專利名稱：癌癥的快速診斷方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及癌癥的快速診斷方法，該方法適用于在無癥狀期或早期檢測個體中是否存在致癌過程。本發(fā)明還涉及碳酸酐酶II即腫瘤標記的激活劑化合物，所述腫瘤標記存在于癌癥患者的血清中；本發(fā)明還涉及治療癌癥的方法，該方法包括用所述癌癥診斷方法檢測無癥狀期或早期患者體內的癌癥；本發(fā)明還涉及完成所述癌癥診斷方法的試劑盒。本發(fā)明的癌癥診斷方法是以癌癥患者的血清對純化的碳酸酐酶II的活性有影響為基礎的。發(fā)現(xiàn)加入適宜量的癌癥患者的血清，可顯著提高純化的碳酸酐酶的活性。另一方面，未發(fā)現(xiàn)健康志愿者的血清或者有其它疾病而不是癌癥的患者的血清有相似的作用。
相關技術描述碳酸酐酶是一種鋅酶，是由Meldrum等在1932年(Meldrum N.U.，Roughton J.W.碳酸酐酶其制備和特性(Carbonic AnhydraseItsPreparation and properties)，J.Physiol.(London)，1933，80，113-142)發(fā)現(xiàn)的。該酶位于紅細胞和參與保持酸基平衡的生物體的其它細胞中(Maren T.H.碳酸酐酶，生理學綜述(Carbonic Anhydrase，Physiological Reviews)1967，47，585-782；Hewett-Emmett D.，Hopkins P.J.，Tashian R.E.，Czelusniak J.碳酸酐酶同功酶的來源和分子進化(Origins and molecular evolution of thecarbonic anhydrase isozymes)，Ann.N.Y.Acad.Sci.1984，429，338-358)。在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了8種不同的碳酸酐酶同功酶(命名為I-VIII)，它們有不同的生理功能，與胃酸分泌、水狀液和頭-脊液形成、胰腺碳酸氫鹽分泌、中間產物代謝、鈣化等有關。
申請人以前的研究工作表明以常規(guī)治療劑量經口使用碳酸酐酶特異性抑制劑(乙酰唑胺、乙氧苯唑胺、苯并噻唑-2-磺胺)可減少胃酸分泌并可消除潰瘍疼痛，同時，用內窺鏡檢查，發(fā)現(xiàn)在很短的時間內使胃十二指腸潰瘍愈合(I.Puscas et al.Les inhibiteurs deI’anhydrase carbonique dans le traitement de I’ulceregastrique et duodenal.Archive Francaises des Maiadies deI’Appareil Digestif，Paris，1976，65577-583；I.Puscas用碳酸酐酶抑制劑治療胃十二指腸潰瘍(Treatment of gastroduodenalulcers with carbonic anhydrase inhibitors)，Ann.New YorkAcad.of Sciences，1984，587-591；I.Puscas碳酸酐酶抑制劑用于治療胃和十二指腸潰瘍(Carbonic anhydrase inhibitors inthe treatment of gastric and duodenal ulcers)，inNewPharmacology of Ulcer Disease，S.Szabo，Gy.Mozsik(Editors)Elsevier Publ.House，New York，USA，164-178，1987；I.PuscasFarmacologia Clinica da Ulcera Peptica，InAparelhoDigestivo，Clinicae Cirurgia，Julio Coelho(Ed)MEDSI Publ.House，Rio de Janeiro，The 1st Edition in 1990，The 2nd Editionin 1996，1704-1734；I.PuscasAvaliacao do paciente com doencado estomago e duodeno，InAparelho Digestivo.Clinica eCirurgia，Julio Coelho(Ed.)，MEDSI Publ.House，Rio deJaneiro，Brasil，The 1st Edition in 1990，The 2nd Edition in1996，173-179)。
