專利名稱：：植物脂肪酸環(huán)氧化酶及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明總的地涉及編碼脂肪酸環(huán)氧化酶(epoxygenase)的新遺傳序列。具體地，本發(fā)明涉及編碼如此處所定義的脂肪酸Δ12-環(huán)氧化酶的遺傳序列。更具體地，本發(fā)明提供編碼植物脂肪酸環(huán)氧化酶，優(yōu)選地是Crepispalaestina或EuphorbialagascaeΔ12-環(huán)氧化酶的遺傳序列。本發(fā)明的遺傳序列提供可改變或控制諸如酵母、霉菌、細菌、昆蟲、鳥類、哺乳動物和植物的生物中脂肪酸代謝，特別是其中將不飽和脂肪酸轉變?yōu)榄h(huán)氧化脂肪酸的代謝的方法。本發(fā)明延伸至用此遺傳序列轉化的遺傳修飾的油-富集生物和從中生成的油。由此生成的油提供了用于高效生產(chǎn)涂料、樹脂、膠、塑料、表面活性劑和潤滑劑等成本有效性原材料的方法。整個說明書及后面的權利要求書中，除非上下文另有需要，詞語“包含”或其不同時態(tài)的變體應理解為表示包括所稱的整體或一組整體但不排除任何其它整體或整體組。本說明書中由作者提及的公開文獻目錄細節(jié)收集在描述的末尾。說明書中提及的核苷酸和氨基酸序列的序列鑒定號(SEQIDNO)在目錄之后定義。發(fā)明背景從可更新的植物來源而不是從不可更新的石油化工制品生產(chǎn)用于工業(yè)用途的化學原料如脂肪酸，在世界范圍有相當大的重要性。此觀念基于保護資源對制造商和消費者有廣泛吸引力并提供發(fā)展農(nóng)業(yè)上新經(jīng)濟作物的重要機會。有不同系列的天然稀有脂肪酸并且它們已得到很好鑒定(Badam和Patil，1981；Smith，1970)。許多這些稀有脂肪酸具有工業(yè)潛力并且這引起了培育這些物種以進行特定脂肪酸農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的興趣。特別感興趣的一類脂肪酸是環(huán)氧-脂肪酸，包含其中兩個相鄰碳鍵由環(huán)氧橋連接的?；?。由于它們的高反應性，它們在涂料、樹脂、膠、塑料、表面活性劑和潤滑劑的生產(chǎn)中有大量的應用。這些脂肪酸現(xiàn)在通過植物油，主要是大豆油和亞麻籽油的化學環(huán)氧化作用生產(chǎn)，但是此方法會產(chǎn)生多元混合物和同質異能形式并需要高昂的加工費用。其他人正在嘗試培育含有環(huán)氧脂肪酸的一些野生植物(如Euphorbialagauscae，Vernoniagalamensis)成為這些油的商業(yè)來源。然而，農(nóng)學適應性和低產(chǎn)量潛力的問題嚴重限制了傳統(tǒng)植物育種和栽培方法的商業(yè)應用。重組DNA技術快速增強的精密性通過在第二種生物或物種中表達從第一種生物或物種分離的基因以賦予其新的表型，大大提高了商業(yè)上重要的工業(yè)方法的效率。更具體地，傳統(tǒng)的工業(yè)方法能通過重組DNA技術的應用變得效率更高或更具成本有效性，導致每單位成本的更大產(chǎn)量。并且，用于表達目的遺傳序列的宿主生物的適當選擇提供一般不由宿主產(chǎn)生或合成的化合物以高產(chǎn)量和純度的生產(chǎn)。但是，盡管重組DNA技術具有一般的有效性，但編碼脂肪酸代謝中重要酶的遺傳序列，特別是編碼負責合成12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸(斑鳩菊酸)和12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸等的脂肪酸Δ12-環(huán)氧化酶的基因的分離，仍然是發(fā)展合成這些脂肪酸的遺傳工程生物的主要障礙。在本發(fā)明之前，僅有有限的生化數(shù)據(jù)顯示脂肪酸環(huán)氧化酶特別是Δ12-環(huán)氧化酶的性質。但是，在Euphorbialagascae中，從亞油酸形成12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸(斑鳩菊酸)看來由細胞色素P450依賴的Δ12環(huán)氧化酶催化(Bafor等，1993；Blee等，1994)。并且，亞麻籽植物正在發(fā)育的種子具有通過內源Δ15去飽和酶將加入的斑鳩菊酸轉變?yōu)?2，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸的能力(Engeseth和Stymne，1996)。環(huán)氧脂肪酸還可通過植物組織中過氧化物依賴的過氧化物酶合成(Blee和Schuber，1990)。在導致本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人設法分離編碼對于環(huán)氧脂肪酸如12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸(斑鳩菊酸)或12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸的生產(chǎn)重要的基因的遺傳序列并將這些遺傳序列轉入高產(chǎn)的商業(yè)含油種子植物和/或其它富含油的生物。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面提供編碼脂肪酸環(huán)氧化酶的分離的核酸分子或與其互補的分離的核酸分子。本發(fā)明的第二方面提供在至少低嚴格條件下與SEQIDNO1或3或5或19或20或與其互補序列的至少20個連續(xù)核苷酸雜交的分離核酸分子。本發(fā)明進一步的方面提供包含與SEQIDNO1或3或5至少65％相同或與SEQIDNO19或20或其互補序列中至少200個連續(xù)核苷酸至少75％相同的核苷酸序列的分離核酸分子。本發(fā)明進一步的方面提供以正義或反義方向包含與啟動子序列可操作連接的上述分離核酸分子的遺傳構建體。本發(fā)明進一步的方面提供改變細胞、組織、器官或生物中環(huán)氧脂肪酸水平的方法，該方法包括在足以使其中的環(huán)氧脂肪酸水平增加或減少的條件下使包含上述分離核酸分子的正義、反義、核酶或共抑制分子在所述細胞中表達一段時間。本發(fā)明進一步的方面提供在細胞中合成重組具酶活性的環(huán)氧化酶多肽的方法，該方法包括在足以使其編碼的環(huán)氧化酶合成的條件下將上述分離的核酸分子在上述細胞中表達一段時間。本發(fā)明進一步的方面提供在細胞中合成重組具酶活性的環(huán)氧化酶多肽的方法，該方法包含以下步驟(i)制備包含可操作地置于能在上述細胞中賦予遺傳序列表達的啟動子控制之下的上述分離核酸分子和選擇性地表達增強子元件的遺傳構建體；(ii)將上述遺傳構建體轉化入上述細胞；并且(iii)選擇高水平表達由遺傳序列編碼的功能性環(huán)氧化酶的轉化體。本發(fā)明進一步的方面提供在轉基因植物中合成重組具酶活性的環(huán)氧化酶多肽的方法，包含以下步驟(i)制備包含可操作地置于種子特異性啟動子控制之下的上述分離核酸分子和選擇性地表達增強子元件的遺傳構建體，其中所述遺傳序列也置于轉錄終止子序列的上游；(ii)將該遺傳構建體轉化入上述植物的細胞或組織；并且(iii)選擇在種子中以高水平表達由遺傳序列編碼的功能性環(huán)氧化酶的轉化體。本發(fā)明進一步的方面提供重組的環(huán)氧化酶多肽或功能性酶分子。本發(fā)明進一步的方面提供包含在SEQIDNO2或4或6中的任意一個中所示的氨基酸序列的重組環(huán)氧化酶或與其至少約50％相同的其同系物、類似物或衍生物。本發(fā)明進一步的方面提供在細胞、組織、器官或生物中合成環(huán)氧化脂肪酸的方法，該方法包括將表達具酶活性的重組環(huán)氧化酶的細胞、組織、器官或生物與脂肪酸底物并優(yōu)選地不飽和脂肪酸底物在足以使上述底物的至少一個碳鍵、優(yōu)選地碳雙鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團的條件下一起培養(yǎng)一段時間。本發(fā)明進一步的方面提供與此處所述的重組環(huán)氧化酶多肽或其同系物、類似物或衍生物結合的免疫反應活性分子。附圖簡述圖1是包含環(huán)氧化酶結構基因的表達質粒的線形表示，該基因可操作地置于截短的napin啟動子(FPl；右手陰影盒)控制之下并置于NOS終止子序列(右手點畫盒)的上游。環(huán)氧化酶遺傳序列由右手開放矩形盒表示。該構建體還包含驅動NPTII基因(左手開放盒)表達的NOS啟動子(左手陰影盒)并位于NOS終止子(左手點畫盒)的上游。還表示了根瘤土壤桿菌Ti質粒的左和右邊界序列。圖2是表示Crepispalaestina的環(huán)氧化酶多肽(Cpal2；SEDIDNO2)、來自還陽參屬種類而不是產(chǎn)生高水平斑鳩菊酸的C.palaestina的其它環(huán)氧化酶(CrepX；SEDIDNO4)的氨基酸序列，來自Vernoniagalamensis的環(huán)氧化酶多肽的部分氨基酸序列(Vgall；SEQIDNO6)，Crepisalpina的Δ12乙炔化酶(actylenase)(Crepl；SEQIDNO8)、擬南芥(L26296；SEQIDNO9)、芥菜(X91139；SEQIDNO10)、大豆(L43921；SEQIDNO11)、Solanumcommersonii(X92847；SEQIDNO12)和大豆(L43920；SEQIDNO13)的Δ12去飽和酶和Ricinacommunis(U22378；SEQIDNO14)的Δ12羥化酶的氨基酸序列的比較圖示。圖3是表示由SEQIDNO1例示的Crepispalaestina環(huán)氧化酶基因的種子特異性表達的Northern印跡雜交的攝影圖示復印件。Northern印跡分析來自Crepispolaestina葉(泳道1)和正在發(fā)育的種子(泳道2)的總RNA。在Northern凝膠中電泳15μg總RNA并按照制造商的說明將其印跡到Amersham公司的HybondN+膜上。印跡與從SEQIDNO1的3′未翻譯區(qū)制備的探針在60℃雜交。