行在培養(yǎng)基中將給定量的免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞很好地混合，加入PEG溶液(例如，平均分子量為大約1000-6000)(已被事先預(yù)熱到大約37℃)通常致其濃度為30-60％(w/v)，接著混合得到的溶液以得到融合細(xì)胞(雜交瘤)。接著，加入合適的培養(yǎng)基到培養(yǎng)溶液中，離心除去上清。重復(fù)本程序幾次以除去培養(yǎng)基中的對(duì)雜交瘤生長(zhǎng)不利的細(xì)胞融合促進(jìn)劑或類似物。
得到的雜交瘤可通過(guò)在通常的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)而選擇，如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培養(yǎng)基(HAT)。雜交瘤在HAT培養(yǎng)基中應(yīng)培養(yǎng)足夠的時(shí)間以使不是期望的雜交瘤的細(xì)胞(即沒(méi)能雜交的細(xì)胞)死亡，通常是培養(yǎng)幾天到幾個(gè)星期。接著，應(yīng)用通常的限度稀釋方法來(lái)篩選和單克隆分泌目的抗體的雜交瘤。
另外，對(duì)PTHrP具有結(jié)合活性的人抗體，可在體外通過(guò)應(yīng)用PTHrP將人淋巴細(xì)胞致敏，接著再把致敏的淋巴細(xì)胞與能無(wú)限增長(zhǎng)的來(lái)自人的骨髓瘤細(xì)胞(日本專利No.1-59878)雜交而得到?；蛘?，抗-PTHrP的人抗體可如下制備，即注射作為抗原的PTHrP到具有人抗體基因的全部組成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，以得到生產(chǎn)抗-PTHrP抗體的細(xì)胞，再把細(xì)胞無(wú)限增殖化，從而可從無(wú)限增殖化的細(xì)胞中得到人抗體(國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)Nos.WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918和WO94/02602)。
由上述方法制備的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可在通常的培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)并在液氮中長(zhǎng)期保存。
為從雜交瘤中生產(chǎn)單克隆抗體，可用包括依據(jù)通常方法培養(yǎng)雜交瘤和從培養(yǎng)液上清中收集單克隆抗體的方法，或包括注射雜交瘤到與雜交瘤相容以使雜交瘤在其體內(nèi)生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物和從所用的哺乳動(dòng)物的腹水中收集雜交瘤的方法。前一種方法適合用來(lái)生產(chǎn)高純度的抗體，而后一種方法適合用來(lái)生產(chǎn)大量的抗體。
3.重組抗體在本發(fā)明中，也可應(yīng)用重組類型的單克隆抗體。這種抗體可依據(jù)通常的基因重組技術(shù)(參見(jiàn)，例如Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)來(lái)生產(chǎn)，包括從雜交瘤中克隆出抗體基因，把抗體基因整合到合適的載體中，把載體引入宿主，再?gòu)乃拗髦猩a(chǎn)出抗體。
更具體地講，從產(chǎn)生抗-PTHrP抗體的雜交瘤中分離出編碼抗-PTHrP抗體的可變區(qū)的mRNA。該mRNA的分離程序?yàn)?，用任何已知的方法制備總RNA，例如胍超離心方法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)和AGPC方法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)，接著用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)或其類似物從總RNA中得到目的mRNA。或者，該mRNA也可應(yīng)用mRNA快速純化試劑盒(Pharmacia)直接制備。
下一步，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA合成抗體V-區(qū)域的cDNA。應(yīng)用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(Seikagaku公司)或其類似物來(lái)合成cDNA。也可使用5′-Ampli Finder Race Kit(Clontech)通過(guò)5′-RACE方法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85.8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)并與PCR方法相結(jié)合，或其類似方法來(lái)合成和擴(kuò)增cDNA。
將目的DNA片段從得到的PCR產(chǎn)物中分離和純化出來(lái)，并被連接DNA載體上去，形成重組載體。將重組載體導(dǎo)入宿主如大腸桿菌中，選擇含有期望的重組載體的菌落。用如雙脫氧核苷酸鏈終止方法來(lái)確認(rèn)在重組載體中的目的DNA片段。
一旦得到編碼抗-PTHrP抗體的V-區(qū)域的DNA，就把DNA整合到包含編碼抗體恒定區(qū)(C)的DNA的表達(dá)載體中去。
為生產(chǎn)在本發(fā)明中應(yīng)用的抗-PTHrP抗體，將抗體基因整合到表達(dá)載體上去，因而抗體基因可在表達(dá)控制區(qū)域(如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子)的控制下表達(dá)。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以表達(dá)抗體。
在抗體基因的表達(dá)中，編碼抗體重鏈(H)的DNA與編碼抗體輕鏈(L)的DNA可以被整合到不同的表達(dá)載體上，接著將宿主細(xì)胞用得到的重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化。或者，編碼抗體H-鏈和L-鏈的DNA可被整合到同一的表達(dá)載體中，接著用得到的此重組表達(dá)載體(WO94/11523)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
在重組抗體的生產(chǎn)中，除了上述的宿主細(xì)胞外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可被用作宿主。例如，將抗體基因整合到編碼動(dòng)物奶中的固有蛋白(如羊β-酪蛋白)的基因的預(yù)定位點(diǎn)上以得到融合基因。將包括引入了抗體基因的融合基因的DNA片段注射到羊胚胎中，接著把胚胎引入雌羊中。有此胚胎的雌羊就懷有轉(zhuǎn)基因羊。目的抗體就從轉(zhuǎn)基因羊或其后代的奶中分泌出來(lái)。為增加含有抗體的奶量，可給轉(zhuǎn)基因羊施用適合的激素(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
4.被修飾的抗體在本發(fā)明中，為了降低對(duì)人體或其類似體的異源性，可以應(yīng)用人工修飾的重組抗體，包括嵌合抗體和人源化的抗體。這些修飾的抗體可通過(guò)已知的方法來(lái)制備。
在本發(fā)明中可用的嵌合抗體的制備可如下完成連接用上述方法制備的編碼抗體V-區(qū)的DNA和編碼人抗體C-區(qū)的DNA，把連接產(chǎn)物整合到表達(dá)載體上去，并把得到的重組表達(dá)載體引入宿主中來(lái)產(chǎn)生嵌合抗體。
人源化抗體也被稱為“改形的人抗體”，其中非人哺乳動(dòng)物(如小鼠)的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)被嫁接到人的抗體上。生產(chǎn)這種人源化抗體的一般基因重組程序是已知的(EP 125023；WO96/02576)。
具體地講，設(shè)計(jì)出一個(gè)小鼠抗體CDRs通過(guò)框架區(qū)(FRs)連接起來(lái)的DNA序列，并通過(guò)應(yīng)用以幾個(gè)寡核苷酸為引物的PCR方法來(lái)合成，該引物被設(shè)計(jì)含有與CDRs和FRs的末端區(qū)相重疊的區(qū)域。將得到的DNA與編碼人抗體C-區(qū)的DNA連接，連接產(chǎn)物被整合到表達(dá)載體上去。把得到的重組表達(dá)載體引入宿主中以生產(chǎn)人源化的抗體(EP239044，WO 96/02576)。對(duì)通過(guò)CDRs連接的FRs加以選擇以使CDRs能形成令人滿意的抗原結(jié)合區(qū)。如果需要，可將抗體V-區(qū)的FRs中的一個(gè)(或幾個(gè))氨基酸置換以使改形的人抗體能形成適合的抗原結(jié)合位點(diǎn)(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌合抗體或人源化抗體的C-區(qū)可是任何人抗體的C-區(qū)，如H-鏈的Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，和L-鏈的Cκ或Cλ。為了提高抗體的穩(wěn)定性或?yàn)榱吮ＷC抗體的穩(wěn)定產(chǎn)生，人抗體的C-區(qū)可被修飾。
嵌合抗體由來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物抗體的V-區(qū)和來(lái)自人抗體的C-區(qū)組成。人源化的抗體由來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物抗體的CDRs和來(lái)自人抗體的FRs與C-區(qū)組成。人源化的抗體對(duì)于本發(fā)明的治療劑來(lái)說(shuō)是特別有用的活性成分，因?yàn)榇丝贵w對(duì)人體的抗原性已被減低。
在本發(fā)明中應(yīng)用的人源化抗體的一個(gè)具體例子是人源化抗體#23-57-137-1；其CDRs來(lái)自源于小鼠產(chǎn)生的抗體#23-57-137-1，其L-鏈由通過(guò)三個(gè)來(lái)自人抗體HSU 03868(GEN-BANK，Deftos，M.et al.，Scan.J.Immunol.，39，95-103，1994)的FRs(FR1、FR2和FR3)連接的CDRs和來(lái)自人抗體S25755(NBRF-PDB)的FR(FR4)組成；其H-鏈由通過(guò)來(lái)自人抗體S31679(NBRF-PDB，Guisinier，A.M.et al.，Eur.J.Immunol.23，110-118，1993)的FRs連接的CDRs組成，其中FRs中氨基酸殘基的一部分被置換以使該被改形的人源化抗體能表現(xiàn)出抗原結(jié)合活性。
分別含有編碼人源化抗體#23-57-137-1的H-鏈和L-鏈的DNA的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，分別被命名為大腸桿菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)(為H-鏈)和大腸桿菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)(為L(zhǎng)-鏈)。這些菌株按照《布達(dá)佩斯條約》于1996年8月15日被保存在日本的日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，其中大腸桿菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)編號(hào)為No.FERM BP-5629，大腸桿菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)的編號(hào)為No.FERM BP-5630。
5.抗體變異體在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體可以是其任何片段或此片段的修飾物，只要它能結(jié)合PTHrP并抑制PTHrP的活性即可。例如，該抗體片段包括Fab、F(ab’)2、Fv或由通過(guò)一個(gè)適合的連接子連接的H-鏈Fv片段或L-鏈Fv片段組成的單鏈Fv(scFv)。具體地講，這些抗體片段可通過(guò)用酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)把抗體切割成抗體片段來(lái)得到，或者通過(guò)重組構(gòu)建編碼抗體片段的基因、把基因插入到表達(dá)載體、將得到的重組表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞而表達(dá)出抗體片段(參見(jiàn)，例如Co，M.S.，et al.，免疫學(xué)雜雜(J.Immunol.)(1994)，152，2968-2976；Better，M.& Horwitz，A.H.，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(1989)，178，476-496，Academic Press，Inc.；Plueckthun，A.& Skerra，A.，酶學(xué)方法(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.；Lamoyi，E.，酶學(xué)方法(1989)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，酶學(xué)方法(1989)121，663-669；and Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可通過(guò)連接子連接H-鏈V-區(qū)和L-鏈V-區(qū)而得到，所述連接子優(yōu)選為肽連接子(Huston，J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，5879-5883)。在scFv中的H-鏈V-區(qū)和L-鏈V-區(qū)可從在此描述的任何一個(gè)抗體中得到。聯(lián)結(jié)V-區(qū)的肽連接子可以是任何單鏈肽，例如12-19個(gè)氨基酸殘基的肽。
編碼scFv的DNA可通過(guò)以下步驟制備首先分別擴(kuò)增編碼抗體H-鏈V-區(qū)和L鏈V-區(qū)的DNA，應(yīng)用編碼抗體H-鏈全部或其部分(包括V-區(qū))的DNA片段和編碼L-鏈全部或其部分(包括V-區(qū))的DNA片段做為模板和決定DNA片段末端的引物對(duì)；其次擴(kuò)增編碼肽連接子的DNA，應(yīng)用編碼肽連接子的DNA片段做為模板和決定DNA片段末端的引物對(duì)，從而肽連接子的兩末端都分別與H鏈V-區(qū)和L鏈V-區(qū)相連。
一旦制備了編碼scFv的DNA，就可應(yīng)用通常的方法來(lái)制備載有DNA的表達(dá)載體和用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主?？捎萌魏瓮ǔ５姆椒◤谋晦D(zhuǎn)化的宿主中制備scFv。
如上所述，在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體片段可以通過(guò)制備此片段的基因和在適合的宿主中表達(dá)此基因來(lái)得到。這些抗體片段也被包括在本發(fā)明的“抗體”之中。
作為上述抗體的被修飾形式，例如，與任何分子(如聚乙二醇)偶聯(lián)的抗-PTHrP抗體也可被應(yīng)用。這些被修飾的抗體也被包括在本發(fā)明的“抗體”之中。被修飾的抗體可通過(guò)對(duì)抗體的化學(xué)修飾來(lái)制備。適于本目的的化學(xué)修飾技術(shù)已為本領(lǐng)域所建立。
6.重組抗體和被修飾抗體的表達(dá)與生產(chǎn)如上述所構(gòu)建的抗體基因可由已知的方法來(lái)生產(chǎn)與表達(dá)。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，需操作性地連接一個(gè)通常有用的啟動(dòng)子、要表達(dá)的抗體基因和poly(A)信號(hào)(位于抗體基因的3′-端下游)。例如，做為有用的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)，人巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)可被應(yīng)用。
其他的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)，例如那些來(lái)自病毒(如逆病毒、多瘤病毒、腺病毒和猴病毒40(SV40))和那些來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如人延長(zhǎng)因子1α(HEF1α))的系統(tǒng)也可被用來(lái)表達(dá)本發(fā)明的抗體。
當(dāng)應(yīng)用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)時(shí)，可以直接應(yīng)用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)進(jìn)行基因表達(dá)。當(dāng)應(yīng)用HEF1α啟動(dòng)子/增強(qiáng)子系統(tǒng)時(shí)，可以直接應(yīng)用Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)進(jìn)行基因表達(dá)。
當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，可將一種有用的啟動(dòng)子、一種用于分泌目的抗體的信號(hào)序列和抗體基因操作性地連接。作為啟動(dòng)子，lacZ啟動(dòng)子和araB啟動(dòng)子可被應(yīng)用。當(dāng)lacZ啟動(dòng)子被應(yīng)用時(shí)，可以用Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASBE J.(1992)6，2422-2427)進(jìn)行基因表達(dá)，而當(dāng)araB啟動(dòng)子被應(yīng)用時(shí)，可以用Better等的方法(Betteret al.，Science(1988)240，1041-1043)進(jìn)行基因表達(dá)。
對(duì)于用于抗體分泌的信號(hào)序列來(lái)說(shuō)，當(dāng)目的抗體要被分泌到大腸桿菌的周質(zhì)腔中時(shí)，pelB信號(hào)序列(Lei，S.P.et al.，J.Bacteriol.(1987)169，4379)可被應(yīng)用。分泌到周質(zhì)腔中的抗體被分離并接著被重疊以使抗體具有適當(dāng)?shù)臉?gòu)型。
從病毒(如SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV))來(lái)的復(fù)制起點(diǎn)或其類似物可被應(yīng)用。為了提高在宿主系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體可進(jìn)一步包含一個(gè)選擇性的標(biāo)記基因，如氨基苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因和二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。
為生產(chǎn)在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體，包括真核和原核細(xì)胞系統(tǒng)的任何表達(dá)系統(tǒng)都可被應(yīng)用。真核細(xì)胞包括已建立的動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、昆蟲、霉菌和真菌、酵母)細(xì)胞系。原核細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞。
在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，如在CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero和HeLa細(xì)胞中表達(dá)。
下一步，被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在體外或在體內(nèi)培養(yǎng)以生產(chǎn)目的抗體?？捎萌魏我阎姆椒ㄟM(jìn)行宿主細(xì)胞培養(yǎng)。在此應(yīng)用的培養(yǎng)基可是DMEM、MEM、RPMI 1640或IMDM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可含有血清補(bǔ)充物，如胎牛血清。
7.抗體的分離和純化如上述所表達(dá)與生產(chǎn)的抗體可從細(xì)胞或宿主動(dòng)物體內(nèi)被分離并被純化到均一程度。在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體的分離與純化可在親和柱上進(jìn)行。蛋白A柱的例子包括Hyper D、POROS、SepharoseF.F.(Pharmacia)。其他分離和純化抗體的常用方法也可被應(yīng)用；因而此方法并非特別地被限定。例如，應(yīng)用包括上述親和柱的不同的色譜方法、過(guò)濾、超過(guò)濾、鹽析和透析都可被單獨(dú)或結(jié)合應(yīng)用以分離和純化目的抗體((抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)Antibodies A Laboratory Manual)，Ed.Harlow，David Lane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)。
8.抗體活性的測(cè)定可用任何已知的方法測(cè)定在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體的抗原結(jié)合活性((抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)Antibodies A Laboratory Manual)，Ed.Harlow，David Lane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)或?qū)ε潴w受體的抑制活性(Harada，A.et al.，國(guó)際免疫學(xué)(International Immunology)(1993)5，681-690)。
