專利名稱：：異源蛋白的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種異源蛋白生產(chǎn)方法的改進(jìn)，其中包括經(jīng)基因操作轉(zhuǎn)化的宿主的培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
：大量的蛋白被用作藥劑，例如人血清白蛋白(以下稱為HSA)，其是血漿的一種主要蛋白成分，這樣的一些蛋白可通過體液的分級(jí)來(lái)產(chǎn)生，此種方法在原料方面會(huì)遇到一些困難，并且生產(chǎn)的制劑有很大的可能性被病毒等污染。近年來(lái)重組DNA技術(shù)的興起，使得利用微生物和細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)這些蛋白成為可能，促進(jìn)了通過基因操作來(lái)進(jìn)行異源蛋白大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)展和研究。然而，其產(chǎn)量仍舊很低且還沒有能夠得到大規(guī)模的生產(chǎn)。提高異源蛋白產(chǎn)量的方法包括向培養(yǎng)基中加入脂肪酸或其鹽以增加重組HSA產(chǎn)量的方法(以下稱為rHSA)(JP-A-4293495)，一種包括加入含有聚亞烷基二醇基團(tuán)的高濃度表面活性劑的方法(日本專利申請(qǐng)公開號(hào)平成3-500969)等等?？紤]到如此的技術(shù)背景，本發(fā)明目的在于通過特定地改進(jìn)培養(yǎng)條件來(lái)增加異源蛋白的產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)通過在含有脂肪酸或其鹽和表面活性劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)基因操作制得的產(chǎn)異源蛋白宿主能夠提高異源蛋白的產(chǎn)量，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了如下所述的。(1).一種異源蛋白的生產(chǎn)方法，包括在含有脂肪酸或其鹽和表面活性劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)基因操作制得的產(chǎn)異源蛋白宿主，且從培養(yǎng)物中收集異源蛋白。(2).如(1)所述的生產(chǎn)方法，其中的脂肪酸有10-26個(gè)碳原子。(3).如(1)所述的生產(chǎn)方法，其中的培養(yǎng)基含有一種濃度為0.01-10W/V％脂肪酸或其鹽。(4).如(1)所述的生產(chǎn)方法，其中的表面活性劑是分子量為100-100000的非離子表面活性劑。(5).如(1)所述的生產(chǎn)方法，其中的培養(yǎng)基含有濃度至多0.5g/L的表面活性劑。發(fā)明的詳述在本發(fā)明中，異源蛋白是指外來(lái)的蛋白，其不僅指宿主細(xì)胞非固有的而且指經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的?，F(xiàn)在將一種公開于已知的出版物上的異源蛋白生產(chǎn)宿主改進(jìn)，經(jīng)基因操作用于本發(fā)明，其可以不受限制只要通過基因操作改造能產(chǎn)生異源蛋白。其特定的實(shí)施例其包括細(xì)胞(例如大腸桿菌，酵母，枯草芽孢桿菌等)，動(dòng)物細(xì)胞等，其經(jīng)基因改造以產(chǎn)生一種異源蛋白。特定地，在本發(fā)明中。宿主優(yōu)選為酵母，其可為糖酵母屬或畢赤酵母屬，這些宿主的營(yíng)養(yǎng)缺陷型或抗生素敏感型也可以被使用?？蛇x擇地，啤酒糖酵母(Saccharomycecervisiae)AH22菌株其是G418敏感型菌株(a，his4，leu2，can1)，巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GTS115菌株(his4NRRL保藏號(hào)No.Y-15851，)等可被使用。產(chǎn)異源蛋白宿主產(chǎn)生的異源蛋白是不特定限定的且優(yōu)選的實(shí)施例為HSA。這些產(chǎn)異源蛋白宿主可通過已知方法或其類似的方法來(lái)制備。