印跡于室溫在2×SSC(氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液)中洗兩次，每次10分鐘，然后于60℃在0.1×SSC中洗20分鐘。圖4是表示用于分離在此處所述的Euphorbialagascae環(huán)氧化酶基因的簡并PCR引物的核苷酸序列(5′到3′方向)的圖示。圖5是表示與不產(chǎn)生斑鳩菊酸的植物相比，SEQIDNO3中例示的環(huán)氧化酶基因在產(chǎn)生斑鳩菊酸的植物中表達的RNA點印跡雜交的攝影圖示復印件。從特定組織中分離1μg總RNA并按照每一制造商的說明將其點印跡至Amersham公司的HybondN+膜上。印跡于42℃與從SEQIDNO3制備的相關32P標記的探針在50％甲酰胺中雜交16小時。印跡于室溫在2×SSC(氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液)中洗兩次，然后于55℃在0.5×SSC中洗20分鐘。過夜曝光后獲得放射自顯影照片。A組表示來自Euphorbialagascae(1)、柏大戟(Euphorbiacyparissu)(2)、Vernoniagalamensis(3)和亞麻(Linumusitatissimum)(4)的正在發(fā)育的種子的總RNA。B組表示來自Euphorbialagascae不同組織包括正在發(fā)育的種子(1)、根(2)和葉(3)的總RNA。圖6是表示用于分離如此處所述的Euphorbialagascae環(huán)氧化酶基因的減數(shù)雜交方法的圖示。+6cDNA庫主要由種子貯存蛋白樣序列組成。對15個這樣的序列庫進行生物素化并進一步從+6cDNA中扣除。LH＝長雜交-20小時；SH＝短雜交-3小時。圖7是表示與不產(chǎn)生斑鳩菊酸的植物相比，SEQIDNO20中例示的環(huán)氧化酶基因在產(chǎn)生斑鳩菊酸的植物中表達的RNA點印跡雜交的攝影圖示復印件。從特定組織中分離1μg總RNA并按照每一制造商的說明將其點印跡至Amersham公司的HybondN+膜上。印跡與從SEQIDNO20制備的相關32P標記的探針于42℃在50％甲酰胺中雜交16小時。印跡于室溫在2×SSC(氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液)中洗兩次，然后于55℃在0.5×SSC中洗20分鐘。過夜曝光后獲得放射自顯影照片。A組表示來自Euphorbialagascae(1)、柏大戟(2)、Vernoniagalamensis(3)和亞麻(Linumusitatissimum)正在發(fā)育的種子的總RNA。B組表示來自Euphorbialagascae不同組織包括正在發(fā)育的種子(1)、根(2)和葉(3)的總RNA。圖8是含有表達盒的雙元質粒載體的圖示，表達盒包含截短的napin種子特異性啟動子(Napin)和胭脂氨酸合酶終止子(NT)，二者之間帶有BamHI克隆位點，以及與胭脂氨酸合酶啟動子(NP)和胭脂氨酸合酶終止子(NT)序列可操作連接的卡那霉素抗性基因NPTII。表達盒側翼是T-DNA左邊界(LB)和右邊界(RB)序列。圖9是含有表達盒的雙元質粒載體的圖示，該盒包含可操作地置于截短的napin種子特異性啟動子(Napin)控制之下及胭脂氨酸合酶終止子(NT)上游的SEQIDNO1，還有與胭脂氨酸啟動子(NP)和胭脂氨酸終止子(NT)序列可操作連接的卡那霉素抗性基因NPTII。表達盒側翼是T-DNA左邊界(LB)和右邊界(RB)序列。為制備此構建體，將SEQIDNO1插入圖8中所示的雙元載體的BamHI位點。圖10是從未轉化的擬南芥植物[(a)組]或已經(jīng)以SEQIDNO1用圖9中所示的遺傳構建體轉化的擬南芥植物[(b)組和(c)組]制備的脂肪酸甲基酯的氣相層析軌跡的圖示。在(a)和(b)組中，脂肪酸甲基酯用填充柱分離法分離。在(c)組中，脂肪酸甲基酯用毛細管柱分離法分離。斑鳩菊酸的洗脫位置如圖所示。圖11是表示如用氣相層析測定的，Cpa12轉化的擬南芥植物的T1植物的自交種子中環(huán)氧化脂肪酸的聯(lián)合分布圖示。測定并繪制了斑鳩菊酸(x-軸)和12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸(y-軸)彼此相關的水平。數(shù)據(jù)表明轉基因植物中這些脂肪酸水平之間的正相關。圖12是表示在用標記物質供給過程中從亞麻籽子葉脂提取物得到的氯仿相中14C-標記摻入的圖示。所用符號◆，[14C]油酸供給；■，[14C]斑鳩菊酸供給。圖13是表示在用標記物質供給過程中亞麻籽子葉的磷脂酰膽堿中14C-標記摻入的圖示。所用符號◆[14C]油酸供給；■，[14C]斑鳩菊酸供給。圖14是表示在用標記物質飼養(yǎng)過程中亞麻籽子葉的三酰甘油中14C-標記摻入的圖示。所用符號◆，[14C]油酸供給；■[14C]斑鳩菊酸供給。優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明的一個方面提供編碼脂肪酸環(huán)氧化酶的分離核酸分子或與其互補的分離核酸分子。其中本發(fā)明的分離核酸分子編碼參與花生四烯酸的直接環(huán)氧化作用的酶，特別優(yōu)選的是此核酸分子來自非哺乳動物來源。如本文所用的，術語“來自”用來表示特定整體或整體組來源于特定物種，但不必需直接從該特定來源獲得。術語“非哺乳動物來源”是指任何哺乳動物之外的生物或來自該生物的組織或細胞。在本文中，術語“來自非哺乳動物來源”用來表示特定整體或整體組來自細菌、酵母、鳥類、兩棲動物、爬行動物、昆蟲、植物、真菌、霉菌和藻類或其它非哺乳動物。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，來源生物是任何具有合成環(huán)氧脂肪酸遺傳能力的生物。更優(yōu)選地，來源生物是植物，例如但不限于苘蒿屬種類、還陽參屬種類、大戟屬種類和斑鳩菊屬種類等。甚至更優(yōu)選地，來源生物從包括粗糙還陽參(Crepisbiennis)、金黃還陽參(Crepisaurea)、Crepisconyzaefolia、Crepisintermedia、Crepisoccidentalis，Crepispalaestina、膀胱還陽參(Crepisvesicaria)、Crepisxacintha、Euphorbialagascae和Vernoniagalamensis的目錄中選出，但不排除其它物種。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，來源生物是含有高水平斑鳩菊酸的還陽參屬種類如Crepispalaestina等或選擇性地Vernoniagalamensis或Euphorbialagascae.其中本發(fā)明的分離核酸分子編碼Δ6-環(huán)氧化酶或Δ9-環(huán)氧化酶或Δ12-環(huán)氧化酶或Δ15-環(huán)氧化酶或至少編碼不參與花生四烯酸直接環(huán)氧化作用的酶，本核酸分子可來自任何產(chǎn)生該酶的來源，包括但不限于酵母、霉菌、細菌、昆蟲、鳥類、哺乳動物和植物。根據(jù)任一前述實施方案所述的本發(fā)明的核酸分子可以是DNA如基因、cDNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸分子，是單鏈或雙鏈的并且除非特別指出不考慮任何二級結構特征。本文所提及的“基因”應理解為其最廣義的含義并包括(i)包含轉錄和/或轉錄調控序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(即內含子，5′-和3′-非翻譯序列)的典型基因組基因；或(ii)與基因的編碼區(qū)(即外顯子)和5′及3′非翻譯序列對應的mRNA或cDNA。術語“基因”還用于描述編碼全部或部分功能產(chǎn)物的合成或融合分子。本發(fā)明優(yōu)選的環(huán)氧化酶基因可通過常規(guī)重組技術從天然存在的環(huán)氧化酶基因得到。一般地，可以對環(huán)氧化酶基因進行誘變以產(chǎn)生單個或多個核苷酸替換、缺失和/或添加。核苷酸插入衍生物包括5′和3′末端融合以及序列內單個或多個核苷酸的插入。插入核苷酸序列變體是那些在核苷酸序列預定位點導入一或多個核苷酸的變體，盡管在對終產(chǎn)物進行適當篩選的情況下隨機插入也是可以的。缺失變體的特征在于從序列中去除一個或更多核苷酸。替換核苷酸變體是那些在序列中已去除至少一個核苷酸并在其位置插入不同核苷酸的變體。這樣的替換可以是“沉默的”，其中替換并未改變密碼子所定義的氨基酸。或者，替換設計為將一個氨基酸改為另一個相似作用的氨基酸或具有相似電荷、極性或疏水性的氨基酸。在本發(fā)明的上下文中，術語“脂肪酸環(huán)氧化酶”應理解為任何通過將脂肪酸的碳鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團、優(yōu)選地通過將不飽和脂肪酸的碳雙鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團催化環(huán)氧化脂肪酸生物合成的酶或其功能相同的或具酶活性的衍生物。盡管不限定本發(fā)明，脂肪酸環(huán)氧化酶可催化選自12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸(斑鳩菊酸)、12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸、15，16-環(huán)氧-9，12-十八碳二烯酸、9，10-環(huán)氧-12-十八碳烯酸和9，10-環(huán)氧-十八碳烯酸等的環(huán)氧脂肪酸生物合成。術語“環(huán)氧”、“環(huán)氧基團”和“環(huán)氧殘基”為本領域技術人員公知是指如下所示的包含通過單鍵連接的兩個碳原子和一個氧原子的三成分環(huán)。因此，術語“環(huán)氧化物”是指包含至少一個如此前所定義的環(huán)氧基團的化合物。本領域技術人員知道脂肪酸命名法是基于碳鏈的長度和碳鏈內不飽和碳鍵的位置。因此，脂肪酸用下面簡寫符號來命名碳原子總數(shù)雙鍵總數(shù)雙鍵(Δ)位置其中雙鍵除非指出是順式的。