作為測(cè)定在本發(fā)明中應(yīng)用的抗-PTHrP抗體的抗原結(jié)合活性的方法，例如，ELISA(酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定)、EIA(酶標(biāo)免疫測(cè)定)、RIA(放射免疫測(cè)定)或熒光抗體技術(shù)均可被應(yīng)用。例如，當(dāng)應(yīng)用酶標(biāo)免疫測(cè)定時(shí)，含有抗-PTHrP抗體的樣品溶液(例如產(chǎn)生抗-PTHrP抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)上清或單獨(dú)以純化形式存在的抗-PTHrP抗體)被加到用PTHrP(1-34)預(yù)先鋪被的平板上。再將用酶(如堿性磷酸酶)標(biāo)記的第二抗體加到平板上。將平板溫育和洗滌。將酶的底物(如對(duì)-硝基苯磷酸)加到平板上，測(cè)定板上溶液的光吸收，以評(píng)估抗體的抗原結(jié)合活性。
為確定在本發(fā)明中應(yīng)用的抗體的活性，測(cè)定抗體(如抗-PTHrP抗體)的中和活性。
9.給藥途徑和藥物制劑本發(fā)明的治療劑可用于治療或改善惡病質(zhì)?？杀槐景l(fā)明治療或改善的惡病質(zhì)可以是任何形式的惡病質(zhì)，包括由癌癥帶來(lái)的惡病質(zhì)。由癌癥導(dǎo)致的惡病質(zhì)的例子包括被描述在J.Urol.(美國(guó))1995年3月，153(3Pt1)p.854-857；Langenbecks Arch.Chir.Suppl II Verh Dtsch Ges Chir(德國(guó))1990，P261-265；Oncology(瑞典)1990，47(1)p.87-91；Int.J.Pancreatol.(美國(guó))1990年8-11月，7(1-3)p.141-150；J.Natl.Cancer Inst.(美國(guó))1990年12月9日，82(24)p.1922-1926中的那些。
癌癥導(dǎo)致的惡病質(zhì)之外的惡病質(zhì)的例子包括被描述在JPEN J.Parenter.Enteral Nutr.(美國(guó))1990年11-12月，14(6)p.605-609；Chest(美國(guó))1990年11月，98(5)p.1091-1094；骨髓移植(Bone MarrowTransplant)(英國(guó))1990年7月，6(1)p.53-57中的那些惡病質(zhì)。
包含抗PTHrP抗體作為活性成分的本發(fā)明的治療劑可口服或腸胃外給藥，但腸胃外給藥是優(yōu)選的。所述治療劑可采用任何制劑形式，如透肺劑(即，一種需在一種裝置如霧化器的幫助下給藥的試劑)、鼻胃劑(nasogastric agent)、透皮劑(如，膏、霜)或注射劑。注射劑的例子包括用于全身或局部給藥的靜脈內(nèi)注射劑(如，滴劑)、肌肉內(nèi)注射劑、腹膜內(nèi)注射劑和皮下注射劑。根據(jù)患者的年齡和疾病的狀況可適當(dāng)選擇給藥途徑。有效的單一劑量可在0.001-1000mg/kg體重的范圍內(nèi)選擇。另外，施給患者的單劑量可在0.01-100000mg/個(gè)體的范圍內(nèi)選擇。然而，包含本發(fā)明的抗PTHrP抗體的治療劑的劑量不受上面提到的范圍的具體限制。
本發(fā)明的治療劑可在任何階段施用給患者，包括在惡病質(zhì)發(fā)生之前或之后?；蛘?，可在預(yù)示著患者要發(fā)生體重減輕的階段施給本發(fā)明的治療劑。
可用任何常規(guī)的方法(Remington藥物科學(xué)，最新版，Mark出版公司，Easton，USA)來(lái)配制包含抗PTHrP抗體作為活性成分的本發(fā)明的治療劑。配方中還可包含可藥用載體和添加劑。
所述載體和添加劑的例子包括水、可藥用的有機(jī)溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和可以作為藥物添加劑的表面活性劑。
在實(shí)際應(yīng)用中，添加劑可根據(jù)所用的劑型在上述成員中適當(dāng)選擇，可使用其中的一種或多種，但不限于此。例如，可使用通過(guò)將純化形式的抗PTHrP抗體溶解于一種溶劑(如，生理鹽水、緩沖液、葡萄糖溶液)中然后再向其中添加抗吸附劑(如，土溫80、土溫20、明膠、人血清白蛋白)而制成的注射劑。
本發(fā)明的治療劑還可以是需在使用前再-配制的凍干劑形式。對(duì)于凍干劑型的制備，可摻入賦形劑如糖醇(如，甘露醇、葡萄糖)和糖。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是顯示抗PTHrP抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的圖；圖2是顯示抗PTHrP抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的圖；圖3是顯示抗PTHrP抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的圖；圖4是顯示抗PTHrP抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的5是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；圖6是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；圖7是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；圖8是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；；圖9是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；圖10是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；圖11是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；圖12是抗原結(jié)合活性測(cè)量結(jié)果的顯示圖；圖13是人源化抗體的中和活性的顯示圖；圖14是人源化抗體的中和活性的顯示圖；圖15是人源化抗體的中和活性的顯示圖；圖16是顯示人源化抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的圖；圖17是顯示人源化抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的圖；圖18是顯示人源化抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的圖；圖19是顯示人源化抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果的圖；實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下文將結(jié)合下列參考實(shí)施例和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但不應(yīng)將這些參考實(shí)施例和實(shí)施例看成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1使用惡病質(zhì)動(dòng)物模型的藥理學(xué)試驗(yàn)使用惡病質(zhì)動(dòng)物模型(一種被植入了人腫瘤的裸鼠)，來(lái)檢驗(yàn)抗PTHrP的鼠單克隆抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果。
使用植入了人口腔癌OCC-1(從Central Institute for ExperimentalAnimal購(gòu)得)的裸鼠作為惡病質(zhì)動(dòng)物模型。人們已經(jīng)知道隨著腫瘤體積的增大，植入了人口腔癌OCC-1的裸鼠表現(xiàn)出血鈣水平升高，并發(fā)展出惡病質(zhì)癥狀如體重減輕和活動(dòng)減少。在該試驗(yàn)中，就所述的鼠單克隆抗體對(duì)上述由人口腔癌OCC-1誘導(dǎo)的惡病質(zhì)的血鈣水平、體重改善和存活時(shí)間延長(zhǎng)的效果進(jìn)行了評(píng)定。
使用BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)將人口腔癌OCC-1在體內(nèi)傳代。對(duì)于藥學(xué)效果的評(píng)定，購(gòu)買6周齡的BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)并使之適應(yīng)環(huán)境一周，以得到在該評(píng)價(jià)試驗(yàn)中使用的7周齡小鼠。
按以下方式制備惡病質(zhì)模型小鼠并分組。從裸鼠中取出被傳代的人口腔癌OCC-1，然后將之精細(xì)地切成3mm3的小塊。將所得的腫瘤塊皮下植入小鼠的側(cè)面區(qū)域，每只小鼠植入一塊。在植入后十天，在證實(shí)了各小鼠中的腫瘤體積已變得足夠大時(shí)，將小鼠分組，以便測(cè)定各組小鼠的血鈣水平、體重和腫瘤體積的平均值，這些小鼠用作惡病質(zhì)動(dòng)物模型。
如下進(jìn)行對(duì)惡病質(zhì)療效的試驗(yàn)。
(1)存活時(shí)間的觀察在存活時(shí)間延長(zhǎng)效果的試驗(yàn)中，對(duì)試驗(yàn)組小鼠每周給藥兩次鼠單克隆抗體，并觀察各鼠的存活時(shí)間。以15mg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈對(duì)另一組試驗(yàn)小鼠給藥一劑現(xiàn)有治療高鈣血的藥劑-pamidronate(pamidronate鈉；Aredia)。作為該試驗(yàn)中的對(duì)照，以0.2ml/鼠的劑量經(jīng)尾靜脈給對(duì)照組小鼠施用磷酸鹽緩沖液(PBS)，每周兩次。結(jié)果示于圖1。
(2)血鈣水平的觀察以每只鼠每次10μg或100μg的劑量經(jīng)尾靜脈對(duì)試驗(yàn)組的惡病質(zhì)模型小鼠給藥兩次抗PTHrP的鼠單克隆抗體，兩次給藥間隔兩天。以15mg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈對(duì)另一組試驗(yàn)小鼠給藥一劑現(xiàn)有治療高鈣血的藥劑-pamidronate(pamidronate鈉；Aredia)。作為該試驗(yàn)中的對(duì)照，以0.2ml/鼠的劑量經(jīng)尾靜脈給對(duì)照組小鼠施用兩次磷酸鹽緩沖液(PBS)，兩次給藥間隔兩天。
(3)血鈣水平的測(cè)定對(duì)小鼠給藥鼠單克隆抗體后第一天或四天，測(cè)定各只小鼠的血鈣水平以評(píng)價(jià)抗體的藥效。用hematocrit管從各只小鼠的眼眶采血，并用643型自動(dòng)Ca/pH分析儀(CIBA-CORNING)分析所采的血樣，以全血的鈣離子水平來(lái)確定血鈣水平。每天稱量各只小鼠的體重，直至給藥抗體后的第四天。結(jié)果示于圖2和3中。
(4)腫瘤體積的測(cè)定通過(guò)測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)軸(a，mm)和最短軸(b，mm)并將所得的兩測(cè)量值套入Galant’s方程(ab2/2)，定出給藥抗體后第四天的腫瘤體積。結(jié)果示于圖4。
從這些結(jié)果可明顯看出，雖然以10μg的劑量被給藥抗體的小鼠的血鈣水平與被給藥了pamidrorate的小鼠的血鈣水平相當(dāng)，但是觀察到被給藥了抗體的小鼠的體重減輕受到抑制，因其體重減輕不如被給藥了pamidronate的小鼠的那樣明顯。與被給藥了pamidronate的小鼠和對(duì)照小鼠相比，被以100μg的劑量給藥了抗體的小鼠防止了血鈣水平的升高并以更大的程度抑制了體重減輕。與被給藥了pamidronate的小鼠和對(duì)照小鼠相比，在以100μg每周兩次的劑量給藥了抗-PTHrP中和性抗體的小鼠，其存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)(p＝0.0003，Log Rank測(cè)驗(yàn))。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)中和性抗-PTHrP的鼠單克隆抗體具有任何現(xiàn)有的治療高鈣血的藥劑所沒(méi)有的優(yōu)異效果，如防止體重減輕和延長(zhǎng)存活時(shí)間。這些結(jié)果證明本試驗(yàn)所用的抗體可用作惡性(腫瘤)相關(guān)性惡病質(zhì)的治療劑。實(shí)施例2使用高鈣血和惡病質(zhì)動(dòng)物模型的藥理學(xué)試驗(yàn)使用惡病質(zhì)動(dòng)物模型(一種被植入了人腫瘤的裸鼠)，來(lái)檢驗(yàn)“q”型抗PTHrP的人源化抗體對(duì)惡病質(zhì)的治療效果。
使用植入了人口腔癌OCC-1(從Central Institute for ExperimentalAnimal購(gòu)得)的裸鼠作為惡病質(zhì)動(dòng)物模型。人們已經(jīng)知道隨著腫瘤體積的增大，植入了人口腔癌OCC-1的裸鼠表現(xiàn)出血鈣水平升高，并發(fā)展出惡病質(zhì)癥狀如體重減輕和活動(dòng)減少。在該試驗(yàn)中，就所述的“q”型抗PTHrP的人源化抗體對(duì)上述由人口腔癌OCC-1誘導(dǎo)的惡病質(zhì)的血鈣水平、體重改善和存活時(shí)間延長(zhǎng)的效果進(jìn)行了評(píng)定。
使用BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)將人口腔癌OCC-1在體內(nèi)進(jìn)行亞培養(yǎng)。對(duì)于藥學(xué)效果的評(píng)定，購(gòu)買6周齡的BALB/c-nu/nu裸鼠(Japan CLEA Co.，Inc.)并使之適應(yīng)環(huán)境一周，以得到在該評(píng)價(jià)試驗(yàn)中使用的7周齡小鼠。
按以下方式制備惡病質(zhì)模型小鼠并分組。從裸鼠中取出被傳代的人口腔癌OCC-1，然后將之精細(xì)地切成3mm3的小塊。將所得的腫瘤塊皮下植入小鼠的側(cè)面區(qū)域，每只小鼠植入一塊。在植入后十天，在證實(shí)了各小鼠中的腫瘤體積已變得足夠大時(shí)，將小鼠分組，以便測(cè)定各組小鼠的血鈣水平、體重和腫瘤體積的平均值，這些小鼠用作惡病質(zhì)動(dòng)物模型。
如下進(jìn)行對(duì)惡病質(zhì)療效的試驗(yàn)。
(1)存活時(shí)間的觀察在存活時(shí)間延長(zhǎng)效果的試驗(yàn)中，對(duì)試驗(yàn)組小鼠每周給藥兩次“q”型人源化抗體抗體，并觀察各鼠的存活時(shí)間。作為該試驗(yàn)中的對(duì)照，以0.1ml/鼠的劑量經(jīng)尾靜脈給對(duì)照組小鼠施用磷酸鹽緩沖液(PBS)，每周兩次。結(jié)果示于圖16。
(2)血鈣水平的觀察以每只鼠每次10μg或100μg的劑量經(jīng)尾靜脈對(duì)試驗(yàn)組小鼠給藥兩次“q”型抗PTHrP的人源化抗體，兩次給藥間隔兩天。作為該試驗(yàn)中的對(duì)照，以0.1ml/鼠的劑量經(jīng)尾靜脈兩次給對(duì)照組小鼠施用磷酸鹽緩沖液(PBS)，兩次施用間隔2天。
(3)血鈣水平的測(cè)定對(duì)小鼠給藥“q”型抗PTHrP的人源化抗體后第一天或四天，測(cè)定各只小鼠的血鈣水平以評(píng)價(jià)抗體的藥效。用hematocrit管從各只小鼠的眼眶采血，并用643型自動(dòng)Ca/pH分析儀(CIBA-CORNING)分析所采的血樣，以全血的鈣離子水平來(lái)確定血鈣水平。每天稱量各只小鼠的體重，直至給藥抗體后的第四天。結(jié)果示于圖17和18中。
(4)腫瘤體積的測(cè)定通過(guò)測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)軸(a，mm)和最短軸(b，mm)并將所得的兩測(cè)量值套入Galant’s方程(ab2/2)，定出第一次給藥抗體后第四天的腫瘤體積。結(jié)果示于圖19。
從這些結(jié)果可明顯看出，被以10μg或100μg的劑量給藥抗體的小鼠，其血鈣水平的升高得到了防止，其體重減輕受到抑制，因其體重減輕不如對(duì)照小鼠的那樣明顯。與對(duì)照鼠相比，被以100μg的劑量一周兩次給藥了“q”型抗PTHrP的人源化抗體的小鼠，其存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)(p＝0.0108，Log Rank測(cè)驗(yàn))。這些“q”型抗PTHrP的人源化抗體對(duì)惡性(腫瘤)相關(guān)性惡病質(zhì)的作用效果與上述受試的鼠單克隆抗體的作用效果類似。這些結(jié)果證明本試驗(yàn)所用的抗體可用作惡性(腫瘤)相關(guān)性惡病質(zhì)的治療劑。參考實(shí)施例1產(chǎn)生抗-PTHrP(1-34)鼠單克隆抗體的雜交瘤的制備能夠產(chǎn)生抗人PTHrP(1-34)(SEQ ID NO75)、#23-57-154和#23-57-137-1單克隆抗體的雜交瘤按照Kanji Sato等報(bào)道的方法制備(Sato，K.等，J.Bone Miner.Res.，8，849-860，1993)。
使用的免疫原是PTHrP(1-34)(Peninsula)，用碳二亞胺(Dojinn)將所述PTHrP鍵合到載體蛋白甲狀腺球蛋白上。透析甲狀腺球蛋白鍵合的PTHrP(1-34)，獲得蛋白濃度為2μg/毫升的溶液。將得到的溶液與弗氏佐劑(Difco)以1∶1的比例混合得到乳劑。該乳劑以100μg/只鼠的劑量分別對(duì)16只BALB/C雌鼠背部皮下注射或腹膜內(nèi)注射11次以免疫接種鼠。第一次免疫注射時(shí)使用弗氏完全佐劑，在隨后的加強(qiáng)免疫注射中，使用弗氏不完全佐劑。
以下列方式測(cè)定每只免疫接種鼠血清中的抗體滴度。從每只鼠尾靜脈取血，然后離心該血樣獲得抗血清。該抗血清用RIA緩沖液稀釋，與125I-標(biāo)記的PTHrP(1-34)混合，然后測(cè)定其結(jié)合活性。對(duì)已被確定具有足夠高的抗體滴度的鼠以50μg/只鼠的劑量腹膜內(nèi)注射無(wú)載體蛋白的PTHrP(1-34)，進(jìn)行最后的免疫接種。
上述最后免疫接種后三天，處死鼠，切下它們的脾。然后，按照已知的常規(guī)方法用50％聚乙二醇4000使脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3x63Ag8U.1進(jìn)行細(xì)胞融合。如此制備的融合細(xì)胞在96孔的平板中以2×104/孔的量在85個(gè)孔中接種。雜交瘤通過(guò)HAT培養(yǎng)如下述進(jìn)行篩選。
觀察到細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的孔的培養(yǎng)物上清液中通過(guò)固相RIA法確定有PTHrP-識(shí)別抗體的存在來(lái)篩選雜交瘤。從已被確實(shí)具有PTHrP-識(shí)別抗體結(jié)合能力的孔中收集雜交瘤。將獲得的雜交瘤懸浮于含15％FCS并添加OPI-補(bǔ)充物(Sigma)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，隨后采用限制稀釋法勻化雜交瘤，因此獲得兩種雜交瘤克隆類型，#23-57-154和#23-57-137-1，均對(duì)PTHrP(1-34)表現(xiàn)強(qiáng)結(jié)合能力。
被命名為“鼠-鼠雜交瘤#23-57-137-1”的雜交瘤克隆#23-57-137-1已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款于1996年8月15日保藏在日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，登記號(hào)為FERM BP-5631。參考實(shí)施例2編碼鼠抗人PTHrP(1-34)的鼠單克隆抗體V區(qū)DNA的克隆編碼上述從#23-57-137-1獲得的鼠抗人PTHrP(1-34)單克隆抗體V區(qū)的DNA，按照下列方式進(jìn)行克隆。
(1)mRNA的制備從雜交瘤#23-57-137-1用Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech)如下述制備mRNA。也就是，將上述獲得的雜交瘤#23-57-137-1細(xì)胞用提取緩沖液完全勻化，用低聚(dT)-纖維素旋轉(zhuǎn)柱按照試劑盒生產(chǎn)商規(guī)定的程序從其中分離并提取mRNA。所得提取溶液用乙醇沉淀，獲得作為沉淀的mRNA。將mRNA沉淀溶解于洗脫緩沖液中。
(2)編碼鼠H鏈V區(qū)基因的cDNA的制備和擴(kuò)增(i)#23-57-137-1抗體H鏈V區(qū)的cDNA的克隆編碼抗人PTHrP鼠單克隆抗體H鏈V區(qū)的DNA通過(guò)5′-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。該5′-RACE法用5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(CLONETECH)按照核試劑盒所附的說(shuō)明進(jìn)行。該方法中，用于合成cDNA的引物是MHC2引物(SEQ ID NO1)，其可與鼠H鏈C區(qū)雜交。將作為cDNA合成模板的上述獲得的mRNA(2μg)與10pmoles MHC2引物混合。得到的混合物與逆轉(zhuǎn)錄酶在52℃反應(yīng)30分鐘以實(shí)現(xiàn)從mRNA到cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。
將所得的反應(yīng)溶液與6N NaOH混合以水解其中殘存的mRNA(65℃反應(yīng)30分鐘)，然后進(jìn)行乙醇沉淀，分離純化作為沉淀的cDNA。將如此分離到的cDNA與T4 RNA連接酶在37℃反應(yīng)6小時(shí)再另外于室溫反應(yīng)16小時(shí)，以使cDNA連接到Ampli FINDER Anchor(SEQ IDNO42)的5′末端上。使用了錨引物(SEQ ID NO2)和MHC-G1引物(SEQ ID NO3)作為PCR法擴(kuò)增cDNA的引物(S.T.Jones等，生物技術(shù)，9，88，1991)。
該方法中使用的PCR溶液(每50μl)包括10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1.5mM MgCl2、2.5單位TaKaRa Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)、10pmoles錨引物和1μl MHC-G1引物和Ampli FINDER Anchor引物連接在其上的cDNA反應(yīng)混合物，并且該P(yáng)CR溶液上用50μl礦物油液封。用480J型熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)進(jìn)行PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)94℃45秒；60℃45秒；72℃2分鐘。
