專利名稱：：具有氨肽酶活性的多肽及編碼核酸的制作方法
背景技術：
：發(fā)明領域本發(fā)明涉及具有氨肽酶活性的分離的多肽和編碼這些多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞以及所述多肽的制備方法。本發(fā)明進一步涉及獲得可作為提味劑的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法。相關技術的描述許多食品，例如湯、調(diào)味汁和佐料都含有通過水解蛋白類原料而獲得的提味劑。傳統(tǒng)上，這種水解過程是采用濃鹽酸來進行，隨后用氫氧化鈉進行中和。但是，這種化學水解方法導致水解過程中得到的氨基酸嚴重降解，并且該化學反應過程中會形成有害的副產(chǎn)品。對化學法水解得到的提味劑的日益擔憂引發(fā)了酶法水解工藝的開發(fā)。蛋白類原料的酶法水解過程目的在于達到較高的水解度(DH)，這一點通常是通過使用非特異性作用的蛋白水解酶復合體(即非特異性作用的內(nèi)切和外切肽酶)實現(xiàn)的。例如，WO94/25580描述了一種使用得自米曲霉(Aspergillusoryzae)的非特異性作用的酶制劑來水解蛋白質(zhì)的方法。目前還沒有特異性作用的蛋白水解酶用于這一目的，因為這樣的酶只能產(chǎn)生不完全水解。具有氨肽酶活性的多肽能催化從肽、多肽和蛋白質(zhì)的N-端切下1或更多個氨基酸殘基。這類多肽被分類在國際生物化學和分子生物學會制定的酶學分類編號EC3.4.11.中。WO96/28542公開了一種分子量為35kDa的氨肽酶。JP-7-5034631(Noda)公開了一種得自yellowkoji霉菌(包括米曲霉)的亮氨酸氨肽酶。JP-7-4021798(ZaidanHojinNodaSangyo)公開了通過添加亮氨酸氨肽酶II來制備醬油的方法，其中亮氨酸氨肽酶II是通過培養(yǎng)多個菌株，包括米曲霉460(ATCC20386)和IAM2616制成的。已知米曲霉460能產(chǎn)生多種亮氨酸氨肽酶，其中的三種通過凝膠過濾測得分子量為26.5、56和61kDa(分別見Nakada等，1972，農(nóng)業(yè)和生物化學AgriculturalandBiologicalChemistry)37757-765；Nakada等，1972，農(nóng)業(yè)和生物化學37767-774；和Nakada等，1972，農(nóng)業(yè)和生物化學37775-782)。柑橘青霉(Penicilliumcitrium)能產(chǎn)生一種胞內(nèi)亮氨酸氨肽酶，通過SDS-PAGE測得分子量為65kDa(Kwon等，1996，工業(yè)微生物學雜志(JournalofIndustrialMicrobiology)1730-35)。WO97/04108(Roehm)公開了編碼醬油曲霉(A.sojae)亮氨酸氨肽酶的DNA。Chang和Smith(1989，生物學化學雜志(JournalofBiologicalChemistry)2646979-6983)公開了得自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的液泡氨肽酶編碼基因的分子克隆和測序。Chang等(1992，生物學化學雜志2678007-8011)公開了得自釀酒酵母的甲硫氨酸氨肽酶編碼基因的分子克隆和測序。通常需要使用有肽酶活性的混合體系來制備具有良好感官品質(zhì)和較高水解度的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。人們很希望能提供一種單一組分的肽酶，可利用其活性，將它單獨或與其他酶結(jié)合使用以改善食品中所用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的感官品質(zhì)和水解度。本發(fā)明的一個目的是提供具有氨肽酶活性的改善的多肽，和獲得有良好感官品質(zhì)和高水解度的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有氨肽酶活性的分離的多肽，它們選自(a)有與SEQIDNO2氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列的多肽；(b)由這樣一個核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在中度嚴謹條件下與(i)SEQIDNO1的核酸序列，(ii)其互補鏈，或(iii)其亞序列可雜交；(c)(a)或(b)的等位基因變體；和(d)(a)、(b)或(c)的一個片段，該片段具有氨肽酶活性；和(e)有氨肽酶活性和如下物理化學特性的多肽(i)在有N-丙氨酰對硝基苯胺的情況下，于室溫確定出最佳pH范圍在大約pH7.27到pH10.95；(ii)在沒有底物情況下，60℃保溫20分鐘后于pH7.5確定出對溫度的穩(wěn)定性為初始活性的90％或以上；和(iii)對Xaa-pNA(Xaa-P-nitroanilide)有活性，其中Xaa選自亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的分離的核酸序列，和包含該核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞以及制備所述多肽的方法。本發(fā)明還涉及由蛋白類底物獲得水解產(chǎn)物的方法，該方法包括將蛋白類材料與單獨的、或結(jié)合內(nèi)肽酶的有氨肽酶活性的多肽進行接觸，還涉及由該方法獲得的水解產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及由蛋白類底物獲得富含游離谷氨酸和/或肽鍵合谷氨酸殘基的水解產(chǎn)物的方法，該方法包括將底物進行脫酰胺反應，和接受具有氨肽酶活性的多肽的作用。本發(fā)明進一步涉及包含有氨肽酶活性的多肽的提味組合物。該組合物還可以包含另外的酶活性。最后一個方面，本發(fā)明的方法可以用于食品相關的應用(如烘烤)中，以改善風味?？蛇x擇地，通過添加由本發(fā)明所述方法獲得的水解產(chǎn)物可以改善食品的風味。附圖簡述圖1顯示米曲霉ATCC20386氨肽酶的核酸序列和推導出的氨基酸序列(分別是SEQIDNO1和2)。圖2顯示pMWR3的限制圖譜。圖3顯示pEJG19的限制圖譜。圖4顯示pDM181的限制圖譜。圖5顯示pEJG28的限制圖譜。發(fā)明詳述具有氨肽酶活性的多肽術語“氨肽酶活性”在文中定義為能催化從肽、寡肽或蛋白質(zhì)的N-端切下氨基酸的肽酶活性。一般來說，氨肽酶活性能從肽、多肽或蛋白質(zhì)的N-端切除氨基酸X，其中X可以代表選自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸的任何氨基酸殘基，但至少是亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和/或脯氨酸。應當理解，本發(fā)明所述具有氨肽酶活性的分離的多肽對要裂解的肽、多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以是非特異性的。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的多肽，該多肽具有氨肽酶活性，其氨基酸序列與SEQIDNO2氨基酸序列的相同程度至少是大約50％、優(yōu)選至少是大約60％、優(yōu)選至少是大約70％，更優(yōu)選至少是大約80％，還要優(yōu)選的是至少大約90％，最優(yōu)選至少是大約95％，最最優(yōu)選的是至少大約97％(以下稱為“同源多肽”)。在一個優(yōu)選實施方案中，同源多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO2氨基酸序列有5個不同的氨基酸，優(yōu)選4個氨基酸不同，更優(yōu)選3個不同，還要優(yōu)選的是2個不同，最優(yōu)選1個氨基酸不同。用于本發(fā)明的目的，通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)用相同性表、缺口罰分和缺口長度罰分均為10來確定兩個氨基酸序列之間的相同程度。優(yōu)選地，本發(fā)明所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或等位基因變體；和它們的一個有氨肽酶活性的片段。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述多肽具有SEQIDNO2的氨基酸序列或它的一個有氨肽酶活性的片段。SEQIDNO2的片段是該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個氨基酸的多肽。在一個最優(yōu)選的實施方案中，多肽具有SEQIDNO2的氨基酸序列。優(yōu)選地，多肽片段含有至少330個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少380個氨基酸殘基，最優(yōu)選有至少430個氨基酸殘基。等位基因變體表示一個基因占據(jù)相同染色體位點的兩個或多個可替換形式中任意一種。通過突變自然產(chǎn)生等位基因變體，并可能導致種群內(nèi)的表現(xiàn)型多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽沒有變化)或者可以編碼氨基酸序列改變的多肽。術語“等位基因變體”也用來表示等位基因變體所編碼的蛋白質(zhì)。同源多肽的氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列不同之處可能在于插入或缺失1或多個氨基酸殘基和/或用不同的氨基酸殘基取代1或多個氨基酸殘基。優(yōu)選地，氨基酸改變是小的變化，即不會顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大約30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸殘基；有多達大約20-25個殘基的小連接肽；或者這樣一個小延伸，它通過改變凈電荷有助于純化或者有其它功能(如多聚組氨酸尾巴、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。保守性取代的例子是在堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(如丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)內(nèi)進行的取代。通常不會改變特異性作用的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill(1979)等(《蛋白質(zhì)》，AcademicPress，NewYork)描述過。最常見的替換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向進行的替換。在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及具有氨肽酶活性的分離的多肽，編碼它們的核酸序列在低度嚴謹條件下，更優(yōu)選在中度嚴謹條件下，最優(yōu)選在高度嚴謹條件下，與寡核苷酸探針(這些探針在相同的條件下，能與SEQIDNO1的核酸序列或其互補鏈雜交)能夠雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，分子克隆實驗指南，第2版，ColdSpringHarbor，NewYork)；或所述多肽的等位基因變體和有氨肽酶活性的片段。雜交是指按照標準Southern印跡操作進行實驗，核酸序列與對應于SEQIDNO1所示核酸序列中多肽編碼部分的寡核苷酸探針在低度到高度嚴謹條件下(即，在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切變性的鮭精DNA、甲酰胺(對低度、中度和高度嚴謹條件分別為25、35或50％)中于42℃預雜交和雜交)能發(fā)生雜交。可以根據(jù)本領域熟知的方法，用SEQIDNO2的氨基酸序列或其部分序列來設計寡核苷酸引物，或者可以用編碼本發(fā)明所述多肽的核酸序列(如SEQIDNO1的核酸序列，或其亞序列)從不同屬或種的株系中鑒定和克隆到編碼有氨肽酶活性的多肽的DNA。具體來說，可以按照標準Southern印跡操作，用這些探針與所研究的屬或種的基因組或cDNA雜交，以便鑒定和分離其中的相應基因。這些探針可以比完整序列短得多，但應至少有15個、優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少40個核苷酸長。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針都可使用。通常為了檢測相應基因要將探針進行標記(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。因此，可以從得自其他生物的基因組、cDNA或組合化學文庫篩選能與上述探針雜交、并編碼有氨肽酶活性的多肽的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者其他分離技術來分離來自其他生物的基因組DNA或其他DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定到硝酸纖維素膜或其他合適的載體物質(zhì)上。為了鑒定出與SEQIDNO1同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用了載體材料，并且最終用2×SSC、0.2％SDS將該載體材料洗3次，每次30分鐘，洗滌溫度優(yōu)選至少50℃，更優(yōu)選至少55℃，更優(yōu)選至少60℃，更優(yōu)選至少65℃，還要優(yōu)選的是至少70℃，最優(yōu)選的是至少75℃。用X-光膠片檢測出在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。在第三個實施方案中，本發(fā)明涉及具有以下物理化學特性的分離的多肽(i)在有N-丙氨酰對硝基苯胺的情況下，于室溫確定的最佳pH在大約pH7.27到大約pH10.95；(ii)沒有底物的情況下，60℃保溫20分鐘后于pH7.5確定出對溫度的穩(wěn)定性為起始活性的90％或以上；和(iii)對N-Xaa?；?對硝基苯胺有活性，其中的Xaa選自亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。本發(fā)明所述多肽還有水解其他底物的能力。在一個優(yōu)選實施方案中，在有N-丙氨酰-脯氨酰對硝基苯胺的情況下，于室溫溫育5分鐘后，確定出最佳pH在大約pH7.27到大約pH10.95，更優(yōu)選在大約pH8.03到pH10.95，最優(yōu)選在大約pH8.62到pH10.51。在第四個實施方案中，本發(fā)明涉及與具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽在免疫化學特性上相同或部分相同的分離的多肽。免疫化學特性是采用熟知的Ouchterlony雙向免疫擴散操作通過免疫交叉反應相同性檢測實驗確定的。具體說，是依照Harboe和Ingild(在N.H.Axelsen，J.Kroll，和B.Weeks編的“定量免疫電泳手冊”，BlackwellScientificPublications，1973，23章)或Johnstone和Thorpe(實用免疫化學，BlackwellScientificPublications，1982(具體在27-31頁))描述的步驟，通過免疫兔(或其他嚙齒動物)制備抗血清，該抗血清所含抗體與具有SEQIDNO2氨基酸序列之多肽的表位具有免疫反應性或可與之結(jié)合。有相同免疫化學特性的多肽是這樣的多肽，在使用特定免疫化學技術時，它們與抗血清反應的方式相同(如沉淀物的完全融合、相同的沉淀形態(tài)和/或相同的電泳遷移率)。Axelsen、Bock和Kroll(N.H.Axelsen，J.Kroll，和B.Weeks編“定量免疫電泳手冊”，BlackwellScientificPublications，1973，10章)對免疫化學相同性作了更詳細解釋。免疫化學特性部分相同的多肽是采用特定的免疫化學技術時與抗血清反應的方式部分相同(如沉淀物的部分融合、部分相同的沉淀形態(tài)和/或部分相同的電泳遷移率)的多肽。。Axelsen、Bock(N.H.Axelsen，J.Kroll，和B.Weeks編“定量免疫電泳手冊”，BlackwellScientificPublications，1973，11章)對免疫化學特性部分相同作了更詳細解釋?？梢詮娜魏螌俚奈⑸镏蝎@得能和這樣的寡核苷酸探針雜交的核酸序列所編碼的多肽(該寡核苷酸探針能與SEQIDNO1核酸序列、其互補鏈或者等位基因變體和亞序列雜交)；該多肽的等位基因變體和片段；或者同源多肽和免疫化學特性相同或部分相同的多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，這些多肽可以來源于細菌。例如，可以從革蘭氏陽性細菌，如芽孢桿菌或鏈霉菌中得到這些多肽。芽孢桿菌的例子如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌；鏈霉菌的例子如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或者從革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌或假單胞菌中得到。所述多肽可以來源于真菌，更優(yōu)選得自酵母菌，如假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、許旺酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia；或者來源于絲狀真菌，如支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix、鏈孢霉屬、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根霉屬(THielavia)、Tolypocladium或木霉屬的菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，從卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、S.douglasii、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形糖酵母(S.oviformis)菌株中獲得所述多肽。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述多肽來源于桿孢狀鐮孢、Fusarium.cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡鐮孢(Fusariumnegundi)、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusariumvenenatum、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、Trichodermaharzianum、康寧木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木霉菌株。優(yōu)選本發(fā)明所述多肽得自曲霉屬的某些菌種，這些種包括但不限于，棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽，例如具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽，得自米曲霉菌株、最優(yōu)選得自米曲霉ATCC20386或它的突變株。應理解，就上述菌株而言，本發(fā)明包括其良好和不良狀態(tài)，以及其他分類學上的等同體(例如變形體)，而無論其已知種名為何。本領域技術人員容易認識到適當?shù)牡韧w是相同的。本發(fā)明所述多肽還可以得自與“曲霉”同義的微生物，如Raper，K.D.和Fennel，D.I.定義的(1965，《曲霉屬》，TheWilkinsCompany，Baltimore)。Aspergilli是有絲分裂孢子(mitosporic)真菌，其特征是aspergillum包含沒發(fā)現(xiàn)其有性形態(tài)的分生孢子柄，它的末端形成一個小泡，后者又有1或2層同時形成的分化細胞，分別稱為擔孢子梗或瓶梗，無性過程形成的孢子稱為分生孢子。曲霉屬的已知有性型包括散囊菌屬、Neosartorya和赤孢殼屬(Emericella)。公眾可很容易從許多培養(yǎng)物保藏中心(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC，德意志微生物保藏中心(DSM)，真菌菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(NRRL))獲得曲霉屬菌株及其有性型。另外，用前面提到的探針可以從其他來源，包括從自然界(如土壤、沉積物、水體等)分離到的微生物中鑒定和獲得這些多肽。用于從其自然生存環(huán)境分離微生物的技術是本領域已知的。類似地，通過篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫可以得到所述核酸序列。一旦用探針檢測到了編碼所述多肽的核酸序列，就可以采用本領域技術人員已知的技術(參見，例如Sambrook等，1989，出處同前)對序列進行分離和克隆。就本發(fā)明的目的而言，文中與特定來源連在一起使用的術語“得自”意味著所述多肽由該來源產(chǎn)生或由插入了來自該來源的基因的細胞產(chǎn)生。