專利名稱：喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)以及編碼該酶的DNA。特別地，本發(fā)明涉及利用編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA生產(chǎn)具有基因改造煙堿水平的轉(zhuǎn)基因植物，和由此產(chǎn)生的植物。
背景技術(shù)：
考慮到煙堿有令人上癮的特性，生產(chǎn)煙堿水平減少的煙草是令人感興趣的。此外，在作為轉(zhuǎn)基因受體以表達(dá)具商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)品例如藥物、化妝品組分或食品添加劑方面，具有極低煙堿生產(chǎn)水平或無(wú)煙堿產(chǎn)生的煙草是有吸引力的。已經(jīng)設(shè)計(jì)有眾多的方法可用于從煙草中除去煙堿。然而，這些方法中的大多數(shù)還會(huì)除去煙草中除煙堿外的其它成分，從而對(duì)煙草質(zhì)量有不利影響。利用經(jīng)典的農(nóng)作物育種技術(shù)已經(jīng)獲得了比野生型煙草類植物中煙堿水平更低(約低8％)的煙草類植物。人們期望得到具有更低水平煙堿的煙草類植物和煙草。
降低生物學(xué)產(chǎn)物水平的方法之一是減少導(dǎo)致該產(chǎn)物產(chǎn)生的生物合成途徑中所需酶的量。若受影響的酶天然以限速量(相對(duì)于途徑中所需的其它酶類)存在，則該酶豐度的任何減少將會(huì)導(dǎo)致終產(chǎn)物產(chǎn)量的減少。如果該酶量不是限速量的，為了消除此途徑的產(chǎn)物，就必須將其在細(xì)胞中的產(chǎn)生量降低到限速量水平。相反地，如果酶的存在量是限速性的，那么此酶活性的任何增加會(huì)增加此生物合成途徑的終產(chǎn)物。
煙堿最初形成于煙草類植物的根中并隨后被轉(zhuǎn)移到葉中，并在此貯存[Tso，煙草類植物生理學(xué)和生物化學(xué)(Physiology andBiochemistry of Tobacco Plants)，第233-34頁(yè)，Dowden，Hutchinson & Ross，Straudsburg，Pa.(1972)]。煙堿生物合成中的限制性步驟是由喹啉酸形成煙酸，該步驟由喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(“QPRT酶”)催化。QPRT酶似乎是煙草中由煙酸至煙堿合成途徑中的限速酶。見(jiàn)，例如，F(xiàn)eth等，“煙草愈傷組織內(nèi)煙堿途徑中酶活性的調(diào)節(jié)”，植物(planta)，168，pp.402-07(1986)；Wagner等，“煙草中煙堿途徑酶活性的調(diào)節(jié)”，植物生理學(xué)(Physiol.Plant.)，68，pp.667-72(1986)。Nakatani和Malik的美國(guó)專利5,369,023和5,260,205中提出，通過(guò)反義調(diào)節(jié)腐敗甲基轉(zhuǎn)移酶(putrescencemethyl transferase，PMT酶)的表達(dá)來(lái)改變煙草類植物中的煙堿水平。在Wahad和Malik的PCT申請(qǐng)WO94/28142中描述了編碼PMT的DNA和有義及反義PMT構(gòu)建體的使用。
發(fā)明概述本發(fā)明首要方面是包括SEQ ID No.1的分離DNA分子；編碼具SEQID No.2序列的酶的DNA序列；可與此DNA雜交并編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA序列；和由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性導(dǎo)致與上述DNA不同的DNA序列。本發(fā)明更進(jìn)一步的方面是由這種DNA編碼的肽。
本發(fā)明另一方面是一種DNA構(gòu)建體，它含有植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和位于該啟動(dòng)子下游并與之可操作連接的編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA片段。編碼該酶的DNA可以是反義或有義的方向。
本發(fā)明另一方面是通過(guò)提供一種已知表達(dá)喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞，用含有啟動(dòng)子及含編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的序列部分的DNA的外源DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該植物細(xì)胞，而制備其喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)有所減少的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面是轉(zhuǎn)基因煙草植物，與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株相比，其喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)減少。這種植物的細(xì)胞內(nèi)有包含植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的一段編碼DNA序列的DNA構(gòu)建體。
本發(fā)明另一方面是減少植物細(xì)胞中喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的方法，該方法是通過(guò)培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化而含有外源DNA的植物細(xì)胞進(jìn)行的，其中外源DNA的被轉(zhuǎn)錄鏈與該細(xì)胞內(nèi)源喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA互補(bǔ)。該互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄降低了內(nèi)源喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)。
本發(fā)明另一方面是葉片中煙堿水平減少的煙草植物的制備方法，該方法通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞中含有外源DNA序列的煙草植物而進(jìn)行，其中外源DNA序列的被轉(zhuǎn)錄鏈與細(xì)胞內(nèi)源喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的信使RNA互補(bǔ)。
本發(fā)明一方面是喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的制備方法，該方法通過(guò)向已知表達(dá)喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)入含有喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶編碼DNA序列的外源DNA構(gòu)建體而進(jìn)行。
本發(fā)明另一方面是喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因煙草植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞中含有編碼植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的外源DNA序列。
本發(fā)明另一方面是增加植物細(xì)胞中喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的方法，該方法通過(guò)培養(yǎng)已被轉(zhuǎn)化而含有編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的外源DNA的植物細(xì)胞進(jìn)行。
本發(fā)明另一方面是葉片中煙堿水平增加的煙草植物的生產(chǎn)方法，該方法通過(guò)培養(yǎng)其細(xì)胞中含有編碼細(xì)胞內(nèi)具功能的喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的外源DNA序列的煙草植物而進(jìn)行。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示煙堿的生物合成途徑。已知受Nic1和Nic2調(diào)節(jié)的酶活性是QPRT酶(喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)和PMT酶(腐敗甲基轉(zhuǎn)移酶)。
圖2A顯示NtQPT1 cDNA(SEQ ID No.1)的核酸序列，其編碼序列(SEQ ID No.3)用大寫字母表示。
圖2B提供了由NtQPT1 cDNA編碼的煙草QPRT酶推斷的氨基酸序列(SEQ ID No.2)。
圖3對(duì)比了推斷的NtQPT1氨基酸序列與深紅紅螺菌、麻風(fēng)分枝桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、人和釀酒酵母中的相關(guān)序列。
圖4顯示缺失喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌突變體(TH265)用NtQPT1 cDNA的互補(bǔ)結(jié)果。用帶有NtQPT1的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；表達(dá)NtQPT1的轉(zhuǎn)化TH265細(xì)胞在無(wú)煙酸的基本培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，這表明NtQPT1編碼QPRT酶。
圖5比較了在Nic1和Nic2煙草突變體中的煙堿水平和相關(guān)的NtQPT1 mRNA穩(wěn)態(tài)水平野生型Burley21(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)；Nic1-Burley 21(nic1/nic1 Nic2/Nic2)；Nic2-Burley21(Nic1/Nic1 nic2/nic2)；和Nic1-Nic2-Burley21(nic1/nic1nic2/nic2)。實(shí)心圖欄顯示mRNA轉(zhuǎn)錄水平；影線圖欄顯示煙堿水平。
圖6列出隨著時(shí)間的推移，去梢煙草植物與未去梢對(duì)照植物比較的NtQPT1 mRNA相對(duì)水平。實(shí)心欄顯示mRNA轉(zhuǎn)錄水平；影線欄顯示煙堿水平。
發(fā)明詳述在煙草植物中，煙堿是由煙酸與4-甲基氨基丁醇縮合產(chǎn)生的。導(dǎo)致煙堿產(chǎn)生的生物合成途徑見(jiàn)圖1。兩調(diào)節(jié)位點(diǎn)(Nic1和Nic2)作為煙堿產(chǎn)生的共顯性調(diào)節(jié)子起作用。Nic單、雙突變體根部的酶學(xué)分析顯示，喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)和腐敗甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT酶)兩種酶的活性與煙堿生物合成水平成正比例關(guān)系。煙草組織(根和愈傷組織)中酶活性與煙堿合成的不同能力間的比較顯示，QPRT酶活性與煙堿含量直接相關(guān)(Wagner和Wagner，植物(Planta)，165532(1985))。Saunders和Bush(植物生理學(xué)(Plant Physiol)64236(1979))的研究顯示，在低煙堿突變體根部的QPRT酶水平與葉片中煙堿水平成比例關(guān)系。
本發(fā)明包括一新型cDNA序列(SEQ ID No.1)，它編碼具SEQ IDNo.2序列的植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)。因?yàn)镼PRT酶活性與煙堿含量嚴(yán)格相關(guān)，構(gòu)建與野生型植物內(nèi)水平相比其根部QPRT酶水平降低的轉(zhuǎn)基因煙草植物后，會(huì)導(dǎo)致植物葉片中的煙堿水平下降。本發(fā)明提供了生產(chǎn)這種轉(zhuǎn)基因植物的方法和核酸構(gòu)建體以及這種轉(zhuǎn)基因植物。這種方法包括反義NtQPT1 RNA的表達(dá)，從而降低煙草根部QPRT酶的量。其外煙堿還被發(fā)現(xiàn)存在于非煙草類的植物中，盡管存在量通常遠(yuǎn)比煙草中低。