(ii)#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)的cDNA的克隆編碼抗人PTHrP的鼠單克隆抗體L鏈V區(qū)的基因通過(guò)5′-RACE法克隆(Frohman，M.A.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，85，8998-9002，1988；Belyavsky，A.等，核酸研究17，2919-2932，1989)。該5′-RACE法用5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clonetech)按照該試劑盒所附的說(shuō)明進(jìn)行。該方法中，將低聚-dT引物用作合成cDNA的引物。2μg如上述制備的mRNA(作為cDNA合成模板)與低聚-dT引物混合。得到的混合物與逆轉(zhuǎn)錄酶在52℃反應(yīng)30分鐘以實(shí)現(xiàn)從mRNA到cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。所得反應(yīng)溶液與6N NaOH混合以水解其中殘存的任何RNA(65℃反應(yīng)30分鐘)，得到的反應(yīng)溶液用乙醇沉淀，分離并純化作為沉淀的cDNA。如此合成的cDNA與T4 RNA連接酶在37℃反應(yīng)6小時(shí)再另外于室溫反應(yīng)16小時(shí)，以使cDNA連接到Ampli FINDER Anchor的5′末端上。
在鼠L鏈λ鏈C區(qū)保守序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)PCR引物MLC(SEQ IDNO4)，然后用394 DNA/RNA合成儀(ABI)合成該引物。用于合成引物的PCR溶液(每100μl)包括10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、1.5mM MgCl2、2.5單位AmpliTaq(Perkin Elmer)、50pmoles錨引物(SEQ ID NO2)和1μl MLC(SEQ ID NO4)引物和Ampli FINDER錨引物連接在其上的cDNA反應(yīng)混合物，上面覆蓋50μl礦物油。用480J型熱循環(huán)儀(PerkinElmer)進(jìn)行35個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)94℃45秒；60℃45秒；72℃2分鐘。
(3)PCR產(chǎn)物的純化和裂解成片段上述PCR法擴(kuò)增的每種DNA片段用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.產(chǎn)品)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。為了得到每種H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，分別從凝膠上切下包含長(zhǎng)度約為550堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖凝膠段。所獲得的每種凝膠段用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒所附的說(shuō)明純化其中的目的DNA片段。純化的DNA用乙醇沉淀出來(lái)，然后溶解于含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的20μl溶液中。這樣制備的DNA溶液的一部分(1μl)用限制性酶XmaI(New England Biolabs)于37℃消化1小時(shí)，另外用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo株式會(huì)社)于37℃消化1小時(shí)。將消化溶液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集DNA。
按照這種方式分別獲得了編碼鼠H鏈V區(qū)的DNA和編碼鼠L鏈V區(qū)的DNA，它們都具有5′末端的EcoRI識(shí)別序列和3′末端的XmaI識(shí)別序列。
使用DNA連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo株式會(huì)社)按照該試劑盒所附的說(shuō)明于16℃反應(yīng)1小時(shí)，而將包含編碼鼠H鏈V區(qū)DNA或編碼鼠L鏈V區(qū)DNA的EcoRI-XmaI DNA片段分別連接到事先用EcoRI和XmaI消化的pUC19載體上。將獲得的連接混合物的一部分(10μl)加入100μl含大腸桿菌JM109(Nippon Gene株式會(huì)社)感受態(tài)細(xì)胞的溶液中。冰上靜置細(xì)胞混合物15分鐘，42℃靜置1分鐘，然后再于冰上靜置1分鐘。所得細(xì)胞混合物與300μl SOC培養(yǎng)基混合(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook，等，Cold Spring Harbor Laborarory Press，1989)，于37℃保溫30分鐘。將得到的細(xì)胞溶液鋪板接種到添加有100或50μg/毫升氨芐青霉素、0.1mM IPTG和20μg/毫升X-gal的LB或2xYT瓊脂培養(yǎng)基上(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook，等，Cold Spring HarborLaborarory Press，1989)，然后于37℃保溫過(guò)夜。按照這種方式，即可制備大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。
將該轉(zhuǎn)化體在含100或50μg/毫升氨芐青霉素的2毫升LB或2xYT培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后用質(zhì)粒提取儀PI-100∑(Kurabou工業(yè)株式會(huì)社)或QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片制備質(zhì)粒DNA。測(cè)序確定所獲得的質(zhì)粒DNA的序列。
(4)編碼鼠抗體V區(qū)的cDNA序列承載于質(zhì)粒上的編碼區(qū)cDNA序列用染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)由DNA測(cè)序儀373A(ABI；Perkin-Elmer)確定。在該測(cè)序中，使用了M13引物M4(Takara Shuzo株式會(huì)社)(SEQ ID NO5)和M13引物RV(Takara Shuzo株式會(huì)社)(SEQ ID NO6)，在兩個(gè)方向上測(cè)定堿基序列。
將所獲得的包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)基因的質(zhì)粒命名為“MBC1H04”，將包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠L鏈V區(qū)基因的質(zhì)粒命名為“MBC1L24”。編碼鼠#23-57-137-1抗體H鏈V區(qū)的承載于質(zhì)粒MBC1H04上的DNA序列和編碼鼠#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)的承載于質(zhì)粒MBC1L24上的DNA序列(包括相應(yīng)的氨基酸序列)分別如SEQ ID NO57和65所示。H鏈V區(qū)片段和L鏈V區(qū)片段的多肽分別從SEQ ID NO57和65所示DNA序列的第58個(gè)堿基(編碼谷氨酰胺)開(kāi)始翻譯。H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO46和45所示。
具有質(zhì)粒MBC1H04的大腸桿菌和具有質(zhì)粒MBC1L24的大腸桿菌分別被命名為“大腸桿菌JM109(MBC1H04)”和“大腸桿菌JM109(MBC1L24)”。這些大腸桿菌株系已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款于1996年8月15日保藏在日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大腸桿菌JM109(MBC1H04)的登記號(hào)為FERM BP-5628，大腸桿菌JM109(MBC1L24)的登記號(hào)為FERM BP-5627。
(5)抗人PTHrP鼠單克隆抗體#23-57-137-1的CDR的確定H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)的一般結(jié)構(gòu)彼此相似。即，兩者都有通過(guò)三個(gè)高可變區(qū)(即，互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))連接的四個(gè)框架區(qū)的結(jié)構(gòu)?？蚣軈^(qū)的氨基酸序列相對(duì)保守，而CDR區(qū)的氨基酸序列表現(xiàn)出相當(dāng)高的可變性(Kabat，E.A.等，“具有免疫活性的蛋白序列”，美國(guó)健康和人服務(wù)部門，1983)。基于上述事實(shí)，可以參考Kabat，E.A.等建立的抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)檢索抗人PTHrP的鼠單克隆抗體V區(qū)氨基酸序列的同源性來(lái)確定CDR。
L鏈V區(qū)中CDR1-3的氨基酸序列分別如SEQ ID NO59-61所示，H鏈V區(qū)中CDR1-3的氨基酸序列分別如SEQ ID NO62-64所示。
表1V區(qū)SEQ ID NO CDR1CDR2CDR3H鏈V區(qū) 57 31-35 50-66 99-107L鏈V區(qū) 65 23-34 50-60 93-105參考實(shí)施例3嵌合抗體的構(gòu)建(1)嵌合抗體H鏈的構(gòu)建(i)H鏈V區(qū)的構(gòu)建編碼鼠H鏈V區(qū)的克隆cDNA用PCR法修飾，以將其連接到攜帶人H鏈V區(qū)Cγ1基因組DNA的表達(dá)載體上。所使用的反向引物MBC1-S1(SEQ ID NO7)被設(shè)計(jì)為可以與編碼V區(qū)引導(dǎo)序列5′-末端區(qū)的DNA雜交，并具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)和HindIII-識(shí)別序列。使用的正向MBC1-a(SEQID NO8)被設(shè)計(jì)為可以與編碼J區(qū)3′-末端區(qū)的DNA雜交，并具有供體剪接序列和BamHI-識(shí)別序列。使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)及所附的緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用的PCR溶液(每50μl)包括0.07μg的作為模版DNA的質(zhì)粒MBC1H04，50pmole作為引物的MBC1-a和50pmole的MBC1-S1，添加到緩沖液中2.5U的TaKaRa ExTaq和0.25mM的dNTP；液面用50μl礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)進(jìn)行30次循環(huán)，循環(huán)溫度為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃2分鐘。如此PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA片段使用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.產(chǎn)品)通過(guò)瓊脂糖電泳分離。
然后，切下含長(zhǎng)度為437堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖凝膠片段，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒所附的說(shuō)明純化DNA片段。純化的DNA通過(guò)乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。得到的DNA溶液的一部分(1μl)用限制性酶BamHI和HindIII(Takara Shuzo株式會(huì)社)于37℃消化1小時(shí)。消化溶液用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集目的DNA。
將所獲得的包含編碼鼠H鏈V區(qū)DNA的HindIII-BamHI DNA片段亞克隆到用HindIII和BamHI消化過(guò)的pUC19載體上。得到的質(zhì)粒使用M13引物M4和M13引物RV作為引物，并使用染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)通過(guò)DNA測(cè)序儀373A(Perkin-Elmer)測(cè)序。結(jié)果，包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)的正確堿基序列的DNA并在其5′末端區(qū)具有HindIII識(shí)別序列和Kozak序列以及在其3′末端區(qū)具有BamHI識(shí)別序列的質(zhì)粒被命名為“MBC1H/pUC19”。
(ii)用于制備鼠-人嵌合H鏈cDNA型的H鏈V區(qū)的構(gòu)建上述步驟構(gòu)建的編碼鼠H鏈V區(qū)的DNA用PCR法修飾，以使其連接到人H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA上。設(shè)計(jì)了用于修飾H鏈V區(qū)的反向引物MBC1HVS2(SEQ ID NO9)以便用甘氨酸替代編碼H鏈V區(qū)引導(dǎo)序列前面部分序列的第二個(gè)氨基酸(即，天冬氨酸)，并使之具有Kozak共有序列(Kozak，M等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)及HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列。同時(shí)設(shè)計(jì)了用于修飾H鏈V區(qū)的正向引物MBC1HVR2(SEQ ID NO10)以便其可與編碼J區(qū)3′末端區(qū)的DNA序列和編碼C區(qū)5′末端區(qū)的DNA雜交，并具有ApaI-和SmaI-識(shí)別序列。
使用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)及所附的緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用的PCR溶液(每50μl)包括0.6μg的質(zhì)粒MBC1H/pUC19作為模版DNA，50pmole的MBC1HVS2和50pmole的MBC1HVR2作為引物，緩沖液中的2.5U的TaKaRa Ex Taq和0.25mM的dNTP；液面用50μl礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)進(jìn)行30次循環(huán)，循環(huán)溫度為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA片段使用1％ Sea Kem GTG瓊脂糖(FMC Bio.產(chǎn)品)通過(guò)瓊脂糖電泳分離。然后，切下含長(zhǎng)度為456堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖凝膠片段，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒所附的說(shuō)明純化其中的DNA片段。純化的DNA乙醇沉淀收集，然后溶解于20μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
得到的DNA溶液(1微升)用限制性酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo株式會(huì)社)于37℃消化1小時(shí)。消化混合溶液用苯酚和氯仿提取，然后乙醇沉淀收集DNA。將所獲得的包含編碼鼠H鏈V區(qū)基因的EcoRI-SmaI DNA片段亞克隆到用EcoRI和SmaI消化過(guò)的質(zhì)粒pUC19載體上。得到的質(zhì)粒使用M13引物M4和M13引物RV作為引物，并使用染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)通過(guò)DNA測(cè)序儀373A(Perkin-Elmer)測(cè)序。結(jié)果，包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)的正確堿基序列的DNA并在其5′末端區(qū)具有HindIII識(shí)別序列和Kozak序列以及在其3′末端區(qū)具有ApaI和SmaI識(shí)別序列的質(zhì)粒被命名為“MBC1Hv/pUC19”。
(iii)嵌合抗體H鏈表達(dá)載體的構(gòu)建包含人抗體H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA按照如下方法制備。從被導(dǎo)入了編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體H鏈C區(qū)IgG1的基因組DNA的表達(dá)載體DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f(見(jiàn)WO92/19759)和編碼人源化PM1抗體L鏈V區(qū)和人抗體L鏈κ鏈C區(qū)的基因組DNA的表達(dá)載體RV1-PM1a(見(jiàn)WO92/19759)的CHO細(xì)胞中制備mRNA。通過(guò)獲得的mRNA，用RT-PCR法克隆包含人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA，然后亞克隆到質(zhì)粒pUC19的HindIII-BamHI位點(diǎn)。確定亞克隆質(zhì)粒的DNA序列，具有正確堿基序列的質(zhì)粒被命名為“pRVh-PM1f-cDNA”。
制備了具有在SV40啟動(dòng)子和DHFR基因之間HindIII位點(diǎn)缺失和EF-1α啟動(dòng)子和人源化PM1抗體H鏈V區(qū)之間EcoRI位點(diǎn)缺失的表達(dá)載體，用于構(gòu)建包含人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1基因的cDNA的表達(dá)載體。
獲得的質(zhì)粒pRVh-PM1f-cDNA用BamHI消化，用Klenow片段使末端平齊化，進(jìn)一步用HindIII消化，從而獲得平端HindIII-BamHI片段。這種平端HindIII-BamHI片段被分別連接到上述已經(jīng)用HindIII和BamHI消化過(guò)的有HindIII位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)缺失的表達(dá)載體DHFR-ΔE-RVh-PM1-f上因此，構(gòu)建出了包含編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA的表達(dá)載體RVh-PM1f-cDNA。
包含編碼人源化PM1抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA的表達(dá)載體RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化，從其中收集包含H鏈C區(qū)的DNA片段。將得到的DNA片段導(dǎo)入上述用ApaI和BamHI消化過(guò)的質(zhì)粒MBC1Hv/pUC19中。如此制備的質(zhì)粒被命名為“MBC1HcDNA/pUC19”。這種質(zhì)粒是分別包含編碼鼠抗體H鏈V區(qū)和人抗體C區(qū)Cγ1的cDNA的質(zhì)粒，并在其5′端具有EcoRI-和HindIII-識(shí)別序列以及在其3′端具有BamHI-識(shí)別序列。
質(zhì)粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得編碼嵌合抗體H鏈的DNA片段。將得到的DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化的表達(dá)載體pCOS1中。這樣獲得的編碼嵌合抗體的表達(dá)載體被命名為“MBC1HcDNA/pCOS1”。其中，用EcoRI和SamI消化使HEF-PMh-gγ1(見(jiàn)WO92/19759)抗體基因缺失，然后將它連接到EcoRI-NotI-BamHI接合物(Takara Shuzo株式會(huì)社)上，而構(gòu)建出表達(dá)載體pCOS1。
為制備在CHO細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒，質(zhì)粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得編碼嵌合抗體H鏈的DNA，然后其被導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化的表達(dá)質(zhì)粒pCHO1中。這樣獲得的編碼嵌合抗體的表達(dá)質(zhì)粒指定為“MBC1HcDNA/pCHO1”。其中，用EcoRI和SamI消化使DHFR-ΔE-RVh-PM1-f(見(jiàn)WO92/19759)抗體基因缺失，然后將它連接到EcoRI-NotI-BamHI接合體上(Takara Shuzo株式會(huì)社)上，以構(gòu)建表達(dá)載體pCHO1。
(2)人L鏈C區(qū)的構(gòu)建(i)克隆載體的制備為構(gòu)建包含人L鏈C區(qū)基因的pUC19載體，制備了HindIII位點(diǎn)缺失的pUC19載體。2μg的pUC19載體在20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8U HindIII(TakaraShuzo株式會(huì)社)反應(yīng)液于37℃消化1小時(shí)。得到的消化混合溶液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀，收集目的DNA。
將收集到的DNA在50μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、100mM NaCl、0.5mM dNTP和6U Klenow片段(GIBCO BRL)的反應(yīng)液中于室溫反應(yīng)20分鐘，生成平齊化DNA末端。這種反應(yīng)混合物用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀收集載體DNA。