如文中定義，“分離的”多肽是基本上沒有其他非氨肽酶多肽的多肽，例如通過SDS-PAGE確定出至少大約20％純，優(yōu)選至少大約40％純，更優(yōu)選大約60％純，還要優(yōu)選的是大約80％純，最優(yōu)選大約90％純，最最優(yōu)選大約95％純的多肽。核酸序列本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所述多肽的分離的核酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，編碼多肽的核酸序列得自曲霉，例如米曲霉，在一個更優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列，例如SEQIDNO1的核酸序列得自米曲霉ATCC20386。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述核酸序列是質(zhì)粒pEJG18(該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-21677)所含序列。本發(fā)明還包括編碼具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽的核酸序列，它與SEQIDNO1之間因遺傳密碼的簡并性而有所不同。本發(fā)明還涉及SEQIDNO1的亞序列，這些亞序列編碼SEQIDNO2的具有氨肽酶活性的片段。SEQIDNO1的亞序列是SEQIDNO1涵蓋的核酸序列，但從5’末端和/或3’末端缺失掉了1或多個核苷酸。優(yōu)選地，亞序列含有至少990個核苷酸，更優(yōu)選至少1140個核苷酸，最優(yōu)選至少1290個核苷酸。所述核酸序列可以得自在分類學上等同于曲霉的微生物(Raper，K.D.和Fennel，D.I.定義過的，出處同前)，不論這些微生物名稱如何。用于分離和克隆編碼多肽的核酸序列的技術是本領域已知的，包括從基因組DNA中分離、由cDNA制備或?qū)⑺鼈兘M合運用。為了從基因組DNA克隆本發(fā)明所述核酸序列，可以使用已知的聚合酶鏈式反應(PCR)或用抗體篩選表達文庫來檢測有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段。參見例如，Innis等，1990，PCR方法和應用指南，AcademicPress，NewYork。還可以使用其他核酸擴增操作，如連接酶鏈反應(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴增方法(NASBA)。可以從曲霉屬的一個或另一個菌株或者相關微生物中克隆得到所述核酸序列，因此，該核酸序列例如可以是所述核酸序列的多肽編碼區(qū)之等位基因或種變體。文中使用的術語“分離的核酸序列”是指基本上不含其他核酸序列的核酸序列，例如，經(jīng)瓊脂糖電泳確定出至少大約20％純，優(yōu)選至少大約40％純，更優(yōu)選至少大約60％純，還要優(yōu)選的是至少大約80％純，最優(yōu)選至少大約90％純。例如，可以通過標準克隆步驟獲得分離的核酸序列，在基因工程中常用這些步驟來將核酸序列從其天然位置轉(zhuǎn)移到不同的位點，該序列在此被復制。克隆步驟可以包括切割和分離所需的包含多肽編碼核酸序列的核酸片段、將該片段插入載體分子以及將重組載體導入宿主細胞并在其中復制出多拷貝或多克隆的該核酸序列。核酸序列可以是基因組DNA、cDNA、RNA、半合成的、合成的或者是它們的任何組合方式。本發(fā)明還涉及編碼活性多肽、與SEQIDNO1核酸序列有一定同源性的核酸序列，同源程度至少約為50％、優(yōu)選約60％、優(yōu)選約70％、約80％、更優(yōu)選約90％，還要優(yōu)選的是約95％，最優(yōu)選的是大約97％同源。就本發(fā)明目的而言，兩個核酸序列間的同源程度是通過Clustal方法(Higgins，1989，出處同前)用相同性表，缺口罰分和缺口長度罰分均為10確定的。合成與本發(fā)明所述多肽基本相似的多肽時，可能有必要對編碼本發(fā)明多肽的核酸序列進行修飾。術語與所述多肽“基本相似”是指非天然形式的多肽。這些多肽可能與從天然來源分離到的多肽在某些設計方式上不同。例如，可能希望用例如定點誘變來合成多肽的變體，這些變體有不同的特異性作用、熱穩(wěn)定性或最佳pH等?？梢栽赟EQIDNO1中多肽編碼部分所示核酸序列的基礎上構(gòu)建出類似序列，例如其亞序列；并/或通過引入這樣的核苷酸取代而構(gòu)建，這些取代不會使產(chǎn)生的氨基酸序列與原核酸序列編碼的多肽不同，但它們符合制備酶所用宿主生物對密碼子的使用習慣；或通過引入會產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構(gòu)建。關于核苷酸取代的綜述，參見例如Ford等，蛋白質(zhì)表達和純化(ProteinExpressionandPurification)295-107。對本領域技術人員顯而易見的是，可以在分子功能關鍵區(qū)以外作這些取代，而仍可以得到活性多肽?？梢砸勒毡绢I域的已知操作，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參見例如，Cunningham和Wells，1989，科學(Science)2441081-1085)，鑒定出那些為本發(fā)明所述分離的核酸序列編碼的多肽活性所必需、因此最好不進行取代的氨基酸殘基。后一種技術中，向分子中每個帶正電荷的殘基導入突變，檢測所得突變分子的氨肽酶活性從而鑒定出對分子活性比較關鍵的氨基酸殘基。通過分析例如用核磁共振、晶體學或光親合標記確定的立體結(jié)構(gòu)，也可以確定底物-酶相互作用的位點(參見例如，deVos等，1992，科學255306-312；Smith等，1992，分子生物學雜志(JournalofMolecularBiology)224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS快報(FEBSLetters)30959-64)。本發(fā)明所述多肽還包括融合多肽或可裂解的融合多肽，這些融合多肽是在所述多肽或其片段的N-或C-末端融合上了另一個多肽。融合多肽是通過將編碼另一個多肽的核酸序列(或者其一部分)與本發(fā)明的核酸序列(或者其一部分)融合在一起制備的。用于制備融合多肽的技術是本領域已知的，包括讀框一致地連接多肽編碼序列，并且使融合多肽的表達受到相同的啟動子和終止子的調(diào)控。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所述多肽的分離的核酸序列，這些序列在低度嚴謹條件，更優(yōu)選在中度嚴謹條件，最優(yōu)選在高度嚴謹條件下能與這樣的寡核苷酸探針雜交，該探針在相同的條件下能與SEQIDNO1的核酸序列或其互補鏈，或其等位基因變體和亞序列雜交(Sambrook等，1989，出處同前)。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸序列的核酸構(gòu)建體，在這些核酸構(gòu)建體中，核酸序列可操縱地連接了1或多個調(diào)控序列，該調(diào)控序列在與其相容的條件下能指導編碼序列在合適的宿主細胞中進行表達。表達應理解為包括多肽生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，包括，但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌?！昂怂針?gòu)建體”在文中定義為單鏈或雙鏈核酸分子，它們分離自天然基因，或者已被修飾而含有以非天然方式組合和排列的核酸片段的基因。當核酸構(gòu)建體包含所有表達本發(fā)明所述編碼序列必需的調(diào)控序列時，術語核酸構(gòu)建體與表達盒同義。術語“編碼序列”在文中定義為能轉(zhuǎn)錄為mRNA，并翻譯成本發(fā)明所述多肽的序列。編碼序列的范圍通常是由位于mRNA5’端開放讀碼框上游的核糖體結(jié)合位點(對于原核細胞)或ATG起始密碼子(對于真核細胞)和位于mRNA3’端開放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止序列確定的。編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列?？梢砸远喾N方式操作編碼本發(fā)明所述多肽的分離的核酸序列使其表達所述多肽。在將編碼多肽的核酸序列插入載體中之前對其進行加工可能比較理想，或者是必需的，這取決于具體的表達載體。利用克隆方法修飾核酸序列的技術為本領域所熟知。本文中術語“控制序列”定義為包括本發(fā)明多肽的表達所必需或有利的所有組分。每個調(diào)控序列對于編碼多肽的核酸序列可以是天然含有的或外來的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。為了導入特定的限制位點以便于將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)連接起來，可以提供帶有接頭的調(diào)控序列。術語“可操縱地連接”在文中定義為這樣一種結(jié)構(gòu)，其中調(diào)控序列相對于DNA序列的編碼序列適當?shù)匚挥谀苤笇Мa(chǎn)生多肽的位置上。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列、用來表達核酸序列的宿主細胞能識別的核酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是任何在所選用的宿主細胞中有轉(zhuǎn)錄活性的核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，可以得自編碼對于宿主細胞是內(nèi)源或外源、胞外或胞內(nèi)多肽的基因。指導轉(zhuǎn)錄本發(fā)明所述核酸構(gòu)建體(特別是在細菌宿主細胞中)的合適啟動子的例子，是得自以下來源的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，原核細胞的β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美國科學院學報(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA)753727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，美國科學院學報，8021-25)?！皝碜灾亟M細菌的有用蛋白質(zhì)”(科學美國人，1980，24274-94)一文以及Sambrook等(1989，出處同前)描述過其他啟動子。用于在絲狀真菌宿主細胞中指導轉(zhuǎn)錄本發(fā)明所述核酸構(gòu)建體的合適啟動子的例子得自編碼以下酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucormiehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(美國專利4288627)和它們的突變、截短和雜合啟動子。特別優(yōu)選用于絲狀真菌宿主細胞的啟動子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(來源于編碼黑曲霉中性α-淀粉酶的基因和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的雜合啟動子)，以及glaA啟動子。可用于酵母宿主的啟動子得自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、半乳糖激酶基因(GAL1)、乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)和3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等(1992，酵母(Yeast)8423-488)描述過其他可用于酵母宿主細胞的啟動子。可用于哺乳動物宿主細胞的啟動子包括病毒啟動子，如來自猴病毒40(SV40)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)和人巨細胞病毒(CMV)的病毒啟動子。調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即能被宿主細胞識別從而終止轉(zhuǎn)錄的一段序列。終止序列可操縱地連接在編碼多肽的核酸序列的3’末端。任何適用于所用宿主細胞的終止子都可以用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選終止子得自編碼以下酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。用于酵母宿主細胞的優(yōu)選終止子得自編碼以下酶的基因釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)、或釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。Romanos等(1992，出處同前)描述過其他可用于酵母宿主細胞的終止子。用于哺乳動物宿主細胞的終止序列為本領域所熟知。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列(mRNA的非翻譯區(qū)，對宿主細胞翻譯非常重要)。前導序列可操縱地連接在編碼多肽的核酸序列的5’末端。任何適用于所用宿主細胞的前導序列都可以用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選前導序列得自編碼以下酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶。適用于酵母宿主細胞的前導序列得自以下基因釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)。調(diào)控序列還可以是多聚腺苷酸化序列，該序列可操縱地連接在核酸序列的3’末端，當翻譯時，它能被宿主細胞識別為向轉(zhuǎn)錄后的mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號。任何適用于所用宿主細胞的多聚腺苷酸化序列都可以用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選多聚腺苷酸化序列得自編碼以下酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。Guo和Sherman(1995，分子細胞生物學155983-5990)描述過可用于酵母宿主細胞的多聚腺苷酸化序列。用于哺乳動物宿主細胞的多聚腺苷酸化序列為本領域所熟知。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，該區(qū)編碼一段連在多肽氨基端、能引導編碼多肽進入細胞分泌途徑的氨基酸序列。核酸序列編碼區(qū)的5’端可能天然含有信號肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)與分泌多肽的編碼區(qū)片段翻譯讀框一致地連接在一起。可選擇地，核酸序列編碼區(qū)的5’端可含有對編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)。在正常情況下不含有信號肽編碼區(qū)的編碼序列，可能需要添加外來信號肽編碼區(qū)?？蛇x擇地，為了增強多肽分泌，可以用外來的信號肽編碼區(qū)簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)。信號肽編碼區(qū)可以得自曲霉屬內(nèi)某些種的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、根霉屬內(nèi)某些種的脂酶或蛋白酶基因、釀酒酵母α-因子的基因、芽孢桿菌屬內(nèi)某些種的淀粉酶或蛋白酶基因，或者小牛前凝乳酶原基因。但是，任何能引導表達后的多肽進入所用宿主細胞的分泌途徑的信號肽編碼區(qū)都可以用于本發(fā)明。用于細菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區(qū)是得自芽孢桿菌NCIB11837的麥芽糖源淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌的枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌的β-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)或枯草芽孢桿菌PrsA基因的信號肽編碼區(qū)。Simonen和Palva(1993，微生物學綜述(MicrobiologicalReviews)57109-137)描述過其他的信號肽。用于絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼區(qū)是得自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicolalanuginosa纖維素酶或Humicolalanuginosa脂酶基因的信號肽編碼區(qū)?？捎糜诮湍杆拗骷毎男盘栯牡米葬劸平湍甫?因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的編碼基因。Romanos等(1992，出處同前)描述過其他有用的信號肽編碼區(qū)。調(diào)控序列還可以是肽原編碼區(qū)，該區(qū)編碼位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。這樣產(chǎn)生的多肽已知是酶原或多肽原(或者在某些情況中是酶原)形式。多肽原通常沒有活性，可以由多肽原催化性地或自身催化性地切割肽原而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。肽原編碼區(qū)可以得自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子基因、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶基因或嗜熱毀絲霉漆酶基因(WO95/33836)。在多肽的氨基末端有信號肽和肽原區(qū)的情況中，肽原區(qū)與多肽的氨基末端相鄰，而信號肽區(qū)與肽原區(qū)的氨基末端相鄰。本發(fā)明所述核酸構(gòu)建體還可以包含1或多個核酸序列，這些序列編碼1或多個有助于指導多肽表達的因子，例如轉(zhuǎn)錄激活因子(例如，反式作用因子)、伴侶蛋白和加工蛋白酶。任何可用于所選宿主細胞的因子都可以用于本發(fā)明。編碼1或多個這類因子的核酸不必與編碼多肽的核酸序列串聯(lián)在一起。轉(zhuǎn)錄激活因子是一種能激活編碼多肽的核酸序列進行轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)(Kudla等，1990，EMBOJournal91355-1364；Jarai和Buxton，1994，現(xiàn)代遺傳學(CurrentGenetics)262238-2244；Verdier，1990，酵母6271-291)。編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列可以得自編碼以下蛋白質(zhì)的基因嗜熱脂肪芽孢桿菌NprA(nprA)、釀酒酵母血紅素激活蛋白1(hap1)、釀酒酵母半乳糖代謝蛋白4(gal4)、構(gòu)巢曲霉氨調(diào)節(jié)蛋白(areA)和米曲霉α-淀粉酶激活因子(amyR)。另外的例子可參見Verdier，1990，出處同前和MacKenzie等，1993，普通微生物學雜志(JournalofGeneralMicrobiology)1392295-2307。伴侶蛋白是能協(xié)助其他多肽進行正確折疊的蛋白質(zhì)(Hartl等，1994，TIBS1920-25；Bergeron等，1994，TIBS19124-128；Demolder等，1994，生物技術雜志(JournalofBiotechnology)32179-189；Craig，1993，科學2601902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然(Nature)35533-45；Puig和Gilbert，1994，生物學化學雜志2697764-7771；Wang和Tsou，1993，F(xiàn)ASEB雜志71515-11157；Robinson等，1994，生物/技術(Bio/Technology)1381-384；Jacobs等，1993，分子微生物學(MolecularMicrobiology)8957-966)。編碼伴侶蛋白的核酸序列可以得自編碼以下蛋白質(zhì)的基因枯草芽孢桿菌GroE蛋白、枯草芽孢桿菌PrsA、米曲霉蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、釀酒酵母鈣聯(lián)接蛋白、釀酒酵母BiP/GRP78和釀酒酵母Hsp70。另外的例子可參見Gething和Sambrook，1992，出處同前和Hartl等，1994，出處同前。加工蛋白酶是能切割肽原從而產(chǎn)生成熟的有生物化學活性的多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母1067-79；Fuller等，1989，美國科學院學報861434-1438；Julius等，1984，細胞(Cell)371075-1089；Julius等，1983，細胞32839-852；美國專利5702934)。