申請人的進一步研究還表明胃酸分泌的主要刺激劑-組胺、胃分泌素和乙酰膽堿-可直接激活胃粘膜中的碳酸酐酶II和IV(I.Puscas用組胺刺激胃酸分泌的機制新概念(New concepts concerning themechanism of stimulation of gastric acid secretion byhistzmine).VithWorld Congress of Gastroenterology，Madrid，1978，213；I.Puscas用組胺直接激活在人胃粘膜中的碳酸酐酶(Direct activation by histamine of the carbonic anhydrase inthe human gastric mucosa)，Rev.Roum.Biochem.，1979，4317-320)。申請人的研究還證明在紅細胞和血管壁中的碳酸酐酶的同功酶I與血管調節(jié)過程有關(I.Puscas et al.用一氧化氮抑制碳酸酐酶(Inhibition of carbonic anhydrase by nitric oxide).Arzneimittel-Forschung/Drug Research，1995，8846-848；I.Puscas et al.有血管舒張作用的前列腺素抑制碳酸酐酶，而白三烯B4和C4提高碳酸酐酶活性(Prostaglandins hayingvasodilating effects inhibit carbonic anhydrase whileleukotriens B4and C4incresase carbonic anhydrase activity).Int.J.Cl in.Pharmacol Therapeutics，1995，32，3176-181；I.Puscas et al.硝酸異山梨醇、硝酸甘油和硝普化鈉誘導血管舒張，同時抑制紅細胞中碳酸酐酶I直至消除(Isosorbide nitrates，nitroglycerine and sodium nitroprusside induce vasodilation，concomitantly inhibiting down to abolishment carbonicanhydrase I in erythrocytes). American Journal ofHypertension，1997，10(1)，124-128)，位于紅細胞和分泌細胞中的碳酸酐酶同功酶II可調節(jié)生物體內的分泌過程(I.Puscas et al.World Congressof Gastroenterology，Los Angeles，Oct.19941329-32；1366-81；I.Puscas et al.非甾類抗炎藥物通過直接作用機制激活碳酸酐酶(Nonsteroidal anti-inflammatorydrugs activate carbonic anhydrase by a direct mechanism ofaction.)J.Pharmacol.Exp.Therap.，USA，1996，277，31146-1148)。
申請人的結果導致提出有關細胞內信號傳遞新理論的假設pH理論。根據該理論，產生血管和分泌調節(jié)的刺激或主要信使可通過兩個機制起作用在細胞膜上的特異性受體和直接與膜結合的碳酸酐酶。該酶通過其激活作用或抑制作用可確保有足夠的pH用于刺激-受體復合物的形成，以便將信息傳遞給細胞效應物。通過碳酸酐酶引發(fā)的這種pH修飾作用，這種酶可參與生物體及癌癥形成過程中的生理和病理過程的調節(jié)(I.Puscas et al.碳酸酐酶與有機體生理和病理過程的調節(jié)(Carbonic anhydrase and modulation of physiologic andpathologic processes in the organism)I.Puscas-(Editior)，Helicon Publishing House Timisoara，Romania，1994，羅馬尼亞文本p.155-205 and 577-585，英文本p.147-197 and 551-559；I.Puscas碳酸酐酶-有機體生理和病理過程的調節(jié)物pH理論(Carbonic anhydrase-a modulator of physiologic andpathologic processes in the organismThe pH Theory).第4屆碳酸酐酶國際學術會議，1995年7月，University of Oxford，England；I.Puscas碳酸酐酶調節(jié)生物體中的生理和病理過程，pH理論(Carbonic anhydrase modulating physiological andpathological processes in organism. The pH theory). TheMedical Novelty(Noutatea Medicala)，Bucharest，Romania，1997，35-15)。