這樣收集到的載體DNA在10μl包含50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、1mM ATP、1mM DTT、5％(v/v)聚乙二醇-8000和0.5U T4 DNA連接酶(GIBCO BRL)的反應(yīng)液中16℃反應(yīng)2小時(shí)以使載體DNA自主連接。將5μl反應(yīng)液加入100μl包含感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞(日本基因株式會(huì)社)的溶液中，得到的溶液在冰上靜置30分鐘，42℃靜置1分鐘，進(jìn)一步置于冰上1分鐘。向反應(yīng)溶液中加入了500微升SOC培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1小時(shí)。得到的溶液在表面添加有X-gal和IPTG的2xYT瓊脂培養(yǎng)基(包含50μg/毫升的氨芐青霉素)上鋪板(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook，等，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)，然后37℃培養(yǎng)過(guò)夜，由此獲得轉(zhuǎn)化體。
轉(zhuǎn)化體在包含氨芐青霉素(50μg/毫升)2xYT瓊脂培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。從培養(yǎng)基的細(xì)胞碎片用質(zhì)粒Mini試劑盒(QIAGEN)按照試劑盒上的介紹分離并純化質(zhì)粒DNA。純化的質(zhì)粒用HindIII消化。證實(shí)具有HindIII位點(diǎn)缺失的質(zhì)粒被命名為“pUC19 ΔHindIII”。
(ii)編碼人L鏈λ鏈C區(qū)DNA的構(gòu)建已經(jīng)知道人抗體L鏈λ鏈C區(qū)具有至少四種同種型，包括Mcg+Ke+Oz-，Mcg-Ke-Oz-，Mcg-Ke-Oz+和Mcg-Ke+Oz-(P.Dariavach，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，84，9074-9078，1987)?；贓MBL數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與#23-57-137-1鼠L鏈λ鏈C區(qū)同源的人抗體L鏈λ鏈C區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人抗體L鏈λ鏈的同種型Mcg+Ke+Oz-(保藏編號(hào)為X57819)(P.Danavach，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院年報(bào)，84，9074-9078，1987)表現(xiàn)出與#23-57-137-1鼠L鏈λ鏈C區(qū)有最高的同源性，氨基酸序列為64.4％的同源性，DNA序列為73.4％的同源性。
然后，用PCR法構(gòu)建編碼人抗體L鏈λ鏈C區(qū)的DNA。下列使用的每種引物均通過(guò)394 DNA/RNA合成儀(ABI)合成。合成的引物HLAMB1(SEQ ID NO11)和HLAMB3(SEQ ID NO13)均具有有義DNA序列，引物HLAMB2(SEQ ID NO12)和HLAMB4(SEQ ID NO14)均具有反義DNA序列，每種引物的兩個(gè)末端均包含長(zhǎng)度為20-23堿基對(duì)的互補(bǔ)序列。
外部引物HLAMBS(SEQ ID NO15)和HLAMBR(SEQ ID NO16)分別具有與引物HLAMB1和HLAMB4互補(bǔ)的序列。HLAMBS包含EcoRI-，HindIII-和BlnI-識(shí)別序列，HLAMBR包含EcoRI-識(shí)別序列。在第一次PCR反應(yīng)中進(jìn)行了HLAMB1-HLAMB2間的反應(yīng)和HLAMB3-HLAMB4間的反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將這兩種生成物等量混合，然后進(jìn)入第二次PCR反應(yīng)。向反應(yīng)物中加入外部引物HLAMBS和HLAMBR。使反應(yīng)混合物進(jìn)行第三PCR反應(yīng)用于擴(kuò)增全長(zhǎng)DNA。
PCR反應(yīng)用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)按照該試劑盒所附的說(shuō)明進(jìn)行。第一次PCR反應(yīng)中，使用了100μl包含5pmoleHLAMB1、0.5pmole HLAMB2和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液或者包含0.5pmole HLAMB3、5pmole HLAMB4和5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液，液面用50μl礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)進(jìn)行5次循環(huán)，溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘。
第二次PCR反應(yīng)中，使用兩種反應(yīng)液(各50μl)的混合物，液面用50μl礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘。
第三次PCR反應(yīng)中，向反應(yīng)液中加入外部引物HLAMBS和HLAMBR各50pmole，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘。
第三次PCR反應(yīng)獲得的DNA片段用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(NuSieve GTG Agarose，F(xiàn)MC)進(jìn)行電泳，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒上介紹的程序從凝膠中收集和純化。
將這樣獲得的DNA片段在20μl包含50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM NaCl、和8U EcoRI(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。消化液用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀并從中收集DNA。將收集到的DNA溶解于8μl含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
如上制備的0.8μg的質(zhì)粒pUC19 ΔHindIII用EcoRI按照上述同樣方式消化。消化液用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀，獲得經(jīng)消化的質(zhì)粒pUC19 ΔHindIII。這樣消化獲得的質(zhì)粒在50μl包含50mMTris-HCl(pH 9.0)、1mM MgCl2和堿性磷酸酶(大腸桿菌C75；TakaraShuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中于37℃反應(yīng)30分鐘以使質(zhì)粒脫磷酸化(即，BAP-處理)。反應(yīng)液用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉淀并從中收集DNA。這樣獲得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
這樣制備的經(jīng)BAP-處理的質(zhì)粒pUC19 ΔHindIII(1μl)與4μl上述PCR反應(yīng)獲得的DNA混合，利用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo株式會(huì)社)將二者連接起來(lái)。將得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞中形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片分離質(zhì)粒。
對(duì)于所獲得的上述質(zhì)粒，測(cè)定克隆DNA的序列。確定DNA序列時(shí)，使用了373A DNA測(cè)序儀(ABI)和引物“M13引物M4”和“M13引物RV”(Takara Shuzo株式會(huì)社)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆DNA中具有長(zhǎng)度為12堿基對(duì)的缺失部分。該質(zhì)粒被命名為“CλΔ/pUC19”。然后，為了彌補(bǔ)缺失的這一部分，重新合成了引物HCLMS(SEQ ID NO17)和HCLMR(SEQ ID NO18)，并且通過(guò)PCR法重新構(gòu)建了正確的DNA。
用包含缺失DNA的質(zhì)粒cλΔ/pUC19作為模版以及HLAMBS和HCLMS引物對(duì)或引物HCLMS和HLAMB4引物對(duì)進(jìn)行了第一次PCR反應(yīng)。分別純化每一個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。在第二次PCR反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物彼此組合在一起。向第二PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入外部引物HLAMBS和HLAMB4，隨后進(jìn)行第三次PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增全長(zhǎng)DNA。
第一次PCR反應(yīng)中，使用了100μl包含0.1μg cλΔ/pUC19作為模版、各50pmole的引物HLAMBS和HCLMR或者各50pmole的引物HCLMS和HLAMB4，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液，液面用50μl礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘。
第一PCR的反應(yīng)產(chǎn)物，HLAMBS-HCLMR(236堿基對(duì))和HCLMS-HLAMB4(147堿基對(duì))用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以分離DNA片段。然后用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化DNA片段。第二次PCR反應(yīng)中，使用了20μl包含40納克純化的DNA片段和1U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液，液面用25μl礦物油覆蓋，以溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘進(jìn)行5個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)。
第三次PCR反應(yīng)中，使用了100μl包含2μl第二次PCR反應(yīng)得到的反應(yīng)液、外部引物HLAMBS和HLAMB4各50pmole以及5UTaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液，液面用50μl礦物油覆蓋，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)程序?yàn)?4℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘，由此得到長(zhǎng)度為357堿基對(duì)的DNA片段(第三次PCR產(chǎn)物)。用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段。用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)收集和純化產(chǎn)生的DNA片段。
0.1μg這樣獲得的DNA片段用EcoRI消化，然后亞克隆到預(yù)先用BAP處理過(guò)的質(zhì)粒pUC19 ΔHindIII中。得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。這樣制備的轉(zhuǎn)化體在2毫升含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中分離并純化質(zhì)粒。
用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo株式會(huì)社)在373ADNA測(cè)序儀(ABI)測(cè)定了如此獲得的質(zhì)粒的DNA序列。證明確實(shí)無(wú)任何缺失的正確DNA序列的質(zhì)粒被命名為“Cλ/pUC19”。
(iii)編碼人L鏈κ鏈C區(qū)DNA的構(gòu)建用PCR法從質(zhì)粒HEF-PM1k-gk(WO92/19759)克隆了編碼L鏈κ鏈C區(qū)的DNA片段。設(shè)計(jì)正向引物HKAPS(SEQ ID NO19)，使之包含EcoRI-、HindIII-以及BlnI-識(shí)別序列，并設(shè)計(jì)反向引物HKAPA(SEQID NO20)，使之包含EcoRI-識(shí)別序列，二者均使用394 DNA/RNA合成儀(ABI)合成。
用100μl包含0.1μg質(zhì)粒HEF-PM1k-gk作為模版、各50pmole引物HKAPS和HKAPA，以及5U TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，液面覆蓋50μl礦物油，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)為94℃1分鐘；60℃1分鐘；72℃1分鐘，由此得到長(zhǎng)度為360堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物。DNA片段用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)收集和純化。
這樣獲得的DNA片段用EcoRI消化，然后克隆到已經(jīng)用BAP處理過(guò)的質(zhì)粒pUC19 ΔHindIII中。得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞中以形成轉(zhuǎn)化體。這樣制備的轉(zhuǎn)化體在2毫升含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒。
純化的質(zhì)粒DNA用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo株式會(huì)社)在373A DNA測(cè)序儀(ABI)上測(cè)序。證實(shí)了具有正確堿基序列的質(zhì)粒被命名為“Cκ/pUC19”。
(3)嵌合抗體L鏈表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建了嵌合#23-57-137-1抗體L鏈表達(dá)載體。將編碼#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)的DNA連接到各個(gè)質(zhì)粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19的HindIII和BlnI位點(diǎn)(位于人抗體C區(qū)之前)，由此得到包含編碼嵌合#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)和L鏈λ鏈或κ鏈C區(qū)DNA的pUC19載體。然后用EcoRI消化每種得到的載體以便切出編碼嵌合抗體L鏈的DNA，將該DNA亞克隆到HEF表達(dá)載體中。
用PCR法從質(zhì)粒MBC1L24克隆編碼#23-57-137-1抗體L鏈V區(qū)的DNA片段。用394 DNA/RNA合成儀(ABI)獨(dú)立地合成引物。使用的反向引物MBCCHL1(SEQ ID NO21)被設(shè)計(jì)為包含Hind III-識(shí)別序列和Kozak序列(Kozak，M等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)，正向引物MBCCHL3(SEQ ID NO22)被設(shè)計(jì)為包含BglII-和RcoRI-識(shí)別序列。
用100μl包含10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、1.5mMMgCl2、0.2mM dNTP、0.1μg MBC1L24，各50pmole引物MBCCHL1和MBCCHL3以及1μl AmpliTaq(PERKIN ELMER)的反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，液面覆蓋50μl礦物油。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)為94℃45秒；60℃45秒；72℃2分鐘。
用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離出長(zhǎng)度為444堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，然后用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)收集和純化。純化的DNA片段溶解于20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。1μl PCR產(chǎn)物在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、50mM NaCl、8U HindIII(Takara Shuzo株式會(huì)社)和8U EcoRI(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中于37℃消化1小時(shí)。消化液用苯酚氯仿提取，隨后用乙醇沉淀并從中收集目的DNA。如此獲得的DNA溶解于8μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
1μg的質(zhì)粒pUC19用HindIII和EcoRI按照上述同樣方式消化。然后用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀。所獲得的被消化的質(zhì)粒用BAP(即，堿性磷酸酶(大腸桿菌C75；Takara Shuzo株式會(huì)社))處理，然后所得反應(yīng)溶液用苯酚和氯仿提取，用乙醇沉淀并從中收集DNA。這樣獲得的DNA溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mMEDTA的溶液中。
將BAP-處理的質(zhì)粒pUC19(1μl)與4μl上述PCR產(chǎn)物混合，用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo株式會(huì)社)將二者連接起來(lái)。得到的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞(日本基因株式會(huì)社)，以上述同樣的方式形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT瓊脂培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)純化細(xì)胞碎片中的質(zhì)粒。DNA測(cè)序后，證實(shí)具有正確DNA序列的質(zhì)粒被命名為“CHL/pUC19”。
各1μg的質(zhì)粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19分別在20μl包含20mMTris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8UHindIII(Takara Shuzo株式會(huì)社)和2U BlnI(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中于37℃消化1小時(shí)。消化液用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀，并從中收集DNA。DNA用BAP在37℃處理30分鐘，然后用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀并從中收集DNA。將得到的DNA溶解于10μl包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mM EDTA的溶液中。
8μg包含編碼#23-57-137-1L鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒CHL/pUC19用HindIII和BlnI以上述同樣方式消化，以得到409bp的DNA片段。利用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳該DNA片段，然后用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化該DNA片段。將該DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
將4μl L鏈V區(qū)的DNA分別亞克隆到1μl經(jīng)BAP-處理的質(zhì)粒Cλ/pUC19或Cκ/pUC19上，然后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞中以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在3毫升含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)分離和純化細(xì)胞碎片中的質(zhì)粒。將由此制備的質(zhì)粒分別命名為“MBC1L(λ)/pUC19”和“MBC1L(κ)/pUC19”。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19分別用EcoRI消化，然后用3％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳。用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)從凝膠中分離和純化長(zhǎng)度743堿基對(duì)的DNA片段，并將該DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
2.7μg的表達(dá)載體(質(zhì)粒HEF-PM1k-gk)用EcoRI消化，然后用苯酚和氯仿提取，隨后用乙醇沉淀，并從中收集DNA片段。DNA片段用BAP處理，然后用1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳。用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)從凝膠中分離和純化長(zhǎng)度為6561堿基對(duì)的DNA片段。將該DNA片段溶解于10μl含10mM Tris-HCl(pH 7.4)和1mMEDTA的溶液中。