本發(fā)明還提供了編碼QPRT酶或QPRT酶反義RNA分子的有義和反義重組DNA分子，和含有那些重組DNA分子的載體，以及用那些DNA分子和載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞和植物與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照煙草細(xì)胞和植物相比，具更低或更高煙堿含量的特征。
具極低煙堿產(chǎn)生水平、或無(wú)煙堿產(chǎn)生的煙草植物，作為轉(zhuǎn)基因的受體以表達(dá)有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)物諸如藥物、化妝品組分或食品添加劑是有吸引力的。煙草作為編碼目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的受體植物是有吸引力的，因?yàn)闊煵菀子谶M(jìn)行基因工程操作，并且每英畝可產(chǎn)生非常大的生物量；對(duì)于煙堿產(chǎn)生所用資源減少的煙草植物，相應(yīng)地將會(huì)有更多的資源用來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。用生產(chǎn)目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化煙草的方法在本領(lǐng)域眾所周知；任何合適的技術(shù)都可用于本發(fā)明的低煙堿煙草植物。
根據(jù)本發(fā)明，具減少的QPRT酶表達(dá)和減少的煙堿水平的煙草植物，可期望用來(lái)生產(chǎn)具減少的煙堿含量的煙草產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的煙草植物，可適用于任何傳統(tǒng)的煙草產(chǎn)品，包括但并不限于煙絲，葉卷煙和卷煙煙草，和嚼煙煙草，和包括葉煙、碎煙或切煙在內(nèi)的任何形式。
本發(fā)明構(gòu)建體也可用于提供具植物體內(nèi)增加的QPRT酶表達(dá)和增加的煙堿含量的轉(zhuǎn)基因植物。這種構(gòu)建體，利用這些構(gòu)建體的方法和由此生產(chǎn)的植物可以期望用于生產(chǎn)具更改的煙堿含量的煙草產(chǎn)物，或生產(chǎn)為了其殺蟲(chóng)效果而增加煙堿含量的植物。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TobRD2基因[見(jiàn)Conkling等，植物生理，93，1203(1990)]編碼煙草(Nicotiana tabacum)QPRT酶，并在這里提供了NtQPT1(先前稱之為TobRD2)的cDNA序列和所編碼酶的氨基酸序列。將NtQPT1氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，顯示其與編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)(圖3)的細(xì)菌蛋白具有限的序列相似性。
在原核和真核生物中，喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶是從頭的煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成所必需的。在煙草的根部而不是葉片中，檢測(cè)到高水平的QPRT酶。為了確定是NtQPT1編碼QPRT酶，本發(fā)明者利用了大腸桿菌細(xì)菌株系(TH265)，一種缺乏喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nadC-)的突變體。這種突變體在缺乏煙酸的基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。然而，該細(xì)菌株系中NtQPT1蛋白的表達(dá)提供了NadC+表型(圖4)，這證實(shí)NtQPT1編碼QPRT酶。
本發(fā)明者檢測(cè)了煙草Nic1和Nic2突變體的效果，和去頂梢煙草植物內(nèi)NtQPT1穩(wěn)態(tài)mRNA水平和煙堿水平的影響。(通過(guò)在開(kāi)始開(kāi)花時(shí)去頂梢以除去頂端優(yōu)勢(shì)，眾所周知可導(dǎo)致煙草中煙堿生物合成及轉(zhuǎn)運(yùn)水平的增加，這是煙草生產(chǎn)中的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用方法。)如果NtQPT1確實(shí)與煙堿生物合成有關(guān)，可以預(yù)期(1)在Nic1/Nic2雙突變體中NtQPT1mRNA水平會(huì)更低，和(2)去梢后NtQPT1 mRNA水平會(huì)增加。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在Nic1/Nic2雙突變體中NtQPT1 mRNA水平大約是野生型的25％(圖5)。其外，去梢6小時(shí)內(nèi)，煙草植物中的NtQPT1 mRNA水平增加大約8倍。因此，NtQPT1被確定是煙堿生物合成途徑中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)基因。
轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物植物細(xì)胞基因組中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可以如下進(jìn)行將處于宿主細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子控制之下的外源DNA整合到該植物細(xì)胞基因組中，其中外源DNA的轉(zhuǎn)錄鏈與待調(diào)節(jié)的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄DNA鏈互補(bǔ)。該引入的DNA被稱為反義DNA，提供了與自然產(chǎn)生(內(nèi)源)mRNA互補(bǔ)并且能抑制該內(nèi)源mRNA表達(dá)的RNA序列。此類基因表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制并沒(méi)有完全被理解。盡管并不希望被任何單一理論所束縛，值得一提的是，反義調(diào)節(jié)假設(shè)的一種理論認(rèn)為反義DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA分子能與內(nèi)源mRNA分子結(jié)合并阻止或抑制其轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明方法中，反義產(chǎn)物可以互補(bǔ)于天然靶RNA的編碼或非編碼(或兩者全部)部分。可以用任何合適方法將反義構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，并可以整合到植物基因組中，以進(jìn)行反義序列的誘導(dǎo)或組成型轉(zhuǎn)錄。見(jiàn)，例如，Shewmarker等的美國(guó)專利號(hào)No.5,453,566和5,107,065(全文引入作為參考)。
如這里所用，外源的或異源DNA(或RNA)是指通過(guò)人類的努力已被導(dǎo)入細(xì)胞(或細(xì)胞祖先)的DNA(或RNA)。該異源DNA可以是被轉(zhuǎn)化細(xì)胞中天然存在序列或其片段的拷貝。
為了生產(chǎn)與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照煙草植物相比具降低QPRT酶水平并由此具更低煙堿含量的煙草植物，可以用含有部分QPRT cDNA序列、全長(zhǎng)QPRT cDNA序列、部分QPRT染色體序列或全長(zhǎng)QPRT染色體序列以反義方向連在可操作的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列中的外源QPRT反義轉(zhuǎn)錄單元，來(lái)轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞。適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列包括在將被轉(zhuǎn)化的植物中可操作的轉(zhuǎn)錄起始序列(“啟動(dòng)子”)，和多聚腺苷酸化/轉(zhuǎn)錄終止序列。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如限制作圖，Southern雜交，和核酸序列分析，可用來(lái)確證攜有以反義方向可操作連接調(diào)節(jié)序列的QPRT酶序列的克隆。然后從成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中再生出煙草植物。最優(yōu)選的是，所利用的反義序列與內(nèi)源序列互補(bǔ)，然而，可以容忍外源與內(nèi)源序列間有微小差異。優(yōu)選的是，反義DNA序列應(yīng)有充分的序列同源性，使其能夠在以下所述的嚴(yán)格條件下與細(xì)胞內(nèi)待調(diào)節(jié)的內(nèi)源序列相結(jié)合。
在數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室中都曾利用反義技術(shù)創(chuàng)造與正常量相比水平減少的特異酶類的轉(zhuǎn)基因植物。例如，通過(guò)將查耳酮合酶反義基因插入煙草和矮牽?；蚪M中，已經(jīng)產(chǎn)生出具更低水平查耳酮合酶的植物(查耳酮合酶是花色素生物合成途徑中的一種酶)。這些轉(zhuǎn)基因煙草和矮牽牛植物開(kāi)的花的顏色比正常更淺(Van der Krol等，“轉(zhuǎn)基因植物中的反義查耳酮合酶基因抑制花色素產(chǎn)生”，自然(Nature)，333，866-69(1988))。反義RNA技術(shù)已被成功用來(lái)抑制西紅柿中聚半乳糖醛酸酶的產(chǎn)生[Smith等，“轉(zhuǎn)基因西紅柿中聚半乳糖醛酸酶基因表達(dá)的反義RNA抑制”，自然，334，pp.724-26(1988)；Sheehy等“通過(guò)反義RNA技術(shù)降低西紅柿果實(shí)中的聚半乳糖醛酸酶活性”，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，85，pp.8805-09(1988)]，和抑制煙草中核酮糖二磷酸羧化酶小亞基的產(chǎn)生(Rodermel等，“核-細(xì)胞器相互作用核反義基因抑制轉(zhuǎn)化煙草植物中核酮糖二磷酸羧化酶的水平”，細(xì)胞(Cell)，55，pp.673-81(1988))?；蛘撸ㄟ^(guò)將目的酶類的基因以有義(即正常)方向轉(zhuǎn)化植物，可以創(chuàng)造出該酶與正常量相比具更高水平特征的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因煙草植物的煙堿水平可以用標(biāo)準(zhǔn)煙堿分析方法來(lái)檢測(cè)。與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比，QPRT酶水平減少的轉(zhuǎn)化植物，相應(yīng)地與對(duì)照相比也具有減少的煙堿水平；與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比QPRT酶水平增加的轉(zhuǎn)化植物，相應(yīng)地與對(duì)照相比也具增加的煙堿水平。
可以選擇本發(fā)明反義方法中所用的異源序列，以產(chǎn)生互補(bǔ)于完整或部分QPRT酶mRNA序列的RNA產(chǎn)物。該序列可以互補(bǔ)于天然信使RNA的任意鄰近序列，也就是說(shuō)，它可以互補(bǔ)于內(nèi)源mRNA序列5’-末端或帽子位點(diǎn)附近，帽子位點(diǎn)下游，帽子位點(diǎn)與起始編碼子之間，也可以覆蓋全部或僅一部分非編碼區(qū)，可以跨接非編碼區(qū)和編碼區(qū)，可以互補(bǔ)于所有或部分編碼區(qū)，互補(bǔ)于編碼區(qū)3’-末端，或互補(bǔ)于mRNA的3’-非翻譯區(qū)。合適的反義序列可以至少約13至15個(gè)核苷酸，至少約16至21個(gè)核苷酸，至少約20個(gè)核苷酸，至少約30個(gè)核苷酸，至少約50個(gè)核苷酸，至少約75個(gè)核苷酸，至少約100個(gè)核苷酸，至少約125個(gè)核苷酸，至少約150個(gè)核苷酸，至少約200個(gè)核苷酸，或更多。其外，這里序列可以沿3’或5’末端延伸或縮短。
具體的反義序列和反義序列的長(zhǎng)度可以根據(jù)期望抑制的程度，反義序列的穩(wěn)定性等等而多樣。利用在本領(lǐng)域可獲得技術(shù)及這里所提供信息，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可被指導(dǎo)選擇適當(dāng)QPRT酶反義序列。參考這里的圖2A和序列SEQ ID No.1，本發(fā)明的寡核苷酸可以是反義方向的QPRT酶cDNA序列連續(xù)片段，長(zhǎng)度不限，只要足以在轉(zhuǎn)入受體植物細(xì)胞后獲得預(yù)期效果即可。