過去幾年已經在了解癌癥的生物學和生物化學基礎方面取得了顯著的進展。癌癥是一種異常細胞生長失控的疾病，所述異常細胞從最初的解剖部位向其它組織擴散。這種轉移過程包括在任何腫瘤細胞產生轉移集落前發(fā)生的各種細胞過程。如果失控，這種擴散就是癌癥致命結果的主要原因。但是，如果能夠被早期檢測并迅速得到治療，許多癌癥是可以治愈的；其它一些癌癥用各種治療方法可以控制許多年。
申請人的體外和體內研究證實致癌物質降低碳酸酐酶II和過氧化物歧化酶活性，而抗癌物質可提高這些酶的活性。(I.Puscas etal.碳酸酐酶I、II、非甾類抗炎藥物與致癌物質之間的關系(Relation between carbonic anhydrase I，CA II，non-steroidalanti-inflammatory drugs and some carcinogenic substances)，消化疾病周刊，San Diego，California，May 1995，0643；I.Puscaset al.胃癌患者與對照的超氧化物歧化酶的值(The values ofsuperoxie dismtase in patients with gastric cancer as comparedto controls)，Digestive Disease Week，San Francisco，California，May 1996，0798；I.Puscas et al.抗癌化療增加紅細胞并提高胃粘膜碳酸酐酶活性(Anticancer chemotherapyincreases red cell and gastric mucosa carbonic anhydraseactivity).體內研究。消化疾病周刊，San Francisco，California，May 1996，0797)。本申請人的其它最新研究-用患不同癌癥的患者完成的(組織學和計算機X線體層照相術確定的)-已表明與健康志愿者相比，所有患者的紅細胞碳酸酐酶II和超氧化物歧化酶活性都很低(I.Puscas et al.與對照相比，苯并芘和環(huán)磷酰胺對胃癌患者中的超氧化物歧化酶和碳酸酐酶活性的影響(The effectof benzpyrene and cyclophosphamide on superoxid dismutase andcarbonic anhydrase activity in gastric carcinoma patients ascompared to controls).The First Forum of Gastroenterology，“Banat-Crisana”，Timisoara，Romania，Oct.1996)。
到目前為止，利用腫瘤標記，在許多情況下早期檢測腫瘤并精心監(jiān)測所述疾病是可行的，所述腫瘤標記是表明腫瘤增殖存在并在血清、血漿或其它體液中可檢測到的生物化學指標。已經將腫瘤標記如癌胚抗原(CEA)、腫瘤壞死因子(TNF-α和β)、唾液酸、前列腺特異性抗原(PSA)等用于確定對治療的反應、確定殘余疾病或疾病的復發(fā)。直到今天，沒有特異性的腫瘤標記；在正常生理學狀態(tài)或非腫瘤疾病中它們中的大部分的水平都很低。因此，這些標記不能用于癌癥的一般性篩選檢測。
為了消除腫瘤標記的主要缺陷，本發(fā)明涉及建立在無癥狀階段篩選癌癥的快速方法，或在出現(xiàn)癥狀階段確定癌癥的快速方法。癌癥的所述早期檢測方法可以與其他用于腫瘤定位的常規(guī)方法一起對癌癥進行有效的外科或藥物治療。
申請人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，癌癥患者的血清可顯著激活純化的碳酸酐酶II的活性，并且用健康人的血清或患有其他疾病而不是癌癥的患者的血清則不產生這種激活作用?；谶@些觀察結果，本申請人發(fā)現(xiàn)，通過檢測血清對純化的碳酸酐酶II的活性的影響可以診斷任何類型癌癥，甚至在早期也可進行所述診斷。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了(1)用于癌癥診斷的方法，該方法包括(a)將待測個體的稀釋的血清樣品與純化的碳酸酐酶II溶液混合，制備第一反應混合物；(b)確定所述第一反應混合物中碳酸酐酶II的活性；(c)確定第二反應混合物中碳酸酐酶II的活性，所述第二反應混合物含有除血清以外的所有第一反應混合物；和(d)評估相對于步驟(c)，步驟(b)中碳酸酐酶II的激活程度；(2)在癌癥患者血清中存在的腫瘤標記物，所述腫瘤標記物在lμM或更低的濃度可激活碳酸酐酶；(3)治療癌癥的方法，該方法包括用上述(1)中定義的癌癥診斷方法，在無癥狀階段或早期檢測患者的癌癥過程；和(4)用于完成上述(1)的癌癥診斷方法的試劑盒，所述試劑盒含有含碳酸酐酶II的組分。
發(fā)明詳述本發(fā)明的癌癥診斷方法是一種體外方法，優(yōu)選的待測個體是人。