將BAP-處理的HEF載體(2μl)與3μl質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19或MBC1L(κ)/pUC19的EcoRI片段連接起來(lái)。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞中以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)純化細(xì)胞碎片中的質(zhì)粒。
這樣純化的質(zhì)粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8U HindIII(Takara Shuzo株式會(huì)社)和2U PvuI(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中于37℃消化1小時(shí)。在這一消化反應(yīng)中，如果上述DNA片段以正確方向插入載體，則得到5104/2195堿基對(duì)的消化片段，如果上述DNA片段反向插入載體，則得到4387/2926堿基對(duì)的消化片段。證實(shí)具有正向插入片段的質(zhì)粒被分別命名為“MBC1L(λ)/neo”(來(lái)自質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19)和“MBC1L(κ)/neo”(來(lái)自質(zhì)粒MBC1L(k)/pUC19)。
(4)COS-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染上述制備的表達(dá)質(zhì)粒分別用COS-7細(xì)胞短暫表達(dá)以便評(píng)價(jià)嵌合抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性和中和活性。
通過(guò)Gene Pulser(Bio Rad)電穿孔將質(zhì)粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(λ)/neo或者質(zhì)粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(κ)/neo的組合共轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中，進(jìn)行嵌合抗體的短暫表達(dá)。即，向0.8毫升細(xì)胞懸浮液(其中COS-7細(xì)胞懸浮于PBS(-)，濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升)中加入每種質(zhì)粒DNA各10μl。得到的溶液應(yīng)用1500V和2μF靜電容量的脈沖進(jìn)行電穿孔。室溫恢復(fù)10分鐘后，將細(xì)胞懸浮于包含2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中，然后用10cm的培養(yǎng)皿在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，離心除去細(xì)胞碎片，以此作為ELISA分析的樣品。該程序中，嵌合抗體從COS-7細(xì)胞上清液中的純化通過(guò)AffiGel Protein A MAPSII試劑盒(Bio Rad)按照試劑盒上介紹的方法進(jìn)行。
(5)ELISA分析(i)抗體濃度的確定確定抗體濃度的ELISA平板如下制備。用于ELISA的96孔平板(Maxisorp，NUNC)的每個(gè)孔都用100μl補(bǔ)加有1μg/毫升的山羊抗人IgG抗體(TAGO)的包被緩沖液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3)包被，然后用200μl稀釋緩沖液[50mM Tris-HCl、1mM MgCl2、0.1M NaCl、0.05％Tween20、0.02％NaN3、1％牛血清白蛋白(BSA)；pH7.2]封閉。每孔加入其中嵌合抗體得以表達(dá)的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清的系列稀釋液或者逐步稀釋的純化嵌合抗體。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl與堿性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗體(TAGO)。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(Bio Rad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。純化的Hu IgG1λ(結(jié)合位點(diǎn))用作該測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
(ii)抗原結(jié)合能力的確定確定抗原結(jié)合能力的ELISA平板如下制備。用于ELISA分析的96孔平板的每個(gè)孔都用100μl補(bǔ)加有1μg/毫升的人PTHrP(1-34)(肽研究所)的包被緩沖液包被，然后用200μl稀釋緩沖液封閉。每孔加入其中嵌合抗體得以表達(dá)的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清的系列稀釋液或者逐步稀釋的純化嵌合抗體。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl與堿性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗體(TAGO)溶液。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(Bio Rad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)嵌合抗體具有對(duì)人PTHrP(1-34)的結(jié)合能力，克隆的鼠抗體V區(qū)(圖5)也具有的正確結(jié)構(gòu)。還發(fā)現(xiàn)具有L鏈λ鏈C區(qū)的嵌合抗體和具有L鏈κ鏈C區(qū)的嵌合抗體對(duì)PTHrP(1-34)的結(jié)合能力沒(méi)有差異。因此，通過(guò)人源化抗體L鏈λ鏈構(gòu)建了人源化抗體L鏈C區(qū)。
(6)能穩(wěn)定產(chǎn)生嵌合抗體的CHO細(xì)胞系的建立為了建立能穩(wěn)定產(chǎn)生嵌合抗體的細(xì)胞系，將上述表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞(DXB11)。
為建立能穩(wěn)定產(chǎn)生嵌合抗體的細(xì)胞系，使用用于CHO細(xì)胞的下列表達(dá)質(zhì)粒的任一組合質(zhì)粒MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(λ)/neo；或者M(jìn)BC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(κ)/neo。這些質(zhì)粒組合通過(guò)Gene Pulser(Bio Rad)電穿孔分別如下共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。每種表達(dá)載體獨(dú)立地用限制性酶PvuI切開(kāi)成為線型DNA。得到的DNA用苯酚和氯仿提取并用乙醇沉淀收集。這樣制備的質(zhì)粒DNA分別用于電穿孔。即，將質(zhì)粒DNA各10μg加入0.8毫升包含CHO細(xì)胞(濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升)的PBS(-)細(xì)胞懸浮液中。得到的混合液應(yīng)用靜電容量為1500V和2μF的脈沖進(jìn)行電穿孔。室溫恢復(fù)10分鐘后，將電穿孔的細(xì)胞懸浮于添加有10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培養(yǎng)基中。得到的懸浮液用三個(gè)96孔平板(Falcon)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)當(dāng)天，培養(yǎng)基用選擇性培養(yǎng)基[添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(G418Sulfate；GIBCO)的不含核糖核苷或脫氧核糖核苷的MEM-α培養(yǎng)基]替換。從培養(yǎng)基中選擇導(dǎo)入了抗體基因的細(xì)胞。用新鮮培養(yǎng)基替換選擇性培養(yǎng)基。在置換該培養(yǎng)基約2周，當(dāng)觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，顯微鏡下觀察用上述ELISA分析法確定產(chǎn)生的抗體量。在這些細(xì)胞中篩選產(chǎn)生大量抗體的細(xì)胞。
將已建立的能穩(wěn)定產(chǎn)生抗體穩(wěn)定細(xì)胞系在搖瓶中用添加2％UltraLow IgG胎牛血清但不含核糖核苷或脫氧核糖核苷的MEM培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng)。培養(yǎng)第3到4天，收集培養(yǎng)基上清液，然后用孔徑為0.2μm(Millipore)的濾器過(guò)濾以除去其中的細(xì)胞碎片。
隨后，用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millipore)上按照其上介紹的方法純化CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的嵌合抗體。純化的嵌合抗體作為確定中和活性和檢驗(yàn)對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物的效能的樣品。純化的嵌合抗體的濃度和抗原結(jié)合活性用上述同樣的ELISA系統(tǒng)確定。參考實(shí)施例4
人源化抗體的構(gòu)建(1)人源化抗體H鏈的構(gòu)建(i)人源化H鏈V區(qū)的構(gòu)建通過(guò)PCR法用CDR-移植技術(shù)制備人源化#23-57-137-1抗體H鏈。為制備具有來(lái)源于人抗體S31679(NBRF-PDB；Cuisinier，A.M.等，歐洲免疫雜志，23，110-118，1993)的FR的人源化#23-57-137-1抗體H鏈(“a”型)使用了下列六種類型PCR引物CDR-移植引物MBC1HGP1(SEQ ID NO23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO24)(均包含有義DNA序列)以及MBC1HGP2(SEQ ID NO25)和MBC1HGP4(SEQID NO26)(均包含反義DNA序列)，它們的每個(gè)末端均包含長(zhǎng)度為15-21堿基對(duì)的互補(bǔ)序列；以及外部引物MBC1HVS1(SEQ ID NO27)和MBC1HVR1(SEQ ID NO28)，它們分別具有與CDR-移植引物MBC1HGP1和MBC1HGP4的同源性。
CDR-移植引物MBC1HGP1、MBC1HGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4按照下列方式用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠分離(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，并用壓碎浸泡法(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)按下列方式從凝膠片段中提取。
每種CDR-移植引物各1nmole用6％變性聚丙烯酰胺凝膠分離得到DNA片段。用UV照射硅膠薄層平板從所得DNA片段中鑒定所需長(zhǎng)度的DNA片段，然后用壓碎浸泡法收集。將所得DNA溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液(100μl)包含上述CDR-移植引物MBC1HGP1、MBC1HGP2、MBC1HGP3和MBC1HGP4各1μl、0.25mM dNTP和2.5U TaKaRa Ex Taq的緩沖液。PCR反應(yīng)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。將外部引物MBC1HVS1和MBC1HVR1各50pmole加入反應(yīng)混合物。利用這種反應(yīng)混合物再用同樣的溫度循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)另外30個(gè)循環(huán)。這樣擴(kuò)增得到的DNA片段用4％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠進(jìn)行電泳分離。
切下包含長(zhǎng)度為421堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖片段，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法純化DNA片段。純化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。獲得的PCR反應(yīng)混合物用于將DNA片段亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化的質(zhì)粒pUC19上；隨后確定所得質(zhì)粒的堿基序列。具有正確序列的質(zhì)粒被命名為“hMBCHv/pUC19”。
(ii)用于人源化H鏈cDNA的H鏈V區(qū)的構(gòu)建為了連接到人源化H鏈C區(qū)Cγ1的cDNA上，上述步驟構(gòu)建的人源化H鏈V區(qū)的DNA用PCR法修飾。該方法中，使用的反向引物MBC1HVS2被設(shè)計(jì)為可以與編碼V區(qū)引導(dǎo)序列5′-末端區(qū)的序列雜交并攜帶Kozak共有序列(Kozak等，分子生物學(xué)雜志，196，947-950，1987)以及HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列。所用的正向引物MBC1HVR2被設(shè)計(jì)為可以與編碼J區(qū)3′-末端區(qū)的DNA序列和編碼C區(qū)5′-末端區(qū)的DNA序列雜交并攜帶ApaI-和SamI-識(shí)別序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)和所附的緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液為包含0.4μg hMBCHv/pUC19作為DNA模版，MBC1HVS2和MBC1HVR2各50pmole作為引物、2.5UTaKaRa Ex Taq和緩沖液中的0.25mM dNTP。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。這樣由PCR法擴(kuò)增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠電泳分離。
切下含有長(zhǎng)度為456堿基對(duì)的DNA片段的凝膠，用GENECLEANII試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法從中純化DNA片段。純化的DNA片段用乙醇沉淀，然后溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。獲得的PCR反應(yīng)混合物用于將DNA片段亞克隆到預(yù)先用EcoRI和SamI消化的質(zhì)粒pUC19上；隨后確定所得到質(zhì)粒的堿基序列。結(jié)果，由此制備出包含編碼來(lái)源于雜交瘤#23-57-137-1的鼠H鏈V區(qū)的DNA并也包含5′-末端區(qū)HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列和Kozak序列以及3′-末端區(qū)ApaI-和SamI-識(shí)別序列的質(zhì)粒，并被命名為“hMBC1Hv/pUC19”。
(2)人源化抗體H鏈表達(dá)載體的構(gòu)建包含hPM1抗體H鏈的cDNA序列的質(zhì)粒RVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI消化以獲得包含H鏈C區(qū)堿基序列的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用ApaI和BamHI消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Hv/pUC19中。由此制備的質(zhì)粒被命名為“hMBC1HcDNA/pUC19”。該質(zhì)粒包含編碼人源化#23-57-137-1抗體H鏈V區(qū)的DNA和編碼人H鏈C區(qū)Cγ1的DNA并具有5′-末端區(qū)HindIII-和EcoRI-識(shí)別序列以及3′-末端區(qū)BamHI-識(shí)別序列。質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19中包含的人源化“a”型H鏈的堿基序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO58和SEQID NO56所示。
質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得包含編碼H鏈堿基序列的DNA片段。將該DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化過(guò)的表達(dá)質(zhì)粒pCOS1中。結(jié)果獲得了人源化抗體的表達(dá)質(zhì)粒，并被命名為“hMBC1HcDNA/pCOS1”。
為制備在CHO細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒，質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI消化以獲得包含編碼H鏈DNA的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入預(yù)先用EcoRI和BamHI消化過(guò)的表達(dá)載體pCHO1上。由此獲得了人源化抗體的表達(dá)質(zhì)粒并被命名為“hMBC1HcDNA/pCHO1”。
(3)L鏈雜合可變區(qū)的構(gòu)建(i)FR1、2/FR3、4雜合抗體的制備構(gòu)建了具有人源化抗體的FR區(qū)和鼠(嵌合)抗體的FR區(qū)的FR雜合L鏈的基因，并評(píng)價(jià)了該區(qū)人源化作用的適宜性。該步驟中，包含來(lái)源于人抗體的FR1和FR2以及來(lái)源于鼠抗體的FR3和FR4的雜合抗體是利用存在于CDR2中的Af1II限制性位點(diǎn)來(lái)制備的。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/neo和hMBC1L(λ)/neo各10μg分別在100μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、50mMNaCl、0.01％(w/v)BSA和10U Af1II(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。反應(yīng)液用2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，由此從質(zhì)粒MBC1L(λ)/neo中得到長(zhǎng)度為6282堿基對(duì)的DNA片段(稱為“c1”)和長(zhǎng)度為1022堿基對(duì)的DNA片段(稱為“C2”)，并從質(zhì)粒hMBC1L(λ)/neo中得到長(zhǎng)度為6282bp的DNA片段(稱為“h1”)和1022bp的DNA片段(稱為“h2”)。
獲得的c1和h1片段各1μg用BAP處理。用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀收集DNA片段，然后溶于10μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
BAP-處理的c1和h1 DNA片段各1μl分別與4μl h2和c2 DNA片段混合，以使彼此連接(4℃過(guò)夜)。將各連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升包含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒。
純化的質(zhì)粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、2U ApaLI(Takara Shuzo株式會(huì)社)或8UBamHI(Takara Shuzo株式會(huì)社)和HindIII(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。該步驟中，如果c1-h2片段正確連接到質(zhì)粒上，該連接獲得5560/1246/498堿基對(duì)的ApaLI消化片段或者7134/269堿基對(duì)的BamHI/HindIII消化片段。基于這一假定，鑒定出了所需的質(zhì)粒。
編碼人FR1、2/鼠FR3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體被命名為“h/mMBC1L(λ)/neo”。另一方面，沒(méi)有獲得h1-c1的克隆。因此，在pUC載體上進(jìn)行了重組，隨后將重組產(chǎn)物克隆到HEF載體上。其中，用做模版的是包含編碼無(wú)氨基酸替換的人源化抗體L鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19，和包含編碼FR3中第91位(即，按照Kabat定義的第87號(hào)氨基酸)酪氨酸由異亮氨酸取代的人源化抗體L鏈V區(qū)DNA的質(zhì)粒hMBC1Ldλ/pUC19。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19、hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19各10微升分別在30μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、50mM NaCl、0.01％(w/v)BSA、16U HindIII和4U Afl II的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。反應(yīng)液用2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，從質(zhì)粒MBC1L(λ)/pUC19中得到長(zhǎng)度為215堿基對(duì)的DNA片段(稱為“c2”)或者分別從質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19中得到長(zhǎng)度為3218堿基對(duì)的DNA片段(分別稱為“hal”和“hdl”)。然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)收集并純化這些DNA片段。