例如，一種產(chǎn)HSA宿主(或產(chǎn)HSA菌株)可以通過下述方法來(lái)制備，一種使用已知的HSA基因的方法，(JP-A-58-56684，JP-A-58-90515，JP-A-58-150517)，一種使用新HSA基因的方法(JP-A-62-29985，JP-A-1-98486)，一種使用一段合成信號(hào)序列(JP-A-1-240191)的方法，一種使用血清白蛋白信號(hào)序列的方法(JP-A-2-167095)，一種含有重組質(zhì)粒整合在染色體上的方法(JP-A-3-72889)，一種含有宿主的融合的方法(JP-A-3-53877)，一種包括在含有甲醇的培養(yǎng)基上突變的方法，一種利用突變子AOX2啟動(dòng)子的方法(JP-A-6-90768，JP-A-4-299984)，HSA通過枯草芽孢桿菌的表達(dá)(JP-A-62-25133)，HSA通過酵母的表達(dá)(JP-A-60-41487，JP-A-63-39576，JP-A-63-74493)，HSA通過畢赤酵母的表達(dá)(JP-A-2-104290)等等。其中，在含有甲醇的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘變的方法如下所述，一個(gè)帶有在AOX1啟動(dòng)子控制下表達(dá)HSA的轉(zhuǎn)錄單元的質(zhì)粒被導(dǎo)入一個(gè)合適的宿主的AOX1基因區(qū)域，宿主優(yōu)選為畢赤酵母，特別的是巴斯德畢赤酵母GTS115菌株通過常規(guī)方法以提供轉(zhuǎn)化子(JP-A-2-104290)。此轉(zhuǎn)化子在含有甲醇的培養(yǎng)基中有很弱的增殖能力。因此，通過公開于JP-A-4-299984中的方法，此轉(zhuǎn)化子被培養(yǎng)在含有甲醇的培養(yǎng)基上以引起誘變并且只有能夠生長(zhǎng)的菌株被恢復(fù)。在這種情況下，甲醇的濃度大約為0.0001％-5％。培養(yǎng)基可以是合成的或天然的。培養(yǎng)條件是15℃-40℃，大約是1小時(shí)-1000小時(shí)。只要用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主的培養(yǎng)基含有一種脂肪酸或其鹽，并且含有一種表面活性劑，則對(duì)與其他組分可以無(wú)其他限制，且本領(lǐng)域公知培養(yǎng)基經(jīng)常被應(yīng)用。在含有脂肪酸或其鹽和表面活性劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主能夠增加異源蛋白的產(chǎn)量。此外，宿主本身分泌的酶能抑制異源蛋白的分解。優(yōu)選的脂肪酸的實(shí)施例包括10到26個(gè)碳原子。上述脂肪酸的實(shí)施例包括飽和的和不飽和例如十四烷酸，棕櫚酸，棕櫚烯酸，油酸，叔-異油酸，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸等。這些脂肪酸的鹽是，例如堿金屬鹽如鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽等，堿土金屬鹽以及有機(jī)銨鹽，作為參考被加入到含有油酸或其鹽的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中脂肪酸的含量大約為0.01-10W/V％，優(yōu)選的為大約0.2-5W/V％。本發(fā)明中所用的表面活性劑是非離子表面活性劑優(yōu)選的為有100-100000的高分子量。上述的非離子表面活性劑的實(shí)施例包括聚亞烷基二醇(例如有平均分子量為1000-10000優(yōu)選為2000-60000的聚丙二醇)，聚氧化亞烷基共聚物(例如平均分子量為100-100000優(yōu)選為1000-30000的聚氧化亞乙基-聚氧化亞丙基共聚物)，氫化蓖麻油聚氧化亞烷基衍生物[例如氫化蓖麻油聚氧化亞乙基(20)醚，氫化蓖麻油聚氧化亞乙基(40)醚，氫化蓖麻油聚氧化亞乙基(100)醚等]，蓖麻油聚氧化亞乙基(20)醚，蓖麻油聚氧化亞乙基(40)醚，蓖麻油聚氧化亞乙基(100)醚等]，聚氧化亞乙基脫水山梨醇脂肪酸脂(例如聚氧化亞乙基脫水山梨醇一油酸脂，聚氧化亞乙基脫水山梨醇一硬脂酸酯，聚氧化亞乙基脫水山梨醇一棕櫚酸酯，聚氧化亞乙基脫水山梨醇一月桂酸酯等)，脫水山梨糖醇脂肪酸脂，烷基苯酚聚氧化亞乙基醚，聚氧化亞乙基脫水山梨醇脂肪酸脂，聚氧化亞乙基氫化蓖麻油，聚甘油脂肪酸脂等。特別地，優(yōu)選的培養(yǎng)基含有聚亞烷基二醇聚氧化亞乙基聚氧化亞丙基共聚物(Pluronic商標(biāo)等)，或聚氧化亞乙基脫水山梨醇脂肪酸脂(Tween商標(biāo)等)。培養(yǎng)基中表面活性劑的含量?jī)?yōu)選的至多為0.5g/L。培養(yǎng)基可以是合成的培養(yǎng)基或天然的培養(yǎng)基，優(yōu)選為合成的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基或液體的培養(yǎng)基，優(yōu)選為液體的培養(yǎng)基。