本發(fā)明也可應(yīng)用于煙堿產(chǎn)生的有義共抑制方法中。本發(fā)明實(shí)踐中所用的有義DNA，其長(zhǎng)度足以在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可以抑制該植物細(xì)胞中如這里所述的植物QPRT酶蛋白的天然表達(dá)。此類有義DNA可以是編碼QPRT酶的完整基因組或互補(bǔ)DNA，或其片段，該片段長(zhǎng)度通常至少為15個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得確定可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)天然基因表達(dá)抑制效果的有義DNA長(zhǎng)度的方法。
本發(fā)明的另一具體實(shí)例中，利用含有編碼酶性RNA分子(即“核酶”)的DNA片段的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了煙草植物細(xì)胞，其中的酶性RNA分子針對(duì)的是(即切斷)這里所述的植物QPRT酶編碼DNA的mRNA轉(zhuǎn)錄物。核酶含有可結(jié)合到靶mRNA易接近區(qū)的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和可催化切割RNA的結(jié)構(gòu)域，從而阻止翻譯和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括互補(bǔ)于靶mRNA序列的反義序列；催化基元可以是錘頭基元或其它基元，諸如發(fā)夾基元。RNA靶中的核酶切割位點(diǎn)可以先通過(guò)掃描靶分子確認(rèn)出來(lái)(例如GUA，GUU或GUC序列)。一旦確認(rèn)，即可以評(píng)估相應(yīng)于含有切割位點(diǎn)的靶基因區(qū)的15，20，30或更多核糖核苷酸的短DNA序列是否有預(yù)期的結(jié)構(gòu)特征。利用本領(lǐng)域已知的核糖核酸酶保護(hù)分析法，通過(guò)檢測(cè)候選靶與互補(bǔ)寡核苷酸的雜交能力，可以估計(jì)出它們的適當(dāng)性。根據(jù)已知技術(shù)，例如T.Cech等的美國(guó)專利號(hào)No.4,987,071；Keene等的美國(guó)專利號(hào)No.5,559,021；Donson等的美國(guó)專利號(hào)No.5,589,367；Toirence等的美國(guó)專利號(hào)5,583,032；Joyce的美國(guó)專利號(hào)No.5,580,967；Gold等美國(guó)專利號(hào)No.5,595,887；Wagner等的美國(guó)專利號(hào)No.5,591,601；和美國(guó)專利號(hào)No.5,622,854(全文引入作為參考)，可以產(chǎn)生編碼酶性RNA分子的DNA。植物細(xì)胞中此類酶性RNA分子的產(chǎn)生及QPRT酶蛋白產(chǎn)生的破壞皆會(huì)減少植物細(xì)胞內(nèi)的QPRT酶活性，且作用方式基本雷同于反義RNA的產(chǎn)生即，通過(guò)打斷細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生該酶的mRNA的翻譯。這里所用術(shù)語(yǔ)“核酶”是指含RNA的核酸，其可作為酶(諸如核糖核酸內(nèi)切酶)起作用，并可以與術(shù)語(yǔ)“酶性RNA分子”互換使用。本發(fā)明進(jìn)一步包括編碼核酶的DNA，已被插入表達(dá)載體中的編碼核酶的DNA，含這種載體的宿主細(xì)胞，和利用核酶減少植物中QPRT酶產(chǎn)生的方法。
執(zhí)行本發(fā)明所用的核酸序列包括與SEQ ID No.1具序列相似性、并編碼具喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的那些核酸序列。這個(gè)定義旨在涵蓋QPRT酶蛋白的天然等位變體。由此，執(zhí)行本發(fā)明也可用能與SEQ ID No.1 DNA雜交并編碼QPRT酶(特別是植物QPRT酶)表達(dá)的DNA序列。
可以存在多種形式的煙草QPRT酶。酶的多樣形式可能歸因于單基因產(chǎn)物的翻譯后修飾，或者是由于NtQPT1基因的多樣形式。
依慣常方式可以確定編碼具QPRT酶活性的蛋白的其它DNA序列與SEQ ID No.1 DNA或與編碼如SEQ ID No.2所示蛋白的其它DNA序列相雜交的條件。例如，此類序列的雜交可在降低嚴(yán)格條件或甚至嚴(yán)格條件下執(zhí)行[例如，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的原位雜交分析(見(jiàn)J.Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(第二版，1989)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室))對(duì)所給出的編碼SEQ ID No.2蛋白的DNA而言，嚴(yán)格條件即是，用0.3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉，0.1％SDS在60℃或甚至70℃的條件下洗膜]。一般地，此類序列與這里所給的序列SEQ ID No.1或編碼SEQ ID No.2蛋白的DNA序列相比，至少65％相似，75％相似，80％相似，85％相似，90％相似，或甚至95％相似，或更高(通過(guò)將兩序列排列取其最大配對(duì)數(shù)，可以確定序列相似性，為了盡可能配對(duì)而允許被排列的兩序列任一中出現(xiàn)缺口。優(yōu)選的缺口堿基長(zhǎng)為10或更少，更優(yōu)選缺口長(zhǎng)為5或更少，仍更優(yōu)選缺口長(zhǎng)為2或更少)。
利用差異雜交操作，能夠分離出cDNA克隆，其mRNA水平可低至約0.05％的poly(A+)RNA。見(jiàn)M.Conkling等，植物生理93，1203-1211(1990)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，可以利用植物組織(例如根和/或葉)的mRNA反轉(zhuǎn)錄成的單鏈cDNA探針來(lái)篩選cDNA文庫(kù)。差異篩選過(guò)程中，將硝酸纖維素膜或尼龍膜浸至5×SSC中，放入96孔吸板中，從主板上轉(zhuǎn)移150μl穩(wěn)定過(guò)夜溫育液至每孔中，并真空抽干直到所有液體都透過(guò)膜。用排槍加入150μl變性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)至每單孔中，并允許存在3分鐘。如上所述抽吸后移走濾膜，并用0.5M Tris-HCl(pH8.0)，1.5M NaCl中和。然后再真空烘烤2小時(shí)后用相應(yīng)探針溫育。使用尼龍膜，并將主板在7％DMSO中貯存于-70℃，可以用多探針多次篩選雜交膜，保存數(shù)年之后也能找回合適的克隆。
如這里所用，術(shù)語(yǔ)“基因”是指一段DNA序列，它整合有(1)包括啟動(dòng)子在內(nèi)的上游(5’)調(diào)控信號(hào)，(2)編碼該基因的產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或RNA的編碼區(qū)，(3)包括轉(zhuǎn)錄終止子和多聚腺苷酸化信號(hào)在內(nèi)的下游(3’)區(qū)和(4)有效及特異表達(dá)所需的相關(guān)序列。
本發(fā)明的DNA序列可以基本上由這里所提供的序列(SEQ ID No.1)組成，或是代表這些基因的等位或多態(tài)變體的相當(dāng)核酸序列，或是其編碼區(qū)。
本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求中所用短語(yǔ)“實(shí)質(zhì)性序列相似性”是指與這里公開(kāi)和要求保護(hù)的實(shí)際序列相比有微小和非重大的序列變異的DNA、RNA或氨基酸序列，被認(rèn)為與本發(fā)明的序列同等。這樣考慮，“微小和非重大的序列變異”是指“相似”序列(即，與這里公開(kāi)和要求保護(hù)的DNA、RNA或蛋白質(zhì)具有實(shí)質(zhì)性序列相似性的序列)，在功能上同等于本發(fā)明公開(kāi)和要求保護(hù)的序列。功能同等序列以實(shí)質(zhì)上相同的方式行使功能，產(chǎn)生與這里公開(kāi)和要求保護(hù)的核酸和氨基酸組合物實(shí)質(zhì)上相同的組合物。
這里提供的DNA序列可被轉(zhuǎn)入多種宿主細(xì)胞。多種具理想生長(zhǎng)和可操作特性的合適宿主細(xì)胞，在本領(lǐng)域已經(jīng)可以獲得。
在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求中所用短語(yǔ)“分離的”或“實(shí)質(zhì)上純的”作為DNA、RNA、多肽或蛋白質(zhì)的修飾語(yǔ)，意指所述的DNA、RNA、多肽或蛋白質(zhì)已經(jīng)在人為努力下從它們的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中分離出來(lái)。
如這里所用，“體內(nèi)DNA序列”或“天然DNA序列”是指可從非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或組織中分離的DNA序列。天然DNA序列是那些還沒(méi)有被人工改變，諸如定點(diǎn)誘變的序列。一旦確證天然DNA序列，則具天然DNA序列的DNA分子可以化學(xué)合成或利用本領(lǐng)域已知和重組DNA程序產(chǎn)生。如這里所用，天然植物DNA序列是可以從非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織中分離的序列。如這里所用，天然煙草DNA序列是可以從非轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞或組織中分離的序列。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，或“轉(zhuǎn)錄盒”，沿5’至3’轉(zhuǎn)錄的方向包括這里所討論的啟動(dòng)子，這里所討論的與該啟動(dòng)子可操作性地結(jié)合的DNA序列，和，可選擇的，包含RNA聚合酶終止信號(hào)和多聚腺苷酸酶多聚腺苷酸化信號(hào)在內(nèi)的終止序列。所有的這些調(diào)節(jié)區(qū)應(yīng)該能夠在待轉(zhuǎn)化組織的細(xì)胞中操作。任何合適的終止信號(hào)可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明任務(wù)，實(shí)例包括，但并不受限于，胭脂氨酸合酶(nos)終止子，章魚堿合酶(ocs)終止子，CaMV終止子，或與轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)來(lái)自同一基因或來(lái)自不同基因的天然終止信號(hào)。見(jiàn)，例如，Rezian等(1988)見(jiàn)上，和Rodermel等(1988)，見(jiàn)上。
術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”用在這里，是指一個(gè)DNA分子的諸DNA序列連接在一起的方式能使得一個(gè)DNA序列的功能受另一個(gè)影響。因此，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響DNA的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子即可操作性地連接著該DNA(即，該DNA在該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下)。啟動(dòng)子被稱為“DNA的上游區(qū)”，后者反過(guò)來(lái)被稱為啟動(dòng)子的“下游區(qū)”。