編碼加工蛋白酶的核酸序列可以得自編碼下述蛋白質(zhì)的基因釀酒酵母二肽基氨肽酶、釀酒酵母Kex2、Yarrowialipolytica雙堿性加工內(nèi)蛋白酶(xpr6)和尖鐮孢金屬蛋白酶(p45基因)。添加能根據(jù)宿主細胞的生長情況來調(diào)節(jié)多肽表達的調(diào)控序列可能也是需要的。調(diào)控系統(tǒng)的例子是那些能對化學或物理刺激物(包括在有調(diào)控化合物的情況下)作出反應，從而開放或關閉基因的表達的系統(tǒng)。原核細胞體系中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)控序列。調(diào)控序列的其他例子是那些能使基因發(fā)生擴增的調(diào)控序列。在真核細胞體系中，這類調(diào)控序列包括二氫葉酸還原酶基因(該基因在有氨甲蝶呤的情況下發(fā)生擴增)和金屬硫蛋白基因(重金屬可使其擴增)。在這些情況中，應將編碼多肽的核酸序列與調(diào)控序列可操縱地連接在一起。本發(fā)明還涉及使編碼本發(fā)明所述多肽的內(nèi)源基因的表達情況發(fā)生改變的核酸構(gòu)建體。構(gòu)建體可以含有使內(nèi)源基因表達改變所必需的最少數(shù)量成分。在一個實施方案中，核酸構(gòu)建體優(yōu)選含有(a)靶向序列、(b)調(diào)控序列、(c)外顯子和(d)剪接供體位點。一旦將核酸構(gòu)建體導入了細胞，該構(gòu)建體將通過同源重組插入到細胞基因組中的內(nèi)源基因位點。靶向序列引導元件(a)-(d)整合到內(nèi)源基因中，從而使元件(b)-(d)與內(nèi)源基因可操縱地連接在一起。在另一個實施方案中，核酸構(gòu)建體包含(a)靶向序列、(b)調(diào)控序列、(c)外顯子和(d)剪接供體位點、(e)內(nèi)含子和(f)剪接受體位點，其中的靶向序列引導元件(a)-(f)整合到內(nèi)源基因中，從而使元件(b)-(f)與內(nèi)源基因可操縱地連接在一起。但是，構(gòu)建體可以含有其他成分，如選擇標記。在這兩個實施方案中，這些成分的導入將導致產(chǎn)生一個新的轉(zhuǎn)錄單位，在這個轉(zhuǎn)錄單位中內(nèi)源基因的表達情況會有所改變。本質(zhì)上來說，這個新轉(zhuǎn)錄單位是靶向構(gòu)建體導入的序列與內(nèi)源基因的融合產(chǎn)物。在一個內(nèi)源基因發(fā)生改變的實施方案中，該基因是被激活。在這個實施方案中，利用同源重組插入一個調(diào)控序列，代替、破壞或失活正常情況下與親本細胞的內(nèi)源基因相關的調(diào)控區(qū)，從而導致基因表達水平高于相應的親本細胞?？梢赃M一步利用本領域已知方法(參見，例如美國專利5641670)，使構(gòu)建體含有擴增性選擇標記基因，從而使被激活的基因發(fā)生擴增。在內(nèi)源基因發(fā)生改變的另一個實施方案中，該基因的表達減少。靶向序列可以位于內(nèi)源基因之內(nèi)、緊鄰該基因、在上游基因內(nèi)部或與內(nèi)源基因相距較遠。可以使用1或多個靶向序列。例如，環(huán)狀質(zhì)?；駾NA片段優(yōu)選使用單個靶向序列，而線性質(zhì)粒或DNA片段優(yōu)選使用兩個靶向序列。構(gòu)建體中的調(diào)控序列可以包含1或多個啟動子、增強子、或斯加弗德結(jié)合區(qū)或基質(zhì)結(jié)合位點、負調(diào)控元件、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點或這些序列的組合形式。構(gòu)建體還可含有內(nèi)源基因的1或多個外顯子。外顯子定義為能被拷貝成RNA并存在于成熟mRNA分子中、使外顯子序列合乎內(nèi)源基因的編碼區(qū)讀框的DNA序列。外顯子可以任選地含有編碼1或多個氨基酸和/或部分編碼氨基酸的DNA?？蛇x擇地，外顯子含有對應于5’非編碼區(qū)的DNA。當這個(些)外源外顯子編碼1或多個氨基酸和/或氨基酸的一部分時，應這樣設計核酸構(gòu)建體，以便經(jīng)轉(zhuǎn)錄和剪接后，其讀碼框與內(nèi)源基因的編碼區(qū)一致，這樣來源于第二個外顯子的mRNA部分中合適的讀碼框部分不被改變。構(gòu)建體的剪接供體位點指導一個外顯子與另一個外顯子進行剪接。通常，第一個外顯子位于第二外顯子的5’方向，在第一個外顯子的3’方向與之部分重疊和側(cè)接的剪接供體位點識別側(cè)接在第二外顯子5’方向的剪接受體位點。剪接受體位點與剪接供體位點一樣，都是指導一個外顯子與另一個外顯子進行剪接的序列。剪接結(jié)構(gòu)用剪接受體位點(與剪接供體位點結(jié)合發(fā)揮作用)來去除內(nèi)含子。表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達載體?？梢詫⑸鲜龈鞣N核酸和調(diào)控序列連接在一起來制備重組表達載體，該載體可以包括1或多個方便的限制位點，以便可以在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列?？蛇x擇地，通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入用于表達的合適載體中，可以表達本發(fā)明所述核酸序列。為了進行表達并可能分泌，在制備表達載體時，將編碼序列放在載體中的一定位置以便編碼序列與適當?shù)恼{(diào)控序列可操縱地連接在一起。重組表達載體可以是任何便于進行重組DNA操作并表達核酸序列的載體(例如質(zhì)?；虿《?。選擇載體通常取決于載體與它將要導入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。載體可以是自主復制型載體(即以染色體外個體存在的載體，其復制獨立于染色體的復制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可以含有任何保證自我復制的手段?；蛘?，載體是一個當導入宿主細胞時，將整合到基因組中并與所整合到的染色體一起復制的載體。載體系統(tǒng)可以是單個載體或質(zhì)粒，或者是兩個或多個載體或質(zhì)粒，它們一同含有要導入到宿主細胞基因組中的全部DNA，或者是轉(zhuǎn)座子。優(yōu)選本發(fā)明所述載體含有1或多個使得容易挑選出轉(zhuǎn)化細胞的選擇標記。選擇標記是這樣一個基因，其產(chǎn)物賦予對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性、相對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。細菌選擇標記的例子是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者能賦予抗生素抗性(如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性)的標記。適用于哺乳動物細胞的標記是二氫葉酸還原酶(dfhr)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygB)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶II和腐草霉素抗性基因。適用于酵母宿主細胞的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇標記可選自(包括，但不限于)amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)以及來自其他種的等同物質(zhì)。優(yōu)選用于曲霉細胞的是來自構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)的bar基因。另外，可以通過共轉(zhuǎn)化進行選擇，例如WO91/17243中描述過的，其中選擇標記位于獨立的載體上。優(yōu)選本發(fā)明所述載體包含這樣的元件，它(們)允許載體穩(wěn)定地整合到宿主細胞基因組中，或者保證載體在細胞中獨立于細胞的基因組進行自主復制。就整合到宿主細胞基因組的情況而言，載體可以依賴于編碼多肽的核酸序列或載體的其他元件，以便載體通過同源或非同源重組穩(wěn)定地整合到基因組中。可選擇地，載體可含有用于引導通過同源重組整合到宿主細胞基因組中的附加核酸序列。附加的核酸序列能使載體整合到宿主細胞基因組中染色體上的精確位點。為了增加在精確位點整合的可能性，優(yōu)選整合元件應含有足夠數(shù)量的核酸，如100到1500個堿基對，優(yōu)選400到1500個堿基對，最優(yōu)選800到1500個堿基對，它們與相應的目標序列高度同源，從而增加了同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的目標序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。就進行自主復制的情況而言，載體還可以包含復制起點，使載體能在目標宿主細胞中自主地復制。細菌復制起點的例子是以下質(zhì)粒的復制起點允許在大腸桿菌中復制的pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，以及允許在芽孢桿菌中復制的pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞的復制起點的例子是2μ復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合以及ARS4和CEN6的組合。復制起點可以帶有使其在宿主細胞中成為溫度敏感型的突變(參見例如，Ehrlich，1978，美國科學院學報751433)?？梢韵蛩拗骷毎迦?個以上拷貝的編碼本發(fā)明所述多肽的核酸序列來擴大表達該核酸序列?？梢酝ㄟ^將至少1個附加拷貝的序列插入宿主細胞基因組中或者與該核酸序列一起插入一個可擴增的選擇標記，來使核酸序列穩(wěn)定擴增，后一情況中，可以通過在有合適選擇試劑存在下培養(yǎng)細胞，挑選出含有擴增拷貝的選擇標記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細胞。用于連接前面描述的各元件來構(gòu)建本發(fā)明所述重組表達載體的操作是本領域技術人員熟知的(參見例如，Sambrook等，1989，出處同前)。宿主細胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸序列的重組宿主細胞，這些細胞適合用來重組地制備多肽。術語“宿主細胞”涵蓋任何由于復制期間發(fā)生的突變而與親本細胞不同的后代。將包含本發(fā)明所述核酸序列的載體導入宿主細胞，使載體保持染色體整合的或染色體外自我復制的形態(tài)。通常認為整合有優(yōu)勢，因為這樣核酸序列更可能穩(wěn)定地保持在細胞內(nèi)。載體可以通過如上描述的同源或非同源重組整合到宿主的染色體中。選擇宿主細胞很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是單細胞微生物(例如原核細胞)或非單細胞微生物(例如真核細胞)。有用的單細胞是細菌細胞，如革蘭氏陽性細菌，包括，但不限于芽孢桿菌屬的細胞，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillusclausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌；或者鏈霉菌屬的細胞，例如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或者是革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌或假單胞菌。在一個優(yōu)選實施方案中，細菌宿主細胞是緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。可以通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(MolecularGeneralGenetics)168111-115)、使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young和Spizizin，1961，細菌學雜志(JournalofBacteriology)81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學雜志(JournalofMolecularBiology)56209-221)、電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技術6742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，細菌學雜志1695771-5278)將載體導入細菌宿主細胞。宿主細胞可以是真核細胞如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。有用的哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、Hela細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞或任何其他可以從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到的永生化細胞系。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是一種真菌細胞。文中所用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(Hawksworth等，在AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi，第8版，CABInternational，UniversityPress，Cambridge，UK中定義的)以及卵菌門(Oomycota)(Hawksworth等，1995，出處同前，171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，出處同前)。子囊菌門的代表性組包括例如脈孢菌屬、真青霉屬(＝青霉屬)、赤孢殼屬(Emericella)(＝曲霉屬)、散囊菌屬(＝曲霉屬)和以下所列的真酵母。擔子菌門的例子包括例如蘑菇、銹菌和黑粉菌。壺菌門的代表性組包括例如異水霉屬(Allomyces)、小芽枝霉屬(Blastocladiella)、雕蝕菌屬(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌門的代表性組包括例如水霉科(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉)，如綿霉屬(Achlya)。有絲分裂孢子真菌的例子有曲霉屬、青霉屬、假絲酵母屬和鏈格孢屬。接合菌門的代表性組包括例如根霉屬和毛霉屬。在一個更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是一種酵母細胞。文中使用的“酵母”包括子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目)、擔子孢子酵母和屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母。子囊孢子酵母分為蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)兩個科。后者包括四個亞科裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如裂殖酵母屬)、拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母亞科(Saccharomycoideae)(例如畢赤酵母屬、克魯維酵母屬和酵母屬)。擔子孢子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidim)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Spordiobolus)、Filobasidium和Filobasidiella。屬于半知菌類的酵母分為兩個科擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如Sporobolomyces屬和布勒彈孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假絲酵母屬)。因為酵母的分類在將來可能會改變，就本發(fā)明的目的而言，應按照《酵母的生物學和活性》(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.P.編，Soc.App.Bactoriol，論文集No.9，1980)中的描述來定義酵母。酵母的生物學和遺傳學操作是本領域所熟知的(參見例如，《酵母的生物化學和遺傳學》，Bacil，M.，Horecker，B.J.和Stopani，A.O.M.編，第二版，1987；《酵母》，Rose，A.H.和Harrison，J.S.編，第二版，1987；以及《酵母屬酵母的分子生物學》，Strathern等編，1981)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、畢赤酵母屬或Yarrowia屬內(nèi)的種的細胞。在最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomycesdouglasii、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是Yarrowialipolytica細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是一種絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門亞支的所有絲狀形態(tài)(如Hawksworth等定義的，1995，出處同前)。絲狀真菌的特點在于其菌絲壁由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其他復雜多糖組成。它們通過菌絲的延伸進行營養(yǎng)生長，碳代謝是專性好氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出芽進行的，碳代謝可以是發(fā)酵。在一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是以下種但不限于這些種的細胞枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬及木霉屬。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌宿主細胞是曲霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是鐮孢屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是腐質(zhì)霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是毀絲霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是毛霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是脈孢菌屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是青霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是梭孢殼屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Tolypocladium屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是木霉屬細胞。在一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉細胞、臭曲霉細胞、日本曲霉細胞、黑曲霉細胞或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusariumtorulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusariumvenenatum。在一個甚至更最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Fusariumvenenatum(Nirenbergsp.nov.)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Humicolainsolens或Humicolalanuginosa細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是米赫毛霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是嗜熱毀絲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是粗糙鏈孢菌細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是產(chǎn)紫青霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Thielaviaterrestris細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，木霉細胞是Trichodermaharzianum、康寧木霉、Trichodermalongibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木霉細胞?？