在癌癥診斷方法的優(yōu)選實施方案中，稀釋的血清含有0.1-50體積％的血清，優(yōu)選1-10體積％血清。用于稀釋血清樣品的稀釋劑選自水和含水有機溶劑，例如含0.1-50體積％，優(yōu)選1-15體積％一種或多種有機溶劑的含水混合物，所述稀釋劑還可任意地含有緩沖液和/或有機或無機鹽。適宜的有機溶劑包括低級醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇，酮，例如丙酮和丁酮，二醇和三醇化合物，例如乙二醇1，3-丙二醇和甘油，和醚如二乙醚，二乙二醇和2-甲氧基乙醇。適宜的緩沖液包括HEPES，DIPSO、TAPSO、TES和MOPS，適宜的有機或無機鹽包括硫酸鈉和硫酸鉀。
在純化的碳酸酐酶II的溶液中，所述碳酸酐酶II的濃度為0.01nM-0.1mM，優(yōu)選1.0nM-1.0μM。所述溶液的合適溶劑選自水劑和含水有機溶劑，所述溶劑還可含有緩沖液、無機鹽或有機鹽，和/或一種或多種指示劑。就有機溶劑、緩沖液、有機和無機鹽而言，是指上述稀釋的血清樣品。適宜的指示劑包括對硝基苯酚、酚紅和氮藍四唑。
根據本發(fā)明，優(yōu)選稀釋的血清樣品與純化的碳酸酐酶溶液以100∶1至1∶100的比例混合，優(yōu)選的比例為10∶1至1∶10，最佳為1∶1。
在優(yōu)選的實施方案中，第一反應混合物含有0.05-25體積％血清，優(yōu)選0.5-5體積％血清。應理解，相對于第二反應混合物中的碳酸酐酶II活性，在第一反應混合物中100％或更高的激活作用，表明個體中存在致癌過程，而所述第一反應混合物含有25體積％或較少，優(yōu)選5體積％或更少的血清(第一反應混合物中的碳酸酐酶II活性至少是第二反應混合物中的兩倍)。
在本發(fā)明方法進一步優(yōu)選的實施方案中，稀釋的血清是含10體積％血清的水溶液，純化的碳酸酐酶II溶液是含1.0-10μM碳酸酐酶II的含水緩沖液，第一反應混合物含有稀釋的血清樣品和純化的碳酸酐酶II溶液，兩者的比例為1∶1。
碳酸酐酶II活性可用一種例如在前文引用的具體文獻中描述的已知方法來確定。在本發(fā)明方法的一優(yōu)選實施方案中，用截流法(stop-flow method)(Khalifah R.G.碳酸酐酶的二氧化碳水合活性對天然人同功酶B和C的停-流動力學研究(The carbondioxide hydration activity of carbonic anhydrasestop-flowkinetic studies on the native human isozymes B and C)，J.Biol.Chem.，1971，2462561-2573)確定碳酸酐酶活性。該方法包括測量對二氧化碳水合作用的酶活性。二氧化碳水合作用用以pH改變?yōu)榛A的比色法確定。測量試劑混合物從其起始的pH7.5降至最終6.5所需的時間。用分光光度計在400nm測量反應，使用動力快速分光光度計HI-TECH SF-51MX(England)，該裝置配有一個混合容器和提供試劑的兩個注射器系統(tǒng)。通過兩個不同的途徑確保用反應小杯提供的試劑第一個注射器導入由酶-緩沖液組成的反應混合物(即第一或第二反應混合物)，而第二個注射器導入底物溶液，該底物溶液是含5-50mM，優(yōu)選15nN二氧化碳的二氧化碳水溶液。試劑進入反應小杯后混合，由此開始反應和監(jiān)測。接收從混合室發(fā)出的由光電倍增管傳遞的信號，用配有數學協(xié)處理器和動力學軟件RKBIN IS-1的計算機顯示。
也可用其它方法評估碳酸酐酶活性，例如以pH變化為基礎的方法(Philpot F.J.et al.A modifiedcolorimetric estimation of carbonic anhdrase，Biochem.J.，1936；302192-94；Kernohan J.K.et.al.The activity ofconcentrated solutions of carbonic anhydrase，Biochem.Biophys Acta，19636731-41；Maren T.H.Carbonic anhydrasechemistry，physiology and inhibition.Physiol.Rev.1967，47595-781；Wilbur K.M.&Anderson N.O.Electrometric andcolorimetric determination of carbonic anhydrase.J.Biol.Chem.1948，176147-153)。所述方法是以H+產生和消耗的測量值為基礎，并通過下列步驟完成a)pH指示劑，其中H+產生通過指示劑顏色的變化用肉眼觀察或b)pH電極，其中用pH電極測量H+產生和消耗。