轉(zhuǎn)錄盒可被提供為DNA構(gòu)建體，其中還有至少一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)。便利起見(jiàn)，它通常有在大腸桿菌中具有功能的復(fù)制系統(tǒng)，諸如ColE1，pSC101，pACYC184，或諸如此類。這樣，在每次操作后，都可以對(duì)所得構(gòu)建體進(jìn)行克隆，測(cè)序，并確定出操作的正確性。此外還可以有或者僅有廣泛宿主范圍的復(fù)制系統(tǒng)，諸如P-1非相容性質(zhì)粒的復(fù)制系統(tǒng)，例如pRK290。除了復(fù)制系統(tǒng)之外，經(jīng)常至少還要有一個(gè)標(biāo)記存在，它可在一或多宿主中發(fā)揮作用，或者針對(duì)各種宿主有各不相同的標(biāo)記。也就是說(shuō)，可以有一種標(biāo)記用于原核宿主篩選，而另有另一種標(biāo)記用于在真核宿主，特別是植物宿主中的篩選。標(biāo)記物可以是針對(duì)殺生物劑(諸如抗生素，毒素，重金屬，等等)的保護(hù)作用；可以提供互補(bǔ)，即通過(guò)給營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)能力；或者可以通過(guò)在植物體中產(chǎn)生新化合物從而提供可見(jiàn)的表型。
通過(guò)限制性酶切合適的復(fù)制系統(tǒng)并插入特定構(gòu)建體或片段至適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)，可以依次導(dǎo)入包括多種構(gòu)建體、轉(zhuǎn)錄盒、標(biāo)記等等的多樣性片段。連接和克隆之后，DNA構(gòu)建體可以分離出來(lái)，用于下一步操作。所有這些技術(shù)被充分示范于文獻(xiàn)中，如J.Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(第二版，1989)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)中的范例。
可以用來(lái)將帶有本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到植物組織中的載體包括農(nóng)桿菌載體和彈射載體(ballistic vector)，以及適于DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的載體。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指整合有編碼序列有效表達(dá)所必需信號(hào)的DNA序列區(qū)。這包括可與RNA聚合酶結(jié)合的序列但并不僅限于此類序列，并且可以包括可與其它調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的區(qū)域和涉及蛋白翻譯控制的區(qū)域，并可包括編碼序列。
執(zhí)行本發(fā)明所用啟動(dòng)子可以是具組成性活性的啟動(dòng)子。多種具組成性活性并且可在植物中操作的啟動(dòng)子已經(jīng)可以獲得。優(yōu)選的實(shí)例是在大多數(shù)植物組織中組成性表達(dá)的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。或者，如以下進(jìn)一步詳細(xì)解釋的那樣，啟動(dòng)子可以是根特異性啟動(dòng)子或根皮層特異性啟動(dòng)子。
利用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)出反義序列。見(jiàn)，例如，Cornelissen等，“轉(zhuǎn)基因煙草中RNA水平和翻譯效率皆被反義RNA所降低”，核酸研究(Nucleic Acids Res.17，pp.833-43(1989)；Rezaian等，“利用轉(zhuǎn)基因植物中黃瓜花葉病毒反義RNA評(píng)估病毒的控制”。植物分子生物學(xué)(Plant MolecularBiology)11，pp.463-71(1988)；Rodermel等，“核-器官相互作用核反義基因抑制轉(zhuǎn)基因煙草植物中核酮糖二磷酸羧化酶水平”，細(xì)胞(Cell)，55，pp.673-81(1988)；Smith等，“反義RNA抑制轉(zhuǎn)基因西紅柿中聚半乳糖醛酸基因表達(dá)”，自然，334，pp.724-26(1988)；Van der Krol等，“轉(zhuǎn)基因植物中反義查耳酮合酶基因抑制花色素形成”，自然，333，pp.866-69(1988)。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞和植物中優(yōu)選使用CaMV 35S啟動(dòng)子表達(dá)QPRT酶。利用CaMV啟動(dòng)子在煙草根部表達(dá)其它重組基因已經(jīng)被很好地描述過(guò)(Lam等，“定點(diǎn)突變改變了體外因子結(jié)合，并改變了轉(zhuǎn)基因植物中的啟動(dòng)子表達(dá)模式”，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，86，pp.7890-94(1989)；Poulsen等，”分析5’上游序列以選擇性表達(dá)煙草白花丹(plumbaginifolia)rbcS-8B基因”，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)，214，pp.16-23(1988))。
其它僅在根組織中有活性的啟動(dòng)子(根特異性啟動(dòng)子)也特別適合用于本發(fā)明方法。見(jiàn)，例如，Conkling等的美國(guó)專利號(hào)No.5,459,252；Yamamoto等，植物細(xì)胞，3371(1991)。也可用TobRD2根皮層特異性啟動(dòng)子。見(jiàn)，例如由Conkling等寄交的美國(guó)專利申請(qǐng)SN08/508,786；PCT WO9705261。這里陳述的所有專利均全文引入作文參考。
用于產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞和植物的QPRT酶重組DNA分子和載體可以進(jìn)一步含有顯性篩選標(biāo)記基因。煙草中可用的適當(dāng)顯性篩選標(biāo)記特別包括編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的抗生素抗性基因。另外為眾人所知適于煙草中應(yīng)用的顯性篩選標(biāo)記是編碼抗氨甲蝶呤的二氫葉酸還原酶的突變型二氫葉酸還原酶基因。含有合適抗生素抗性基因的DNA載體和相應(yīng)的抗生素可從商業(yè)途徑獲得。
將混合細(xì)胞群體涂板于含合適濃度抗生素(或正常情況下對(duì)煙草細(xì)胞的有毒的其它化合物)的培養(yǎng)基中，所選用的顯性篩選標(biāo)記基因產(chǎn)物產(chǎn)生出抗性，從而可以從眾多未轉(zhuǎn)化細(xì)胞群中篩選出轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞。因此，僅僅那些已轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞才能幸存并增殖。
本發(fā)明產(chǎn)生重組植物的方法，一般地，首先涉及提供一種可再生的植物細(xì)胞(此植物細(xì)胞通常屬于可再生的組織)。然后用包含有本發(fā)明轉(zhuǎn)錄盒(如這里所述)的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該植物細(xì)胞，并且從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中再生出重組植物。如以下所解釋，執(zhí)行轉(zhuǎn)化步驟的技術(shù)在本領(lǐng)域已知，包括但并不限于用攜帶轉(zhuǎn)錄盒的微顆粒轟擊植物細(xì)胞，用含有攜帶轉(zhuǎn)錄盒的Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌感染細(xì)胞，或任意適于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的其它技術(shù)。
可用來(lái)執(zhí)行本發(fā)明的多種農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)已為人知。例如美國(guó)專利號(hào)4,459,355公開(kāi)了一種利用含Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌株系轉(zhuǎn)化易感性植物，包括雙子葉植物的方法。美國(guó)專利號(hào)No.4,795,855中公開(kāi)了利用農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化木本植物。另外，Schilperoort等擁有的美國(guó)專利4,940,838號(hào)公開(kāi)了一種對(duì)于執(zhí)行本發(fā)明有用的二元農(nóng)桿菌載體(即，其中，農(nóng)桿菌含有的一種質(zhì)粒具Ti質(zhì)粒的Vir區(qū)但無(wú)T區(qū)，而第二種質(zhì)粒具T區(qū)但無(wú)Vir區(qū))。
攜帶本發(fā)明DNA構(gòu)建體的微顆粒適于植物細(xì)胞的彈射(基因槍)轉(zhuǎn)化，也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物。微顆粒被射進(jìn)植物細(xì)胞以生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出植物。任何適于彈射細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法學(xué)和儀器可以應(yīng)用于本發(fā)明實(shí)踐。典型儀器和程序見(jiàn)Sanford和Wolf的美國(guó)專利No.4945050和Christou等的美國(guó)專利號(hào)No.5,015,580。當(dāng)應(yīng)用彈射轉(zhuǎn)化程序時(shí)，可以將轉(zhuǎn)錄盒插入能夠在被轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或整合其中的質(zhì)粒上。適于此類系統(tǒng)中應(yīng)用的微顆粒實(shí)例包括1至5μM金球顆粒。DNA構(gòu)建體可以利用任何合適技術(shù)，諸如沉淀，沉積在微顆粒上。
根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的程序，利用DNA介導(dǎo)的植物細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及隨后從轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生出植物，可以將本發(fā)明DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至植物種內(nèi)。煙草原生質(zhì)體和含DNA的脂質(zhì)體的融合法或電穿孔法在本領(lǐng)域已為人所知。(Shillito等，“通過(guò)數(shù)種方法，包括電穿孔法完成雙子葉和單子葉植物原生質(zhì)體的直接基因轉(zhuǎn)化”，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，153，pp.313-36(1987))。
如這里所用，轉(zhuǎn)化是指外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，使得產(chǎn)生出穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了外源DNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
利用本領(lǐng)域眾所周知的煙草細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出完整的煙草植物。所選擇的植物再生方法要與轉(zhuǎn)化方法相容。如標(biāo)準(zhǔn)DNA分析方法應(yīng)用于受控制的雜交的后代所示，轉(zhuǎn)基因煙草植物內(nèi)QPRT酶序列的穩(wěn)定存在及其方向可以由QPRT酶序列的孟德?tīng)栠z傳學(xué)分配規(guī)律證實(shí)。從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因煙草植物后，通過(guò)常規(guī)植物育種實(shí)踐技術(shù)即可很容易地將所導(dǎo)入的DNA序列轉(zhuǎn)入其它煙草品種中，而不需要過(guò)多實(shí)驗(yàn)操作。
例如，為了分析轉(zhuǎn)基因的分離，再生轉(zhuǎn)化植物(Ro)可以生長(zhǎng)成熟，用于煙堿水平的測(cè)試，并自交產(chǎn)生出R1代植物。攜帶轉(zhuǎn)基因的R1代植物有一部分對(duì)于轉(zhuǎn)基因而言是純合的。為了確認(rèn)純合R1代植物，轉(zhuǎn)基因R1植物生長(zhǎng)至成熟并自交。純合R1植物產(chǎn)生的R2子代中每個(gè)都攜有轉(zhuǎn)基因；而雜合R1植物子代發(fā)生3∶1分離。