例如，棕櫚酸(n-十六烷酸)是飽和的16-碳脂肪酸(即160)，油酸(十八碳烯酸)是在C-9和C-10之間有一個雙鍵的不飽和18-碳脂肪酸(即181Δ9)，亞油酸(十八碳二烯酸)是在C-9和C-10及C-12和C-13之間有兩個雙鍵的不飽和18-碳脂肪酸(即182Δ9.12)。然而，本文中環(huán)氧化酶可催化任何碳鍵向環(huán)氧基團的轉化或選擇性地不飽和脂肪酸底物中雙鍵向環(huán)氧基團的轉化。在這方面，本領域技術人員熟知高等生物的大部分單一不飽和脂肪酸是18-碳不飽和脂肪酸(即181Δ9)，而來自高等生物的大部分多聚不飽和脂肪酸是其中有至少一個位于C9與C10之間的雙鍵的18-碳脂肪酸。并且，細菌也包含C16-單一不飽和脂肪酸。此外，本發(fā)明的環(huán)氧化酶可作用于不只一個脂肪酸底物分子，因此本發(fā)明并不受限于本環(huán)氧化酶所作用的底物分子性質。優(yōu)選地，本發(fā)明環(huán)氧化酶的底物分子是含有至少一個雙鍵的不飽和脂肪酸。更進一步地，環(huán)氧化酶可作用于任一底物分子的任一號碳原子。例如，它們可稱為Δ6-環(huán)氧化酶、Δ9-環(huán)氧化酶、Δ12-環(huán)氧化酶或Δ15-環(huán)氧化酶等。因此，本發(fā)明并不限于環(huán)氧化酶可作用的底物中碳原子的位置。如本文所用的，術語“Δ6-環(huán)氧化酶”應理解為是指催化脂肪酸底物的Δ6碳鍵轉變?yōu)棣?環(huán)氧基團，優(yōu)選地催化至少一個不飽和脂肪酸的Δ6雙鍵轉變?yōu)棣?環(huán)氧基團的環(huán)氧化酶。如本文所用的，術語“Δ9-環(huán)氧化酶”應理解為是指催化脂肪酸底物的Δ9碳鍵轉變?yōu)棣?環(huán)氧基團，優(yōu)選地催化至少一個不飽和脂肪酸的Δ9雙鍵轉變?yōu)棣?環(huán)氧基團的環(huán)氧化酶。如本文所用的，術語“Δ12-環(huán)氧化酶”應理解為是指催化脂肪酸底物的Δ12碳鍵轉變?yōu)棣?2環(huán)氧基團，優(yōu)選地催化至少一個不飽和脂肪酸的Δ12雙鍵轉變?yōu)棣?2環(huán)氧基團的環(huán)氧化酶。如本文所用的，術語“Δ15-環(huán)氧化酶”應理解為是指催化脂肪酸底物的Δ15碳鍵轉變?yōu)棣?5環(huán)氧基團，優(yōu)選地催化至少一個不飽和脂肪酸的Δ15雙鍵轉變?yōu)棣?5環(huán)氧基團的環(huán)氧化酶。本發(fā)明顯然可延伸至編碼所有上述環(huán)氧化酶等的遺傳序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，分離的核酸分子編碼將棕櫚油酸(161Δ9)、油酸(181Δ9)、亞油酸(182Δ9.12)、亞麻酸(183Δ9.12，15)或花生四烯酸(204Δ5，8，11，14)中的至少一個碳鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團的脂肪酸環(huán)氧化酶。優(yōu)選地，碳鍵是碳雙鍵。更優(yōu)選地，本發(fā)明的分離核酸分子編碼至少將亞油酸中的一個或兩個雙鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團的脂肪酸環(huán)氧化酶。根據(jù)此實施方案，將亞油酸的Δ9和Δ12兩個雙鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團的環(huán)氧化酶可互相獨立地催化這樣的轉化過程，因此該環(huán)氧化酶是如前所定義的Δ9-環(huán)氧化酶和/或Δ12-環(huán)氧化酶。在另一可選的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的脂肪酸環(huán)氧化酶是如前所定義的Δ12-環(huán)氧化酶、Δ-15環(huán)氧化酶或Δ9-環(huán)氧化酶。更優(yōu)選地，本發(fā)明的脂肪酸環(huán)氧化酶是如前所定義的Δ12-環(huán)氧化酶。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，提供了編碼亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶的分離的核酸分子，該酶至少將亞油酸中的Δ12雙鍵轉變?yōu)棣?2-環(huán)氧基團，從而產(chǎn)生12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸(斑鳩菊酸)。盡管不限制本發(fā)明，但本發(fā)明的Δ12-環(huán)氧化酶的優(yōu)選來源是植物，特別是Crepispalaestina或進一步是不同于C.palaestina但含有高水平斑鳩菊酸的還陽參屬種類、Vernoniagalamensis或Euphorbialagascae。根據(jù)此實施方案，Δ12-環(huán)氧化酶可催化棕櫚油酸轉變?yōu)?，10-環(huán)氧-棕櫚酸和/或油酸轉變?yōu)?，10-環(huán)氧-硬脂酸和/或亞油酸轉變?yōu)?，10-環(huán)氧-12-十八碳烯酸或12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸或9，10，12，13-雙環(huán)氧-硬脂酸中的任何一個或多個和/或亞麻酸轉變?yōu)?，10-環(huán)氧-12，15-十八碳二烯酸或12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸或15，16-環(huán)氧-十八碳二烯酸或9，10，12，13-雙環(huán)氧-15-十八碳烯酸或9，10，15，16-雙環(huán)氧-12-十八碳烯酸或12，13，15，16-雙環(huán)氧-9-十八碳烯酸或9，10，12，13，15，16-三環(huán)氧-硬脂酸中的任何一個或多個和/或花生四烯酸轉變?yōu)?，6-環(huán)氧-8，11，14-二十四碳三烯酸或8，9-環(huán)氧-5，11，14-二十四碳三烯酸或11，12-環(huán)氧-5，8，14-二十四碳三烯酸或14，15-環(huán)氧-5，8，11-二十四碳三烯酸或5，6，8，9-雙環(huán)氧-11，14-二十四碳二烯酸或5，6，11，12-雙環(huán)氧-8，14-二十四碳二烯酸或5，6，14，15-雙環(huán)氧-8，11-二十四碳二烯酸或8，9，11，12-雙環(huán)氧-5，14-二十四碳二烯酸或8，9，14，15-雙環(huán)氧-5，11-二十四碳二烯酸或11，12，14，15-雙環(huán)氧-5，8-二十四碳二烯酸或5，6，8，9，11，12-三環(huán)氧-14-二十四碳烯酸或5，6，8，9，14，15-三環(huán)氧-11-二十四碳烯酸或5，6，11，12，14，15-三環(huán)氧-8-二十四碳烯酸或8，9，11，12，14，15-三環(huán)氧-5-二十四碳烯酸等中的一個或多個。本領域技術人員可以知道不是所有上述底物都可來自天然來源，但盡管如此，可通過化學方法得到合成。天然存在和化學合成的不飽和脂肪酸向環(huán)氧脂肪酸的轉化都在本發(fā)明的范圍之內，唯一要求是如此處所述的本發(fā)明的核酸分子編碼能催化該轉化的酶或其功能性部分。根據(jù)前面的討論，本領域技術人員將知道脂肪酸環(huán)氧化酶可以是細胞色素p450依賴的單加氧酶或混合功能單加氧酶或選擇性地過氧化物依賴的過氧化酶或類似的酶等。然而，本發(fā)明特別涉及那些是混合功能加氧酶的環(huán)氧化酶和編碼該酶的核酸分子及其用途。因此，特別優(yōu)選的是本發(fā)明的核酸分子編碼是混合功能單加氧的脂肪酸氧化酶。在本發(fā)明的上下文中，術語“混合功能單加氧酶”應理解為是指任何催化脂肪酸分子中碳鍵或碳雙鍵的環(huán)氧化作用的酶，其中該酶進一步包含含有如下所示的三組氨酸-富集區(qū)的氨基酸序列(i)His-(Xaa)3-4-His；(ii)His-(Xaa)2-3-His-His；和(iii)His-(Xaa)2-3-His-His其中His代表組氨酸，Xaa代表任何如表1中所列的天然存在的氨基酸殘基，整體(Xaa)3-4是指包含三或四個Xaa重復的氨基酸序列，整體(Xaa)2-3是指包含兩或三個Xaa重復的氨基酸序列。術語“混合功能單加氧酶樣酶”應理解為是指任何包含三個上述的組氨酸-富集區(qū)的酶。在如此處所述的本發(fā)明的例證中，本發(fā)明人已證明了此處提供的Crepispalaestina氨基酸序列包括包含如此前所定義的混合功能單加氧酶的特征性氨基酸序列基序的Δ12-環(huán)氧化酶。與其它混合功能單加氧酶如去飽和酶和羥化酶的氨基酸序列相比，C.palaestinaΔ12-環(huán)氧化酶(SEQIDNO2)與如此處提供的來自未鑒定的還陽參屬種類和Vernoniagalamensis的多肽氨基酸序列之間的緊密氨基酸相同性表明所述的還陽參屬種類和V.galamensis氨基酸序列也是脂肪酸環(huán)氧化酶并可能是Δ12-環(huán)氧化酶。在這方面，此處所舉例的Vernoniagalamensis氨基酸序列是僅包含一個完整組氨酸-富集基序(即His-Arg-Asn-His-His)和第一個組氨酸-富集基序的部分序列(即它包含His-Glu-Cys-Gly-His-His基序的后兩個組氨酸殘基)的部分序列，因為使用針對此第一個組氨酸-富集基序的第一引物和設計為針對第三個組氨酸-富集基序(即His-Val-Met-His-His)上游區(qū)的第二擴增引物通過聚合酶鏈式反應擴增到編碼相同序列的相應核苷酸序列為部分cDNA序列。并且，用對第一個組氨酸-富集基序特異的引物擴增到V.galamensis序列的事實表明相應的全長序列也包含此基序。因此，在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼來自還陽參屬種類包括Crepispalaestina或選擇性地來自Vernoniagalamensis的混合功能單加氧酶或類似的酶。