梢酝ㄟ^已知方式，利用包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁再生的過程來轉(zhuǎn)化真菌細胞。在EP238023中和Yelton等(1984，美國科學院學報811470-1474)中描述了轉(zhuǎn)化曲霉宿主細胞的合適步驟。Malardier等(1989，基因78147-156)或WO96/00787描述了轉(zhuǎn)化鐮孢的合適方法?？梢允褂肂ecker和Guarente(在Abelson，J.N.和Simon，M.I.編，酵母遺傳和分子生物學指南，《酶學方法》，194卷，182-187頁，AcademicPress，Inc.，NewYork)、Ito等(1983，細菌學雜志153163)和Hinnen等(1978，美國科學院學報751920)描述的步驟轉(zhuǎn)化酵母。對于哺乳動物細胞可以采用Graham和VanderEb的磷酸鈣沉淀法(1978，病毒學52546)通過直接攝取進行轉(zhuǎn)化。制備方法本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)能產(chǎn)生所述多肽的野生型菌株，從而得到包含該多肽的上清液；和(b)純化多肽。優(yōu)選地，該菌株是曲霉屬菌株。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法，該方法包括(a)在有利于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)純化該多肽。本發(fā)明進一步涉及制備本發(fā)明多肽的方法，該方法包括(a)在有利于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)含有一個新轉(zhuǎn)錄單位插入其中的同源重組細胞，該轉(zhuǎn)錄單位包括調(diào)控序列、一個外顯子和/或剪接供體位點與編碼多肽的內(nèi)源核酸序列的第二外顯子可操縱連接；和(b)純化該多肽。這些方法基于使用例如美國專利5641670中描述的基因激活技術?；蚣せ罴夹g基于激活一個正常情況下在細胞中不表達的基因，或者增加細胞內(nèi)低水平表達的基因的表達?；蚣せ罴夹g包括那些將一個含有調(diào)控序列、外顯子和/或剪接供體位點的外源DNA構(gòu)建體插入細胞基因組DNA的方法，而插入方式使得產(chǎn)生一個新的轉(zhuǎn)錄單位，其中的調(diào)控序列、外顯子和/或剪接供體位點與內(nèi)源基因可操縱連接并能激活它進行表達。在本發(fā)明所述制備方法中，用本領域已知方法在適合多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)細胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。在包含碳和氮源以及無機鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領域已知的步驟進行培養(yǎng)(參見，例如細菌和酵母的參考書；Bennett，J.W.和LaSure，L.編，《真菌中的基因操作》，AcademicPress，CA，1991)。合適的培養(yǎng)基有供應商提供或者可以參照公開的成分(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)來制備。如果多肽被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中提純多肽。如果多肽不分泌，可以從細胞裂解物中純化?？梢杂帽绢I域已知的所述多肽的特異方法檢測多肽。這些檢測方法包括使用特異抗體、形成酶產(chǎn)物或酶底物的消失。例如，可以用酶檢測法確定多肽的活性。用于確定氨肽酶活性的步驟是本領域已知的，包括，例如在405nm測量N-某酰基對硝基苯胺的起始水解率?？梢杂帽绢I域已知方法回收所產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過常規(guī)操作(包括，但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收多肽?？梢酝ㄟ^各種本領域已知的操作來純化本發(fā)明所述多肽，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親合層析、疏水層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳操作(例如，制備性等電點聚焦)、分級溶解(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(參見例如，蛋白質(zhì)純化，J.C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers，NewYork，1989)。去除或減少氨肽酶活性本發(fā)明還涉及制備親本細胞的突變細胞的方法，包括破壞或刪除編碼該多肽的核酸序列或者它的調(diào)控序列，從而得到多肽產(chǎn)量比親本減少的突變細胞。可以將有氨肽酶活性的多肽在細胞中進行表達所必需的核酸序列修飾或使它失活來方便地構(gòu)建出氨肽酶活性減少的菌株。要進行修飾或失活的核酸序列可以是，例如編碼所述多肽或多肽具有氨肽酶活性所必需的部分的核酸序列，或者是由核酸序列的編碼序列表達為多肽時所需要的有調(diào)控功能的核酸序列。這種調(diào)控或調(diào)節(jié)序列的例子可以是啟動子序列或它的功能性部分(即足夠影響多肽表達的那部分)。其他可能被修飾的調(diào)控序列包括，但不限于前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號序列和終止子?？梢詫毎M行誘變處理并挑選出其氨肽酶產(chǎn)生能力減少或消失的細胞，從而使核酸序列被修飾或失活?？梢酝ㄟ^例如使用合適的物理或化學誘變劑、使用合適的寡核苷酸、或?qū)NA序列做PCR進行(特異性或隨機)誘變。另外，可以將這些誘變劑組合起來進行誘變。適用于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。使用這類試劑時，通常于合適的條件下，在有突變劑存在的情況下培養(yǎng)細胞使其突變，并挑選出氨肽酶活性呈現(xiàn)減少或不表達的細胞?？梢酝ㄟ^在編碼多肽的核酸序列或者其轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的調(diào)控元件中導入、取代或去除1或多個核苷酸來完成本發(fā)明所述多肽的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸來導入一個終止子、去掉起始密碼子或改變開放讀碼框?？梢砸勒毡绢I域已知的方法通過定點突變或PCR誘變來達到修飾或失活的目的。盡管一般來說，修飾可以在體內(nèi)進行，即直接在待修飾核酸序列的表達細胞上進行，但優(yōu)選象下面的例子一樣在體外進行修飾。使所用宿主細胞表達失活或減少的方便方法的例子是基于基因取代或基因破壞技術。例如，在基因破壞方法中，在體外將對應于目標內(nèi)源基因或基因片段的核酸序列進行誘變，從而產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將該序列轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，以產(chǎn)生缺陷型基因。經(jīng)過同源重組，缺陷型核酸序列將取代內(nèi)源基因或基因片段?？赡芟Ｍ毕莼蚧蚧蚱芜€編碼標記物，以便用該標記物挑選出編碼多肽的基因已經(jīng)被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。可選擇地，利用成熟的反義技術，用與多肽編碼序列互補的核苷酸序列將編碼本發(fā)明所述多肽的核酸序列修飾或失活。更具體地說，可以導入與編碼多肽的核酸序列互補的核苷酸序列，該序列在細胞中可以進行轉(zhuǎn)錄并能與細胞中產(chǎn)生的多肽mRNA雜交，從而減少或消除細胞的多肽產(chǎn)量。在能使得互補的反義核苷酸序列與多肽mRNA雜交的條件下，翻譯出的多肽產(chǎn)量就會減少或消除。優(yōu)選地，按照本發(fā)明所述方法進行修飾的細胞是微生物來源的，例如是適合用來產(chǎn)生(對于細胞是同源或異源的)目標蛋白質(zhì)產(chǎn)物的真菌菌株。本發(fā)明還涉及親本細胞的突變細胞，其中所含編碼多肽的核酸序列或其調(diào)控序列被破壞或缺失，從而導致突變細胞中的多肽產(chǎn)量少于親本細胞。這樣得到的多肽缺陷型突變細胞特別適合作為表達同源和/或異源多肽的宿主細胞。因此，本發(fā)明還涉及同源或異源多肽的制備方法，包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)突變細胞；和(b)回收多肽。在本文中，術語“異源多肽”此處定義為宿主細胞的非天然多肽、其中有修飾而使天然序列改變的天然蛋白質(zhì)，或者因采用重組DNA技術操作宿主細胞而使其表達量有改變的天然蛋白質(zhì)。另一方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵能產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽和目標蛋白質(zhì)產(chǎn)物的細胞來生產(chǎn)基本沒有氨肽酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法。該方法包括在發(fā)酵期間或發(fā)酵完成后，向發(fā)酵液中添加足夠量的能抑制氨肽酶活性的試劑，從發(fā)酵液中回收目標產(chǎn)物，以及任選將回收的產(chǎn)物進一步純化。本發(fā)明另一可選擇的方面涉及生產(chǎn)基本上沒有氨肽酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，其中的目標蛋白質(zhì)產(chǎn)物由細胞中編碼本發(fā)明所述多肽的DNA序列編碼。該方法包括在允許產(chǎn)物表達的條件下培養(yǎng)細胞，將得到的培養(yǎng)液進行pH和溫度的組合處理以便較大地減少氨肽酶活性，以及從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物?？蛇x擇地，針對從培養(yǎng)液中回收的酶制劑進行pH和溫度的組合處理。任選地，可以將pH和溫度的組合處理與用氨肽酶抑制劑進行的處理結(jié)合使用。優(yōu)選在pH9-11、40-70℃的范圍內(nèi)，使pH和溫度的組合處理進行充分的時間以達到預期的效果，通常30-60分鐘即可。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，可以將氨肽酶活性消除至少60％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少85％、還要優(yōu)選的是至少95％，最優(yōu)選至少99％。預計通過使用這些方法可以完全消除氨肽酶活性。用于培養(yǎng)和純化目標產(chǎn)物的方法可以采用本領域已知的方法。本發(fā)明所述用于生產(chǎn)基本沒有氨肽酶活性的產(chǎn)物的方法對于生產(chǎn)真核多肽(尤其是真菌蛋白質(zhì)，比如酶)特別有意義。所述的酶可以選自，例如，淀粉分解酶、脂類分解酶、蛋白水解酶、纖維素水解酶、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶。這些酶的例子包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlycosyltransferase)、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠水解酶、過氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶?？梢杂冒彪拿溉毕莸募毎磉_有藥用價值的異源蛋白質(zhì)，如激素、生長因子、受體等。術語“真核細胞多肽”應理解為不僅包括天然多肽，也包括通過氨基酸取代、缺失或添加或者其他修飾使它們的活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受能力等增強的其它一些多肽(例如酶)。本發(fā)明另一個方面涉及通過本發(fā)明方法制備的基本上沒有氨肽酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的制備方法可以將本發(fā)明所述多肽用來生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物以便提高水解程度和改善風味。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明所述多肽與內(nèi)肽酶結(jié)合使用來由富含蛋白質(zhì)的原材料生產(chǎn)高度水解產(chǎn)物的方法。該方法包括用所述多肽和內(nèi)肽酶處理蛋白類底物。可以用諸酶同時或連續(xù)處理底物。將本發(fā)明所述多肽加入到蛋白類底物中，加入量是蛋白質(zhì)水解過程中常規(guī)采用的有效量，優(yōu)選每100g蛋白質(zhì)在大約0.1到100000氨肽酶單位，更優(yōu)選每100g蛋白質(zhì)在大約1到10000氨肽酶單位。本文將一個氨肽酶單位(APU)定義為在特定條件下，每分鐘從N-亮氨酰對硝基苯胺(Leu-p-nitroanilide，Leu-pNA)(SigmaChemicalCo.，St.LouisMO)中釋放1微摩爾N-某?；鶎ο趸桨?p-nitroanilide)所需的酶量?？蛇x擇地，氨肽酶的用量優(yōu)選在大約0.5到500LAPU/g蛋白質(zhì)，更優(yōu)選在大約5到50LAPU/g蛋白質(zhì)。LAPU定義為按照AF298/1-GB(可以向NovoNordiskA/S，Denmark索取)中所述確定的亮氨酸氨肽酶活性。內(nèi)肽酶可以得自芽孢桿菌屬的菌株(優(yōu)選地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌)，葡萄球菌屬的菌株(優(yōu)選金黃色葡萄球菌)，鏈霉菌屬的菌株[優(yōu)選熱普通鏈霉菌(S.thermovularis)或灰色鏈霉菌]，放線菌菌株，曲霉屬菌株(優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉)，或者鐮孢屬菌株(優(yōu)選Fusariumvenenatum)。將內(nèi)肽酶以在蛋白質(zhì)水解過程中常規(guī)采用的有效量加入蛋白類底物中，加入量優(yōu)選在大約0.05到15AU/100g蛋白質(zhì)，更優(yōu)選在大約0.1到8AU/100g蛋白質(zhì)。一個AU(AnsonUnit)定義為在標準條件下(即，25℃，pH7.5和反應10分鐘)降解血紅蛋白的起始速率使得每分鐘釋放出TCA可溶性產(chǎn)物的量與酚試劑產(chǎn)生如1毫當量酪氨酸相同顏色的酶量。分析方法AF4/5可以向NovoNordiskA/S，Denmark索取，該文此處引作參考文獻。所述酶法處理，即底物與酶制劑的共同保溫，可以在不會使酶制劑失活的任何方便溫度進行，優(yōu)選在大約20℃到70℃。根據(jù)成熟的作法，可以通過將保溫體系的溫度升高到酶的失活溫度(例如升高到大約70℃以上)，或類似地，通過將保溫體系的pH降低到酶失活的pH值(例如，低于約pH4.0)，來使酶制劑適當?shù)厥Щ?。另外，本發(fā)明所述方法使蛋白類底物水解度增加。文中使用的水解度(DH)是蛋白質(zhì)中被蛋白水解酶水解的氨基鍵占全部氨基鍵的百分比。在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的亮氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和/或谷氨酰胺含量增加，例如至少增加了1.1倍。在一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的亮氨酸含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Gly含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Glu含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Ser含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Asp含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Asn含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Pro含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Cys含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Ala含量增加。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的Gln含量增加。本發(fā)明還涉及用于獲得富含游離谷氨酸和/或肽鍵合的谷氨酸殘基的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，該方法包括(a)使底物進行脫酰胺過程；和(b)用具有氨肽酶活性的多肽作用于底物。這兩個步驟可以同時進行，或者在第一步驟后進行第二步驟。本發(fā)明所述方法能產(chǎn)生有極佳風味的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，因為無論是游離還是肽鍵合形式的谷氨酸(Glu)都對蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的風味和口味有重要影響。這些方法還產(chǎn)生功能改善的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，具體說是溶解性提高，乳化性能提高、水解程度增加和發(fā)泡性能改善。通過釋放氨將酰胺類化合物(谷氨酰胺或天冬酰胺)轉(zhuǎn)化為帶電荷的酸(谷氨酸或天冬氨酸)稱為脫酰胺反應。脫酰胺反應可以以非酶法或酶法脫酰胺過程進行。在一個優(yōu)選實施方案中，以酶法脫酰胺過程進行脫酰胺反應，例如使底物接受轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或肽谷氨酰胺酶的作用。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以是任何方便的來源，包括哺乳動物(參見例如JP1050382和JP5023182)，包括活化的因子XIII(參見例如WO93/15234)；來源于魚(參見例如EP555649)；以及得自微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(參見例如EP379606，WO96/06931和WO96/22366)。在一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶得自卵菌綱細胞，包括疫霉屬(Phytophthora)菌株，優(yōu)選惡疫霉，或腐霉屬(Pythium)菌株，優(yōu)選畸雌腐霉、腐霉菌、中間型腐霉、終極腐霉、周雄腐霉(或纏器腐霉)。在另一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是細菌來源的，得自芽孢桿菌屬菌株(優(yōu)選枯草芽孢桿菌)，鏈輪絲菌屬(Streptoverticillium)，優(yōu)選茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobaraensis)，灰肉色鏈輪絲菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)，肉桂色鏈輪絲菌(Streptoverticilliumcinnamoneum)，和鏈霉菌屬菌株，優(yōu)選利迪鏈霉菌。所述肽谷氨酰胺酶可以是肽谷氨酰胺酶I(肽基谷氨酰胺酶；EC3.5.1.43)或肽谷氨酰胺酶II(蛋白-谷氨酰胺谷氨酰胺酶；EC3.5.1.44)或者它們的任何混合物。該肽谷氨酰胺酶可以得自曲霉屬的菌株(優(yōu)選日本曲霉)、芽孢桿菌屬的菌株(優(yōu)選環(huán)狀芽孢桿菌)、隱球酵母菌株(優(yōu)選淺白隱球酵母)或德巴利酵母屬菌株，(優(yōu)選克洛德巴利酵母(Debaryomyceskloecheri))。將脫酰胺過程中常規(guī)采用的有效量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶加入蛋白類底物中，加入量優(yōu)選在大約0.01到5％(w/w)，更優(yōu)選在大約0.1到1％(w/w)(酶制劑相對底物的用量)。將脫酰胺過程中常規(guī)采用的有效量的肽谷氨酰胺酶加入蛋白類底物中，加入量優(yōu)選在大約0.01到100,000PG酶單位/100g底物，更優(yōu)選在大約0.1到10,000PG酶單位/100g底物?？梢愿鶕?jù)Cedrangoro等的步驟(1965，酶學(Enzymologia)29143)來確定肽谷氨酰胺酶活性。按照該步驟，將0.5ml酶樣品用1NNaOH調(diào)節(jié)到pH6.5，倒入一個小容器中。然后向容器中加入1ml硼酸鹽緩沖液(pH10.8)。