以二氧化碳濃度或pCO2變化為基礎的方法，該方法以二氧化碳的產生或可逆的CO2-HCO3-反應的消耗為基礎，通過a)氣體測壓技術(Meldrum N.U.，Roughton F.J.W.，J.Physiol，London，1933，80113-142；Roughton F.J.W.et al.，Biochem J.，1946，40319-390)或b)pCO2電極測量(Holland R.A.B.et al.，J.Physiol.，London，1975，2281589-1596；Klocke R.A.，J.Appi.Physiol.，1976，40707-714)。
以反應溫度的變化為基礎的方法，該方法是以由反應引起的溫度的最初快速升高為基礎，用配有溫差電偶的裝置來測量(KernohanJ.C.et al.，J.Physiol.，London，1968，197345-361)。
標記同位素(示蹤物)如18O方法(Silverman D.N..MethodsEnzymol.1982，87732-752)。
用13C的核磁共振方法(NMR)(Simonsson I.et al.，Eur.J.Biochem.1979，93409-417)。
松弛法，其中HCO3-CO2溶液平衡突然改變其物理特性，例如其電場、壓力或溫度，從而改變化學平衡狀態(tài)(Eigen M.et al.，Z.Physik.Chem.NF，1961，30130-136)。
免疫組織化學方法，該方法是以鈷捕獲碳酸酐酶產生的二氧化碳為基礎，該方法可用于確定體內許多位點上的碳酸酐酶(HanssonH.P.J.碳酸酐酶活性的組織化學證明，Histochemie，1967，11112-128；Lonnerholm G.人腎臟中碳酸酐酶活性的組織化學證明，Acta Physiol.Scand.，1973，88455-468)。
熒光檢測法(Shingles R.，Moroney J.V.使用靈敏熒光法測定碳酸酐酶活性，Analytical Biochemistry，1997，252，1190-198)。
使用其它碳酸酐酶評估底物的方法，如對硝基苯乙酸酯法(Schneider F.et al.Uber die Reaktion von Carbonathydrolyasemit p-Nitrophenylacetat，Z.Physiol.Chem.，1963，334279-282)。
如前所述，相對于第二反應混合物中的碳酸酐酶II活性，在第一反應混合物(含有25體積％或更低，優(yōu)選5體積％或更少的血清)中達到100％或更高的激活值表明存在致癌過程。此外，本申請人發(fā)現(xiàn)用早期癌癥患者(不考慮癌癥的位置)的血清對碳酸酐酶II的激活作用較弱。因此，與更晚階段中患者血清的激活作用相比，本發(fā)明方法還適用于確定患者的癌癥階段(通過比較碳酸酐酶II的激活程度)。然而，在所有早期階段的情況下，癌癥患者的碳酸酐酶II激活作用(含5體積％血清的第一反應混合物)超過100％，而晚期患者血清產生的激活作用達到400％，甚至更高。
本發(fā)明方法具有下列優(yōu)點1.可檢測無癥狀階段的腫瘤，而用常規(guī)方法檢測不到早期的腫瘤。
2.用少量血清即可完成。
3.該方法是高度敏感，而且評估方法是可重復的。
4.由于所需的試劑價格低，因此，該方法經濟可行。
從有關癌癥患者血清對碳酸酐酶II的激活作用的上述結果開始，可鑒定在所述癌癥患者血清中引起碳酸酐酶II激活作用的一些相關因子(即腫瘤標記)。因此，已表明腫瘤壞死因子α和β、癌胚抗原、唾液酸和α1抗胰凝乳蛋白酶是碳酸酐酶II的強激活劑。本申請人的研究還證明，與健康志愿者的血清相比，癌癥患者的血清胃分泌素水平高出80％。因此，這可能也是碳酸酐酶II的血清內源激活劑。
本發(fā)明的腫瘤標記在低于1μM的濃度、甚至1nM或更低，甚至1pM或更低的濃度均可激活碳酸酐酶II。優(yōu)選的腫瘤標記包括腫瘤壞死因子α和β、癌胚抗原(CEA)、唾液酸、α1抗胰凝乳蛋白酶和sp185Her2癌蛋白。
可將本發(fā)明的腫瘤標記用作定量檢測激活百分比，具體地說，用于確定癌癥階段的標準溶液。
本發(fā)明治療癌癥的方法適用于治療患者的任何種類的癌癥，所述方法包括按上述檢測無癥狀階段或早期階段中患者體內的癌癥過程。因此，可將本發(fā)明癌癥診斷的方法與任何類型的治療方法聯(lián)用(例如外科或化療方法)。在癌癥過程中早期階段的檢測提高了治愈癌癥過程的機會。
完成本發(fā)明癌癥方法的試劑盒含有含碳酸酐酶II的組合物。所述組合物可以是干燥狀態(tài)或是溶液。所述組合物的其它組分和碳酸酐酶II在所述組合物中的量參考前文討論的第一反應混合物中的化合物。
所述試劑盒還含有含緩沖液如緩沖溶液的組合物，含指示劑的組合物，和含一種或多種腫瘤標記的組合物，其中所述緩沖液、指示劑和腫瘤標記是前文所定義的那些。
通過下列非限制性實施例更詳細地說明本發(fā)明。
實施例試劑-對硝基苯酚-作為顏色指示劑-以0.2mM的濃度使用；pH＝7.5；溫度20-25℃＝室溫(下文稱為r.t.)-HEPES緩沖液以20 mM的濃度使用；pH＝7.5；r.t.