因?yàn)闊焿A作為天然殺蟲(chóng)劑可以幫助保護(hù)煙草植物免于病蟲(chóng)害侵襲。因此可能會(huì)需要用可賦予對(duì)昆蟲(chóng)傷害的保護(hù)作用的轉(zhuǎn)基因(諸如蘇云金芽孢桿菌)再轉(zhuǎn)化通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的低或無(wú)煙堿植物。
本發(fā)明方法可應(yīng)用的優(yōu)選植物是煙草種或煙草，包括煙草(N.tabacum)，黃花煙草和N.glutinosa。可以利用任意煙草株系或品種。優(yōu)選已經(jīng)具低煙堿含量的株系，諸如Nic1/Nic2雙突變體。
能夠隨之進(jìn)行克隆繁殖(無(wú)論是通過(guò)器官發(fā)生或是通過(guò)胚胎發(fā)生)的任意植物組織，皆可以利用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化。術(shù)語(yǔ)“器官發(fā)生”，用在此處，意指由分生組織中央?yún)^(qū)連續(xù)有序地發(fā)育形成莖和根的過(guò)程；術(shù)語(yǔ)“胚胎發(fā)生”，用在這里，意指從體細(xì)胞或配子中以協(xié)調(diào)一致的方式(不是連續(xù)有序)發(fā)育形成莖和根的過(guò)程。選擇的特別組織依賴于可得到的克隆繁殖系統(tǒng)，并最好適于待轉(zhuǎn)化的特定種。典型組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、愈傷組織、已存在分生組織(例如，頂端分生組織，腋芽，和根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。
本發(fā)明植物可以有多種形式。植物可以是已轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；可以是克隆轉(zhuǎn)化體(例如，所有細(xì)胞均被轉(zhuǎn)化而含有轉(zhuǎn)錄盒)；可以包括轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化組織的移植體(例如，柑桔種中轉(zhuǎn)化的根砧木上嫁接著末轉(zhuǎn)化的接穗)。轉(zhuǎn)化植物可以通過(guò)多種方式進(jìn)行增殖，諸如，克隆增殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例如首代(或T1代)已轉(zhuǎn)化植物可以自交產(chǎn)生純合第二代(或T2代)轉(zhuǎn)化植物，而T2代植物可通過(guò)經(jīng)典育種方法進(jìn)一步增殖。顯性篩選標(biāo)記(諸如nptII)可以與轉(zhuǎn)錄盒結(jié)合，以幫助育種。
鑒于前文，很明顯，可以應(yīng)用于本發(fā)明實(shí)踐的植物包括煙草屬的那些種。
熟悉以上所述重組DNA方法的那些人將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以利用全長(zhǎng)QPRT酶cDNA分子或全長(zhǎng)QPRT酶染色體基因，以有義的方向連接適當(dāng)?shù)目刹僮鬟B接的調(diào)節(jié)序列，構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞和植物。(具本領(lǐng)域技能的那些人也會(huì)認(rèn)識(shí)到，以有義方向存在的基因表達(dá)所需的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列除了以上所述的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化/轉(zhuǎn)錄終止序列之外，還包括任意一種已知的真核翻譯起始序列)。此類轉(zhuǎn)化煙草植物具QPRT酶水平增加的特征，并且由此具有比對(duì)照未轉(zhuǎn)化煙草植物更高煙堿含量的特征。
因此，應(yīng)該不難理解，利用QPRT酶DNA序列減少或增加QPRT酶水平，并由此減少或增加煙草植物中煙堿含量，皆囊括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
如這里所用，谷物包括本發(fā)明植物和相同屬內(nèi)、共同種植于農(nóng)田中的多種植物。“農(nóng)田”意指普通的土地或溫室。由此，本發(fā)明提供產(chǎn)生與同種和變種的未轉(zhuǎn)化植物相似農(nóng)作物相比具改變的QPRT酶活性并由此具增加或減少煙堿水平的農(nóng)作物的方法。
以下實(shí)施例是為了具體示例本發(fā)明，并且并不構(gòu)成受限因素。
實(shí)施例分離及測(cè)序?qū)obRD2 cDNA(Conkling等，植物生理，93，1203(1990))進(jìn)行測(cè)序并在這里作為SEQ ID No.1列出，其推斷的氨基酸序列為SEQ IDNo.2。所推斷的氨基酸序列預(yù)測(cè)為胞質(zhì)蛋白。盡管植物QPRT酶基因還未被報(bào)道，將NtPT1氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相比較(圖3)，顯示與某些細(xì)菌類和其它蛋白有有限序列同源性；喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)活性顯示存在于蘇云金芽孢桿菌，大腸桿菌和煙草基因中。編碼QPRT酶的NtQPT1與可能代表部分?jǐn)M南芥QPRT酶基因的擬南芥EST(表達(dá)序列標(biāo)記)序列(Genbank接受號(hào)F20096)編碼的推斷多肽片段具相似性。
實(shí)施例2原位雜交為了確定多種根組織中TobRD2 mRNA轉(zhuǎn)錄物的空間分布，在未轉(zhuǎn)化植物中進(jìn)行原位雜交。利用Meyerowitz，植物分子生物學(xué)公報(bào)(Plant Mol.Bio.Rep.)5，242(1987)和Smith等，植物分子生物學(xué)公報(bào)，5，237(1987)所述技術(shù)，利用TobRD2反義鏈與根組織中的TobRD2 mRNA進(jìn)行原位雜交。七天齡煙草(Nicotania tabacum)幼苗的根在磷酸緩沖的戊二醛中固定，包埋于Paraplast Plus(Monoject有限公司，圣·路易斯，密蘇里州)中，并切片，每片厚8mm，以獲得合適的橫切和縱切切片。在35S-ATP存在下體外合成的反義TobRD2轉(zhuǎn)錄物用作探針。標(biāo)記RNA經(jīng)堿水解產(chǎn)生平均長(zhǎng)為100至200堿基片段供使用。
雜交在50％甲酰胺中于42℃進(jìn)行16小時(shí)，每毫升雜交溶液中含5×106cpm標(biāo)記RNA。曝光后，切片經(jīng)處理，于明暗場(chǎng)顯微鏡下觀察。
雜交信號(hào)定位于根部的皮層細(xì)胞(結(jié)果未附)。相同部位的明和暗場(chǎng)圖像的比較，可將TobRD2轉(zhuǎn)錄物定位于根皮層的薄壁組織細(xì)胞。在表皮層或中柱層沒(méi)有觀察到雜交信號(hào)。
實(shí)施例3Nic1和Nic2煙草突變體中TobRD2 mRNA水平及與煙堿水平的相關(guān)性檢測(cè)Nic1和Nic2突變體煙草植物中的TobRD2穩(wěn)態(tài)mRNA水平。Nic1和Nic2已知可調(diào)節(jié)喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性和腐敗甲基轉(zhuǎn)移酶活性，并為煙堿產(chǎn)生途徑中的共顯性調(diào)節(jié)子。本結(jié)果圖示于圖5A和圖5B中，顯示了TobRD2表達(dá)受Nic1和Nic2的調(diào)節(jié)。
從野生型Burley21煙草植物(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)根部；Nic1-Burley21(nic1/nic1 Nic2/Nic2)根部；Nic2-Burley21(Nic1/Nic1 nic2/nic2)根部；和Nic1-Nic2-Burley21(nic1/nic1 nic2/nic2)根部分離RNA。
四種Burley21株系(nic)種子在土壤中生長(zhǎng)1個(gè)月后，轉(zhuǎn)移至溫室的含充氣培養(yǎng)液的水培室中1個(gè)月。這些株系除兩個(gè)低煙堿位點(diǎn)外均為等基因，具Nic1/Nic1 Nic2/Nic2，Nic1/Nic1 nic2/nic2，nic1/nic1 Nic2/Nic2，nic1/nic1 nic2/nic2基因型。從每基因型種中收獲約20株植物的根并集合在一起用于RNA分離。將每種基因型的總RNA(1μg)加樣于含1.1M甲醛的1％瓊脂糖膠上，電泳后依照Sambrook等(1989)方法轉(zhuǎn)至尼龍膜上。用32P標(biāo)記的TobRD2cDNA片段作探針與膜雜交。利用光密度測(cè)定法得到TobRD2轉(zhuǎn)錄子的相對(duì)強(qiáng)度。圖5(實(shí)心圖標(biāo))顯示了四種基因型中每一種的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平(相對(duì)于Nic1/Nic1 Nic2/Nic2而言)。陰影圖標(biāo)顯示了四種基因型的相對(duì)煙堿水平(與Nic1/Nic1 Nic2/Nic2相比)。
圖5利用野生型Burley21(Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)中發(fā)現(xiàn)的水平作對(duì)比量，比較了相對(duì)的穩(wěn)態(tài)TobRD2 mRNA水平。Nic1/Nic2雙突變體中TobRD2 mRNA水平大約為野生型的25％。圖5B進(jìn)一步比較了本實(shí)施例中所研究的煙草近等基因株系間的煙堿相對(duì)水平(實(shí)心圖標(biāo)顯示TobRD2轉(zhuǎn)錄物水平；陰影圖標(biāo)顯示煙堿水平)。煙堿水平與TobRD2轉(zhuǎn)錄物水平間有很近的相關(guān)性。
實(shí)施例4去梢對(duì)TobRD2 mRNA水平的影響本領(lǐng)域眾所周知，煙草植物的花頂去除(去梢)后會(huì)促進(jìn)根部生長(zhǎng)并增加該植物葉片中的煙堿含量。植物去梢是商業(yè)化煙草栽培實(shí)踐中的標(biāo)準(zhǔn)方法，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易確定在已知生長(zhǎng)條件下對(duì)目標(biāo)煙草植物去梢的最佳時(shí)間。
煙草植物(N.tabacum SR1)種子生長(zhǎng)于土壤中1個(gè)月后轉(zhuǎn)移至含沙的培養(yǎng)罐中。在溫室里植物再生長(zhǎng)兩個(gè)月至它們開(kāi)始開(kāi)花。除去四株植物的花頂和兩節(jié)(去梢)。在指示時(shí)間之后從每株植物收集部分根，用于RNA抽提。對(duì)照植物沒(méi)有去梢。對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總RNA(1μg)經(jīng)含1.1M甲醛的1％瓊脂糖凝膠電泳后，依Sambrook等(1989)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)尼龍膜。用32P標(biāo)記的TobRD2 cDNA片段作探針與膜雜交。TobRD2轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)強(qiáng)度經(jīng)光密度測(cè)定法測(cè)出。圖6顯示了每個(gè)時(shí)間點(diǎn)去梢(實(shí)心圖標(biāo))或未去梢(陰影格圖標(biāo))的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平(與0時(shí)相比)。
24小時(shí)后根組織的相對(duì)TobRD2水平被確定；結(jié)果圖示于圖6(實(shí)心圖標(biāo)顯示去梢植物中TobRD2轉(zhuǎn)錄物水平；陰影格圖標(biāo)顯示未去梢對(duì)照的TobRD2轉(zhuǎn)錄物水平。煙草植物去梢6小時(shí)后，去梢植物中TobRD2的mRNA水平大約增加8倍；在同時(shí)期的對(duì)照植物中無(wú)可見(jiàn)的增加。
實(shí)施例5SEQ ID No.1 DNA對(duì)缺乏QPRT酶的細(xì)菌突變體的互補(bǔ)作用大腸桿菌株系TH265是喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺失突變體(nadC-)，因此不能在無(wú)煙酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