用5N硫酸吸收釋放出的氨，并用Nessler’s試劑使混合體系呈色，于420nm測量。一個PG酶單位是能在這些條件下每分鐘產(chǎn)生1微摩爾氨的酶量?？蛇x擇地，根據(jù)美國專利3857967或下文實施例20中描述的步驟來確定肽谷氨酰胺酶活性。在本發(fā)明所述方法的(b)步，用本發(fā)明所述多肽作用于底物。按照蛋白質(zhì)水解過程中常規(guī)采用的有效量將本發(fā)明所述多肽加入蛋白類底物中，優(yōu)選用量在大約0.001到0.5AU/100g底物，更優(yōu)選在大約0.01到0.1AU/100g底物。在另一個實施方案中，本發(fā)明所述用于制備富含游離谷氨酸和/或肽鍵合谷氨酸殘基的水解產(chǎn)物的方法還包括(c)使底物接受1或多種非特異性內(nèi)肽酶和/或外肽酶的作用。該步驟可以與步驟(a)和(b)同時進行，或者在(a)和(b)后進行。在一個優(yōu)選實施方案中，所述非特異性內(nèi)肽酶和/或外肽酶得自曲霉屬的菌株(優(yōu)選黑曲霉、米曲霉或醬油曲霉)、或芽孢桿菌屬的菌株(優(yōu)選解淀粉芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌)。按照蛋白質(zhì)水解過程中常規(guī)采用的有效量將非特異性作用的內(nèi)肽酶和/或外肽酶加入底物中，優(yōu)選用量在大約0.05到15CPU/100g底物，更優(yōu)選在大約0.1到5CPU/100g底物。一個CPU(酪蛋白蛋白酶單位)定義為在標準條件下(即，25℃，pH9.5保溫30分鐘)每分鐘從酪蛋白中釋放出1微摩爾伯氨基團(通過與標準絲氨酸比較確定)的酶量。分析方法AF228/1(該文此處引作參考文獻)可以向NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，Denmark索取?？梢栽诿钢苿┎粫Щ畹娜魏螠囟认逻M行各種酶法處理，優(yōu)選在大約20℃到70℃進行。可以通過將溫度升高到例如大約70℃以上或者將pH降低到例如pH4.0以下來使酶制劑失活。用于本發(fā)明所述方法的蛋白類底物可以由完整蛋白質(zhì)、預先水解的蛋白質(zhì)(即肽)或者它們的混合物組成。所述蛋白類底物可以來源于植物或動物。優(yōu)選地，蛋白類底物來源于植物，例如大豆蛋白質(zhì)、谷物蛋白質(zhì)(例如小麥谷蛋白、玉米谷蛋白、大麥、黑麥、燕麥、大米)玉米蛋白、羽扇豆、棉籽蛋白、油菜籽蛋白、花生、紫花苜蓿蛋白、豌豆蛋白、蠶豆蛋白、芝麻種子蛋白或向日葵。來源于動物的蛋白類底物可以是乳清蛋白質(zhì)、酪蛋白、肉蛋白、魚蛋白、血紅細胞、蛋清、明膠或乳白蛋白。本發(fā)明還涉及由這些方法制備的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。其他用途本發(fā)明還涉及用本發(fā)明所述多肽使酶失活的方法。另外，本發(fā)明所述多肽可以用于多種需要特異性裂解肽序列的目的。例如，以非活性的前體形式(在成熟蛋白質(zhì)的N-端包含許多附加氨基酸殘基)合成某些蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明所述多肽可以提供必要的翻譯后加工從而活化這類前體蛋白質(zhì)。組合物本發(fā)明更進一步的方面涉及包含本發(fā)明所述多肽的多肽組合物。優(yōu)選地，這些組合物富含本發(fā)明所述多肽。在本文中，術語“富含”是指多肽組合物的氨肽酶活性提高了(富集系數(shù)為1.1)。這種多肽組合物可以包含本發(fā)明所述多肽，并且是以該多肽為主要的酶組分，例如單組分多肽組合物。可選擇地，組合物可包含多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠水解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。其他的酶可以通過以下屬的微生物來制備曲霉屬(優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉)或木霉屬、腐質(zhì)霉屬(優(yōu)選Humicolainsolens)或鐮孢屬(優(yōu)選桿孢狀鐮孢、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusariumtorulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusariumvenenatum)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種改善風味的組合物，它包含具有氨肽酶活性的多肽和合適的載體。可以使用任何本領域已知的任何合適載體。在另一個優(yōu)選實施方案中，這種改善風味的組合物還包含內(nèi)肽酶。在另一個優(yōu)選實施方案中，這種改善風味的組合物還包含1或多種非特異性作用的內(nèi)肽酶和/或外肽酶。在另一個優(yōu)選實施方案中，這種改善風味的組合物還包含1或多種特異性作用的內(nèi)肽酶和/或外肽酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述特異性作用的蛋白水解酶是一種內(nèi)肽酶，比如谷氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.19)；賴氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.50)；亮氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.57)；甘氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.22.25)；脯氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.26)；胰蛋白酶(EC3.4.21.4)或胰蛋白酶樣(賴氨酸/精氨酸特異性的)內(nèi)肽酶；或肽酰-Asp金屬內(nèi)肽酶(EC3.4.24.33)。優(yōu)選谷氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.19)得自芽孢桿菌屬菌株(尤其是地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)、葡萄球菌屬菌株(尤其是金黃色葡萄球菌)、鏈霉菌屬菌株(尤其是熱普通鏈霉菌和變灰鏈霉菌)或放線菌屬菌株。優(yōu)選賴氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.50)得自無色桿菌屬菌株(尤其是水解無色桿菌)、溶桿菌屬菌株(尤其是產(chǎn)酶溶桿菌)或者假單胞菌屬菌株(尤其是銅綠假單胞菌)。亮氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.57)可以來源于植物。優(yōu)選甘氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.22.25)得自木瓜植物(番木瓜)；優(yōu)選脯氨酰內(nèi)肽酶(EC3.4.21.26)得自黃桿菌屬的菌株，或者來源于植物。優(yōu)選胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶得自鐮孢屬的菌株(尤其是例如WO89/06270或WO94/25583中描述的尖鐮孢)。優(yōu)選肽酰-Asp金屬內(nèi)肽酶(EC3.4.24.33)得自假單胞菌(尤其是莓實假單胞菌)。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述特異作用的蛋白水解酶是可以從肽的任一端開始作用的內(nèi)肽酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述特異作用的蛋白水解酶是一種氨肽酶，比如亮氨酰氨肽酶(EC3.4.11.1)或三肽氨肽酶(EC3.4.11.4)。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述特異作用的蛋白水解酶是一種羧肽酶，比如脯氨酸羧肽酶(EC3.4.16.2)、羧肽酶A(EC3.4.17.1)、羧肽酶B(EC3.4.17.2)、羧肽酶C(EC3.4.16.5)、羧肽酶D(EC3.4.16.6)、賴氨酸(精氨酸)羧肽酶(EC3.4.17.3)、甘氨酸羧肽酶(EC3.4.17.4)、丙氨酸羧肽酶(EC3.4.17.6)、谷氨酸羧肽酶(EC3.4.17.11)、肽酰二肽酶A(EC3.4.15.1)或肽酰二肽酶(EC3.4.15.5)?？梢砸勒毡绢I域已知的方法來制備液態(tài)或干燥形式的所述多肽組合物。通過本領域已知方法可使多肽穩(wěn)定化。本發(fā)明還涉及食品，例如包含由本領域方法得到的蛋白水解產(chǎn)物的烤制食品。這種食品的感官特性提高，比如風味、口味、口感、香味和外皮色澤都有改善。在本文中，術語“烤制食品”包括任何從生面團生產(chǎn)的松軟或酥脆的食物?？梢酝ㄟ^本發(fā)明方便地生產(chǎn)出的烤制食品的例子(無論是白色、淺色或黑色類的)是面包(尤其是白色、全麥或燕麥面包，通常做成塊狀或面包卷的形式)、法國長方形面包、比薩餅面包、玉米面豆卷、蛋糕、薄烤餅、餅干、脆面包等。這些烤制食品通常是用含有面粉和水的生面團生產(chǎn)的，并且通常要經(jīng)過發(fā)酵。可以用多種方式發(fā)酵生面團，比如通過加入碳酸氫鈉等，或者通過加入酵面(發(fā)酵過的生面團)，但是優(yōu)選通過加入合適的酵母培養(yǎng)物，比如釀酒酵母(面包酵母)來發(fā)酵?？梢赃x用任何可以購買到的釀酒酵母菌株。另外，用于生產(chǎn)烤制食品的生面團可以是新鮮或冷凍的。K.Kulp和K.Lorenz在《冷凍和冷藏的生面和奶油面糊》中描述了冷凍生面團的生產(chǎn)方法。在生面團中通常包含0.01-5％，更優(yōu)選0.1-3％的本發(fā)明所述改善風味的組合物。在本發(fā)明所述方法中，可以單獨或同時將本發(fā)明所述多肽、內(nèi)肽酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、肽谷氨酰胺酶、1或多種特異和/或非特異作用的內(nèi)肽酶和/或外肽酶、和/或1或多種以上具體指出的酶類加入制備生面團的混合物中或加入用來制備生面團的任何成分(例如面粉)中。本發(fā)明還涉及一種制備生面團或由生面團生產(chǎn)烤制食品的預混合物，例如，采取面粉組合物的形式，其中所述的預混合物包含本發(fā)明所述多肽或改善風味組合物以及載體或烤制成分，并且任選含有1或多種上述具體指出的其他酶類。在另一個實施方案中，這種預混合物包含由本發(fā)明所述方法獲得的水解產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^將相關酶類與合適的載體(比如面粉、淀粉、糖或鹽)混合來制備預混合物。這種預混合物可以含有其他面團改善和/或面包改善添加劑。本文中，術語“預混合物”是烘烤物(通常包括面粉)的混合物，它是預先制備好的，可以在指定條件下儲存，并可以給生面團的制備過程帶來便利。這種預混合物可以方便地用于工業(yè)和商業(yè)中烘烤面包的工廠和作坊，以及零售面包店。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明所述方法制備的水解產(chǎn)物作為食品(比如烤制食品)添加劑來提高感官品質(zhì)，比如風味、口味和香味?？梢詫⑼ㄟ^本發(fā)明所述方法得到的富含游離谷氨酸和/或肽鍵合谷氨酸殘基的水解產(chǎn)物用于多種工業(yè)應用，尤其是需要含有功能性蛋白質(zhì)的應用。例如，本發(fā)明還涉及食品，這些食品包含由本發(fā)明所述方法得到的富含游離谷氨酸和/或肽鍵合谷氨酸殘基的水解產(chǎn)物，還涉及包含由本發(fā)明所述方法得到的富含游離谷氨酸和/或肽鍵合谷氨酸殘基的水解產(chǎn)物的動物飼料添加劑。通過以下實施例進一步描述本發(fā)明，但不應將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例實施例1純化FLAVOURZYMETM氨肽酶II從FLAVOURZYMETM培養(yǎng)液(NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，Denmark)中純化氨肽酶。FLAVOURZYMETM培養(yǎng)液是通過在含有碳和氮源以及微量金屬的培養(yǎng)基中培養(yǎng)米曲霉菌株1568(ATCC20386)得到的。首先，用180ml20mM磷酸鈉(pH7.0)緩沖液稀釋培養(yǎng)液(20ml，含有720mg蛋白質(zhì))并用配備0.45μm濾膜(Nalgene，Rochester，NY)的NalgeneFilterware裝置將其過濾。將濾過液上樣到含有31mlQ-Sepharose，BigBeads(PharmaciaBiotechAB，Uppsala，Sweden)的24×130mm柱子中，這個柱子已用20mM磷酸鈉(pH7.0)緩沖液預平衡過。利用從7.0(20mM磷酸鈉緩沖液)到5.0(20mM醋酸鈉緩沖液)、從5.0到3.5(20mM醋酸鈉緩沖液)然后從3.5到3.0(20mM醋酸鈉緩沖液)的pH梯度洗脫蛋白質(zhì)。收集pH3.5到3.0之間洗脫的組分，將其匯合，并用PM10濾膜(Amicon，NewBedford，MA)經(jīng)超濾濃縮到20ml。濃縮好的溶液用100ml20mM磷酸鈉(pH7.0)緩沖液稀釋，然后上樣到含有PharmaciaMonoQBeads(PharmaciaBiotechAB，Uppsala，Sweden)的20×100mm柱子中，這個柱子已用20mM磷酸鈉(pH7.0)緩沖液預平衡過。用20mM磷酸鈉(pH7.0)緩沖液中的0到0.4MNaCl梯度洗脫蛋白質(zhì)。收集0.330到0.343MNaCl之間的組分，將其匯合，并用對20mM醋酸鈉緩沖液(pH4.0)的超濾進行濃縮。經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)純化過的制品含有三個主要條帶。樣品由分子量為大約65、50和33kDa的幾種組分構(gòu)成。實施例2氨肽酶II的氨基酸測序?qū)?份實施例1中描述的純氨肽酶II制劑電泳，隨后用在10％甲醇中的10mMCAPS(3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸)pH11將其轉(zhuǎn)印到PVDF膜(Novex，SanDiego，CA)上2小時。用含0.1％考馬斯藍R-250的40％甲醇/1％醋酸將PVDF膜染色20秒，然后在50％乙醇中脫色來觀察蛋白質(zhì)條帶。切下65、50和33kDa的三個組分，并依照制造商的說明用印跡箱和液相TFA送遞法在AppliedBiosystems476A型蛋白質(zhì)測序儀(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)osterCity，CA)上做氨基端測序。三個組分都得到相同的氨基端序列RALVSPDEFPEDIQLEDLLEGSQQLEDFAY(SEQIDNO2).將300μl蛋白質(zhì)樣品在SavantSpeedVacAS160(SavantInstruments，F(xiàn)armingdale，NY)中干燥，然后用300μl70％蟻酸(水性)重新溶解。加入幾粒溴化氰晶體，并置暗處于室溫保溫過夜。將樣品再次在SpeedVac中干燥，并在Tricine樣品緩沖液(Novex，SanDiego，CA)中重新溶解。用10-20％TricineSDS-PAGE將溴化氰裂解的片段分離成6、10、15、22、27、40和50kDa的條帶，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。切下6、10、15和22kDa的條帶，進行氨基端測序。15和22kDa條帶的氨基端序列與上述氨基端序列相同，而6和10kDa條帶確定出含有序列TYSPSVEVTADVAVVKNLGTSEADYPDVEGKVAL(SEQIDNO2).實施例3分離米曲霉菌株1568的RNA在裝有每升含7.5g馬鈴薯淀粉、10g大豆粉、2gKH2PO4、5gNa2HPO4-2H2O和0.1gZnSO4-7H2O的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)米曲霉菌株1568。于30℃生長5天后取出2升樣品，收集菌絲，在液N2中冷凍，保存在-80℃。用硫氰酸胍進行抽提，隨后經(jīng)5.7M氯化銫超速離心，從冷凍的粉碎菌絲中制備總RNA(Chirgwin等，1979，生物化學185294-5299)。依照Aviv和Leder(1972，美國科學院學報691408-1412)描述的寡(dT)-纖維素親合層析分離Poly(A)+RNA。實施例4構(gòu)建cDNA文庫采用Gubler和Hoffman(1983，基因25263-269)以及Sambrook等(1989，分子克隆實驗指南，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork)描述的步驟，由5μg實施例3中得到的米曲霉菌株1568Poly(A)+RNA來合成雙鏈cDNA，但在第一鏈反應中使用了寡聚(dT)-NotI錨定引物，而不是寡聚(dT)12-18引物。合成結(jié)束后，用綠豆核酸酶(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)處理cDNA，用T4DNA聚合酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)形成平末端，并使其與非回文結(jié)構(gòu)的BstXI銜接子(Invitrogen，SanDiego，CA)連接(用大約50倍摩爾過量的銜接子)。用NotI消化連接好的cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)體積篩分出1.2-3.0kbcDNA片段，并連接到用BstXI/NotI裂解過的pYES2.0(Invitrogen，SanDiego，CA)中。依照制造商的說明將連接體系轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)的大腸桿菌DH10B細胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中。將由1×106個獨立克隆組成的文庫于20％甘油中以單個池(25000-30000個集落形成單位/池)的形式保存在-80℃，雙鏈cDNA和連接體系保存在-20℃。實施例5提取基因組DNA米曲霉1568在25ml0.5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培養(yǎng)基中于37℃、250rpm生長24小時。經(jīng)Miracloth(Calbiochem，LaJolla，CA)過濾收集菌絲，并用25ml10mMTris-1mMEDTA(TE)緩沖液洗一次。吸掉菌絲制劑上的多余緩沖液，隨后將其冷凍在液氮中。將冷凍的菌絲制品在電動咖啡磨中磨成細粉末，將粉末加入含有20mlTE緩沖液和5ml20％w/v十二烷基磺酸鈉(SDS)的一次性塑料離心管中，將混合液輕輕顛倒幾次以確?；旌暇鶆?，用等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)抽提兩次。向抽提過的樣品中加入醋酸鈉(3M溶液)至終濃度為0.3M，隨后用2.5體積的冰乙醇沉淀DNA。將離心管于15000×g離心30分鐘來沉淀DNA。將DNA沉淀風干30分鐘后重新懸浮于0.5mlTE緩沖液中。將不含DNase的核酸酶A加入重懸的DNA沉淀中至濃度為100μg/ml，然后將混合液于37℃保溫30分鐘。加入蛋白酶K(200μg/ml)，離心管于37℃再保溫1小時。最后，用酚∶氯仿∶異戊醇抽提兩次，用乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA用70％乙醇洗滌，真空下干燥，重新懸浮在TE緩沖液中，保存在4℃。實施例6PCR擴增米曲霉1568氨肽酶II根據(jù)實施例2中描述的米曲霉1568氨肽酶II部分肽的氨基酸序列，依照制造商的說明用AppliedBiosystems394型DNA/RNA合成儀合成以下簡并寡核苷酸引物，以便從米曲霉1568基因組DNA經(jīng)PCR來擴增氨肽酶II基因。正向引物5’-CCIGAYGARTTYCCIGARGA-3’(SEQIDNO3)反向引物5’-RTTYTTIACIACIGCIACRTCIGCIGTIACYTCIAC-3’(SEQIDNO4)(R＝A或G，Y＝C或T，N＝G或A或C或T，H＝A或C或T，I＝次黃苷)將按照實施例5所述制備的大約1μg米曲霉1568基因組DNA作為模板準備擴增反應體系(50μl)。每份反應體系含有如下成分1μg基因組DNA、40pmol正向引物、40pmol反向引物、dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM、1×Taq聚合酶緩沖液(Perkin-ElmerCorp.，Branchburg，NJ.)和2.5單位Taq聚合酶(Perkin-ElmerCorp.，Branchburg，NJ.)。將反應體系在Perkin-Elmer480型熱循環(huán)儀中保溫，如下進行反應第1個循環(huán)94℃5分鐘，50℃2分鐘，72℃2分鐘；第2到26個循環(huán)94℃2分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘。在1.5％瓊脂糖凝膠(EastmanKodak，Rochester，NY)上分離出反應產(chǎn)物，從膠上切下309bp產(chǎn)物條帶，并依照制造商的說明用QiaexII(Qiagen，Chatsworth，CA)將其純化。