根據(jù)此實施方案，甚至更優(yōu)選的是本環(huán)氧化酶至少包含含有三個或更多如下所示的組氨酸-富集區(qū)的氨基酸序列(i)His-Glu-Cys-His-His(SEQIDNO15)；(ii)His-Arg-Asn-His-His(SEQIDNO16)；和(iii)His-Val-Met-His-His(SEQIDNO17)，或其同系物、類似物或衍生物，其中His代表組氨酸，Glu代表谷氨酸，Cys代表半胱氨酸，Gly代表甘氨酸，Arg代表精氨酸，Asn代表天冬酰胺，Val代表纈氨酸，Met代表甲硫氨酸。本發(fā)明明確地延伸至來自其它物種的環(huán)氧化酶基因，包括來自苘蒿屬種類和Euphorbialagascae等的環(huán)氧化酶基因。在優(yōu)選的實施方案中，同時不限制本發(fā)明，本發(fā)明所包括的其它物種的環(huán)氧化酶基因編碼混合功能單加氧酶。本發(fā)明進一步延伸到由這樣的基因編碼的分離的或重組的多肽以及所述基因和多肽的用途。根據(jù)此實施方案所述的本發(fā)明不包括編碼除了如此處所定義的環(huán)氧化酶活性之外的酶活性的核酸分子，具體地來自擬南芥、芥菜、歐洲油菜或大豆等已知含有相似組氨酸-富集基序的Δ12-去飽和酶活性。在本文中，氨基酸序列的“同系物”是指那些來自本發(fā)明的多肽、酶或蛋白的氨基酸序列或多肽序列或選擇性地那些盡管有天然存在的氨基酸替換、添加或缺失但仍與上述氨基酸序列基本一致的氨基酸序列或多肽序列。例如，氨基酸可用具有相似特性如疏水性、親水性、疏水力矩、抗原性、形成或破壞α-螺旋或β-折疊結構的傾向等的其它氨基酸替換。選擇性地或者另外，同源氨基酸序列的氨基酸可用其它具有相似特性如疏水性、親水性、疏水力矩、電荷或抗原性等的氨基酸替換。此處所考慮的天然存在的氨基酸殘基在表1中描述。氨基酸序列的同系物可以是通過任何本領域技術人員公知的方法如通過Fmoc化學法制備的合成肽。選擇性地，氨基酸序列的同系物可來自天然來源如與本發(fā)明的多肽、酶或蛋白相同的物種或另一物種。上述氨基酸序列同系物的優(yōu)選來源包括本文考慮的任何來源。盡管有非天然存在的氨基酸類似物的存在，但是氨基酸序列的“類似物”包括那些與上述氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。此處所考慮的優(yōu)選的非天然存在的氨基酸在表2中列出。涉及氨基酸序列的術語“衍生物”應理解為是指上述氨基酸序列的突變體、部分、片段或多肽融合體。衍生物包括修飾的氨基酸序列或肽，其中配體如碳水化合物、酶、蛋白、多肽或報告分子如放射性核素或熒光化合物與其中所包含的一個或多個氨基酸殘基結合。本發(fā)明也包括所述肽的糖基化、發(fā)熒光、乙酰化或烷基化形式。并且，衍生物可包含此處公開的氯基酸序列的片段或部分并且在本發(fā)明范圍之內，衍生物也可包括含有所述序列的兩個或多個拷貝的同聚體或異聚體并在本發(fā)明范圍之內。衍生肽的步驟為本領域技術人員所熟知。替換包括其中氨基酸替換為不同的天然存在的或非常規(guī)的氨基酸殘基的氨基酸改變。這樣的替換可分為“保守的”，這種情況下氨基酸殘基用另一個具相似性質的天然存在的氨基酸替換，例如GlyAla、ValILeLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln或PheTrpTyr。本發(fā)明所包括的替換也可以是“非保守的”，其中阻遏物多肽中存在的氨基酸殘基替換為具有不同特性的氨基酸如來自不同組的天然存在的氨基酸(如將帶電荷的或疏水的氨基酸替換為丙氨基)，或者選擇性地將天然存在的氨基酸替換為非常規(guī)氨基酸。氨基酸替換一般是單個殘基，但也可以是聚集的或分散的多個殘基。氨基酸缺失經(jīng)常是約1-10個氨基酸殘基的級別，而插入則可以是任何長度。缺失和插入可以在N-末端、C-末端進行或是內部缺失或插入。一般地，氨基酸中的插入比氨基-或羧基-末端的融合更小并以1-4個氨基酸殘基的級別。本發(fā)明明確地延伸至作為環(huán)氧化酶基因的內源細胞成分的補充整合入細胞基因組的所述分離核酸分子。選擇性地，其中宿主細胞不能正常編碼環(huán)氧脂肪酸生物合成所需的酶，本發(fā)明延伸至作為內源細胞基因組的補充整合入細胞基因組的所述分離核酸分子。表1氨基酸三字母縮寫單字母符號丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸IleI亮氨酸LeuL賴氨酸LysK蛋氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV任意殘基XaaX表2非常規(guī)氨基酸代碼非常規(guī)氨基酸代碼α-氨基丁酸AbuL-N-甲基丙氨酸Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸鹽MgabuL-N-甲基精氨酸Nmarg氨基環(huán)丙烷-羧酸鹽(酯)CproL-N-甲基天冬酰胺NmasnL-N-甲基天冬氨酸Nmasp氨基異丁酸AibL-N-甲基半胱氨酸Nmcys氨基正冰片基羧酸鹽(酯)NorbL-N-甲基谷氨酰胺NmglnL-N-甲基谷氨酸Nmglu環(huán)己基丙氨酸ChexaL-N-甲基組氨酸Nmhis環(huán)戊基丙氨酸CpenL-N-甲基異亮氨酸NmileD-丙氨酸DalL-N-甲基亮氨酸NmleuD-精氨酸DargL-N-甲基賴氨酸NmlysD-天冬氨酸DaspL-N-甲基蛋氨酸NmmetD-半胱氨酸DcysL-N-甲基正亮氨酸NmnleD-谷氨酰胺DglnL-N-甲基正纈氨酸NmnvaD-谷氨酸DgluL-N-甲基鳥氨酸NmornD-組氨酸DhisL-N-甲基苯丙氨酸NmpheD-異亮氨酸DileL-N-甲基脯氨酸NmproD-亮氨酸DleuL-N-甲基絲氨酸NmserD-賴氨酸DlysL-N-甲基蘇氨酸NmthrD-蛋氨酸DmetL-N-甲基色氨酸NmtrpD-鳥氨酸DornL-N-甲基酪氨酸NmtyrD-苯丙氨酸DpheL-N-甲基纈氨酸NmvalD-脯氨酸DproL-N-甲基乙基甘氨酸NmetgD-絲氨酸DserL-N-甲基叔丁基甘氨酸NmtbugD-蘇氨酸DthrL-正亮氨酸NleD-色氨酸DtrpL-正纈氨酸NvaD-酪氨酸Dtyrα-甲基-氨基異丁酸鹽MaibD-纈氨酸Dvalα-甲基-γ-氨基丁酸鹽MgabuD-α-甲基丙氨酸Dmalaα-甲基環(huán)己基丙氨酸MchexaD-α-甲基精氨酸Dmargα-甲基環(huán)戊基丙氨酸McpenD-α-甲基天冬酰胺Dmasnα-甲基-α-萘基丙氨酸ManapD-α-甲基天冬氨酸鹽Dmaspα-甲基青霉胺MpenD-α-甲基半胱氨酸DmcysN-(4-氨基丁基)甘氨酸NgluD-α-甲基谷氨酰胺DmglnN-(2-氨基乙基)甘氨酸NaegD-α-甲基組氨酸DmhisN-(3-氨基丙基)甘氨酸NornD-α-甲基異亮氨酸DmileN-氨基-α-甲基丁酸NmaabuD-α-甲基亮氨酸Dmleuα-萘基丙氨酸AnapD-α-甲基賴氨酸DmlysN-苯甲基甘氨酸NpheD-α-甲基蛋氨酸DmmetN-(2-氨甲?；一?甘氨酸NglnD-α-甲基鳥氨酸DmornN-(氨甲酰基甲基)甘氨酸NasnD-α-甲基苯丙氨酸DmpheN-(2-羧乙基)甘氨酸NgluD-α-甲基脯氨酸DmproN-(羧甲基)甘氨酸NaspD-α-甲基絲氨酸DmserN-環(huán)丁基甘氨酸NcbutD-α-甲基蘇氨酸DmthrN-環(huán)庚基甘氨酸NchepD-α-甲基色氨酸DmtrpN-環(huán)己基甘氨酸NchexD-α-甲基酪氨酸DmtyN-環(huán)癸基甘氨酸NcdecD-α-甲基纈氨酸DmvalN-環(huán)十二烷基甘氨酸NcdodD-α-甲基丙氨酸DnmalaN-環(huán)辛基甘氨酸NcoctD-N-甲基精氨酸DnmargN-環(huán)丙基甘氨酸NcproD-N-甲基天冬酰胺DnmasnN-環(huán)十一烷基甘氨酸NcundD-N-甲基天冬氨酸鹽DnmaspN-(2，2-二苯乙基)甘氨酸NbhmD-N-甲基半胱氨酸DnmcysN-(3，3-二苯丙基)甘氨酸NbheD-N-甲基谷氨酰胺DnmglnN-(3-胍基丙基)甘氨酸NargD-N-甲基谷氨酸鹽DnmgluN-(1-羥乙基)甘氨酸NthrD-N-甲基組氨酸DnmhisN-(羥乙基)甘氨酸NserD-N-甲基異亮氨酸DnmileN-(咪唑基乙基)甘氨酸NbisD-N-甲基亮氨酸DnmleuN-(3-吲哚乙基)甘氨酸NhtrpD-N-甲基賴氨酸DnmlysN-甲基-γ-氨基丁酸鹽NmgabuN-甲基環(huán)己基丙氨酸NmchexaD-N-甲基蛋氨酸DnmmetD-N-甲基鳥氨酸DnmornN-甲基環(huán)戊基丙氨酸NmcpenN-甲基甘氨酸NalaD-N-甲基苯丙氨酸DnmpheN-甲基氨基異丁酸鹽NmaibD-N-甲基脯氨酸DnmproN-(1-甲基丙基)甘氨酸NileD-N-甲基絲氨酸DnmserN-(2-甲基丙基)甘氨酸NleuD-N-甲基蘇氨酸DnmthrD-N-甲基色氨酸DnmtrpN-(1-甲基乙基)甘氨酸NvalD-N-甲基酪氨酸DnmtyrN-甲基-萘基丙氨酸NmanapD-N-甲基纈氨酸DnmvalN-甲基青霉胺Nmpenγ-氨基丁酸GabuN-(p-羥苯基)甘氨酸NhtyrL-叔丁基甘氨酸TbugN-(硫乙基)甘氨酸NcysL-乙基甘氨酸Etg青霉胺PenL-高苯丙氨酸HpheL-α-甲基丙氨酸MalaL-α-甲基精氨酸MargL-α-甲基天冬酰胺MasnL-α-甲基天冬氨酸MaspL-α-甲基叔丁基甘氨酸MtbugL-α-甲基半胱氨酸McysL-甲基乙基甘氨酸MetgL-α-甲基谷氨酰胺MglnL-α-甲基谷氨酸鹽MgluL-α-甲基組氨酸MhisL-α-甲基高苯丙氨酸MhpheL-α-甲基異亮氨酸MileN-(2-甲基硫乙基)甘氨酸NmetL-α-甲基亮氨酸MleuL-α-甲基賴氨酸MlysL-α-甲基蛋氨酸MmetL-α-甲基正亮氨酸MnleL-α-甲基正纈氨酸MnvaL-α-甲基鳥氨酸MornL-α-甲基苯丙氨酸MpheL-α-甲基脯氨酸MproL-α-甲基絲氨酸MserL-α-甲基蘇氨酸MthrL-α-甲基色氨酸MtrpL-α-甲基酪氨酸MtyrL-α-甲基纈氨酸MvalL-N-甲基高苯丙氨酸NmhpheN-(N-(2，2-二苯乙基)氨甲NnbhmN-(N-(3，3-二苯丙基氨甲酰Nnbhe酰甲基)甘氨酸甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯乙基氨Nmbc基)環(huán)丙烷本發(fā)明的第二方面提供包含SEQIDNO1或3或5或19或20中所示的核苷酸序列或其互補序列的分離的核酸分子或其同系物、類似物或衍生物。