-純化碳酸酐酶II的儲備液(從SIGMA Diesenhofen，Germany得到)以3.44x10-6M；pH＝7.5，r.t.使用-通過將二氧化碳通入雙蒸餾水至飽和來獲得濃度為15mM的二氧化碳溶液(底物)。
-硫酸鈉-濃度為0.1M-用于保持恒定的離子強度。
通過測量存在碳酸酐酶II的條件下，發(fā)生二氧化碳水合的時間來完成純化碳酸酐酶II活性的評估。測量反應開始時(反應混合物的吸收值為3個單位)至反應結束時(反應混合物的吸收值為零)的值。將吸收值描繪在反應曲線中。
反應小杯包含兩個注射器，注射器含有注射器1∶1毫升混合物0.8ml緩沖液+指示劑+0.1mlCA II溶液(3.44x10-6M)+0.1毫升水注射器II1毫升二氧化碳溶液(15mM)按上述方法完成試劑的注射和碳酸酐酶活性的測量。用該方法測量的反應時間標為T。用下列公式計算碳酸酐酶活性A=T0-TT--[EU/ml]]]>其中T0表示未催化的反應時間；和T表示催化的反應時間(存在CA II的條件下)根據本發(fā)明方法測量存在血清條件下的碳酸酐酶II活性如下進行實施例1從診斷患胃癌的患者中收集5毫升靜脈血。用恒溫器將血液保持30分鐘，然后以4000rpm離心5分鐘。離心后，取出2毫升血清，并按如下方法用雙蒸餾水制備1/10、1/50和1/100的稀釋溶液0.5毫升血清+4.5毫升水，得到1/10的稀釋溶液；從1/10的稀釋溶液中，取1毫升血清，加入4毫升水，得到1/50的稀釋溶液；最后從1/50的稀釋溶液中，取1毫升血清+4毫升水，得到1/100的稀釋溶液。
第一步是測量未催化的反應時間，即確定0.8毫升緩沖液+指示劑與+二氧化碳溶液之間的反應時間。將用該方法測量的時間標為T0，而且T0為6.5秒。
第二步是測量包括0.1毫升純化的碳酸酐酶II(3.44x10-6M)+0.8毫升緩沖液+指示劑+0.1毫升水的CO2溶液的反應時間。將用該方法測量的時間標為T，T為3.25秒。
用下列公式得到存在水的條件下，純化碳酸酐酶II的活性A=T0-TT=6.5s-3.25s3.25s=1.00---[EU/ml]]]>第三步分別加入1/100、1/50和1/10的血清稀釋溶液，與在0.8 ml HEPES緩沖液(20mM)+指示劑(對硝基苯酚0.2mM)中的0.1ml純化碳酸酐酶II的體積比為1∶1。存在二氧化碳的條件下，測量各混合物的反應時間，標為T1、T2、T3。這些值(T1、T2、T3)表示各反應混合物的吸收值降至0的時間間隔。
得到下列值T1＝1.679 s-1/100稀釋溶液的；T2＝1.264 s-1/50釋溶液的；T3＝0.874 s-1/10釋溶液的；按下列方法計算存在血清條件下碳酸酐酶II的活性
按下列方法計算血清稀釋溶液的激活百分比
實施例2從診斷為肺癌的患者取5毫升靜脈血，并按實施例1的方法處理。第一步T0＝6.40 s第二步T＝3.20 s；A＝1.00[EU/ml]第三步T1＝2.143 s(1/100稀釋液)；A1＝1.986[EU/ml]；激活作用98％；T2＝1.449 s(1/50稀釋液)；A2＝3.415[EU/ml]；激活作用241％；T3＝1.125 s(1/10稀釋液)；A3＝4.686[EU/ml]；激活作用368％.