隨后將純化好的PCR產(chǎn)物克隆到pCRII載體(Invitrogen，SanDiego，CA)中，用lac正向和反向引物(NewEnglandBioLabs，Beverly，MA)確定DNA序列。用上述氨肽酶II特異性PCR引物由米曲霉1568擴增含有103個密碼子的氨肽酶II基因片段(309bp)。DNA序列分析表明擴增得到的基因片段編碼相應米曲霉1568氨肽酶II基因的一部分。用氨肽酶II基因片段探測實施例5中描述的米曲霉1568cDNA文庫。實施例7鑒定米曲霉1568氨肽酶II克隆將米曲霉1568cDNA文庫鋪在加有50μg/ml羧芐青霉素的Luria瓊脂平板上。將大約10000個菌落做菌落轉(zhuǎn)移(Maniatis等，1982，分子克隆實驗指南，ColdSpringHarborProcess，ColdSpringHarbor，NewYork)，并用UVStratalinker(Stratagene，LaJolla，CA)將DNA交聯(lián)到膜(HybondN+，Amersham，AflingtonHeights，IL)上。將膜于45℃，在含有5×SSPE、0.3％SDS、50％甲酰胺和10μg/ml剪切變性鮭精DNA的雜交溶液中浸泡3小時。用隨機引發(fā)DNA標記試劑盒(BoehringerMannheim，Mannheim，Germany)將實施例6中描述的從米曲霉1568分離到的氨肽酶II基因片段放射標記，通過加入NaOH至終濃度0.1M使其變性，然后加入到雜交溶液中(放射活性大約1×106cpm/ml雜交液)。雜交體系于45℃水浴震蕩過夜。溫育后，于55℃將膜在有0.2％SDS的2×SSC中洗3次。然后將膜在印跡濾紙上干燥15分鐘，包在SaranWrapTM中，于-70℃用增強屏(Kodak，Rochester，NY)對X-光膠片曝光48小時。有11個菌落與探針產(chǎn)生強雜交信號。將這11個菌落接種到5ml加有50μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并于37℃生長過夜。用Wizard373DNA純化試劑盒(Promega，Madison，WI)由每個菌落制備小量DNA。通過DNA測序證明克隆9和10含有氨肽酶II編碼序列。其中克隆9(pEJG18)是全長序列。將質(zhì)粒pEJG18亞克隆到大腸桿菌DH5α細胞中得到大腸桿菌DH5αEJG18。實施例8米曲霉氨肽酶II基因的DNA序列分析利用AppliedBiosystems373A型自動DNA測序儀(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)osterCity，CA)，采用引物步行技術通過染料終止化學法(Giesecke等，1992，病毒學方法雜志(JournalofVirologyMethods)3847-60)在雙鏈上測定實施例7所述大腸桿菌DH5αEJG18中的pEJG18所含氨肽酶II基因的DNA序列。將寡核苷酸引物設計成氨肽酶II基因的互補序列，并依照制造商的說明在AppliedBiosystems394型DNA/RNA合成儀上合成。圖1顯示了米曲霉1568氨肽酶II編碼基因的核苷酸序列和由其推測出的氨基酸序列(分別是SEQIDNO1和2)。對克隆插入片段進行的序列分析揭示出一個有1488個核苷酸(不包括終止密碼)的大開放讀碼框，它編碼一個496個氨基酸序列的蛋白質(zhì)(SEQIDNO2)。該開放讀碼框的G+C含量是58％。根據(jù)vanHeijne(vanHeijne，1984，分子生物學雜志173243-251)的規(guī)則，起首的15個氨基酸可能包含引導新合成多肽進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌信號肽(圖1中加雙下劃線部分)。實施例2中描述的來源于純化氨肽酶II的部分肽，其氨基酸序列在圖1中加了下劃線，它們與米曲霉1568氨肽酶IIcDNA的推測氨基酸序列(SEQIDNO2)中發(fā)現(xiàn)的一致。用Clustal比對程序(Higgins，1989，出處同前)比較米曲霉1568氨肽酶II的推測氨基酸序列和釀酒酵母氨肽酶IIY的氨基酸序列(SEQIDNO5)，觀察到相同百分比為33.7％。實施例9構(gòu)建用于曲霉宿主的米曲霉1568氨肽酶II表達載體設計了如下兩個合成寡核苷酸引物來由質(zhì)粒pEJG18(大腸桿菌DH5α-EJG18)經(jīng)PCR擴增米曲霉1568氨肽酶II基因編碼序列，以便用于在曲霉宿主中進行亞克隆和表達。正向引物5’-ATGATGAGGTCGCTTTTGTGGGC-3’(SEQIDNO6)反向引物5’-GGGATGCATCTATGCCTCGACTT-3’(SEQIDNO7)粗體字代表編碼序列。為了方便將基因片段亞克隆到定名為pMWR3(圖2)的表達載體中，在氨肽酶II基因的3’端導入NsiI限制酶位點。給5’端加上ATG使其成平末端以便插入SwaI位點。載體pMWR3含有作為調(diào)控序列的TAKA啟動子和終止子。由于質(zhì)粒不含用于真菌轉(zhuǎn)化的選擇標記，用含有可作為選擇標記的amdS的pToC90(WO91/17243)與其共轉(zhuǎn)化。在PCR反應體系(50μl)中使用了各50pmol的上述引物，該反應體系含有70ngpEJG18(pYES2中的米曲霉1568cDNA克隆)；1×Pwo緩沖液(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)；8μl10mM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP混合液；2.5單位PwoI(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)。擴增是在94℃2分鐘、55℃30秒、72℃1分鐘的情況下做1個循環(huán)；94℃15秒、55℃30秒、72℃1分鐘的情況下做9個循環(huán)；94℃15秒、55℃30秒、72℃1分鐘，每個循環(huán)中延長20秒，這種情況下做15個循環(huán)；最后一個循環(huán)94℃15秒、55℃30秒、72℃7分鐘。然后將加熱塊轉(zhuǎn)入4℃浸泡循環(huán)。經(jīng)凝膠電泳和QiaexII純化擴增好的1500bpDNA片段。用NsiI消化氨肽酶克隆(使用制造商確定的條件)。將片段進行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀。將切下的片段克隆到預先用SwaI和NsiI切割好的pMWR3中，得到表達質(zhì)粒pEJG19(圖3)，在該載體中氨肽酶II基因的轉(zhuǎn)錄受到TAKA啟動子的調(diào)控。將質(zhì)粒pEJG19轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中。分離到一株含有pEJG19質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，根據(jù)Sambrook等描述的步驟(1989，出處同前)制備質(zhì)粒DNA。實施例10在米曲霉中表達米曲霉1568氨肽酶II基因用以下原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pEJG19導入堿性蛋白酶缺陷的米曲霉宿主JaL142-6中。進行轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體濃度為約2×107個原生質(zhì)體/ml。將100μl原生質(zhì)體和約5μgpEJG19、5μgpTOC90置于冰上；加入250μl60％PEG4000、10mMTris-HCl(pH7.5)、10mMCaCl2，然后將原生質(zhì)體于37℃保溫30分鐘。加入3mlSTC(1.2M山梨醇、10mMTris-HCl(pH7.5)和10mMCaCl2)。將溶液輕輕混勻，倒在COVE轉(zhuǎn)化平板(每升0.52gKCl、0.52gMgSO4-7H2O、1.52gKH2PO4、1ml下述微量金屬、342.3g蔗糖、25gNoble瓊脂、10ml1M乙酰胺、10ml3MCsCl)上。每升該微量金屬溶液(1000×)含有22gZnSO4-7H2O、11gH3BO3、5gMnCl2-4H2O、5gFeSO4-7H2O、1.6gCoCl2-5H2O、1.6g(NH4)6Mo7O24和50gNa4EDTA。將平板于37℃保溫7天。將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到含相同培養(yǎng)基的平板上，于37℃保溫2天。根據(jù)轉(zhuǎn)化子在以乙酰胺為唯一氮源的COVE培養(yǎng)基上的生長能力總共得到140個轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在每孔含有1ml用75％MY50鹽稀釋的25％MY50培養(yǎng)基之24孔平板中，于34℃、200rpm生長4天。每升MY50中含有50g麥芽糊精、2.0gMgSO4-7H2O、10gKH2PO4、2g檸檬酸、10g酵母提取物、2.0g尿素、2gK2SO4和0.5ml微量元素溶液(pH調(diào)至6.0)。每升該微量元素溶液含有14.3gZnSO4-7H2O、2.5gCuSO4-5H2O、0.5gNiCl2-6H2O、13.8gFeSO4-7H2O、8.5gMnSO4-H2O、3g檸檬酸。每升MY50鹽含有2.0gMgSO4-7H2O、10gKH2PO4、2g檸檬酸和2gK2SO4(pH6.0)。用Leu-pNA(鹽酸鹽)作為底物分析140個孔的氨肽酶II活性。在96孔的微量平板中，將4μl上清液加入100μl溶在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的1mg/mlLeu-pNA中。監(jiān)測405nm的吸光度。氨肽酶II活性最高的4個轉(zhuǎn)化子(20、88、90和137)在含有25mlMY50培養(yǎng)基的125ml搖瓶中于34℃生長4天。在第2、3和4天通過將100μl10倍稀釋的上清液與100μl溶在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的2mg/mlLeu-pNA混合來分析樣品的氨肽酶II活性。轉(zhuǎn)化子20、90和137產(chǎn)量最高。為了純化氨肽酶II，將轉(zhuǎn)化子20和/或90在如上的搖瓶或含有合適碳、氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實施例11純化曲霉產(chǎn)生的重組米曲霉1568氨肽酶II將由實施例10所述搖瓶培養(yǎng)液得到的上清液合并(100ml中約有100mg蛋白質(zhì))，并稀釋到3.7mS，調(diào)pH至7.0。然后將稀釋過的樣品上樣到用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)預平衡過的Q-Sepharose，BigBeads中。用于20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中的0-0.4MNaCl梯度洗脫氨肽酶II，隨后用0.4MNaCl洗滌。通過將100μl各組分與100μl每ml含2mgLeu-pNA的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)混合來檢測氨肽酶II活性。檢測結(jié)果表明氨肽酶II在梯度最后和0.4MNaCl洗滌過程中被洗脫。SDS-PAGE分析顯示這種酶是均一的。實施例12構(gòu)建用于鐮孢的米曲霉1568氨肽酶II表達載體設計了如下兩個合成寡核苷酸引物來由質(zhì)粒pEJG18(大腸桿菌DH5α-EJG18)經(jīng)PCR擴增米曲霉1568氨肽酶II基因編碼序列，以便用于在鐮孢宿主中進行亞克隆和表達。正向引物5’-ATTTAAATcaccATGAGGTCGCTTTTGTGGGC-3’(SEQIDNO8)反向引物5’-GGGTTAATTAACTATGCCTCGACTTGAGAATG-3’(SEQIDNO9)粗體字代表編碼序列。小寫字母代表用于增強表達的Kozak共有序列。(Kozak，1981，核酸研究(NucleicAcidResearch)12857-872)。為了方便將基因片段亞克隆到定名為pDM181(圖4)的表達載體中，在氨肽酶II基因的5’和3’端分別導入SwaI和PacI限制酶位點。載體pDM181含有作為調(diào)控序列的尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(SP387)啟動子和終止子(WO96/00787)。質(zhì)粒還含有bar基因作為真菌轉(zhuǎn)化的選擇標記(deBlock等，1987，EMBO雜志62513-2518)。在PCR反應體系(50μl)中使用了各50pmol的上述引物，該反應體系含有70ngpEJG18；1×Pwo緩沖液；5μl10mM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP混合液；2.5單位PwoI。擴增是94℃2分鐘、55℃30秒、72℃1分鐘情況下做1個循環(huán)；94℃15秒、55℃30秒、72℃1分鐘情況下做9個循環(huán)；94℃15秒、55℃30秒、72℃1分鐘，每個循環(huán)中延長20秒，這種情況下做15個循環(huán)；最后一個循環(huán)94℃15秒、55℃30秒、72℃7分鐘。然后將加熱轉(zhuǎn)入4℃浸泡循環(huán)。經(jīng)凝膠電泳和QiaexII純化擴增好的1500bpDNA片段，然后亞克隆至pCRIITOPOTA克隆載體(Stratagene，SanDiego，CA)中。用SwaI和PacI消化pCRII氨肽酶克隆(使用制造商規(guī)定的條件)。通過凝膠電泳和QiaexII純化片段。將切下的片段克隆到預先用SwaI和PacI切割過的pDM181中，得到表達質(zhì)粒pEJG28(圖5)，在該載體中氨肽酶II基因的轉(zhuǎn)錄受到尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶啟動子的調(diào)控。將質(zhì)粒pEJG28轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ABLEK細胞(Stratagene，SanDiego，CA)中。分離到一株含有pEJG28質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，根據(jù)Sambrook等描述的步驟(1989，出處同前)制備質(zhì)粒DNA。實施例13鐮孢CC1-3的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子分析鐮孢CC1-3是鐮孢菌株A3/5(ATCC20334)之高度分枝的形態(tài)突變株(Wiebe等，1992，真菌學研究(MycologicalResearch)9655-562；Wiebe等，1991，真菌學研究951284-1288；Wiebe等，1991，真菌學研究96555-562)。將其在含有Vogel’s鹽(Vogel，1964，Am.Nature98435-446)、25mMNaNO3和1.5％葡萄糖的液體培養(yǎng)基中，于28℃、150rpm生長4天。經(jīng)4層干酪皮，最后通過一層Miracloth過濾純化分生孢子。經(jīng)離心使分生孢子懸液濃縮。50mlYPG培養(yǎng)基(含有1％酵母提取物、2％細菌蛋白胨和2％葡萄糖)接種大約108個分生孢子，于24℃、150rpm培養(yǎng)14小時。用無菌0.4mm濾器截取得到的菌絲，相繼用無菌蒸餾水和1.0MMgSO4洗滌。將菌絲重懸于10mlNOVOZYM234TM溶液(在1.0MMgSO4中2-10mg/ml)，于34℃、80rpm攪動消化15-30分鐘。NOVOZYM234TM得自NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，Denmark。相繼經(jīng)4層干酪皮和一層Miracloth過濾從得到的原生質(zhì)體懸液中除去未消化的菌絲物質(zhì)。將20ml1M山梨醇與原生質(zhì)體溶液合并?；靹蚝?，經(jīng)離心沉淀原生質(zhì)體并相繼經(jīng)過在20ml1M山梨醇、20mlSTC(0.8M山梨醇、0.05MTris(pH8.0)、0.05MCaCl2)中重懸和離心來洗滌原生質(zhì)體。洗過的原生質(zhì)體以5×107個/ml的濃度重懸于4份STC和1份SPTC(0.8M山梨醇、40％PEG4000、0.05MTris(pH8.0)、0.05MCaCl2)中。將100ml原生質(zhì)體懸液加入含有10μgpEJG28的聚丙烯管(17×100mm)中，混勻并在冰上放置30分鐘。將1mlSPTC輕輕地混入原生質(zhì)體懸液中，繼續(xù)于室溫保溫20分鐘。將12.5ml含有1×Vogel’s鹽、25mMNaNO3、0.8M蔗糖和1％低熔點瓊脂糖(SigmaChemicalCompany，St.Louis，MO)的熔化好的溶液(冷卻到40℃)與原生質(zhì)體混勻，然后鋪到100mm的空培養(yǎng)皿上。繼續(xù)于室溫保溫10到14天。在室溫保溫24小時后，取12.5ml加有10mgBASTATM(HoechstSchering，Rodovre，Denmark)的相同培養(yǎng)基覆蓋在培養(yǎng)皿上。用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)將BASTATM抽提兩次，在使用前再用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次。兩周后，可以看到兩個明顯的轉(zhuǎn)化子(定名為#1和#2)。將每個轉(zhuǎn)化子邊緣的菌絲片段轉(zhuǎn)移到含有Vogel’s/BASTATM培養(yǎng)基之24孔板的孔中。該培養(yǎng)基每升含有25g蔗糖、25gNobel瓊脂、20ml50×Vogel’s鹽(Vogel，1964，出處同前)、25mMNaNO3和10gBASTATM。將平板密封在一個塑料袋中以保持潮濕，于室溫培養(yǎng)大約一周。實施例14在鐮孢中表達米曲霉1568氨肽酶II基因?qū)膶嵤├?3所述2個鐮孢CC1-3轉(zhuǎn)化子得到的菌絲片段接種在20mlM400Da培養(yǎng)基中，并于30℃、150rpm保溫7天。每升M400Da培養(yǎng)基含有50g麥芽糊精、2.0gMgSO4-7H2O、2.0gKH2PO4、4.0g檸檬酸、8.0g酵母提取物、2.0g尿素和0.5ml微量金屬溶液。用5NNaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0。每升該微量金屬溶液含有14.3gZnSO4-7H2O、2.5gCuSO4-5H2O、0.5gNiCl2-6H2O、13.8gFeSO4-7H2O、8.5gMnSO4-H2O和3.0g檸檬酸。未轉(zhuǎn)化的宿主作為對照。在第7天收集1ml培養(yǎng)物上清液并進行保存和分析。通過將10μl上清液與200μl每ml含有2mgN-亮氨酰對硝基苯胺的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)之底物儲液混勻，并在4分鐘內(nèi)監(jiān)測405nm吸光度的變化。兩個轉(zhuǎn)化子都顯示出對Leu-pNA的活性要高于未轉(zhuǎn)化的對照。將實施例13所述原代鐮孢轉(zhuǎn)化子#2在125ml搖瓶(含有25mlM400Da培養(yǎng)基)中，于30℃培養(yǎng)5天。用雙層Miracloth將全部培養(yǎng)液過濾?；厥諡V過液，于-20℃冷凍。實施例15純化鐮孢產(chǎn)生的重組米曲霉1568氨肽酶II將20ml實施例14所述鐮孢的5天培養(yǎng)液經(jīng)0.45μm濾器過濾。然后將樣品在20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中稀釋8倍。樣品的導電率和pH分別為3.2mS和7.10。將樣品上樣到用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)預平衡過的含有60mlQ-Sepharose，BigBeads的XK-26(PharmaciaBiotechAB，Uppsala，Sweden)柱子中。將柱子洗至達到基線，然后用于20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中的0-0.5MNaCl線性梯度經(jīng)8.3柱體積洗脫氨肽酶II，流速為5ml/min。用Leu-pNA作為底物，通過將10μl各組分與90μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)和100μl于每ml50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中含2mgLeu-pNA的底物儲液混合，并監(jiān)測4分鐘內(nèi)405nm處吸收值的變化，從而檢測組分。將所有對Leu-pNA有活性的組分匯合，稀釋并利用帶有PM10膜的Amicon超濾裝置將其濃縮。將濃縮過的樣品上樣到用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)預平衡過的MonoQ16/10柱子(PharmaciaBiotechAB，Uppsala，Sweden)中。用0.15MNaCl洗柱子。然后在10個柱體積內(nèi)進行0.15-0.5MNaCl梯度洗脫，流速為2ml/min。用含有1.7M(NH4)2SO4的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡活性組分。