出于命名的目的，SEQIDNO1中所示的核苷酸序列來自Crepispalaestina并編碼SEQIDNO2中所示的混合功能單加氧酶序列或混合功能單加氧酶樣序列。如此處所例示的，SEQIDNO2中所示的氨基酸序列具有環(huán)氧化酶活性，更具體地是Δ12-環(huán)氧化酶活性。SEQIDNO3中所示的核苷酸序列對應于含有高水平斑鳩菊酸來自還陽參屬種類而不是C.palaestina的cDNA。SEQIDNO4中所示的氨基酸序列對應于SEQIDNO3中所提供的還陽參屬種類環(huán)氧化酶基因的推導氨基酸序列。SEQIDNO5中所示的核苷酸序列對應于使用來自混合功能單加氧酶的保守序列包括本發(fā)明還陽參屬種類環(huán)氧化酶基因序列的擴增引物從Vernoniagalamensis得到的擴增DNA。擴增的DNA包含部分環(huán)氧化酶基因序列，其中包括能編碼作為混合功能單加氧酶的特征的組氨酸-富集基序His-Arg-Asn-His-His的核苷酸序列。SEQIDNO6中所示的氨基酸序列對應于SEQIDNO5中提供的Vernoniagalamensis環(huán)氧化酶基因的推導氨基酸序列。SEQIDNO7中所示的核苷酸序列涉及Crepisalpina乙炔化酶基因的部分序列，該序列用作探針以分離包含SEQIDNO1中所示核苷酸序列的核酸分子。SEQIDNO8中所示的氨基酸序列對應于C.alpina乙炔化酶基團的所述部分序列的推導氨基酸序列。如本文所用的，術語“乙炔化酶”應理解為是指能催化脂肪酸底物分子中的碳雙鍵轉變?yōu)樘既I或選擇性地能催化脂肪酸分子中碳三鍵形成的酶。SEQIDNO18中所示的核苷酸序列對應于用于擴增假定的Euphorbialagascae環(huán)氧化酶基因序列的簡并擴增引物。在這方面，SEQIDNO18中所示的核苷酸殘基是那些由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的殘基，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，T代表胸腺嘧啶，Y代表嘧啶殘基，R代表嘌呤殘基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鳥嘌呤或胸腺嘧啶，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，W代表腺嘌呤或胸腺嘧啶，H代表鳥嘌呤之外的核苷酸，B代表腺嘌呤之外的核苷酸，V代表胸腺嘧啶之外的核苷酸，D代表胞嘧啶之外的核苷酸以及N代表任何核苷酸殘基。SEQIDNO19中所示的核苷酸序列來自Euphorbialagascae并編碼推定的細胞色素P-450依賴的單加氧酶序列或細胞色素P-450依賴的單加氧酶樣序列。SEQIDNO20中所示的核苷酸序列來自Euphorbialagascae并編碼推定的細胞色素P-450依賴的單加氧酶序列或細胞色素P-450依賴的單加氧酶樣的序列。本發(fā)明明確地延伸至與SEQIDNO1，3，5，19或20中任一個所列舉的cDNA分子相當?shù)幕蚪M基因。在最為特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供包含SEQIDNO1，3，5，19或20中所示核苷酸序列的分離的核酸分子或與該核苷酸序列相當?shù)幕蚪M基因或其同系物、類似物或衍生物。出于此目的，核苷酸序列的“同系物”應理解為是指盡管在該序列中存在一個或多個核苷酸替換、插入、缺失或重排，但與本發(fā)明的核酸分子或其互補核苷酸序列基本相同的分離的核酸分子。此處所提到的核苷酸序列的“類似物”應理解為是指盡管在該分離的核酸分子中存在任何正常不存在的非核苷酸成分如碳水化合物、包括放射性核苷酸的放射性化合物、報告分子(例如但不限于DIG、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶等)，但與本發(fā)明的核酸分子或其互補核苷酸序列基本相同的分離的核酸分子。此處所提到的核苷酸序列的“衍生物”應理解為是指任何含有與所述序列或其部分相似的重要序列的分離的核酸分子。一般地，本發(fā)明核酸分子的同系物、類似物或衍生物通過合成方法制備或選擇性從天然存在的來源得到。例如，可對本發(fā)明的核苷酸序列進行誘變以產(chǎn)生單個或多個如上所述的核苷酸替換、缺失和/或插入。在本發(fā)明的一個實施方案中，SEQIDNO1、3、5、19或20中所示的核苷酸序列或其互補序列的優(yōu)選同系物、類似物或衍生物編碼具免疫活性或酶活性的多肽。如本文所用的，術語“免疫活性”應理解為是指多肽分子引起哺乳動物中免疫應答，特別是足以產(chǎn)生抗體例如但不限于IgM或IgG分子或含有該抗體分子的全血清的免疫應答的能力。術語“免疫活性”還進一步延伸至多肽引起足以產(chǎn)生單克隆抗體、抗體分子的合成Fab片段、單鏈抗體分子或其它免疫活性分子的免疫應答的能力。如本文所用的，術語“酶活性”應理解為是指多肽分子催化酶反應，特別是包含脂肪酸底物分子中碳鍵的環(huán)氧化作用的酶反應的能力。更具體地，而不限制本發(fā)明，術語“酶活性”也可以指多肽分子催化脂肪酸底物分子如亞油酸或斑鳩菊酸中Δ9或Δ12環(huán)氧化作用的能力。在可選的實施方案中，SEQIDNO1或3或5中所示的核苷酸序列或其互補序列的優(yōu)選同系物、類似物或衍生物包含與其至少20個連續(xù)核苷酸、而非編碼還陽參屬種類乙炔化酶的核苷酸序列有至少65％相同的核苷酸序列。更優(yōu)選地，與SEQIDNO1或3或5的任一個的相同百分比是至少約85％甚至更優(yōu)選地，SEQIDNO1或3或5的同系物、類似物或衍生物與其至少100或250或500或1000個連續(xù)核苷酸有至少約90％、甚至更優(yōu)選地至少約95％相同。至少約200個連續(xù)核苷酸以上與SEQIDNO19或20或其互補序列的相同百分率是至少約75％，更優(yōu)選地至少約80％，甚至更優(yōu)選地至少約90％以及進一步更優(yōu)選地至少約95％，包括至少約99％相同性。至少約400個連續(xù)核苷酸以上與SEQIDNO19或20有至少65％相同的核苷酸序列也在本發(fā)明范圍之內。此處所提到的兩個或多個核苷酸或氨基酸序列之間的相同百分率或相似百分率應理解為是指用任何本領域技術人員熟知的標準算法得出的核苷酸和氨基酸序列比較中相同或相似的殘基數(shù)目。具體地，核苷酸和/或氨基酸序列的相同和相似性可使用利用Needleman和Wunsch(1970)的算法以最大化匹配殘基數(shù)并最小化序列缺口數(shù)的Gap程序來計算。Gap程序是美利堅合眾國威斯康星州麥迪遜的UniversityResearehPark中ComputerGeneticsGroupInc.的序列和分析軟件包的一部分(Devereux等，1984)。在另一可選的實施方案中，SEQIDNO1、3、5、19或20中所示的核苷酸序列或其互補序列的優(yōu)選同系物、類似物或衍生物在至少低嚴格條件下與來自上述序列的至少20個連續(xù)核苷酸雜交。更優(yōu)選地，雜交的嚴謹性是至少中度嚴謹性，甚至更優(yōu)選地至少高度嚴謹性。為定義嚴謹性的水平，本領域技術人員知道可使用幾種不同的雜交條件。例如，低嚴謹性可包含在6×SSS緩沖液、0.1％(W/V)SDS中于28℃進行的雜交和/或洗滌。中度嚴謹性可包含在2×SSC緩沖液、0.1％(W/V)SDS中于45℃到65℃溫度范圍內進行的雜交和/或洗滌。高嚴謹性可包含在0.1×SSC緩沖液、0.1％(W/V)SDS中于至少65℃溫度下進行的雜交和/或洗滌。一般地，嚴謹性可通過降低SSC緩沖液的濃度和/或增加雜交緩沖液或洗滌緩沖液中SDS的濃度和/或增加雜交和/或洗進行的溫度而提高。雜交和洗滌的條件為本領域普通技術人員所熟知。為闡明影響核酸分子間雜交的參數(shù)，可以方便地參考Ausubel等(1987)的第2.10.8到2.10.16頁，此處引用作為參考。此處公開的分離的核酸分子可使用本領域技術人員所知的大量方法之一用于分離或鑒定來自其它細胞、組織或器官類型或來自另一物種的細胞、組織或器官的其同系物、類似物或衍生物。例如，基因組DNA或mRNA或cDNA可在至少低嚴格雜交條件或相同條件下，與雜交有效量的包含SEQIDNO1、3、5、19或20中所示的核苷酸序列或其互補序列的分離的核酸分子或其功能性部分相接觸，并且使用檢測方法來檢測雜交。檢測方法可以是與本發(fā)明的分離核酸分子共價連接后能給出可鑒定信號的報告分子(例如諸如32P或35S的放射性同位素或生物素化分子)。在可選的方法中，檢測方法是聚合酶鏈式反應(PCR)的任何已知形式。根據(jù)此方法，長約15-50個核苷酸的核酸“引物分子”簡并庫是基于SEQIDNO1、3、5、19或20中公開的核苷酸序列或其互補序列設計的。同系物、類似物或衍生物(即“模板分子”)與兩個上述引物分子雜交，使得第一個引物與模板分子的一條鏈的區(qū)域雜交同時第二個引物與其互補序列雜交，其中第一和第二個引物不在模板分子相同或重疊的區(qū)域內雜交，并且其中每一個引物定位于相對于另一引物在相反鏈上雜交的位置的5′-到3′-方向。模板分子的特異核酸分子拷貝在本領域技術人員熟知的技術聚合酶鏈式反應中酶促擴增得到。引物分子可包含任何天然存在的核苷酸殘基(即腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶核苷)和/或包含能摻入多聚核苷酸分子的肌苷或其功能性類似物或其衍生物。核酸引物分子也可以包含在其它核酸引物分子的水溶液混合物中或是基本上純的形式。受檢測的序列可以重組形式、在病毒顆粒、噬菌體顆粒、酵母細胞、動物細胞或植物細胞中。優(yōu)選地，相關的遺傳序列來自另一植物種類。