實施例3從診斷為乳腺癌的患者體內取5毫升靜脈血并按實施例1的方法處理。第一步T0＝6.35 s；第二步T＝3.175 s；A＝1.00 [EU/ml]；第三步T1＝2.201 s(1/100稀釋液)；A1＝1.885[EU/ml]；激活作用88％；T2＝1.545 s(1/50稀釋液)；A2＝3.108[EU/ml]；激活作用211％；T3＝1.170 s(1/10稀釋液)；A3＝4.425[EU/ml]；激活作用342％；實施例4從診斷為卵巢癌的患者體內收集5毫升靜脈血并按實施例1的方法處理。第一步T0＝6.52 s；第二步T＝3.26 s；A＝1,00 IEU/ml]；第三步T1＝2.330 s(1/100稀釋液)；＝A1＝1.798[EU/ml]；激活作用80％；T2＝1.664 s(1/50稀釋液)；A2＝2.917[EU/ml]；激活作用192％；T3＝1.338 s(1/10稀釋液)；A3＝3.870[EU/ml]；激活作用287％；實施例5從診斷為睪丸癌的患者的體內收集5毫升靜脈血并按實施例1的方法處理。第一步T0＝6.24 s；第二步T＝3.12 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝2.155 s(1/100稀釋液)；A1＝1.895 [EU/ml]；激活作用90％；T2＝1.553 s(1/50稀釋液)；A2＝3.018[EU/ml]；激活作用202％；T3＝1.210 s(1/10稀釋液)；A3＝4.156[EU/ml]；激活作用316％；實施例6從診斷為前列腺癌的患者體內收集5毫升靜脈血并按實施例1的方法處理。第一步T0＝6.42 s；第二步T＝3.21 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝2.407 s(1/100稀釋液)；A1＝1.708[EU/ml]；激活作用71％；T2＝1.798 s(1/50稀釋液)；A2＝2.626[EU/ml]；激活作用163％；T3＝1.475 s(1/10稀釋液)；A3＝3.418[EU/ml]；激活作用242％；實施例7從診斷為白血病的患者體內收集5毫升靜脈血并按實施例1的方法處理。第一步T0＝6.36 s；第二步T＝3.18 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝2.108 s(1/100稀釋液)；A1＝2.016 [EU/ml]；激活作用102％；T2＝1.279 s(1/50稀釋液)；A2＝3.610[EU/ml]；激活作用261％；T3＝1.046 s(1/10稀釋液)；A3＝5.080[EU/ml]；激活作用408％；實施例8從健康志愿者的體內收集5毫升靜脈血并按實施例1的方法處理。第一步T0＝6.28 s；第二步T＝3.14 s；A＝1,00[EU/ml]；第三步T1＝3.14 s(1/100稀釋液)；A1＝1.00[EU/ml]；激活作用0％；T2＝3.09 s(1/50稀釋液)；A2＝1.032[EU/ml]；激活作用3％；T3＝3.06 s(1/10稀釋液)；A3＝1.051[EU/ml]；激活作用5％；實施例9用兩組患者，按如下方法檢測本發(fā)明快速診斷癌癥的方法組1(N＝2320)患不同類型癌癥的患者，所述癌癥已經組織學方法確證。
組2(N＝2638)健康志愿者和有其它疾病而不是癌癥的患者。
從兩組受試者收集靜脈血，按照實施例1的方法確定1/100、1/50和1/10血清稀釋溶液對純化碳酸酐酶II的作用。
結果列于下列表中，所述值是血清對純化碳酸酐酶II激活作用的平均值。
結果表明癌癥患者的血清可強烈激活純化的碳酸酐酶II，而CAII活性不受健康志愿者的血清或非癌癥患者的血清的影響。
從上述結果可以清楚地看出，激活作用與血清濃度成正比，即在實施例中，最大激活作用為1/10的稀釋溶液(≈第一反應混合物中的5體積％血清)，另一方面，血清稀釋度的降低(1/10至1/100≈5體積％至0.5體積％)也降低了血清的激活作用。然而，即使在1/100(≈第一反應混合物中的0.5體積％血清)，激活作用也是明顯的。
實用性本發(fā)明方法提供了用于快速診斷不同類型癌癥的檢測方法。
迄今為止，本申請人完成的研究包括3000多名不同階段不同部位的腫瘤患者，包括咽癌、胃癌、食管癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、前列腺癌、膀胱尿道癌(vesica urinary cancer)、甲狀腺癌、唇癌、白血病、惡性黑素瘤、Hodgkin淋巴瘤等。