將每種hal’和hdl’片段分別連接到c2’片段上，然后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升包含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒。得到的包含hal’片段和hdl’片段的質(zhì)粒DNA被分別命名為“m/hMBC1Laλ/pUC19”和“m/hMBC1Ldλ/pUC19”。
質(zhì)粒m/hMBC1Laλ/pUC19和m/hMBC1Ldλ/pUC19分別用EcoRI消化。2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化長(zhǎng)度為743堿基對(duì)的DNA片段。產(chǎn)物溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
將獲得的各DNA片段(每個(gè)4μl)與上述BAP-處理的HEF載體1μl混合以彼此連接。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在2毫升包含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprep Spin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒DNA。
純化的各質(zhì)粒DNA在20μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、8U HindIII(Takara Shuzo株式會(huì)社)和2U PvuI(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。該步驟中，基于如下的設(shè)想鑒定了質(zhì)粒DNA，即如果DNA片段正向插入質(zhì)粒，該連接反應(yīng)得到5104/2195堿基對(duì)的消化片段，而如果DNA片段反向插入質(zhì)粒，該連接反應(yīng)得到4378/2926堿基對(duì)的消化片段。由此獲得的質(zhì)粒是編碼鼠FR1、2/人FR3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體，它們被分別命名為表達(dá)載體“m/hMBC1Laλ/neo”和“m/hMBC1Ldλ/neo”。
(ii)FR1/FR2雜合抗體的制備按照上述同樣的方式利用存在于CDR1中的SnaBI限制性位點(diǎn)制備FR1/FR2雜合抗體。
質(zhì)粒MBC1L(λ)/neo和mMBC1L(λ)/neo各10μg分別在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.9)、10mM MgCl2、1mM DTT、50mMNaCl、0.01％(w/v)BSA和6U SnaBI(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。將得到反應(yīng)液進(jìn)一步在50μl包含20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、1mM DTT、100mM KCl、0.01％(w/v)BSA和6U PvuI的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。
得到的反應(yīng)液用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，由此從質(zhì)粒MBC1L(λ)/neo中得到4955bp的DNA片段(ml)和2349bp的DNA片段(m2)，并從質(zhì)粒h/mMBC1L(λ)/neo中得到4955bp的DNA片段(hm1)和2349bp的DNA片段(hm2)。然后用GENECLEANII試劑盒(BIO101)從凝膠中收集和純化這些DNA片段。獲得的每種DNA片段均溶于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
m1和hm1片段各1μl分別連接到bm2和m2片段(各4μl)上，然后導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體。獲得的轉(zhuǎn)化體在2毫升包含氨芐青霉素(50μg/毫升)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用QIAprepSpin質(zhì)粒試劑盒(QIAGEN)從細(xì)胞碎片中純化質(zhì)粒DNA。
純化的質(zhì)粒DNA在20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT和8U ApaI(Takara Shuzo株式會(huì)社)或者2UApalI(Takara Shuzo株式會(huì)社)的反應(yīng)液中37℃消化1小時(shí)。
基于下述設(shè)想鑒定了由此制備的質(zhì)粒(m1-hm2和hm1-m2)，即如果每種DNA片段以正確方向連接到質(zhì)粒上，用ApaI和ApaLI消化的質(zhì)粒(m1-hm2)將分別得到7304堿基對(duì)的消化片段和5560/1246/498堿基對(duì)的消化片段，用ApaI和ApaLI消化的質(zhì)粒(hm1-m2)將分別得到6538/766堿基對(duì)的片段和3535/2025/1246/498堿基對(duì)的片段。結(jié)果，獲得了編碼人FR1/鼠FR2、3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體(被命名為“hmmMBC1L(λ)/neo”)和編碼鼠FR1/人FR2/鼠FR3、4雜合抗體L鏈的表達(dá)載體(被命名為“mhmMBC1L(λ)/neo”)。
(4)人源化抗體L鏈的構(gòu)建通過(guò)PCR法用CDR-移植技術(shù)制備了人源化#23-57-137-1抗體L鏈。為制備包含來(lái)源于人抗體HSU03868(GEN-BANK，Deftos M.等，Scand.免疫學(xué)雜志，39，95-103，1994)的FR1、FR2、FR3以及來(lái)源于人抗體S25755(NBRF-PDB)FR4的人源化#23-57-137-1抗體L鏈(“a”型)使用了下述六種類型的PCR引物具有有義DNA序列的CDR-移植引物MBC1LGP1(SEQ ID NO29)和MBC1LGP3(SEQ ID NO30)，具有反義DNA序列的CDR-移植引物MBC1LGP2(SEQ ID NO31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO32)，所有這些CDR-移植引物的每個(gè)末端都具有15-21堿基對(duì)的互補(bǔ)序列；以及分別與CDR-移植引物MBC1LGP1和MBC1LGP4同源的外部引物MBC1LVS1(SEQ ID NO33)和MBC1LVR1(SEQ ID NO34)。
CDR-移植引物MBC1LGP1、MBC1LGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠分離(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，并用壓碎浸泡法從凝膠片段中提取(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
每種CDR-移植引物各1nmole用6％變性聚丙烯酰胺凝膠分離。用UV射線照射的硅膠薄層平板鑒定需要長(zhǎng)度的DNA片段，然后用壓碎浸泡法從凝膠中收集所需的DNA片段。將收集到的DNA片段溶解于20μl含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液(每100μl)包含CDR-移植引物MBC1LGP1、MBC1LGP2、MBC1LGP3和MBC1LGP4各1μl、0.25mMdNTP、緩沖液中的2.5U TaKaRa Ex Taq。PCR反應(yīng)進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。向反應(yīng)混合物中加入外部引物MBC1LVS1和MBC1LVR1各50pmole。利用這種反應(yīng)混合物再用同樣的溫度循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)另外30個(gè)循環(huán)。這樣擴(kuò)增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠電泳分離。
切下包含長(zhǎng)度為421堿基對(duì)DNA片段的瓊脂糖片段，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法從中純化DNA片段。由此制備的PCR反應(yīng)混合物用于將DNA片段亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化的質(zhì)粒pUC19上。測(cè)定得到質(zhì)粒的DNA序列。由此制備的質(zhì)粒被命名為“hMBCL/pUC19”。然而發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒CDR4的第104位氨基酸(按照Kabat確定的第96號(hào)氨基酸)由精氨酸取代。為了將這個(gè)氨基酸校正為酪氨酸，設(shè)計(jì)和合成了引物MBC1LGP10R(SEQ ID NO35)。然后用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo株式會(huì)社)和所附的緩沖液進(jìn)行PCR反應(yīng)。用于PCR反應(yīng)的反應(yīng)液(每100μl)包含0.6μg的質(zhì)粒hMBCL/pUC19為模版DNA、引物MBC1LVS1和MBC1LGP10R各50pmole、2.5U TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo株式會(huì)社)和緩沖液中的0.25mM dNTP，液面覆蓋礦物油(50μl)。PCR反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中溫度循環(huán)為94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘。這樣擴(kuò)增得到的DNA片段用3％Nu Sieve GTG瓊脂糖(FMC Bio.Products)凝膠電泳分離。
切下含有長(zhǎng)度為421堿基對(duì)的DNA片段的凝膠片段，用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法純化DNA片段。由此制備的PCR反應(yīng)混合物用于將該DNA片段亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化的質(zhì)粒pUC19上。
用M13引物M4和M13引物RV確定該質(zhì)粒的DNA序列。結(jié)果證實(shí)該質(zhì)粒具有正確的序列。然后該質(zhì)粒用HindIII和BlnI消化，用1％的瓊脂糖凝膠電泳從中分離到416堿基對(duì)的DNA片段。該DNA片段用GENECLEAN II試劑盒(BIO101)按照試劑盒上指示的方法純化。然后導(dǎo)入預(yù)先用HindIII和BlnI消化的質(zhì)粒Cλ/pUC19上。得到的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Laλ/pUC19”。該質(zhì)粒用EcoRI消化，得到編碼人源化L鏈的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1以至人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。這樣獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Laλ/pCOS1”。“a”型人源化L鏈的DNA序列(包括對(duì)應(yīng)氨基酸序列)如SEQ ID NO66所示。“a”型的氨基酸序列如SEQ ID NO47所示。
“b”型人源化的L鏈通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備?！癰”型被設(shè)計(jì)為用脯氨酸替換“a”型第43位的甘氨酸(相當(dāng)于按Kabat定義的第43號(hào)氨基酸)并用天冬氨酸替換49位的賴氨酸(相當(dāng)于按Kabat定義的第49號(hào)氨基酸)。用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突變引物MBC1LGP5R(SEQ ID NO36)和引物MBC1LVS1進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，消化片段亞克隆到pUC19的BamHI-HindIII位點(diǎn)。測(cè)序后，獲得的質(zhì)粒DNA用HindIII和AflII消化，產(chǎn)生的消化片段連接到預(yù)先用HindIII和AflII消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19上。
由此獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lbλ/pUC19”。該質(zhì)粒DNA用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈DNA的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lbλ/pCOS1”。
“c”型人源化的L鏈通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。將“c”型設(shè)計(jì)為用脯氨酸替換84位的絲氨酸(相當(dāng)于按Kabat定義的第80號(hào)氨基酸)。用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作模版，用突變引物MBC1LGP6S(SEQ ID NO37)和引物M13引物RV進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化過(guò)的pUC19上。
測(cè)序后，獲得的質(zhì)粒用BstPI和Aor51HI消化，產(chǎn)生的DNA片段連接到預(yù)先用BstPI和Aor51HI消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19上。由此獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lcλ/pUC19”。該質(zhì)粒DNA用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈序列的DNA片段。該片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lcλ/pCOS1”“d”、“e”、“f”型人源化的L鏈也通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備?！癲”、“e”、“f”型被設(shè)計(jì)為在91位分別用“a”、“b”、“c”型的異亮氨酸替換酪氨酸(相當(dāng)于按Kabat定義的第87號(hào)氨基酸)。分別用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pCOS1作為“d”型的模版，質(zhì)粒hMBC1Lbλ/pUC19作為“e”型的模版，質(zhì)粒hMBC1Lcλ/pUC19作為“f”型的模版，用突變引物MBC1LGP11R(SEQ ID NO38)和引物M-S1(SEQ IDNO44)分別進(jìn)行“d”、“e”、“f”各型的PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用BamHI和HindIII消化，然后亞克隆到預(yù)先用BamHI和HindIII消化過(guò)的pUC19上。測(cè)序后，質(zhì)粒用HindIII和BlnI消化，產(chǎn)生的消化片段連接到預(yù)先用HindIII和BlnI消化過(guò)的質(zhì)粒Cλ/pUC19上。
由此獲得的質(zhì)粒分別被命名為“hMBC1Ldλ/pUC19”(對(duì)應(yīng)于“d”型)、“hMBC1Leλ/pUC19”(對(duì)應(yīng)于“e”型)和“hMBC1Lfλ/pUC19”(對(duì)應(yīng)于“f”型)。每種質(zhì)粒用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈DNA的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于該質(zhì)粒EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒分別被命名為“hMBC1Ldλ/pCOS1”(對(duì)應(yīng)于“d”型)，“hMBC1Leλ/pCOS1”(對(duì)應(yīng)于“e”型)和“hMBC1Lfλ/pCOS1”(對(duì)應(yīng)于“f”型)。
“g”、“h”型人源化L鏈也通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。設(shè)計(jì)“g”、“h”型以在36位分別用“a”和“d”型的酪氨酸替換組氨酸(相當(dāng)于按Kabat定義的第36號(hào)氨基酸)。用突變引物MBC1LGP9R(SEQ ID NO39)和引物M13引物RV，并用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)。該P(yáng)CR產(chǎn)物用M13引物M4作為引物以及質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作為模版再次進(jìn)行另一個(gè)PCR反應(yīng)。獲得的DNA片段用HindIII和BlnI消化，然后亞克隆到預(yù)先用HindIII和BlnI消化過(guò)的質(zhì)粒Cλ/pUC19上。用該質(zhì)粒作為模版，用引物MBC1LGP13R(SEQ ID NO40)和MBC1LVS1再次進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得的PCR片段用ApaI和HindIII消化，然后分別導(dǎo)入預(yù)先用ApaI和HindIII消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ/pUC19上。確定獲得的質(zhì)粒的DNA序列。證實(shí)含有正確序列的質(zhì)粒分別被命名為“hMBC1Lgλ/pUC19”(對(duì)應(yīng)于“g”型)和“hMBC1Lhλ/pUC19”(對(duì)應(yīng)于“h”型)。每種質(zhì)粒用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈序列的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒分別被命名為“hMBC1Lgλ/pCOS1”和“hMBC1Lhλ/pCOS1”。
“i”、“j”、“k”、“l(fā)”、“m”、“n”、“o”型人源化L鏈也通過(guò)PCR法用誘變導(dǎo)入技術(shù)制備。用突變引物MBC1LGP14S(SEQID NO41)和引物V1RV(λ)(SEQ ID NO43)，并用質(zhì)粒hMBC1Laλ/pUC19作為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)。產(chǎn)生的DNA片段用ApaI和BlnI消化，然后亞克隆到預(yù)先用ApaI和BlnI消化過(guò)的質(zhì)粒hMBC1Lgλ/pUC19上。確定獲得的質(zhì)粒的堿基序列，篩選出對(duì)應(yīng)每種類型而導(dǎo)入了突變的克隆。由此獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lxλ/pUC19(x＝i，j，k，l，m，n或o)”。該質(zhì)粒用EcoRI消化，獲得包含編碼人源化L鏈序列的DNA片段。該DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCOS1的EcoRI位點(diǎn)以至于人源化L鏈的起始密碼子定位于EF1α啟動(dòng)子的下游。由此獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，k，l，m，n或o)”?！癹”、“l(fā)”、“m”、和“o”型的DNA序列(包括對(duì)應(yīng)的氨基酸序列)分別如SEQ IDNO67、68、69和70所示。這些類型的氨基酸序列分別如SEQ ID NO48、49、50和51所示。
“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型的人源化L鏈分別被設(shè)計(jì)為“i”、“j”、“m”、“l(fā)”和“o”型的第87位酪氨酸被異亮氨酸替代的修飾型。這些類型按照下列方式利用FR3中的Aor51MI限制性位點(diǎn)并用“h”型的該位點(diǎn)替換“i”、“j”、“m”、“l(fā)”或“o”型的該位點(diǎn)而制備。從表達(dá)質(zhì)粒hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝i，j，m，l，或o)中缺失包含CDR3、部分FR3和全部FR4的Aor51HI限制性片段(514堿基對(duì))。為去除這一位點(diǎn)，將表達(dá)質(zhì)粒hMBC1Lhλ/pCOS的Aor51HI限制性片段(514堿基對(duì)，包含CDR3、部分FR3和全部FR4)連接到表達(dá)質(zhì)粒上，從而用異亮氨酸替換了第91位的酪氨酸(相當(dāng)于按Kabat定義的87號(hào)氨基酸)。確定產(chǎn)生的質(zhì)粒的DNA序列，選擇91位酪氨酸(相當(dāng)于按Kabat定義的87號(hào)氨基酸)被異亮氨酸替換的各種“i”、“j”、“m”、“l(fā)”或“o”型克隆。對(duì)應(yīng)于“i”、“j”、“m”、“l(fā)”或“o”型的這些修蝕類型分別被命名為“p”、“q”、“r”、“s”和“t”型，這些類型的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝p，q，s，r或t)”?！皅”、“r”、“s”和“t”型的DNA序列(包括對(duì)應(yīng)的氨基酸序列)分別如SEQ ID NO71、72、73、74所示。這些類型的氨基酸序列分別如SEQ ID NO52、53、54、55所示。
質(zhì)粒hMBC1Lqλ/pCOS1用HindIII和EcoRI消化，然后亞克隆到預(yù)先用HindIII和EcoRI消化的質(zhì)粒pUC19上。獲得的質(zhì)粒被命名為“hMBC1Lqλ/pUC19”。
每種人源化L鏈類型中取代氨基酸的位置如表2所示。