利用含SEQ ID No.1 DNA的表達(dá)載體(pWS161)轉(zhuǎn)化TH265細(xì)胞，或僅用表達(dá)載體(pKK233)轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化細(xì)菌的生長(zhǎng)與TH265(pKK233)轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)作比較，以及與未轉(zhuǎn)化TH265 nadC-突變體作比較。比較在ME基本培養(yǎng)基(缺少煙酸)和添加煙酸的ME基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。
具QPRT酶突變(nadC)的大腸桿菌株系，TH265，由K.T.Hughes博士(Hughes等，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bact.)175479(1993))惠贈(zèng)。細(xì)胞保存于LB培養(yǎng)基上，并依Sambrook等(1989)所述方法制備感受態(tài)細(xì)胞。在pKK2233(Brosius，1984)中構(gòu)建含有處于Tac啟動(dòng)子控制下的TobRD2 cDNA的表達(dá)質(zhì)粒。所得質(zhì)粒，pWS161，被轉(zhuǎn)進(jìn)TH265細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞然后鋪板于基本培養(yǎng)基(Vogel和Bonner，1956)瓊脂平板上，平板上分別添加或不添加煙酸(0.0002％)作為添加劑。TH265細(xì)胞本身和轉(zhuǎn)有pKK2233的TH265分別也鋪板于類似平板上用作對(duì)照。
結(jié)果見(jiàn)圖4。僅有轉(zhuǎn)有SEQ ID No.1 DNA的TH265細(xì)胞可在缺乏煙酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，TH265細(xì)菌細(xì)胞中SEQ ID No.1DNA的表達(dá)可賦予這些細(xì)胞NadC+表型，證實(shí)這個(gè)序列編碼QPRT酶。名稱TobRD2也變成NtQPT1。
實(shí)施例6煙草植物的轉(zhuǎn)化將SEQ ID No.1 DNA序列以反義的方向與植物啟動(dòng)子(CaMV35S或TobRD2根皮層特異性啟動(dòng)子)可操作連接，以產(chǎn)生兩種不同DNA盒CaMV35S啟動(dòng)子/反義SEQ ID No.1和TobRD2啟動(dòng)子/反義SEQ IDNo.1。
野生型煙草株系和低煙堿煙草株系被選擇用于轉(zhuǎn)化，例如，野生型Burley21煙草(Nic1+/Nic2+)和純合nic1-/nic2-Burley21。利用每種DNA盒轉(zhuǎn)化來(lái)自每種株系的煙草植物細(xì)胞。利用農(nóng)桿菌載體，例如，帶有Ti邊界序列和nptII基因(賦予對(duì)卡那霉素的抗性，并在nos啟動(dòng)子(nptII)的控制之下)的農(nóng)桿菌雙元載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)篩選后再生成為轉(zhuǎn)基因煙草植物(Ro)。Ro植物生長(zhǎng)至成熟后檢測(cè)其煙堿水平；與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比，轉(zhuǎn)化煙草植物一個(gè)亞類顯示明顯更低的煙堿水平。
使Ro植物自交，對(duì)R1子代中轉(zhuǎn)基因的分離情況進(jìn)行分析。R1子代生長(zhǎng)至成熟后使之自交；R2子代的轉(zhuǎn)基因分離情況顯示哪些R1代植物中的轉(zhuǎn)基因是純合的。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)者Conkling，Mark A.
Mendu，NandiniSong，Wen(ii)發(fā)明名稱喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的調(diào)節(jié)(iii)序列數(shù)目4(iv)通訊地址(A)收信人Kenneth Sibley，Bell Seltzer Park & Gibson(B)街道郵政信箱34009(C)城市Charlotte(D)州北卡羅來(lái)納州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編28234(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(viii)代理人/代理信息(A)姓名Sibley，Kenneth D.
(B)注冊(cè)號(hào)31，665(C)參考/文檔號(hào)5051-338P(ix)電信信息(A)電話919-420-2200
(B)傳真919-881-3175(2)SEQ ID No.1序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1399個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置52..1104(xi)序列描述SEQ ID No.1CAAAAACTAT TTTCCACAAA ATTCATTTCA CAACCCCCCC AAAAAAAAAC C ATG TTT 57Met Phe1AGA GCT ATT CCT TTC ACT GCT ACA GTG CAT CCT TAT GCA ATT ACA GCT 105Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile Thr Ala5 10 15CCA AGG TTG GTG GTG AAA ATG TCA GCA ATA GCC ACC AAG AAT ACA AGA 153Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn Thr Arg20 25 30GTG GAG TCA TTA GAG GTG AAA CCA CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT TTA 201Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr Asp Leu35 40 45 50AAG GAA GTT ATG AAA CTT GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG AAT TTA GGA 249Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn Leu Gly55 60 65GAT GTG ACT TGT AAG GCG ACA ATT CCT CTT GAT ATG GAA TCC GAT GCT 297Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Leu Asp Met Glu Ser Asp Ala70 75 80CAT TTT CTA GCA AAG GAA GAC GGG ATC ATA GCA GGA ATT GCA CTT GCT 345His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala Leu Ala85 90 95GAG ATG ATA TTC GCG GAA GTT GAT CCT TCA TTA AAG GTG GAG TGG TAT 393Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu Trp Tyr100 105 110GTA AAT GAT GGC GAT AAA GTT CAT AAA GGC TTG AAA TTT GGC AAA GTA 441Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Val115 120 125 130CAA GGA AAC GCT TAC AAC ATT GTT ATA GCT GAG AGG GTT GTT CTC AAT 489Gln Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val Leu Asn135 140 145TTT ATG CAA AGA ATG AGT GGA ATA GCT ACA CTA ACT AAG GAA ATG GCA 537Phe Met Gln Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu Met Ala150 155 160GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC ATC TTG GAG ACT AGG AAA ACT GCT CCT 585Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro165 170 175GGA TTA CGT TTG GTG GAT AAA TGG GCG GTA TTG ATC GGT GGG GGG AAG 633Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly Gly Lys180 185 190AAT CAC AGA ATG GGC TTA TTT GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC 681Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp Asn His195 200 205 210ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT CTA AAA TCT GTG GAT CAG 729Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gln215 220 225TAT TTG GAG CAA AAT AAA CTT CAA ATA GGG GTT GAG GTT GAA ACC AGG 777Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln Ile Gly Val Glu Val Glu Thr Arg230 235 240ACA ATT GAA GAA GTA CGT GAG GTT CTA GAC TAT GCA TCT CAA ACA AAG 825Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Thr Lys245 250 255ACT TCG TTG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GTT GTT CCA TTA TCT 873Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser260 265 270AAC GGA GAT ATT GAT GTA TCC ATG CTT AAG GAG GCT GTA GAA TTG ATC 921Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu Leu Ile275 280 285 290AAT GGG AGG TTT GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GTT ACC CTT GAA ACA 969Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr295 300 305GTA CAC AAG ATT GGA CAA ACT GGT GTT ACC TAC ATT TCT AGT GGT GCC 1017Val His Lys Ile Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser Gly Ala310 315 320CTG ACG CAT TCC GTG AAA GCA CTT GAC ATT TCC CTG AAG ATC GAT ACA 1065Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile Asp Thr325 330 335GAG CTC GCC CTT GAA GTT GGA AGG CGT ACA AAA CGA GCA TGAGCGCCAT 1114Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala340 345 350TACTTCTGCT ATAGGGTTGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT1174CATTTTACTA GTTGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA1234TTGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCTTTTCC AACCTTATTG CTTGAGTTGG TAATTTCATT1294ATAGCTTTGT TTTCATGTTT CATGGAATTT GTTACAATGA AAATACTTGA TTTATAAGTT1354TGGTGTATGT AAAATTCTGT GTTACTTCAA ATATTTTGAG ATGTT1399(2)SEQ ID No.2序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度351個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID No.2Met Phe Arg Ala Ile Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile1 5 10 15Thr Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn20 25 30Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr35 40 45Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn50 55 60Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Leu Asp Met Glu Ser65 70 75 80Asp Ala His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala85 90 95Leu Ala Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu100 105 110Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly115 120 125Lys Val Gln Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val130 135 140Leu Asn Phe Met Gln Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu145 150 155 160Met Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr165 170 175Ala Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly180 185 190Gly Lys Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp195 200 205Asn His Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val210 215 220Asp Gln Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln Ile Gly Val Glu Val Glu225 230 235 240Thr Arg Thr Ile Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gln245 250 255Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro260 265 270Leu Ser Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu275 280 285Leu Ile Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu290 295 300Glu Thr Val His Lys Ile Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser305 310 315 320Gly Ala Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile325 330 335Asp Thr Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala340 345 350(2)SEQ ID No.3序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1053個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.3ATGTTTAGAG CTATTCCTTT CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG 60TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG 120AAACCACCAG CACACCCAAC TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA 180GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT AAGGCGACAA TTCCTCTTGA TATGGAATCC 240GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG 300ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA 360GTTCATAAAG GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG CTTACAACAT TGTTATAGCT 420GAGAGGGTTG TTCTCAATTT TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA 480ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTGGATTA 540CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA 600TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA AATAAACTTC AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG CATCTCAAAC AAAGACTTCG 780TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 960GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC1020GCCCTTGAAG TTGGAAGGCG TACAAAACGA GCA 105權(quán)利要求
1.包含選自下組的序列的一種分離DNA分子(a)SEQ ID No.1；(b)編碼具SEQ ID No.2序列的酶的DNA序列；(c)可與以上(a)或(b)的分離DNA雜交并編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA序列；和(d)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使得與以上(a)，(b)，或(c)DNA不同的DNA序列。
2.一種含有表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體，其中構(gòu)建體按5’至3’方向含有植物細(xì)胞內(nèi)可操作的啟動(dòng)子和根據(jù)權(quán)利要求1的DNA區(qū)段，所述DNA區(qū)段置于所述啟動(dòng)子的下游，并與之可操作相連。
3.包含表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體從5’到3’方向包含植物啟動(dòng)子和權(quán)利要求1的DNA區(qū)段，所述DNA區(qū)段置于所述啟動(dòng)子的下游并與之可操作相連，并且是反義方向。
4.從5’到3’方向包含在植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和編碼植物、喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA的DNA構(gòu)建體，所述DNA與所述啟動(dòng)子可操作相連。
5.從5’到3’方向包含在植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和編碼植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA的DNA構(gòu)建體，所述DNA以反義方向與所述啟動(dòng)子可操作相連。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4或5的DNA構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中具組成性活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4或5的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子具植物根組織細(xì)胞中的選擇性活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4或5的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子具植物根皮層組織細(xì)胞中的選擇性活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4或5的DNA構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體進(jìn)一步包括質(zhì)粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4或5的DNA構(gòu)建體，它是由植物轉(zhuǎn)化載體攜帶的。
11.由植物轉(zhuǎn)化載體攜帶的權(quán)利要求2、3、4或5的DNA構(gòu)建體，其中植物轉(zhuǎn)化載體是根瘤農(nóng)桿菌載體。
12.含有權(quán)利要求2，3，4或5的DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。
13.含有權(quán)利要求12的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
14.具有序列SEQ ID No.2的肽。
15.由選自下組的DNA序列編碼的肽(a)SEQ ID No.1；(b)可與以上(a)的分離DNA雜交并編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA序列；和(c)因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與以上的(a)或(b)DNA有差異的DNA序列。
16.用于產(chǎn)生喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)有所降低的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所述方法包括提供一類已知表達(dá)喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞；提供異源DNA構(gòu)建體，此構(gòu)建體從5’至3’方向含有植物細(xì)胞內(nèi)可操作的啟動(dòng)子和包含編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的序列一部分的DNA，所述DNA可操作性地與所述啟動(dòng)子連接；和用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述植物細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比具減少的QPRT酶表達(dá)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述包含編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的序列一部分的DNA處于反義方向。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述包含編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的序列一部分的DNA處于有義方向。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述植物細(xì)胞是煙草。