本發(fā)明的第三個方面提供編碼SEQIDNO2或4或6中所示的氨基酸序列或其同系物、類似物或衍生物的分離的核酸分子。在此處所考慮的一個實施方案中，SEQIDNO2、4或6中所示的氨基酸序列的優(yōu)選同系物、類似物或衍生物是如上所定義的具免疫活性或酶活性的多肽。在本發(fā)明的可選實施方案中，SEQIDNOs2、4或6中所示的氨基酸序列的優(yōu)選同系物、類似物或衍生物包含與其而非還陽參屬種類乙炔化酶多肽有至少60％相同的氨基酸序列。更優(yōu)選地，本發(fā)明所包括的SEQIDNO2或4或6的同系物、類似物或衍生物與其至少約85％相同，更優(yōu)選地至少約90％相同，甚至更優(yōu)選地至少約95％相同，并且進一步更優(yōu)選地至少約99％-100％相同。SEQIDNO2或4或6的同系物、類似物或衍生物可進一步包含如上所定義的組氨酸-富集區(qū)域。甚至更優(yōu)選地，所述環(huán)氧化酶至少包含含有三個或更多如下所示的組氨酸富集區(qū)域的氨基酸序列(i)His-Glu-Cys-Gly-His-His(SEQIDNO15)；(ii)His-Arg-Asn-His-His(SEQIDNO16)；和(iii)His-Val-Met-His-His(SEQIDNO17)或其同系物、類似物或衍生物。根據(jù)此可選的實施方案所述的本發(fā)明不包括來自擬南芥、芥菜、歐洲油菜或大豆等的Δ12-去飽和酶。本發(fā)明的分離的核酸分子對于發(fā)展包含正義分子的遺傳構建體有用，其中所述遺傳構建體設計為在正常不表達該核酸分子的細胞中表達或在正常表達該核酸分子的細胞中過量表達。因此，本發(fā)明進一步的方面提供包含與啟動子序列可操作連接的正義分子的遺傳構建體。如本文所用的，術語“正義分子”應理解為是指編碼脂肪酸環(huán)氧化酶的分離的核酸分子或與其互補的分離的核酸分子，其中所述核酸分子在所述正義分子通過轉染或轉化導入宿主細胞時以適于其表達以產(chǎn)生重組多肽的形式提供。本領域技術人員知道遺傳構建體可用于“轉染”細胞，在這種情況下它被導入上述細胞中但并不整合入細胞的基因組。選擇性地，遺傳構建體可用于“轉化”細胞，在這種情況下它穩(wěn)定地整合入該細胞的基因組中。對應于脂肪酸環(huán)氧化酶基因序列或其同系物、類似物或衍生物的正義分子可用任何已知轉染或轉化所述細胞的方法導入細胞中。其中細胞用本發(fā)明的遺傳構建體進行轉化，完整生物可使用本領域技術人員知曉的任何方法從單個轉化細胞中再生。因此，此處所述的環(huán)氧化酶基因可用于發(fā)展合成屬于與轉染或轉化的細胞來源的屬或種相同的屬或種的野生或天然存在的生物不能正常合成的環(huán)氧脂肪酸的單個細胞或完整生物，或用于使這樣的脂肪酸水平增加高于在這樣的野生或天然存在的生物中正常存在的水平。在可選擇的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子在適當?shù)膯幼有蛄械目刂葡乱苑戳x方向或作為核酶或共抑制分子在細胞中表達時，能降低環(huán)氧脂肪酸的水平。共抑制是當一個或多個內源基因的拷貝或一個或多個基本相似基因的拷貝導入細胞中時發(fā)生的內源基因表達的減弱。本發(fā)明還延伸至使用共抑制來進行如此處所述的環(huán)氧化酶基因表達的抑制。在本發(fā)明的上下文中，反義分子是從與正常轉錄產(chǎn)生能翻譯成多肽的“正義”mRNA分子的核基因鏈互補的核基因鏈轉錄而來的RNA分子。反義分子因此與正義mRNA或其部分相互補。盡管本發(fā)明反義分子的作用方式并不限于任何特定機制，反義RNA分子具有通過與正義mRNA堿基配對而形成雙鏈mRNA的能力，可阻礙正義mRNA的翻譯及隨后多肽基因產(chǎn)物的合成。核酶是包含與靶正義mRNA中兩個至少5個連續(xù)核苷酸堿基的區(qū)域互補的雜交區(qū)域的合成RNA分子。并且，核酶具有高度特異性內切核糖核酸酶活性，能自催化切割靶正義mRNA。核酶功能的完整描述由Haseloff和Gerlach(1988)提供并包含在國際專利申請?zhí)朩O89/05852中。本發(fā)明延伸至靶向如此處所述的編碼環(huán)氧化酶多肽的正義mRNA的核酶，由此與該正義mRNA雜交并切割它，使它不再能翻譯合成功能性多肽產(chǎn)物。根據(jù)此實施方案，本發(fā)明提供包含能與此處所述的編碼環(huán)氧化酶的正義mRNA形成氫鍵連接的復合物以減弱該mRNA翻譯的連續(xù)核苷酸堿基序列的核酶或反義分子。盡管優(yōu)選的反義和/或核酶分子與靶分子的至少約10到20個核苷酸雜交，但本發(fā)明延伸至能與至少長約50-100個核苷酸堿基雜交的分子或能與全長或基本上全長的環(huán)氧化酶mRNA雜交的分子。應當理解本領域中可以對本發(fā)明的反義和/或核酶分子進行包括核苷酸替換等在內的特定修飾，而不破壞該分子抑制環(huán)氧化酶基因表達的功效。因此包括任何編碼同樣產(chǎn)物的該基因的核苷酸序列變體、同系物、類似物或片段均在本發(fā)明范圍之內，唯一的需要是該核苷酸序列變體在轉錄時產(chǎn)生能與所述正義mRNA分子雜交的反義和/或核酶分子。本發(fā)明延伸至設計為能促進正義分子表達的遺傳構建體，能改變細胞中環(huán)氧脂肪酸水平的反義分子、核酶分子或共抑制分子。在特別優(yōu)選的實施方案中，能改變細胞中環(huán)氧脂肪酸組成的正義分子、反義分子、核酶分子、共抑制分子或基因靶向分子來自包含SEQIDNOs1、3、5、19或20所述的以及更優(yōu)選地SEQIDNOs1或3或5所述的以及進一步更優(yōu)選地SEQIDNO1所述的核苷酸序列或其互補鏈、同系物、類似物或衍生物的植物或生物。本領域技術人員也知道正義、反義、核酶或共-抑制分子的表達需要發(fā)明的核酸分子位于與啟動子序列可操作的連接處。基于本目的的啟動子的選擇依賴于所需正義分子的表達水平和/或宿主細胞所來源的物種和/或所需正義分子表達的組織特異性或發(fā)育特異性而有所不同。這里所涉及的“啟動子”應理解為其最廣泛的含義并包括經(jīng)典原核基因組基因的轉錄調控序列，其中有精確轉錄起始所需的TATA盒，有或沒有(CAAT盒序列以及能作為對發(fā)育的和/或外部的刺激的應答或以組織特異性的模式改變基因表達的其它調控元件(即上游活化序列、增強子和沉默子)。在本發(fā)明的上下文中，術語“啟動子”還包括經(jīng)典原核基因的轉錄調控序列，在此情況下包括-35盒序列和/或-10盒轉錄調控序列。在此上下文中，術語“啟動子”還用于描述可引起、活化或增強細胞中所述正義分子表達的合成或融合的分子。優(yōu)選的啟動子可含有一個或多個特異性調控元件的更多拷貝，從而進一步增強正義分子的表達和/或改變該正義分子的空間表達和/或時間表達。例如，銅-應答調控元件可位于異源啟動子序列的相鄰處，驅動正義分子的表達從而引起那里銅誘導的表達。將正義、反義、核酶或共抑制分子置于啟動子序列可調節(jié)的控制之下意味著定位上述分子，從而表達受控于啟動子序列。啟動子經(jīng)常但不必需位于它所調節(jié)的核酸分子的上游或5′端。并且，包含啟動子的調控元件常位于正義、反義、核酶或共-抑制分子或包含相同成分的嵌合基因的轉錄起始位點的2kb之內。在構建異源啟動子/結構基因結合體的過程中，一般優(yōu)選的是使啟動子位于相距基因轉錄起始點大致與啟動子到它在其天然位置所調控的基因，即該啟動子所來源的基因的距離相等的位置。如本領域所知道的，該距離的一些改變可在不丟失啟動子功能的情況下得到適應。相類似地，優(yōu)選的關于位于其控制之下的異源基因的調控序列的位置由在其天然位置，即該元件所來源的基因，的元件的定位來確定。并且如本領域所知的，可在上述距離中發(fā)生一些改變。啟動子的實施例包括CaMV35S啟動子、NOS啟動子、章魚氨酸合成酶(OCS)啟動子、擬南芥SSV基因啟動子、napin種子特異性啟動子、P32啟動子、BK5-Timm啟動子、lac啟動子、tac啟動子、噬菌體λλL或λR啟動子、CMV啟動子(美國專利號為5,168,062的專利)、T7啟動子、lacUV5啟動子、SV40早期啟動子(美國專利號為5,118,627的專利)、SV40晚期啟動子(美國專利號為5,118,627的專利)、腺病毒啟動子、桿狀病毒P10或多角體蛋白啟動子(美國專利號為5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784的專利)等等。根據(jù)此實施方案優(yōu)選的啟動子是那些能在酵母、霉菌或植物細胞中發(fā)揮功能的啟動子。更優(yōu)選地，根據(jù)此實施方案適于使用的啟動子能在來自含油酵母、含油霉菌或含油種子作物植物如在Linola商標下銷售的亞麻(以下稱作“Linola亞麻”)、向日葵、紅花、大豆、亞麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄欖或油棕等的細胞中發(fā)揮功能。Linola是澳大利亞聯(lián)邦科學和工業(yè)研究組織(CSIRO)注冊的商標。在更優(yōu)選的實施方案中，啟動子可來自編碼環(huán)氧化酶的基因組克隆，優(yōu)選地來自此處提及的來自苘蒿屬種類、還陽參屬種類包括C.palaestina或其它還陽參屬種類、Euphorbialagascae或Vernoniagalamensis的環(huán)氧化酶基因的基因組基因相等物。在更優(yōu)選的實施方案中，啟動子可來自如napin基因等的高表達的種子基因。本發(fā)明的基因結構可進一步包含終止子序列并導入到適當?shù)脑谄渲心鼙磉_產(chǎn)生重組多肽基因產(chǎn)物或者核酶或反義分子的宿主細胞。術語“終止子”是指位于轉錄單位末端標志轉錄終止的DNA序列。終止子是包含促進初級轉錄物3′-末端多聚腺苷酸序列的添加的多聚腺苷酸化信號的3′-非翻譯DNA序列。在來自病毒、酵母、霉菌、細菌、昆蟲、鳥類、哺乳動物和植物的細胞中活化的終正子為本文所知并加以描述。它們可以細菌、真菌、病毒、動物和/或植物中分離。特別適合在本發(fā)明的遺傳構建體中使用的終止子的實施例包括根瘤土壤桿菌的胭脂氨酸合酶(NOS)基因終止子?