將樣品上樣到用含有1.7M(NH4)2SO4的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)預平衡過的PhenylSuperose5/5柱子(PharmaciaBiotechAB，Uppsala，Sweden)中。用含有1.7M(NH4)2SO4的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗柱子至達到基線。然后在30個柱體積內(nèi)進行1.7-OM(NH4)2SO4梯度洗脫酶，流速為0.5ml/min。流出液與洗脫下的組分一樣對Leu-pNA有活性。根據(jù)SDS-PAGE分析，酶似乎有一系列不同的糖苷化形式。根據(jù)制造商的建議用內(nèi)糖苷酶F/N糖苷酶F(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)處理各種形式的酶時，所有分析樣品都顯示出分子量～58kDa的單一條帶。將不同糖苷化形式的酶匯合，用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)脫鹽并進行生化鑒定。實施例16重組米曲霉1568氨肽酶II的鑒定以下鑒定中使用實施例11中描述的純化氨肽酶II。確定氨肽酶II對幾種N-某酰對硝基苯胺(pNA)(包括Leu-pNA、Gly-pNA、Ala-pNA和Pro-pNA(SigmaChemicalCo.St.Louis，MO或Bachem，Torrance，CA))的動力學參數(shù)。用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)將每ml二甲基亞砜含有100mg各種pNA的儲液稀釋至0.0064到9.56mM。應注意，底物的溶解性不是總能足以使得濃度與Km相稱，這可能會造成比正常預期更高的誤差。將100μl溶在50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中的酶溶液加入于微量板上孔中的100μl底物溶液時，氨肽酶II即開始與pNA反應，用THERMOmaxMicroplateReader(MolecularDevicesCorp.，Sunnyvale，CA)于25℃、405nm監(jiān)測。pNA水解的起始速率實驗得到表1所示結(jié)果表1氨肽酶在pH7.0、25℃的動力學參數(shù)底物Km(mM)Vmax(相對單位)Leu-pNA76400Gly-pNA0.31670Ala-pNA111200Pro-pNA2120這些結(jié)果表明氨肽酶II具有底物特異性，其中對丙氨酸的特異性比對甘氨酸的差得多。用在50mMTris緩沖液(pH7.5)中的Leu-pNA做底物，在405nm監(jiān)測水解反應來評價1，10-二氮雜菲對氨肽酶II的抑制。制備在甲醇中的200mM1，10-二氮雜菲溶液。通過將100μl每ml含有2mgLeu-pNA的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、10μl1，10-二氮雜菲溶液和100μl在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中稀釋5倍的氨肽酶II混合來進行抑制反應。對照中用10μl20mMTris緩沖液(pH7.6)代替1，10-二氮雜菲溶液。結(jié)果表明，1，10-二氮雜菲溶液能抑制氨肽酶II，這暗示氨肽酶II是一種金屬蛋白酶。在有1，10-二氮雜菲溶液的情況下，Leu-pNA的水解速率從285mOD/分鐘降低到21mOD/分鐘。以下鑒定中使用實施例15中描述的純化氨肽酶II。用Ala-pNA作為底物，在含有0.125M檸檬酸、0.125M磷酸二氫鈉和0.125M硼酸的普通緩沖液(用10MNaOH將pH調(diào)至4.5-11，pH增量幅度為0.5)中確定氨肽酶的最佳pH。將100mgAla-pNA溶解在1mlDMSO中，并取20μlAla-pNA/DMSO加入980μl各種pH值的普通緩沖液中來制備Ala-pNA底物。于環(huán)境溫度，將15μl在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的氨肽酶II加入200μl各種pH值的2mg/mlAla-pNA中起始實驗。監(jiān)測405nm的吸光度5分鐘內(nèi)的變化。將15μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)加入各種pH值的200μl2mg/mlAla-pNA中確定底物的自水解，以便作為對照。下表2所示結(jié)果表明氨肽酶II在pH4.91到10.91的測量范圍內(nèi)對Ala-pNA底物有活性，最佳活性在pH～9.5-10。在pH11及更小時沒有觀察到底物的自水解。表2pHAvg.活性相對活性4.420mOD/min04.9120.0065.417.80.0245.8913.90.0436.4016.370.0516.9023.480.07277.2741.240.1287.5969.150.2148.03145.60.458.62245.990.7619.25306.970.959.68323.151.010.51270.80.83810.95197.860.612用以下方案確定氨肽酶II對溫度的穩(wěn)定性將1.7mlEppendorf管中的480μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)于37℃、45℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃預溫育30分鐘。然后加入20μl純化過的氨肽酶II，樣品再保溫20分鐘。然后將樣品置于冰上。所有溫度的溫育過程一結(jié)束，即用Leu-pNA作為底物檢測樣品的活性。通過將100μl各個溫度的溫育體系與100μl含有2mg/mlLeu-pNA的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)在環(huán)境溫度中混合來進行檢測。監(jiān)測5分鐘405nm吸光度。表3所示結(jié)果表明于60℃、pH7.5溫育20分鐘后，氨肽酶II保持90％的活性。表3溫度(℃)相對37℃的活性百分比3710045101559960906573.77064.67546用以下方案確定氨肽酶II對其各個底物的動力學參數(shù)。使用純化的氨肽酶II(A280＝0.581)。將每個底物溶解在DMSO中至濃度為100mg/ml，然后在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中稀釋50倍至濃度為2mg/ml。底物包括Leu-pNA、Glu-pNA(Bachem，Torrance，CA)和Ala-pNA。在96孔微量板中，將10μl純化的氨肽酶II與以下所示各種底物一起保溫，但Glu-pNA用50μl純化的氨肽酶II，監(jiān)測4分鐘405nm的吸光度1.200μl2mg/ml底物+0μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)2.100μl2mg/ml底物+100μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)3.50μl2mg/ml底物+150μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)4.25μl2mg/ml底物+175μl50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)做Lineweaver-Burke曲線確定每種底物的Km和Kcat，不同糖苷化形式都使用平均分子量97kDa。對Leu-pNA，確定出Km和Kcat分別為5.78mM和230.9min-1。對Glu-pNA，確定出Km和Kcat分別為1.17mM和8.217min-1。對Ala-pNA，確定出Km和Kcat分別為1.49mM和34.638min-1。實施例17用米曲霉1568氨肽酶II制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用大豆、小麥谷蛋白和酪蛋白作為底物，根據(jù)以下步驟檢測實施例11所述純化氨肽酶II的水解能力水解度(DH)檢測是用大豆粉片、小麥谷蛋白粉片和酪蛋白酸鈉(濃度為2％、pH調(diào)至7，如果需要，在水解期間不調(diào)pH)做的10ml小規(guī)模水解，于50℃進行18小時。在85℃水浴3分鐘使水解產(chǎn)物失活。使用的酶是FLAVOURZYMETM和氨肽酶II。酶用量情況如下對于大豆，加入2LAPU和5LAPU氨肽酶II(重組)，與3LAPUFLAVOURZYMETM比較。對谷蛋白，加入2LAPU和5LAPU氨肽酶II(重組)，與3LAPUFLAVOURZYMETM比較。對酪蛋白，加入1LAPU和2LAPU氨肽酶II(重組)，與3LAPUFLAVOURZYMETM比較。一個LAPU(亮氨酸氨肽酶單位)是在如下條件每分鐘分解1微摩爾L-Leu-pNA所需的酶量在0.1MTris緩沖液(pH8.0)中的26mML-亮氨酸-pNA于40℃反應10分鐘。水解過程中，釋放出pNA使溶液變黃，監(jiān)測405nm。水解度(DH)如Adler-Nissen(1986，食物蛋白質(zhì)的酶法水解，ElsevierAppliedSciencePublishers)所定義和描述，是根據(jù)以下步驟，通過上清液與OPA(鄰苯二醛，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)的反應確定的。將水解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋100倍。然后取120μl轉(zhuǎn)移到900μlOPA試劑中。制備OPA試劑的過程，是將160mgOPA溶解在4ml乙醇中并轉(zhuǎn)移到200ml體積的燒瓶中，燒瓶含有7.62g四硼酸二鈉十水合物、200mg十二烷基磺酸鈉和176mg二硫蘇糖醇，用水補至200ml。然后將溶液搖勻，恰好2分鐘后，測量340nm吸光度，并在減去空白值(水與OPA試劑反應)后與0.95mML-絲氨酸(蒸餾水)溶液的吸光度進行比較。為了確定DH的實際數(shù)值，用Adler-Nissen建議的用于三硝基苯磺酸方法(Adler-Nissen，1979，農(nóng)業(yè)和食品化學(AgriculturalandFoodChemistry)171256)的指數(shù)修正在水解產(chǎn)物中測量的絲氨酸當量，在所述方法中產(chǎn)生與文中描述的OPA方法相同的效果。根據(jù)水解混合體系中的蛋白質(zhì)總量而不是溶解蛋白質(zhì)來計算DH。在一個微量培養(yǎng)板孔中將25μl適當稀釋的上清液與200μlOPA試劑混勻，并于25℃恰好反應2分鐘。在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器中測量340nm的吸光度，減去空白值(水與OPA試劑反應)后與95mML-絲氨酸標準溶液的吸光度進行比較。為了確定DH的實際數(shù)值，用Adler-Nissen建議的用于三硝基苯磺酸方法(Adler-Nissen，1979，農(nóng)業(yè)和食品化學171256)的指數(shù)修正在上清中測量的絲氨酸當量，在所述方法中產(chǎn)生與文中描述的OPA方法相同的反應。根據(jù)水解混合體系中的蛋白質(zhì)總量而不是溶解蛋白質(zhì)來計算DH。對于大豆，向3LAPUFLAVOURZYMETM加入2LAPU和5LAPU氨肽酶II分別使絕對DH相對于只用3LAPUFLAVOURZYMETM的樣品升高至少8％和10％。對于谷蛋白，向3LAPUFLAVOURZYMETM加入2LAPU和5LAPU氨肽酶II分別使絕對DH升高6％和9％。對于白明膠，向3LAPUFLAVOURZYMETM加入2LAPU和5LAPU氨肽酶II分別使絕對DH升高4.9％和5.3％。對于酪蛋白，向3LAPUFLAVOURZYMETM加入1LAPU和2LAPU氨肽酶II分別使絕對DH相對于只用3LAPUFLAVOURZYMETM的樣品升高7％和9％。實施例18用米曲霉氨肽酶II水解大豆蛋白質(zhì)以10ml規(guī)模(微量水解)水解大豆蛋白質(zhì)，起始pH為7.0，蛋白質(zhì)濃度為2％。水解時間和溫度分別為18小時和50℃。將酶于85℃5分鐘失活，離心水解產(chǎn)物。用OPA方法分析上清液的DH。通過上清液與OPA(鄰苯二醛，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)的反應來確定Adler-Nissen(1986，食物蛋白質(zhì)的酶法水解，ElsevierAppliedSciencePublishers)所定義和描述的水解度(DH)。制備OPA試劑的過程是將160mgOPA溶解在4ml乙醇中并轉(zhuǎn)移到200ml體積的燒瓶中，燒瓶含有7.62g四硼酸二鈉十水合物、200mg十二烷基磺酸鈉和176mg二硫蘇糖醇，用水補至200ml。用PicoTagHPLC方法(WatersAssociates，Milford，MA)依照制造商的說明分析所選樣品的游離氨基酸含量。每個含有200mg大豆蛋白質(zhì)的水解搖瓶中酶用量如下表4所示。氨肽酶II是按照實施例10所述在米曲霉中重組產(chǎn)生并純化的。該氨肽酶II溶液A280為8.1，由氨基酸測定的結(jié)果估計蛋白質(zhì)含量為5mg/ml。DH分析的結(jié)果列在表4中。由總蛋白質(zhì)濃度2％而非溶解蛋白質(zhì)含量來計算DH。表4水解產(chǎn)物的DH結(jié)果<p>*這項計算使用的氨肽酶II濃度為5mg/ml表5顯示添加最大量的氨肽酶II(0.5g/kg大豆蛋白)時，與基量FLAVOURZYMETM相比每種氨基酸的相對增量％表5添加氨肽酶II導致的游離氨基酸的相對增量％氨基酸1.5％FLAVOURZYMETM6％FLAVOURZYMETM+氨肽酶II+氨肽酶II天冬氨酸123.426.0谷氨酸54.224.5天冬酰胺115.1-7.0絲氨酸123.80.0谷氨酰胺91.719.8甘氨酸145.722.4組氨酸31.92.8精氨酸24.96.1蘇氨酸40.48.8丙氨酸77.418.5脯氨酸87.559.2酪氨酸51.310.5頡氨酸41.412.7甲硫氨酸36.89.7半胱氨酸74.423.2異亮氨酸24.613.0亮氨酸22.47.5苯丙氨酸22.88.0賴氨酸49.010.3總量49.110.6DH28.78.0結(jié)果表明向低劑量FLAVOURZYMETM(1.5％)中加入氨肽酶II時，甘氨酸顯出最高的相對增量，然后是絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、半胱氨酸和丙氨酸。當向高劑量FLAVOURZYMETM(6％)加入氨肽酶II時，脯氨酸顯出最高的相對增量，然后是天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。實施例19脫酰胺作用使蛋白質(zhì)溶解性及谷氨酸釋放增加小麥谷蛋白得自Cargill(JOB5141)，脫酰胺小麥谷蛋白(DWG)得自StaProConsultancyB.V.，Lemdijk32，9422THSmilde，NL。將11g谷蛋白和89g水混合在一起得到8％的蛋白質(zhì)懸液。用NaOH將pH調(diào)到6.5。將谷氨酸/天冬氨酸特異的蛋白酶(SP446)(可根據(jù)WO91/13554的描述得到)，或者賴氨酸/精氨酸特異的蛋白酶(SP387)(可根據(jù)WO89/06270的描述得到)加入懸液。蛋白質(zhì)的用量對SP446是0.01AU/g蛋白質(zhì)，對SP387為0.006AU/g蛋白質(zhì)。以20LAPU/g蛋白質(zhì)的劑量將FLAVOURZYMETM(一種可得自NovoNordiskA/S，Bagsvaaerd，Denmark的非特異性蛋白酶制劑，含有內(nèi)肽酶和外肽酶活性，是通過米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的)加入某些水解產(chǎn)物中。水解于50℃進行18小時，不需進一步調(diào)pH。于85℃加熱15分鐘使酶失活。將pH調(diào)到5，并將水解產(chǎn)物離心。確定上清液中的蛋白質(zhì)和游離谷氨酸含量。經(jīng)Kjeldahl分析確定蛋白質(zhì)含量，所用Kjeldahl因子為6.25。用谷氨酸定量試劑盒(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)，依照制造商的說明確定游離谷氨酸的含量。將方法略做改進以適用于微滴培養(yǎng)板。就小麥谷蛋白(WG)和脫酰胺小麥谷蛋白(DWG)進行比較時，表6所示結(jié)果表明脫酰胺化使谷蛋白對特異蛋白酶的易感性增加，因此有更多的蛋白質(zhì)溶解。將FLAVOURZYMETM與一種特異蛋白酶同時加入時，由于脫酰胺化而使谷氨酸的釋放量加倍。表6</tables>實施例20酶法脫酰胺以及谷氨酸釋放使環(huán)狀芽孢桿菌ATCC21590于30℃、270rpm混合在搖瓶(400ml)中生長20小時來生產(chǎn)肽谷氨酰胺酶II，搖瓶中含有200ml由1％蛋白胨、0.5％乳糖、0.025％MgSO4-7H2O、0.005％FeSO4-7H2O、0.025％KH2PO4和17％Na2HPO4-12H2O(將pH調(diào)至7.2)組成的培養(yǎng)基。在4000rpm離心收獲1升搖瓶中的細胞。然后將細胞冷凍。得自環(huán)狀芽孢桿菌的肽谷氨酰胺II的純化過程在室溫下進行。將冷凍的環(huán)狀芽孢桿菌細胞融化，懸浮在裂解緩沖液(50mMTris/HCl；25％(w/v)蔗糖；1mMEDTA，pH8.0)中直到獲得均勻的懸液，每升裂解緩沖液有100g濕細胞。將溶菌酶(10mg/ml)和DNAseI(SigmaDN-25，10mg/ml)溶解在裂解緩沖液中。然后在每升細胞懸液中加入100ml溶菌酶溶液、10ml1.0MMgCl2和1mlDNAseI溶液。將酶放置反應1小時。將懸液經(jīng)蔡氏深度濾板過濾，濾過液在SephadexG25柱子(PharmaciaBiotechAB，Uppsala，Sweden)上轉(zhuǎn)移到10mMKH2PO4/NaOH(pH8.0，緩沖液A)中。將酶溶液上樣到在緩沖液A中平衡過的SOURCEQ柱子(PharmaciaBiotechAB，Uppsala，Sweden)上，并利用溶于緩沖液A的線性NaCl梯度(0-500mM)洗脫。按以下描述分析從柱子上流下的組分的肽谷氨酰胺酶II活性，并將有活性的組分匯合。匯合組分在280nm的吸光度為1.78，據(jù)此估計蛋白質(zhì)的純度為1.8mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE凝膠判斷肽谷氨酰胺酶II匯合液中的蛋白質(zhì)純度接近25％。因此，制品中含有大約0.5mg/ml純肽谷氨酰胺酶II。用一個Boehringer-Mannheim定氨試劑盒(目錄號1112732)。通過測量N-叔丁氧羰基-Gln-Pro(N-t-BOC-Gln-Pro；SigmaNo.B-4403)中的γ-羧基酰胺在水解過程中形成的氨來確定肽谷氨酰胺酶的活性。在這個試劑盒中，是通過確定谷氨酸脫氫酶消耗NADH的量來測量氨含量的，還要使用不加N-t-BOC-Gln-Pro的空白以便消除其他消耗NADH的酶類的影響。將總量200mg的小麥谷蛋白加入9ml沸水中，冷卻后，將pH調(diào)至7.0。然后加入上述肽谷氨酰胺酶II制劑(PEP)。以0.04AU/g蛋白質(zhì)的用量加入實施例19中描述的谷氨酸/天冬氨酸特異性蛋白酶，以20LAPU/g蛋白質(zhì)的用量加入實施例19中描述的FLAVOURZYMETM。水解反應于50℃進行18小時(不調(diào)pH)。同時做不加肽谷氨酰胺酶的對照。離心水解產(chǎn)物，按照實施例19的描述測量谷氨酸含量。按照實施例18的描述確定DH。下表7所示結(jié)果表明，用肽谷氨酰胺酶制劑進行的水解使得DH和谷氨酸的釋放量都增加。表7月4日序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名NovoNordiskBiotech，Inc.(B)街道1445DrewAuenue(C)城市Davis，Californis(E)國家美國(F)郵政編碼(ZIP)95616-4880(G)電話(530)757-8100(H)傳真(530)758-0317(ii)發(fā)明題目具有氨肽酶活性的多肽及其編碼核酸(iii)序列數(shù)9(iv)通訊地址(A)收件人NovoNordiskofNorthAmerica，Inc.