20.權(quán)利要求16的方法，其中進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述啟動(dòng)子具組成性活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述啟動(dòng)子具植物根組織細(xì)胞中的選擇性活性。
23.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述啟動(dòng)子具植物根皮層組織細(xì)胞中的選擇性活性。
24.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟是通過(guò)用攜有所述DNA構(gòu)建體的微顆粒轟擊所述植物細(xì)胞而進(jìn)行的。
25.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟是通過(guò)利用含攜帶有所述DNA構(gòu)建體的Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌感染所述植物細(xì)胞而進(jìn)行的。
26.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草種子的方法，包括從由權(quán)利要求19的方法得到的轉(zhuǎn)基因煙草植物中收集種子。
27.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述異源DNA序列與所述植物細(xì)胞中表達(dá)的所述喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶信使RNA(QPRT mRNA)在選自下組的區(qū)域內(nèi)互補(bǔ)(a)所述QPRT mRNA的5’-非翻譯序列；(b)所述QPRT mRNA的3’-非翻譯序列；和(c)所述QPRT mRNA的翻譯區(qū)。
28.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述異源DNA序列與所述植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所述喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶信使RNA的至少15個(gè)核苷酸互補(bǔ)。
29.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述異源DNA序列與所述植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所述喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶信使RNA的至少200個(gè)核苷酸互補(bǔ)。
30.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述異源DNA序列包括選自權(quán)利要求1的DNA序列的喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶編碼序列。
31.相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物，其喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)減少的煙草種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物含有包括下述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞外源DNA構(gòu)建體，其沿5’至3’方向包含在所述植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和含有植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的編碼DNA序列一個(gè)區(qū)段的DNA，所述DNA與所述啟動(dòng)子可操作性連接；所述植物與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比其QPRT酶表達(dá)有所降低。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的含有喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的編碼DNA序列一個(gè)區(qū)段的DNA區(qū)段是以反義方向存在的。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述含有喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA的編碼DNA序列一個(gè)區(qū)段的DNA區(qū)段是以有義方向存在的。
34.相對(duì)于未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物，其喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)降低的煙草轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求31的植物的子代。
35.相對(duì)于未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物，其喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)降低的煙草轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求31的植物或其子代。
36.包括權(quán)利要求31的多種植物、共同種植于農(nóng)田中的谷物。
37.用來(lái)減少植物細(xì)胞中喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的方法，所述方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了外源DNA的植物細(xì)胞，其中所述外源DNA的轉(zhuǎn)錄鏈與所述細(xì)胞的內(nèi)源喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶mRNA互補(bǔ)，所述互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄降低了所述喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)。
38.葉片中煙堿水平降低的煙草植物的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)煙草植物或其子代植物，其中所述植物包含含有DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，所述構(gòu)建體包含在所述植物中具功能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和與之可操作性連接在一起的外源DNA序列，所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄鏈與所述細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶信使RNA互補(bǔ)。
39.喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)有所提高的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的制備方法，所述方法包括提供一種已知表達(dá)喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞；提供一種異源DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體沿5’至3’方向包含在植物細(xì)胞內(nèi)可操作的啟動(dòng)子和編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA序列，所述DNA序列與所述啟動(dòng)子可操作連接；并且用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比所述植物細(xì)胞具增加的QPRT酶表達(dá)。
40.與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比，其喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)有所增加的煙草種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中含有外源DNA構(gòu)建體，其沿5’至3’方向含有在所述植物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子和編碼植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA序列，所述DNA與所述啟動(dòng)子可操作性連接；所述植物與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物相比具增加的QPRT酶表達(dá)。
41.相對(duì)于未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物，其喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)表達(dá)增加的煙草種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求74的植物的子代。
42.增加植物細(xì)胞中喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的方法，所述方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有異源DNA的植物細(xì)胞，其中所述異源DNA編碼喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。
43.根據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中獲得所述轉(zhuǎn)化植物所用的方法包括向宿主植物細(xì)胞基因組中整合一種構(gòu)建體，該構(gòu)建體沿轉(zhuǎn)錄的方向含有在所述植物細(xì)胞中具功能的啟動(dòng)子，編碼在所述細(xì)胞中有功能的喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的DNA序列，在所述植物細(xì)胞中具功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，所述DNA序列與所述啟動(dòng)子可操作連接，由此獲得轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
44.葉片中煙堿水平有所提高的煙草植物的制備方法，所述方法包括培養(yǎng)煙草植物或其子代植物，其中所述植物包含含有一種DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，所述構(gòu)建體包含在所述植物中具功能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和與之可操作性連接的外源DNA序列，其中所述DNA序列編碼在所述細(xì)胞內(nèi)具功能的喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。
全文摘要
提供了編碼植物喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPRT酶)的DNA,以及含有該DNA的構(gòu)建體。還提供了改變喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1257542SQ98805370
公開(kāi)日2000年6月21日 申請(qǐng)日期1998年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月12日
發(fā)明者M·A·科克林格, N·蒙都, 宋文 申請(qǐng)人:北卡羅來(lái)納州大學(xué)