本申請人描述了許多碳酸酐酶激活劑和抑制劑，所述試劑可在不同疾病中作為治療藥物施用并能夠影響本申請所述的檢測方法。由于這一原因，強烈建議在進行所述癌癥診斷方法前5天，中斷用H2受體拮抗劑進行的治療，并在進行檢測前10天，中斷用碳酸酐酶抑制劑(乙酰唑胺、E1，E2，E3前列腺素)或非甾類抗炎藥物進行的任何治療。
本申請人的研究證明本發(fā)明的方法可用于診斷所有類型的癌癥。
權利要求
1.癌癥診斷的方法，該方法包括(a)將待測個體的稀釋的血清樣品與純化的碳酸酐酶II溶液混合，制備第一反應混合物；(b)確定所述第一反應混合物中碳酸酐酶II的活性；(c)確定第二反應混合物中碳酸酐酶II的活性，所述第二反應混合物含有除血清以外的所有第一反應混合物；和(d)評估相對于步驟(c)，步驟(b)中碳酸酐酶II的激活程度。
2.權利要求1的方法，其中所述稀釋的血清樣品含有0.1體積％至50體積％，優(yōu)選1至10體積％的血清。
3.權利要求1或2的方法，其中所述稀釋的血清樣品稀釋劑選自水和含水有機溶劑，所述稀釋劑可任意地含有緩沖液。
4.權利要求1的方法，其中純化的碳酸酐酶II溶液中的碳酸酐酶II的濃度為0.01 nM至1.0mM，優(yōu)選1.0nM至1.0μM，其中所述溶液的溶劑選自水和含水有機溶劑，所述溶劑還可含有緩沖液和/或指示劑。
5.權利要求1的方法，其中稀釋血清樣品與純化碳酸酐酶溶液以100∶1至1∶100，優(yōu)選10∶1至1∶10，最佳以1∶1的比例混合。
6.權利要求1的方法，其中所述第一反應混合物含有0.05至25體積％，優(yōu)選0.1至10體積％，最佳0.5至5體積％的血清。
7.權利要求6的方法，其中含25體積％或更少，優(yōu)選5體積％或更少血清的第一反應混合物相對于第二反應混合物中的碳酸酐酶II活性有100％或更高的激活作用，表明在個體中存在致癌過程。
8.權利要求1的方法，其中稀釋的血清樣品是含10體積％血清的含水溶液，純化的碳酸酐酶II溶液是含1.0至10nM碳酸酐酶II的含水緩沖液，所述第一反應混合物通過將所述稀釋的血清樣品與所述純化的碳酸酐酶溶液以1∶1的比例混合來制備。
9.權利要求1或8的方法，其中通過截流動力測量法測量碳酸酐酶II的二氧化碳水合作用來測定所述酶。
10.權利要求9的方法，其中第一和第二反應混合物的開始pH為7.5，其中所述酶活性的確定包括將第一或第二反應混合物與底物溶液混合，所述底物溶液是含5至50mM二氧化碳，優(yōu)選10至25mM二氧化碳，最佳15mM二氧化碳的含水溶液，然后測量達到最終pH6.5所需的時間。
11.權利要求1的方法適用于檢測與癌癥階段無關的，特別是無癥狀階段或早期個體中的癌癥過程。
12.權利要求1的方法適用于不同階段不同部位的癌癥診斷篩選試驗，所述癌癥包括咽癌、胃癌、食管癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、前列腺癌、膀胱尿道癌、甲狀腺癌、唇癌、白血病、惡性黑素瘤、Hodgkin淋巴瘤和任何其它形式的癌癥。
13.在癌癥患者血清中存在的腫瘤標記，所述腫瘤標記在1μM或更低的濃度可激活碳酸酐酶II。
14.權利要求13的腫瘤標記，選自腫瘤壞死因子α和β、癌胚抗原、唾液酸、α1抗胰凝乳蛋白酶和sp 185Her2癌蛋白。
15.治療癌癥的方法，該方法包括通過癌癥診斷方法，檢測無癥狀期或早期患者體內的癌癥過程，所述癌癥診斷方法包括(a)將待測個體的稀釋的血清樣品與純化的碳酸酐酶II溶液混合，制備第一反應混合物；(b)確定所述第一反應混合物中碳酸酐酶II的活性；(c)確定第二反應混合物中碳酸酐酶II的活性，所述第二反應混合物含有除血清以外的所有第一反應混合物；和(d)評估相對于步驟(c)，步驟(b)中碳酸酐酶II的激活程度。
16.用于完成權利要求1或15的癌癥診斷方法的試劑盒，該試劑盒含有含碳酸酐酶II的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及快速診斷癌癥的方法。具體地講本發(fā)明涉及適用于檢測無癥狀期或早期個體中的致癌過程的快速癌癥診斷方法。本發(fā)明還涉及碳酸酐酶Ⅱ即腫瘤標記的激活化合物,所述腫瘤標記存在于癌癥患者的血清中,本發(fā)明涉及治療癌癥的方法,該方法包括用所述癌癥診斷方法檢測無癥狀期或早期個體中的癌癥;并涉及完成所述癌癥診斷方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/25GK1256713SQ98805210
公開日2000年6月14日 申請日期1998年3月13日 優(yōu)先權日1997年3月17日
發(fā)明者約安·普斯卡斯, 尤蓮娜·卡曼·普斯卡斯, 馬瑟拉·克爾陶, 加布里拉·杜慕塔, 邁克爾·貝坎 申請人:約安·普斯卡斯, 尤蓮娜·卡曼·普斯卡斯, 馬瑟拉·克爾陶, 加布里拉·杜慕塔, 邁克爾·貝坎