例如，合成的培養(yǎng)基一般含有不同的糖作為碳源，尿素、銨鹽、硝酸鹽等作為氮源，不同的維生素、核苷酸等作為痕量的營(yíng)養(yǎng)素以及含有無(wú)機(jī)鹽(例如Mg，Ca，F(xiàn)e，Na，K，Mn，Co，Cu等)。培養(yǎng)基的實(shí)施例包括YNB液體培養(yǎng)基等。天然培養(yǎng)基的實(shí)施例包括YPD液體培養(yǎng)基[1％的酵母提取物(Difco生產(chǎn))，2％的細(xì)菌蛋白胨(Difco生產(chǎn))，2％的葡萄糖]。當(dāng)使用利用甲醇的宿主時(shí)，含有甲醇的培養(yǎng)基可被利用。這種情況下，甲醇的濃度優(yōu)選為約0.01-5％。本發(fā)明的培養(yǎng)基通過將脂肪酸或其鹽和表面活性劑加至傳統(tǒng)的已知培養(yǎng)基中可以很容易的來(lái)制備。其他的培養(yǎng)條件類似于那些傳統(tǒng)方法所利用的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度是，例如，15℃-40℃，一般為20℃-37℃。當(dāng)宿主為酵母時(shí)，優(yōu)選為20℃-30℃，當(dāng)宿主為細(xì)菌時(shí)，優(yōu)選為30℃-37℃。培養(yǎng)時(shí)間一般大約為1-1000小時(shí)。培養(yǎng)是通過在靜止或振蕩，攪拌或通氧的條件下分批培養(yǎng)或流加(fedbatch)培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)，優(yōu)選使用發(fā)酵罐流加培養(yǎng)。例如將高濃度的葡萄糖部分加至流加培養(yǎng)基中，避免高濃度的底物抑制影響產(chǎn)生細(xì)胞，因此就獲得了高濃度的細(xì)胞和產(chǎn)品(JP-A-3-83595)。優(yōu)選在培養(yǎng)之前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基可以為，例如，YNB液體培養(yǎng)基或YPD液體培養(yǎng)基。預(yù)培養(yǎng)的條件優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為10-100小時(shí)，溫度大約是酵母為30℃，細(xì)菌為37℃。培養(yǎng)結(jié)束后，通過已知的分離和純化方法從培養(yǎng)物中收集異源蛋白。如同此處所用的，培養(yǎng)物包括一些能夠含有異源蛋白的物質(zhì)，例如，一種培養(yǎng)物培養(yǎng)基，一種產(chǎn)異源蛋白宿主等，以及通過培養(yǎng)宿主獲得的特殊的上層清液，及其濾出液，一種細(xì)菌細(xì)胞，一種細(xì)胞等。本發(fā)明通過如下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例進(jìn)行具體地說明，但并非是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1(1)所使用的細(xì)菌菌株的制備使用突變型AOX2啟動(dòng)子[天然AOX2啟動(dòng)子(YEAST，5，167-177(1988)或Mol.Cell.Biol，9，1316-1323(1989))其中起始密碼子上游255th核苷酸從T變成C]，構(gòu)建一種用于HSA表達(dá)的pMM042質(zhì)粒且導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母GTS115以提供轉(zhuǎn)化體UHG42-3菌株(JP-A-4-29984)。(2)培養(yǎng)基的成分預(yù)培養(yǎng)，使用YPD培養(yǎng)基(2％細(xì)菌蛋白胨，1％酵母提取物，2％葡萄糖)。用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基的成分列于表1中，流加培養(yǎng)基的成分列于表2中，表1和表2中2*溶液的成分列于表3中。如同表1和表2所示，本實(shí)施例所用分批培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基的油酸成分為0.5W/V％。表1分批培養(yǎng)基的成分</tables>1生物素0.2g/L，*2見表3表2流加培養(yǎng)基的成分*2見表3表3YTM溶液的成分(3)利用發(fā)酵罐的培養(yǎng)方法①預(yù)培養(yǎng)將細(xì)菌懸浮液(1ml，大約OD540＝大約10)接種在YTM培養(yǎng)基(50ml)上在30℃條件下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。