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV)35S基因的終止子、來自玉米的Zein基因終止子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞單位(SSU)基因終止子序列、亞三葉草矮化病毒(SCSV)基因序列終止子、任何rho非依賴的大腸桿菌終止子等。本領域技術人員知道在實施本發(fā)明的過程中適于使用的其它啟動子序列和終止子序列。這些序列不需任何過多的實驗而可輕易使用。本發(fā)明的遺傳構建體可進一步包括當該遺傳構建體需要作為附加遺傳元件(如質?；蛘沉７肿?在特異性細胞中得以保持時，在特異性細胞類型如細菌細胞中復制所需要的復制序列起點。優(yōu)選的復制起點包括，或不限于復制的fl-起點和colEl起點。遺傳構建體可進一步包含可選擇標記基因或在導入該遺傳構建體的細胞中的功能性基因。如本文所用的，術語“可選擇標記基因”包括任何給予細胞表型的基因，它在細胞中的表達有利于鑒定和/或篩選轉染或轉化了本發(fā)明遺傳構建體或其衍生物的細胞。這里所考慮的適當?shù)目蛇x擇標記基因包括氨芐青霉素抗性(Ampr)、四環(huán)素抗性基因(Tcr)、細菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、膦絲菌素抗性基因、新霉素磷酸轉移酶基因(nptII)、潮霉素抗性基因、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因和熒光素酶基因等。本發(fā)明進一步的方面提供表達如這里所述的重組環(huán)氧化多肽或核酶、反義或共抑制分子或其同系物、類似物或衍生物的轉染或轉化的細胞、組織、器官或完整生物。優(yōu)選地，分離的核酸分子包含在如此處所述的遺傳構建體之內。本發(fā)明的遺傳構建體可通過多種為本領域技術人員所知的技術導入細胞中。所用的技術依賴于針對特別的生物的已知的成功技術而有所不同。將重組DNA導入細菌細胞、酵母細胞或植物、昆蟲、真菌(包括霉菌)、鳥類或哺乳動物組織或細胞的方法包括但不限于用CaCl2轉化及其變化而來的，特別是由Hanahan描述的方法(1983)；直接DNA攝入原生質體(Krens等，1982；Paszkowski等，1984)；PEG介導的攝入原生質體(Armstrong等，1990)；微粒轟擊；電穿孔(Fromm等，1985)；DNA的微注射(Crossway等，1986)；組織外植體或細胞的微粒轟擊(Christou等，1988；Sanford，1988)；核酸的組織真空滲透；或者對于植物如主要由Au等(1985)、Herrera-Estrella等(1983a、1983b、1985)所描述的T-DNA介導的從土壤桿菌到植物組織的轉移。對于細胞的微粒轟擊，是將微粒推進細胞中以產(chǎn)生轉化細胞。任何適當?shù)陌l(fā)射細胞轉化方法學和設備可用于實施本發(fā)明。典型的設備和步驟由Stomp等(美國專利號為5,122,466的專利)和Sanford和Wolf(美國專利號為4,945,050的專利)提供。當使用發(fā)射轉化步驟時，遺傳構建體可包含能在轉化細胞中復制的質粒。適合用于該系統(tǒng)的微粒的例子包括1到5μm的金粒。DNA結構可通過任何適當?shù)募夹g，如通過沉淀置于微粒上。在特別優(yōu)選的實施方案中，其中遺傳構建體包含正義分子，特別優(yōu)選的是從它所產(chǎn)生的重組環(huán)氧化酶多肽是具酶活性的。或者，其中細胞來自多細胞生物并且相關技術是有效的，根據(jù)本領域所熟知的步驟，完整生物可從轉化細胞中再生。本領域技術人員也知道用于轉化、再生和繁殖其它類型細胞如真菌的方法。在植物中，通過器官發(fā)生或胚胎發(fā)生而能進行次生克隆繁殖的植物組織，可用本發(fā)明的遺傳構建體和從它再生的全植物進行轉化。所選的特別的組織將依賴于可用于并最適于轉化的特別的物種的克隆繁殖系統(tǒng)而變化。典型的靶組織包括葉片、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、現(xiàn)有分生組織(如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導的分生組織(如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。如本文所用的，術語“器官發(fā)生”意味著莖和根順序從分生組織中心發(fā)育的方法。如本文所用的，術語“胚胎發(fā)生”意味著莖和根從體細胞或配子以協(xié)同模式(而非順序地)一起發(fā)育的方法。再生的轉化植物可通過多種方法如通過克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術進行繁殖。例如，第一代(或T1)轉化植物可自交產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉化體，并且T2植物進一步通過經(jīng)典的育種技術進行繁殖。此處所考慮的再生的轉化生物可含有多種形式。例如，它們可以是轉化細胞和非轉化細胞的異源嵌合體；克隆轉化體(如所有轉化細胞含有表達盒)；轉化和未轉化組織的嫁接(如植物中轉化的根的砧木與未轉化的接穗嫁接。本發(fā)明進一步的方面提供改變細胞、組織、器官或生物中環(huán)氧脂肪酸水平的方法，該方法包含在細胞中表達如這里所述的正義、反義、核酶或共抑制分子一段時間并在足以使那里的環(huán)氧脂肪酸水平增強或減弱的條件下進行。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法包含用正義、反義、核酶或共抑制分子轉化細胞、組織、器官的額外的第一步。如上面所討論的，分離的核酸分子可包含在遺傳構建體中。根據(jù)此實施方案，在其中表達所述正義、反義、核酶或共抑制分子的細胞、器官、組織或生物可來自細菌、酵母、真菌(包括霉菌)、昆蟲、植物、鳥類或哺乳動物。因為重組環(huán)氧化酶多肽可在再生的轉化體中合成以及離體合成，因此本發(fā)明可選的優(yōu)選實施方案提供在細胞中合成具酶活性的重組環(huán)氧化酶多肽的方法，該方法包含以下步驟(i)制備包含可操作地置于能引起上述遺傳構建體在上述細胞中表達的啟動子控制之下的本發(fā)明的cDNA或基因組環(huán)氧化酶遺傳序列并選擇地包含表達增強子元件的遺傳構建體；(ii)將上述遺傳構建體轉化入上述細胞；并且(iii)選擇以高水平表達由遺傳序列編碼的環(huán)氧化酶的轉化體。本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案提供在轉基因植物中合成具酶活性的重組環(huán)氧化酶多肽的方法，包含以下步驟(i)制備包含可操作地置于種子特異性啟動子控制之下的本發(fā)明的環(huán)氧化酶cDNA或基因組遺傳序列并選擇性地包含表達增強子元件的遺傳構建體，其中所述遺傳序列也位于轉錄終止子序列的上游。(ii)將所述遺傳序列轉化入上述植物的細胞或組織中；并且(iii)選擇在種子中以高水平表達由遺傳序列編碼的環(huán)氧化酶的轉化體。在更加特別優(yōu)選的實施方案中，植物是正常產(chǎn)生高水平亞油酸的合油種子物種，例如Linola亞麻、油籽油菜、向日葵、紅花、大豆、亞麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄欖或油棕等。在進一步更加特別優(yōu)選的實施方案中，植物是正常產(chǎn)生高水平亞油酸的含油種子物種，例如Linola亞麻、向日葵或紅花等。此處所述的具酶活性的重組環(huán)氧化酶對于從不飽和脂肪酸底物產(chǎn)生環(huán)氧化脂肪酸特別有用。本發(fā)明特別考慮在不正常產(chǎn)生特異性環(huán)氧化脂肪酸的細胞或再生的轉化生物中產(chǎn)生特異性環(huán)氧化脂肪酸。因此，本發(fā)明進一步的方面提供在細胞、組織、器官或生物中產(chǎn)生環(huán)氧化脂肪酸的方法，該方法包含將表達本發(fā)明的具酶活性的重組環(huán)氧化酶的細胞、組織、器官或生物與脂肪酸底物分子，優(yōu)選地是不飽和脂肪酸底物分子培養(yǎng)一段時間并在足以使上述底物的至少一個碳鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團的條件下實施該方法。在可選實施方案中，試驗的方法進一步包含用如此前所述的編碼上述重組環(huán)氧化酶的核酸分子或其同系物、類似物或衍生物轉化或轉染細胞、組織、器官或生物的額外的第一步。如上面所討論的，分離的核酸分子可包含在遺傳構建體中。根據(jù)此實施方案，表達試驗的環(huán)氧化酶的細胞、器官、組織或生物來自細菌、酵母、真菌(包括霉菌)、昆蟲、植物、鳥類或哺乳動物。更優(yōu)選地，細胞、器官、組織或生物來自酵母、植物或真菌，進一步更優(yōu)選地來自含油的酵母或植物或真菌，或來自不正常表達本發(fā)明的重組環(huán)氧化酶的含油種子植物。在此處所考慮的主要經(jīng)濟含油種子植物中，亞麻、向日葵、玉米和紅花的高亞油酸基因型是優(yōu)選的靶植物。大豆和油菜籽是另外的靶植物但對于最大環(huán)氧脂肪酸的合成是次適合的，這是因為它們的亞油酸底物水平較低并存在活化的Δ15-去飽和酶與環(huán)氧化酶競爭亞油酸底物。可選實施方案是用本發(fā)明的環(huán)氧化酶轉化Linola(＝低亞麻酸亞麻)。Linola亞麻正常含有70％左右的亞油酸，其中很少一部分(＜2％)最終通過Δ15-去飽和酶轉變?yōu)閬喡樗?Green，1986)。此處所考慮的優(yōu)選的不飽和脂肪酸的底物包括但不限于棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等。在天然含有高水平斑鳩菊酸的植物物種中，其中的Δ12-環(huán)氧化酶可非常有效地環(huán)氧化亞油酸。作為結果，本發(fā)明特別考慮在轉基因含油種子里在種子油合成的過程中以高水平表達來自Euphorbialagascae、斑鳩菊屬種類和還陽參屬種類的重組Δ12-環(huán)氧化酶，從而在其中產(chǎn)生高水平的斑鳩菊酸。因此，根據(jù)發(fā)明的此實施方案，亞油酸是特別優(yōu)選的底物。并不排除其它底物。