(B)街道405LexingtonAvenue(C)城市NewYork(D)國家美國(E)ZIP10174(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC可兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(vi)目前的申請資料(A)申請?zhí)柎?B)申請日1998年5月13日(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)代理人/代理資料(A)姓名Gregg，ValetaA(B)登記號35,127(C)資料/文檔號5253，204-WO(ix)通訊資料(A)電話212-867-0123(B)傳真212-878-9655(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特征(A)長度1491個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(xi)序列描述SEQIDNO1ATGAGGTCGCTTTTGTGGGCTTCGTTGCTTTCGGGCGTGTTGGCTGGGAGGGCGCTTGTT60TCGCCGGATGAGTTCCCCGAGGATATTCAGTTGGAAGATCTGCTGGAAGGATCCCAACAG120CTTGAGGACTTCGCCTATGCCTACCCCGAGCGCAATCGCGTCTTTGGTGGTAAAGCCCAC180GACGACACGGTTAACTATCTCTACGAGGAGCTGAAGAAGACTGGCTACTATGATGTCTAC240AAGCAGCCTCAGGTGCACCTGTGGAGCAATGCCGACCAGACGCTCAAGGTGGGCGATGAG300GAAATCGAGGCGAAGACCATGACCTACAGTCCCAGCGTCGAGGTCACCGCCGATGTAGCC360GTCGTCAAGAACCTGGGATGCAGCGAGGCGGATTACCCATCCGATGTCGAGGGCAAGGTC420GCCCTGATCAAGCGTGGAGAATGCCCGTTCGGCGACAAGTCGGTTCTCGCTGCCAAAGCC480AAGGCCGCGGCTTCGATTGTCTATAACAATGTGGCCGGATCCATGGCGGGCACCCTTGGC540GCGGCGCAGAGTGATAAGGGACCGTATTCGGCCATTGTCGGTATCAGCTTGGAGGATGGC600CAGAAGCTGATCAAGCTTGCTGAGGCTGGATCGGTATCTGTGGATCTGTGGGTGGATAGT660AAGCAGGAGAACCGTACGACGTATAACGTTGTCGCGCAGACGAAGGGCGGCGATCCGAAC720AACGTCGTCGCGCTGGGTGGCCACACGGACTCAGTCGAGGCGGGCCCTGGTATCAACGAC780GATGGCTCGGGCATTATTAGCAACTTGGTCATTGCCAAAGCGCTCACGCAGTACTCCGTC840AAGAATGCCGTGCGCTTCCTCTTCTGGACAGCAGAGGAGTTCGGTCTGCTGGGCAGCAAC900TACTACGTCTCCCATCTGAATGCCACCGAGCTGAACAAGATCCGACTGTACCTGAACTTC960GACATGATCGCCTCACCTAACTACGCCCTCATGATCTATGACGGTGATGGATCGGCGTTC1020AACCAGAGCGGACCGGCCGGTTCCGCCCAGATCGAGAAACTGTTCGAGGACTACTACGAC1080TCCATCGACCTGCCTCATATCCCCACCCAGTTTGACGGACGTTCCGACTACGAGGCCTTT1140ATCCTGAACGGCATTCCGTCCGGTGGACTCTTCACGGGCGCCGAGGGCATCATGTCCGAA1200GAGAACGCAAGCCGCTGGGGAGGTCAAGCCGGCGTGGCCTACGACGCCAACTACCACGCC1260GCGGGAGACAACATGACCAACCTCAACCATGAAGCCTTCCTGATCAACTCCAAAGCCACC1320GCCTTCGCCGTCGCCACCTACGCCAACGACCTCTCCTCGATCCCCAAACGGAATACCACA1380TCCTCCTTGCACCGACGAGCCCGCACCATGCGACCATTCGGCAAGAGAGCTCCGAAGACA1440CACGCTCACGTATCAGGATCCGGATGCTGGCATTCTCAAGTCGAGGCATAG1491(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長度496個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO2MetArgSerLeuLeuTrpAlaSerLeuLeuSerGlyValLeuAlaGly151015ArgAlaLeuValSerProAspGluPheProGluAspIleGlnLeuGlu202530AspLeuLeuGluGlySerGlnGlnLeuGluAspPheAlaTyrAlaTyr354045ProGluArgAsnArgValPheGlyGlyLysAlaHisAspAspThrVal505560AsnTyrLeuTyrGluGluLeuLysLysThrGlyTyrTyrAspValTyr65707580LysGlnProGlnValHisLeuTrpSerAsnAlaAspGlnThrLeuLys859095ValGlyAspGluGluIleGluAlaLysThrMetThrTyrSerProSer100105110ValGluValThrAlaAspValAlaValValLysAsnLeuGlyCysSer115120125GluAlaAspTyrProSerAspValGluGlyLysValAlaLeuIleLys130135140ArgGlyGluCysProPheGlyAspLysSerValLeuAlaAlaLysAla145150155160LysAlaAlaAlaSerIleValTyrAsnAsnValAlaGlySerMetAla165170175GlyThrLeuGlyAlaAlaGlnSerAspLysGlyProTyrSerAlaIle180185190ValGlyIleSerLeuGluAspGlyGlnLysLeuIleLysLeuAlaGlu195200205AlaGlySerValSerValAspLeuTrpValAspSerLysGlnGluAsn210215220ArgThrThrTyrAsnValValAlaGlnThrLysGlyGlyAspProAsn225230235240AsnValValAlaLeuGlyGlyHisThrAspSerValGluAlaGlyPro245250255GlyIleAsnAspAspGlySerGlyIleIleSerAsnLeuValIleAla260265270LysAlaLeuThrGlnTyrSerValLysAsnAlaValArgPheLeuPhe275280285TrpThrAlaGluGluPheGlyLeuLeuGlySerAsnTyrTyrValSer290295300HisLeuAsnAlaThrGluLeuAsnLysIleArgLeuTyrLeuAsnPhe305310315320AspMetIleAlaSerProAsnTyrAlaLeuMetIleTyrAspGlyAsp325330335GlySerAlaPheAsnGlnSerGlyProAlaGlySerAlaGlnIleGlu340345350LysLeuPheGluAspTyrTyrAspSerIleAspLeuProHisIlePro355360365ThrGlnPheAspGlyArgSerAspTyrGluAlaPheIleLeuAsnGly370375380IleProSerGlyGlyLeuPheThrGlyAlaGluGlyIleMetSerGlu385390395400GluAsnAlaSerArgTrpGlyGlyGlnAlaGlyValAlaTyrAspAla405410415AsnTyrHisAlaAlaGlyAspAsnMetThrAsnLeuAsnHisGluAla420425430PheLeuIleAsnSerLysAlaThrAlaPheAlaValAlaThrTyrAla435440445AsnAspLeuSerSerIleProLysArgAsnThrThrSerSerLeuHis450455460ArgArgAlaArgThrMetArgProPheGlyLysArgAlaProLysThr465470475480HisAlaHisValSerGlySerGlyCysTrpHisSerGlnValGluAla485490495(2)SEQIDNO3的資料(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型無(xi)序列描述SEQIDNO3CysCysIleGlyAlaTyrGlyAlaArgThrThrTyrCysCysIleGly151015AlaArgGlyAla20(2)SEQIDNO4的資料(i)序列特征(A)長度36個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO4ArgThrThrTyrThrThrIleAlaCysIleAlaCysIleGlyCysIle151015AlaCysArgThrCysIleGlyCysIleGlyThrIleAlaCysTyrThr202530CysIleAlaCys35(2)SEQIDNO5的資料(i)序列特征(A)長度537個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO5MetHisPheSerLeuLysGlnLeuAlaValAlaAlaPheTyrAlaThr151015AsnLeuGlySerAlaTyrValIleProGlnPhePheGlnGluAlaPhe202530GlnGlnGluGluProIleGluAsnTyrLeuProGlnLeuAsnAspAsp354045AspSerSerAlaValAlaAlaAsnIleProLysProHisIleProTyr505560PheMetLysProHisValGluSerGluLysLeuGlnAspLysIleLys65707580ValAspAspLeuAsnAlaThrAlaTrpAspLeuTyrArgLeuAlaAsn859095TyrSerThrProAspTyrGlyHisProThrArgValIleGlySerLys100105110GlyHisAsnLysThrMetGluTyrIleLeuAsnValPheAspAspMet115120125GlnAspTyrTyrAspValSerLeuGlnGluPheGluAlaLeuSerGly130135140LysIleIleSerPheAsnLeuSerAspAlaGluThrGlyLysSerPhe145150155160AlaAsnThrThrAlaPheAlaLeuSerProProValAspGlyPheVal165170175GlyLysLeuValGluIleProAsnLeuGlyCysGluGluLysAspTyr180185190AlaSerValValProProArgHisAsnGluLysGlnIleAlaLeuIle195200205GluArgGlyLysCysProPheGlyAspLysSerAsnLeuAlaGlyLys210215220PheGlyPheThrAlaValValIleTyrAspAsnGluProLysSerLys225230235240GluGlyLeuHisGlyThrLeuGlyGluProThrLysHisThrValAla245250255ThrValGlyValProTyrLysValGlyLysLysLeuIleAlaAsnIle260265270AlaLeuAsnIleAspTyrSerLeuTyrPheAlaMetAspSerTyrVal275280285GluPheIleLysThrGlnAsnIleIleAlaAspThrLysHisGlyAsp290295300ProAspAsnIleValAlaLeuGlyAlaHisSerAspSerValGluGlu305310315320GlyProGlyIleAsnAspAspGlySerGlyThrIleSerLeuLeuAsn325330335ValAlaLysGlnLeuThrHisPheLysIleAsnAsnLysValArgPhe340345350AlaTrpTrpAlaAlaGluGluGluGlyLeuLeuGlySerAsnPheTyr355360365AlaTyrAsnLeuThrLysGluGluAsnSerLysIleArgValPheMet370375380AspTyrAspMetMetAlaSerProAsnTyrGluTyrGluIleTyrAsp385390395400AlaAsnAsnLysGluAsnProLysGlySerGluGluLeuLysAsnLeu405410415TyrValAspTyrTyrLysAlaHisHisLeuAsnTyrThrLeuValPro420425430PheAspGlyArgSerAspTyrValGlyPheIleAsnAsnGlyIlePro435440445AlaGlyGlyIleAlaThrGlyAlaGluLysAsnAsnValAsnAsnGly450455460LysValLeuAspArgCysTyrHisGlnLeuCysAspAspValSerAsn465470475480LeuSerTrpAspAlaPheIleThrAsnThrLysLeuIleAlaHisSer485490495ValAlaThrTyrAlaAspSerPheGluGlyPheProLysArgGluThr500505510GlnLysHisLysGluValAspIleLeuAsnAlaGlnGlnProGlnPhe515520525LysTyrArgAlaAspPheLeuIleIle530535(2)SEQIDNO6的資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO6ATGATGAGGTCGCTTTTGTGGGC23(2)SEQIDNO7的資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO7GGGATGCATCTATGCCTCGACTT23(2)SEQIDNO8的資料(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQIDNO8ATTTAAATCACCATGAGGTCGCTTTTGTGGGC32(2)SEQIDNO9的資料(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO9GGGTTAATTAACTATGCCTCGACTTGAGAATG3權(quán)利要求1.一種具有氨肽酶活性的分離多肽，選自(a)一種其氨基酸序列與SEQIDNO2中氨基酸16到496的氨基酸序列至少70％相同的多肽；(b)一種多肽，其編碼核苷酸序列在中等嚴謹條件下與(i)SEQIDNO1中核苷酸46到1488的核酸序列，(ii)其互補鏈，或者(iii)編碼具有氨肽酶活性的多肽片段的SEQIDNO1亞序列能夠雜交；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)(a)、(b)或(c)的片段，該片段具有氨肽酶活性；和(e)一種具有氨肽酶活性的多肽，它具有以下物理化學特性(a)在有N-丙氨酰對硝基苯胺條件下，于環(huán)境溫度確定的最佳pH范圍為大約pH7.27到pH10.95；(ii)沒有上述底物情況下于60℃保溫20分鐘后，測得pH7.5時相對于起始活性，熱穩(wěn)定性為90％或90％以上；以及(iii)對Xaa-pNA有活性，其中Xaa選自Leu、Glu、Gly、Ala和Pro。2.權(quán)利要求1的多肽，它含有與SEQIDNO2的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列。3.權(quán)利要求2的多肽，它含有與SEQIDNO2的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。4.權(quán)利要求3的多肽，它含有與SEQIDNO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。5.權(quán)利要求4的多肽，它含有與SEQIDNO2的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。6.權(quán)利要求5的多肽，它含有與SEQIDNO2的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。7.權(quán)利要求1的多肽，它含有SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段。8.權(quán)利要求7的多肽，它含有SEQIDNO2的氨基酸序列。9.權(quán)利要求2的多肽，得自曲霉屬菌株。10.權(quán)利要求9的多肽，得自一株米曲霉。11.權(quán)利要求1的多肽，其編碼核酸序列在中等嚴謹條件下能與SEQIDNO1的核酸序列，或其互補鏈或者其編碼具有氨肽酶活性的多肽片段的亞序列雜交。12.權(quán)利要求11的多肽，其編碼核酸序列在中等嚴謹條件下能與SEQIDNO1的核酸序列或其互補鏈雜交。13.權(quán)利要求11的多肽，得自曲霉屬菌株。14.權(quán)利要求13的多肽，得自一株米曲霉。15.權(quán)利要求1的多肽，其編碼核酸序列能在高度嚴謹條件下與SEQIDNO1的核酸序列，或其互補鏈或者其編碼具有氨肽酶活性的多肽片段的亞序列雜交。16.權(quán)利要求15的多肽，其編碼核酸序列能在高度嚴謹條件下與SEQIDNO1的核酸序列，或其互補鏈雜交。17.權(quán)利要求15的多肽，得自曲霉屬菌株。18.權(quán)利要求17的多肽，得自一株米曲霉。19.權(quán)利要求1的多肽，它具有以下物理化學特性(a)在有N-丙氨酰對硝基苯胺條件下，于環(huán)境溫度確定的最佳pH范圍為大約pH7.27到pH10.95；(ii)沒有底物情況下于60℃保溫20分鐘后，測得pH7.5時相對于起始活性，熱穩(wěn)定性為90％或90％以上；以及(iii)對Xaa-pNA有活性，其中Xaa選自Leu、Glu、Gly、Ala和Pro。20.權(quán)利要求19的多肽，得自曲霉屬菌株。21.權(quán)利要求20的多肽，得自一株米曲霉。22.權(quán)利要求1的多肽，它是由包含在大腸桿菌NRRLB-21677中的質(zhì)粒pEJG18中的核酸序列編碼的。23.一種包含編碼權(quán)利要求1所述多肽的核酸序列的分離核酸序列。24.一種核酸構(gòu)建體，它包含權(quán)利要求23所述核酸序列，該序列可操縱性連接了1或多個指導在合適的表達宿主中產(chǎn)生多肽的調(diào)控序列。25.一種重組表達載體，它包含權(quán)利要求24所述核酸構(gòu)建體、啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號。26.一種包含權(quán)利要求24所述核酸構(gòu)建體的重組宿主細胞。27.權(quán)利要求1所述多肽的生產(chǎn)方法，包括(a)培養(yǎng)一株菌來產(chǎn)生含有該多肽的上清液；和(b)回收該多肽。28.多肽的生產(chǎn)方法，包括(a)在適合該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求26所述宿主細胞；和(b)回收該多肽。29.權(quán)利要求1所述多肽的生產(chǎn)方法，包括(a)在有利于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)同源重組細胞，所述細胞中插入了新轉(zhuǎn)錄單位，該單位包含與編碼所述多肽的內(nèi)源核酸序列的外顯子可操作連接的調(diào)控序列、外顯子和/或剪接供體位點；和(b)回收該多肽。30.細胞突變體的制備方法，包括破壞或缺失編碼權(quán)利要求1所述多肽的核酸序列或其調(diào)控序列，從而使得到的突變體比原細胞中的多肽產(chǎn)量減少。31.由權(quán)利要求30的方法得到的突變體。32.制備異源多肽的方法，包括(a)在適合該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求31所述突變細胞；和(b)回收該多肽。33.由蛋白類底物制備水解產(chǎn)物的方法，包括使底物受到權(quán)利要求1所述多肽和一種內(nèi)肽酶的作用。34.權(quán)利要求33的方法，其中的水解產(chǎn)物富含亮氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和/或谷氨酰胺。35.權(quán)利要求33的方法，其中的水解產(chǎn)物富含甘氨酸。36.由權(quán)利要求33所述方法制備的蛋白水解產(chǎn)物。37.權(quán)利要求36的蛋白水解產(chǎn)物，其中的水解產(chǎn)物富含亮氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和/或谷氨酰胺。38.權(quán)利要求36的蛋白水解產(chǎn)物，其中的水解產(chǎn)物富含甘氨酸。39.包含權(quán)利要求36所述蛋白水解產(chǎn)物的食品。40.由蛋白類底物獲得富含游離谷氨酸和/或肽鍵合谷氨酸殘基的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，包括使底物進行脫酰胺作用和受到權(quán)利要求1所述多肽的作用。41.權(quán)利要求40的方法，還包括使底物受到1或多種非特異作用的內(nèi)肽酶和/或外肽酶酶類的作用。42.由權(quán)利要求41的方法得到的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。43.包含權(quán)利要求42所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的食品。44.包含權(quán)利要求1所述多肽和合適載體的改善風味組合物。45.包含權(quán)利要求1所述多肽和烘烤成分、用于生面團的預混合物。全文摘要本發(fā)明涉及得自米曲霉、具有氨肽酶活性的分離的多肽,和編碼這些多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞以及制備和使用所述多肽的方法。文檔編號A23J3/30GK1276012SQ98805174公開日2000年12月6日申請日期1998年5月15日優(yōu)先權(quán)日1997年5月16日發(fā)明者A·布林克沃斯凱,K·布朗,E·格萊特里,T·博恩,L·V·科弗德申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術有限公司