②主培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物(14ml)接入分批培養(yǎng)基(700ml)在小頸發(fā)酵罐中通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25℃，pH為5.8。AdekanolLG-109(AsahiDenkaKogyo生產(chǎn))，為一種聚氧化亞烷基表面活性劑，將其以0.4g/L加至培養(yǎng)基中。在分批培養(yǎng)中，當(dāng)酵母增殖到足夠的高濃度且甘油被消耗時(shí)，補(bǔ)料培養(yǎng)基被加入培養(yǎng)360小時(shí)以產(chǎn)生HSA產(chǎn)物。培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)物被取樣和通過下述實(shí)施例的方法測(cè)量HSA產(chǎn)物的含量。結(jié)果，含量為114％而產(chǎn)物沒加入油酸為100％時(shí)。實(shí)施例2除了補(bǔ)料培養(yǎng)基的油酸為1W/V％外，以和實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行培養(yǎng)。HSA產(chǎn)物的含量為125％。實(shí)施例3除了補(bǔ)料培養(yǎng)基的油酸為5W/V％外，以和實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行培養(yǎng)。HSA產(chǎn)物的含量為127％。實(shí)施例4除了補(bǔ)料培養(yǎng)基的表面活性劑為L(zhǎng)-61(平均分子量為2000，環(huán)氧乙烷∶氧化丙烯＝10∶90，AsahiDenkaKogyo生產(chǎn))外，其是一種聚環(huán)氧乙烷-聚氧化丙烯共聚物，以和實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行培養(yǎng)。參考例HSA濃度的檢測(cè)離心一部分回收培養(yǎng)物，在其變清后過濾上清液，接著用HPLC凝膠過濾分析進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，通過產(chǎn)異源蛋白宿主產(chǎn)生的異源蛋白的量可以增加并且宿主本身分泌的酶對(duì)異源蛋白的降解可以被抑制，由此可以增加產(chǎn)生的異源蛋白的量。本發(fā)明包括產(chǎn)異源蛋白宿主在含有脂肪酸或其鹽和一種表面活性劑的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)，且是一種容易和簡(jiǎn)單的方法。本申請(qǐng)是以在日本申請(qǐng)的專利申請(qǐng)No.9-85064為基礎(chǔ)，其內(nèi)容在此作為參考。權(quán)利要求(1).一種異源蛋白的生產(chǎn)方法，包括在含有脂肪酸或其鹽和表面活性劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)基因操作制得的產(chǎn)異源蛋白宿主，且從培養(yǎng)物中收集異源蛋白。(2).如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中的脂肪酸有10-26個(gè)碳原子。(3).如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中的培養(yǎng)基含有一種濃度為0.01-10W/V％脂肪酸或其鹽。(4).如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中的表面活性劑是分子量為100-100,000的非離子表面活性劑。(5).如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中的培養(yǎng)基含有濃度至多0.5g/L的表面活性劑。全文摘要一種異源蛋白的生產(chǎn)方法,包括在含有脂肪酸或其鹽和表面活性劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)基因操作制得的產(chǎn)異源蛋白宿主,且從培養(yǎng)物中收集異源蛋白。產(chǎn)異源蛋白宿主產(chǎn)生異源蛋白的量可以增加,此外,由于宿主本身分泌的酶對(duì)異源蛋白的降解可以被抑制,由此可以大幅度增加產(chǎn)生的異源蛋白的量。文檔編號(hào)C12N1/16GK1257549SQ98805410公開日2000年6月21日申請(qǐng)日期1998年4月3日優(yōu)先權(quán)日1997年4月3日發(fā)明者應(yīng)田豐雄,大屋智資,桑江忍,大山政男,小林薰,上村八尋申請(qǐng)人:吉富制藥株式會(huì)社