表2序列表中取代氨基酸的位置(按照Kabat定義的氨基酸編號(hào))型 36 43 45 47 49 80 87ab PDc PdIe PD If P Ig Yh Y Ii Y Kj Y K Dk Y K Vl Y K V Dm Y Dn YVo YV Dp Y K Iq Y K D Ir Y D Is Y K V D It YV D I上表2中，大寫字母代表下列氨基酸Y酪氨酸；P脯氨酸；K賴氨酸；V纈氨酸；D天冬氨酸；I異亮氨酸。
包含質(zhì)粒hMBC1HcDNA/pUC19的大腸桿菌株系和包含質(zhì)粒hMBC1Lqλ/pUC19的大腸桿菌株系分別被命名為“大腸桿菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)”和“大腸桿菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)”，它們已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款于1996年8月15日保藏在日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，日本)，大腸桿菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)的登記號(hào)為FERM BP-5629，大腸桿菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)的登記號(hào)為FERM BP-5630。
(5)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞為確定雜合抗體和人源化#23-57-137-1抗體的抗原結(jié)合活性和中和活性，使上述表達(dá)質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中短暫表達(dá)。為短暫表達(dá)雜合抗體L鏈，將下列各質(zhì)粒的組合用Gene Pulser(Bio Rad)通過(guò)電穿孔共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞hMBC1HcDNA/pCOS1和h/mMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Laλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Ldλ/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和hmmMBC1L(λ)/neo；hMBC1HcDNA/pCOS1和mhmMBC1L(λ)/neo。即，將各質(zhì)粒DNA 10微克加入0.8毫升COS-7細(xì)胞懸浮于PBS(-)濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液。對(duì)得到的溶液應(yīng)用靜電容量為1500V和25μF的脈沖。室溫恢復(fù)10分鐘，電穿孔處理的細(xì)胞懸浮于添加2％Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中，然后用10cm的培養(yǎng)皿在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，并離心除去細(xì)胞碎片。如此制備的溶液用于下文的ELISA分析。
為實(shí)現(xiàn)人源化#23-57-137-1抗體的短暫表達(dá)，各質(zhì)粒組合hMBC1HcDNA/pCOS1或hMBC1Lxλ/pCOS1(x＝a-t)以上述雜合抗體同樣的方式用Gene Pulser(Bio Rad)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。獲得的培養(yǎng)上清液作為用于下文ELISA分析的樣品。
其中，COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的雜合抗體或人源化抗體用AffiGel Protein A MAPSII試劑盒(Bio Rad)按照試劑盒上指示的方法進(jìn)行純化。
(6)ELISA分析(i)抗體濃度的確定確定抗體濃度的ELISA平板如下制備。用于ELISA的96孔平板(Maxisorp，NUNC)的每個(gè)孔都用100μl添加有1μg/毫升的山羊抗人IgG抗體(TAGO)的包被緩沖液(0.1M NaHCO3，0.02％ NaN3)包被，然后用200μl稀釋緩沖液[50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1M NaCl，0.05％ Tween20，0.02％ NaN3，1％牛血清白蛋白(BSA)；pH7.2]封閉。每孔加入表達(dá)雜合抗體或人源化抗體的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清的系列稀釋液或者逐步稀釋的純化雜合抗體或人源化抗體溶液。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl與堿性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗體(TAGO)。室溫培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(Bio Rad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。純化的Hu IgG1λ(結(jié)合位點(diǎn))用作抗體濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
(ii)抗原結(jié)合能力的確定確定抗原結(jié)合能力的ELISA平板如下制備。用于ELISA的96孔平板(Maxisorp，NUNC)的每個(gè)孔均用100μl添加有1μg/毫升人PTHrP(1-34)的包被緩沖液包被，然后用200μl稀釋緩沖液封閉。每孔加入雜合抗體或人源化抗體得以表達(dá)的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清的系列稀釋液或者逐步稀釋的純化雜合抗體或人源化抗體溶液。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入100μl與堿性磷酸酶偶合的山羊抗人IgG抗體(TAGO)。室溫培養(yǎng)并用PBS-Tween20沖洗后，每孔加入1毫克/毫升的底物溶液(“Sigma104”，對(duì)-硝基苯磷酸，SIGMA)。用微平板讀數(shù)儀(Bio Rad)于405nm測(cè)量溶液的吸收值。
(7)活性的確定(i)人源化H鏈的評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)包含“a”型人源化H鏈和嵌合L鏈的抗體表現(xiàn)與嵌合抗體(見(jiàn)圖6)同樣水平的PTHrP結(jié)合活性。該結(jié)果表明“a”型成功地實(shí)現(xiàn)了H鏈V區(qū)的足夠程度的人源化。因此，“a”型人源化H鏈用做下列實(shí)驗(yàn)中的人源化抗體H鏈。
(ii)雜合抗體的活性(ii-a)FR1、2/FR3、4雜合抗體當(dāng)L鏈為h/mMBC1L(λ)時(shí)，抗體不表現(xiàn)抗原結(jié)合活性。然而，當(dāng)雜合抗體的L鏈為m/hMBC1Laλ或m/hMBC1Ldλ時(shí)，抗體表現(xiàn)與嵌合#23-57-137-1抗體同樣水平的抗原結(jié)合活性(圖7)。這些結(jié)果表明FR3和FR4沒(méi)有問(wèn)題，但FR1和FR2在制備人源化抗體時(shí)存在一些氨基酸殘基需要被替換。
(ii-b)FR1/FR2雜合抗體當(dāng)雜合抗體的L鏈為mhmMBC1L(λ)時(shí)，抗體不表現(xiàn)抗原結(jié)合活性。然而，當(dāng)雜合抗體的L鏈為hmmMBC1L(λ)時(shí)，抗體表現(xiàn)與嵌合#23-57-137-1抗體同樣水平的抗原結(jié)合活性(圖8)。這些結(jié)果表明FR1在制備人源化抗體時(shí)沒(méi)有問(wèn)題，但FR2存在一些氨基酸殘基需要被替換。
(iii)人源化抗體的活性確定了每種“a”型到“t”型用做L鏈的人源化抗體的抗原結(jié)合活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有“j”，“l(fā)”，“m”，“o”，“q”，“r”，“s”和“t”型L鏈的人源化抗體表現(xiàn)與嵌合抗體同樣水平的PTHrP-結(jié)合活性(圖9-12)。
(8)能穩(wěn)定地生產(chǎn)抗體的CHO細(xì)胞系的建立為建立能穩(wěn)定生產(chǎn)人源化抗體的細(xì)胞系，將上述表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞(DXB11)。
采用下列質(zhì)粒的各組合來(lái)建立能穩(wěn)定表達(dá)人源化抗體的細(xì)胞系hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lmλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lqλ/pCOS1；hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lrλ/pCOS1。質(zhì)粒用Gene Pulser(Bio Rad)通過(guò)電穿孔共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。隨后，每種表達(dá)載體用限制性酶PvuI裂解，以獲得線型DNA片段。得到的DNA片段用苯酚和氯仿提取，然后用乙醇沉淀。制備的DNA分別如下述用于電穿孔。即，每種質(zhì)粒DNA各10微克加入0.8毫升包括COS-7細(xì)胞懸浮于PBS(-)濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸浮液中。對(duì)得到的溶液應(yīng)用靜電容量為1500V和25μF的脈沖。室溫恢復(fù)10分鐘后，電穿孔處理的細(xì)胞懸浮于添加10％胎牛血清(GIBCO)的MEM-α培養(yǎng)基(GIBCO)中，然后用96孔平板(Falcon)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)當(dāng)天，用添加10％胎牛血清(GIBCO)和500毫克/毫升GENETICIN(硫酸G418；GIBCO)但無(wú)核糖核苷和脫氧核糖核苷的MEM-α選擇培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。從培養(yǎng)基中篩選導(dǎo)入了抗體基因的細(xì)胞。用新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。在置換該培養(yǎng)基后約兩周，顯微觀察細(xì)胞。當(dāng)觀察到滿意的細(xì)胞生長(zhǎng)后，用如上述確定抗體濃度的常規(guī)ELISA分析法確定細(xì)胞產(chǎn)生的抗體量。從這些細(xì)胞中篩選大量產(chǎn)生抗體的那些細(xì)胞。
用添加2％Ultra Low IgG胎牛血清但無(wú)核糖核苷或脫氧核糖核苷的MEM-α培養(yǎng)基在搖瓶中大規(guī)模培養(yǎng)這樣建立的能穩(wěn)定生產(chǎn)抗體的細(xì)胞系。培養(yǎng)后第3天和第4天收集培養(yǎng)基上清液，并用0.2μm的濾器(Millipore)過(guò)濾以除去其中的細(xì)胞碎片。CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的人源化抗體用POROS Protein A柱(PerSeptive Biosystems)在ConSepLC100(Millopore)上按照包括于其中的指導(dǎo)方法進(jìn)行純化。該人源化抗體用做確定中和活性和檢查對(duì)高鈣血癥模型動(dòng)物藥理效能的樣品。用上述ELISA系統(tǒng)確定純化的人源化抗體的濃度和抗原結(jié)合活性。參考實(shí)施例5中和活性的確定鼠抗體、嵌合抗體和人源化抗體的中和活性的測(cè)定通過(guò)大鼠骨髓瘤細(xì)胞系ROS17/2.8-5細(xì)胞進(jìn)行。在CO2培養(yǎng)箱中，將ROS17/2.8-5細(xì)胞培養(yǎng)在添加10％胎牛血清(GIBCO)的Ham′s F-12培養(yǎng)基中，將ROS17/2.8-5細(xì)胞接種到用96孔平板的每孔中培養(yǎng)1天，細(xì)胞濃度為104個(gè)細(xì)胞/100μl/孔。培養(yǎng)基用添加4mM氫化可的松和10％胎牛血清的Ham′s F-12培養(yǎng)基(GIBCO)更換。培養(yǎng)三到四天后，培養(yǎng)細(xì)胞用260μl Ham′s F-12培養(yǎng)基(GIBCO)沖洗，然后其中加入80μl添加有1mM異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，SIGMA)、10％胎牛血清和10mM HEPES的Ham′s F-12培養(yǎng)基。得到的混合物于37℃保溫30分鐘。
用于檢測(cè)中和活性的鼠抗體、嵌合抗體和人源化抗體預(yù)先按照下列各組逐步稀釋[10μg/毫升，3.3μg/毫升，1.1μg/毫升和0.37μg/毫升]，[10μg/毫升，2μg/毫升，0.5μg/毫升和0.01μg/毫升]和[10μg/毫升，5μg/毫升，1.25μg/毫升，0.63μg/毫升和0.31μg/毫升]。每種稀釋的抗體樣品溶液與等量4納克/毫升PTHrP(1-34)混合。得到的混合溶液80μl加入各孔。每種抗體的終濃度為上述抗體濃度的四分之一，因此PTHrP(1-34)的濃度成為1納克/毫升。室溫處理十分鐘后，除去培養(yǎng)上清液，殘留物用PBS沖洗三次。從產(chǎn)物中用100μl 0.3％HCl-95％乙醇提取細(xì)胞中的cAMP，然后用水蒸汽吸收器蒸發(fā)除去HCl-乙醇。殘留物溶解于120μl cAMP EIA試劑盒(CAYMAN CHEMICAL’S)所附的EIA緩沖液中以提取其中的cAMP。用cAMP EIA試劑盒(CAYMAN CHEMICAL’S)按照其中指示的方法確定cAMP的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在具有與嵌合抗體表現(xiàn)同樣水平抗原結(jié)合活性的人源化抗體中，具有在91位酪氨酸被異亮氨酸取代的“q”，“r”，“s”和“t”型L鏈人源化抗體表現(xiàn)與嵌合抗體最接近的中和活性，尤其L鏈為“q”型的人源化抗體表現(xiàn)最強(qiáng)的中和活性(圖13-15)。工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明提供了包含能抑制PTHrP和其受體相結(jié)合的物質(zhì)作為活性成分的惡病質(zhì)治療劑。
在使用惡病質(zhì)模型動(dòng)物的藥學(xué)試驗(yàn)中，上述物質(zhì)可使試驗(yàn)動(dòng)物與對(duì)照相比防止體重減輕并使存活時(shí)間延長(zhǎng)。因此，所述物質(zhì)可用于治療惡病質(zhì)。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO1的序列描述AAATAGCCCT TGACCAGGCA 20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO2的序列描述CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO3的序列描述GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG28(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO4的序列描述GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA 29(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO5的序列描述GTTTTCCCAG TCACGAC17(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO6的序列描述CAGGAAACAG CTATGAC17(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO7的序列描述GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C31(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO8的序列描述TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA 30(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO9的序列描述GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG 36(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO10的序列描述TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G 41(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度109個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO11的序列描述GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC 60CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT 109(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度110個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO12的序列描述GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT 110(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO13的序列描述GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 60CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG 98(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度106個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO14的序列描述TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT60CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC 106(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO15的序列描述GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC 43(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO16的序列描述TGTTGAATTC TTACTATGAA 20(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO17的序列描述CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC39(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO18的序列描述GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA39(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO19的序列描述GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC46(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO20的序列描述TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO21的序列描述GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT35(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO22的序列描述TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC48(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度128個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO23的序列描述GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA60GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG120TCCCTGAG 128(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度125個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO24的序列描述ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC60ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG120GACAC 125(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度132個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO25的序列描述CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC60CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC120CTCCCAGGCT GG132(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度110個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO26的序列描述TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG110(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO27的序列描述GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG 30(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO28的序列描述TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG 30(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度133個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO29的序列描述ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG60GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT120CGGTCAAGCT CAC 133(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO30的序列描述AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT60CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度128個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO31的序列描述CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC60TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC120GAGGCTCC 128(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度114個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO32的序列描述CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA60TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO33的序列描述ACAAAGCTTC CACCATG17(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO34的序列描述CTTGGATCCG GGCTGACCT 19(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO35的序列描述CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60TTGTTCCTTA ATTGT 75(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DN″(xi)SEQ ID NO36的序列描述AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG 43(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO37的序列描述ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA46(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度111個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO38的序列描述CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C 111(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO39的序列描述CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT42(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO40的序列描述CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG 26(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO41的序列描述GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA35(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO42的序列描述CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG35(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO43的序列描述GGCTTGGAGC TCCTCAGA 18(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型其他核酸(A)說(shuō)明/desc＝″合成DNA″(xi)SEQ ID NO44的序列描述GACAGTGGTT CAAAGTTTT 20(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO45的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg65 70 75Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO46的序列描述Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr
50 55 60Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp80 85 90Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe95 100 105Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala110 115(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度116個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO47的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly110 115(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO48的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO49的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg
65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO50的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO51的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO52的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO53的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO53的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO54的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val95 100 105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO55的序列描述Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr20 25 30Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg35 40 45Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp50 55 60Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg65 70 75Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr80 85 90Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val
11295 100105Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro110 115(2)SEQ ID NO56的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度118個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO56的序列描述Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly1 5 10 15Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr50 55 60Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe95 100 105Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115(2)SEQ ID NO57的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO57的序列描述ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys-15 -10 -5GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu1 5 10GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly15 20 25TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro30 35 40GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT AGT GGr GGT AGT 225Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser45 50 55TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser60 65 70AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu75 80 85AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr90 95 100ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 405Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val105 110 115TCT GCA 411Ser Ala(2)SEQ ID NO58的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO58的序列描述
114ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA45Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg-15 -10 -5GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG90Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val1 5 10GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA135Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly15 20 25TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA180Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro30 35 40GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT225Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser45 50 55TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC270Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser60 65 70AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG315Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu75 80 85AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT360Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr90 95 100ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC405Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val105 110 115TCC TCA 411Ser Ser(2)SEQ ID NO59的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO59的序列描述Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala1 5 10(2)SEQ ID NO60的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO60的序列描述Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr1 5(2)SEQ ID NO61的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO61的序列描述Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr1 5(2)SEQ ID NO62的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO62的序列描述Pro Tyr Trp Met Gln1 5(2)SEQ ID NO63的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO63的序列描述Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO64的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO64的序列描述Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr1 5 10(2)INEQRMATION FOR SEQ ID NO65(2)SEQ ID NO65的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO65的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser1 5 10TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu30 35 40AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CTT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC 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NO68的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO68的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser
15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA ACC ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO69的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO69的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO70的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO70的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO71的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO71的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu
30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CAT GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO72的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO72的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO73的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO73的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His45 50 55AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO74的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度411個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(xi)SEQ ID NO74的序列描述ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser-15 -10 -5GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser1 5 10GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser15 20 25CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu30 35 40AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His
45 50 55AGC ACA GTG GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser60 65 70GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp75 80 85GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln90 95 100TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly105 110 115CAG CCC 411Gln Pro(2)SEQ ID NO75的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO75的序列描述Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile1 5 10 15Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu20 25 30Ile His Thr Ala
權(quán)利要求
1.一種用于惡病質(zhì)的治療劑，包括作為活性成分的能抑制甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)和其受體相結(jié)合的物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的用于惡病質(zhì)的治療劑，其中所述的物質(zhì)是PTHrP拮抗劑。
3.權(quán)利要求1的用于惡病質(zhì)的治療劑，其中所述的物質(zhì)是抗PTHrP的抗體。
4.權(quán)利要求1的用于惡病質(zhì)的治療劑，其中所述的物質(zhì)是抗PTHrP抗體的片段和/或其被改性的片段。
5.權(quán)利要求3或4的用于惡病質(zhì)的治療劑，其中所述的抗體是人源化的或嵌合的抗體。
6.權(quán)利要求5的用于惡病質(zhì)的治療劑，其中所述的人源化的抗體是人源化的#23-57-137-1抗體。
7.權(quán)利要求3或4的用于惡病質(zhì)的治療劑，其中所述的抗體是單克隆型抗體。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的用于惡病質(zhì)的治療劑，其中所述的惡病質(zhì)是一種由癌誘導(dǎo)的惡病質(zhì)。
全文摘要
本文公開(kāi)了一種惡病質(zhì)治療劑,它含有作為活性成分的能抑制甲狀旁腺素相關(guān)肽和其受體結(jié)合的物質(zhì)。所述的抑制性物質(zhì)的例子包括甲狀旁腺素相關(guān)肽受體的拮抗劑、甲狀旁腺素相關(guān)肽抗體、抗體片段和被改性的抗體。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1255858SQ98805095
公開(kāi)日2000年6月7日 申請(qǐng)日期1998年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月15日
發(fā)明者佐藤功, 恒成利明, 石井公惠 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社