上述底物分子的產(chǎn)物可由本領域技術人員容易地測定，不需過多實驗。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的特別優(yōu)選的環(huán)氧脂肪酸包括12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸(斑鳩菊酸)和12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸等。在底物分子存在下培養(yǎng)表達重組環(huán)氧化酶的細胞、器官、組織或生物的條件有所不同，這至少依賴于細胞、組織、器官或生物對底物的吸收，以及在特別選擇的環(huán)境中環(huán)氧化酶對底物分子的親和力。最佳條件可由相關領域技術人員輕易測出。本發(fā)明明確延伸至分離的含油環(huán)氧脂肪酸和/或如這里所述的產(chǎn)生的分離的環(huán)氧脂肪酸本身以及任何由此衍生的產(chǎn)物，例如涂料、樹脂、膠、塑料、表面活性劑和潤滑劑等。本發(fā)明人進一步顯示出行使催化功能如去飽和、乙炔化、羥化和/或環(huán)氧化作用的混合功能單加氧酶(MMO)，形成有大量核苷酸和氨基酸序列相似性的基因家族。例如，作用于具有相似鏈長度和任一碳雙鍵(如果存在)的位置的底物分子的去飽和酶、乙炔化酶、羥化酶和/或環(huán)氧化酶與作用于其它底物的酶相比彼此更加密切相關，并可認為是“家族”。任何基因家因成員間的序列相似性不受限于任何理論或作用模式，在相關底物的性質和修飾反應過程中發(fā)生在靶碳鍵上的反應事件的生化相似性中有其基礎，顯示了家族中的不同序列可包含有助于實現(xiàn)家族成員的特異性催化特性的催化決定子或至少其功能性部分。家族的一個實施例是分別催化亞油酸Δ12位進行去飽和、乙炔化、羥化和/或環(huán)氧化作用的去飽和酶、乙炔化酶、羥化酶和/或環(huán)氧化酶(以下稱之為“C18Δ12-MMO家族”)。本發(fā)明已比較了C18Δ12-MMO家族成員的核苷酸和氨基酸序列從而測定其在Δ12位可能包含有其它催化功能的決定子的不同區(qū)域(以下稱之為“推定的催化決定子”)。更進一步地，著眼于其它脂肪酸鏈長度和雙鍵位置，該脂肪酸修飾MMO家族的存在受到考慮。例如，C18Δ15-去飽和酶認為是屬于能在C18脂肪酸底物中Δ15位上進行去飽和、乙炔化、羥化和/或環(huán)氧化作用的相關酶的家族，C18Δ15-MMO家族。通過產(chǎn)生這些催化決定子已經(jīng)過交換(稱為“區(qū)域交換”)的合成基因，編碼一個催化功能的基因可能會轉變?yōu)榫幋a另一個催化功能的基因。例如，本發(fā)明的Δ12環(huán)氧化酶可通過用來自Crepisalpina的Δ12乙炔化酶的相同區(qū)域替換其C-末端和N-末端序列的一部分而轉變?yōu)棣?2乙炔化酶。相類似地，相反的區(qū)域交換也能夠實行。作為進一步的改進，上述催化功能中的改變可相類似地通過僅針對那些每一個區(qū)域之中對決定相關催化功能重要的氨基酸制造特異性改變(如添加、替換或缺失)而發(fā)揮效應。因此，本發(fā)明進一步的方面考慮到包含來自如這里所述的環(huán)氧化酶基因的核苷酸序列的合成脂肪酸基因，其中該合成脂肪酸基因編碼具有環(huán)氧化酶或乙炔化酶或羥化酶或去飽和酶活性的多肽，其中該多肽或者包含不同于天然存在的環(huán)氧化酶或乙炔化酶或羥化酶或去飽和酶氨基酸序列的氨基酸序列，或者該多肽表現(xiàn)出不同于天然存在的環(huán)氧化酶或乙炔化酶或羥化酶或去飽和酶的催化特性或者該多肽包含與SEQIDNO為2或4或6的序列的部分或該部分的同系物、類似物或衍生物至少有約60％相同的氨基酸序列。發(fā)明中合成的脂肪酸基因優(yōu)選地來自Δ12環(huán)氧化酶基因。在一個實施方案中，發(fā)明中合成的脂肪酸基因編碼融合的多肽，其中SEQIDNO為2或4或6的序列的N-末端和/或C-末端氨基酸由相同家族不同成員的氨基酸序列按閱讀框架替換。在特別優(yōu)選的實施方案中，SEQIDNO為2或4或6的序列的N-末端和/或C-末端氨基酸由圖2中所述的乙炔化酶、去飽和酶或羥化酶多肽的相應區(qū)域替換。更優(yōu)選地，來自SEQIDNO為2或4或6的N-末端和/或C-末端區(qū)域的至少約30個氨基酸殘基由圖2中所述的乙炔化酶、去飽和酶或羥化酶多肽的相應區(qū)域替換。在另一個實施方案中，發(fā)明中合成的脂肪酸基因編碼融合多肽，其中脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羥化酶或脂肪酸去飽和酶的N-末端和/或C-末端氨基酸由SEQIDNO為2或4或6的N-末端和/或C-末端區(qū)域按閱讀框架替換。在特別優(yōu)選的實施方案中，脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羥化酶或脂肪酸去飽和酶的N-末端和/或C-末端氨基酸由SEQIDNO為2或4或6的N-末端和/或C-末端區(qū)域按閱讀框架替換。進一步更優(yōu)選地，脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羥化酶或脂肪酸去飽和酶選自圖2所提供的表中。再進一步更優(yōu)選地，來自脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羥化酶或脂肪酸去飽和酶N-末端和/或C-末端區(qū)域的至少約30個氨基酸殘基由SEQIDNO為2或4或6的N-末端和/或C-末端區(qū)域按閱讀框架替換。因此，本發(fā)明延伸至這里所涉及的環(huán)氧化酶的變體，其中該變體來自此處所述的環(huán)氧化酶多肽并表現(xiàn)出可證明的乙炔化酶或羥化酶或去飽和酶活性，并且或者包含不同于天然存在的乙炔化酶或羥化酶或去飽和酶的氨基酸序列，或者表現(xiàn)出不同于天然存在的乙炔化酶或羥化酶或去飽和酶的催化特性，或者包含與SEQIDNO為2或4或6中任一個至少有60％相同的氨基酸序列。作為發(fā)明的其它方面，此處所述的變體一旦所述合成基因導入適當宿主細胞中并在其中表達，可作為重組多肽或在轉基因生物中產(chǎn)生。此處所述的重組多肽或其同系物、類似物或衍生物也可以是具有免疫活性的分子。本發(fā)明進一步的方面提供能與發(fā)明中重組環(huán)氧化酶多肽結合的具免疫活性的分子。優(yōu)選地，能與免疫活性分子結合的重組環(huán)氧化酶多肽包含SEQIDNO為2、4或6中所述的氨基酸序列或其同系物、類似物或衍生物。在一個實施方案中，免疫活性分子是抗體分子?？贵w分子可以是單克隆或多克隆的。單克隆或多克隆抗體可選自天然存在的針對來自重組基因產(chǎn)物的抗原決定基或肽片段或合成的環(huán)氧化酶膚的抗體或者可針對重組環(huán)氧化酶或其同系物、類似物或衍生物特異產(chǎn)生。多克隆和單克隆抗體是通過用適當?shù)幕虍a(chǎn)物、或抗原決定基、或基因產(chǎn)物的肽片段免疫而獲得的?；蛘?，抗體片段可用作如Fab片段。本發(fā)明延伸至重組的和合成的抗體以及抗體雜種?！昂铣煽贵w”在這里認為是包括抗體的片段和雜種。這里所考慮的抗體可用于鑒定表達此處所述的實施方案所包括的相關環(huán)氧化酶多肽的遺傳序列。成功檢測相關環(huán)氧化酶遺傳序列的唯一需要是該遺傳序列表達產(chǎn)生至少一個由抗體分子識別的抗原決定基。優(yōu)選地，為達到獲得表達利于檢測的目的，相關遺傳序列可操作地置于啟動子序列如細菌的lac啟動子之后。根據(jù)此優(yōu)選的實施方案，抗體用于檢測表達相關環(huán)氧化酶的質?；蚴删w的存在。相應地，抗體分子在表達相關環(huán)氧化酶的質粒或噬菌體的純化中也是有用的。試驗的抗體分子也可用于純化發(fā)明中的重組環(huán)氧化酶或其天然存在的相等物或同系物、類似物或衍生物。本發(fā)明參照下列非限定的實施例進一步得到描述。實施例1Euphorbialagascae和還陽參屬種類中環(huán)氧脂肪酸的特性來自野生物種Euphorbialagascae和不同還陽參屬物種的種子通過氣液層析篩選環(huán)氧脂肪酸的存在。如表3中所示，Euphorbialagascae在其種子油中含有非常高水平的環(huán)氧脂肪酸斑鳩菊酸。來自Crepispalaestina的種子顯示出含有占總脂肪酸重量百分比61.4％的斑鳩菊酸和0.71％的乙炔脂肪酸還陽參油酸(表3)。表3來自Crepisalpina、Crepispalaestina和Euphorbialagascae的脂中的脂肪酸組成</tables>a從種子脂類的甲酯衍生物的氣液層析測定中的總峰面積的面積百分比計算而來實施例2Euphorbialagascae和Crepispalaestina中亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶的生化特征鑒定亞油酸鹽的Δ12-環(huán)氧化酶從豆油酸合成斑鳩菊酸。亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶來自Euphorbialagascae和Crepispalaestina并定位于微粒體。來自這些物種的酶至少能在從正在發(fā)育的種子制備的膜(微粒體的)部分保持活性。除非表4中另有說明，來自Euphorbialagascae的膜的制備和它們的環(huán)氧化酶活性的分析按Bafor等(1993)描述的進行，與含NADPH的物質進行溫育。如GLC和放射性GLC的分離一樣，脂提取、分離和甲基化基本按照Kohn等(1994)和Bafor等(1993)所描述的進行。來自Crepisalpina和Crepispalaestina的膜的制備通過下面所述的步驟獲得。Crepisalpina和Crepispalaestina植物在溫室中生長并在發(fā)育的中期(開花后17-20天)收獲種子。子葉從種子包被中擠出并用研缽和研杵在0.1MpH7.2含有0.33M蔗糖、4mMNADH、2mMCoASH、1mg牛血清白蛋白/ml和4,000單位過氧化氫酶/ml的磷酸緩沖液中攪勻。勻漿在18,000xg離心10分鐘，產(chǎn)生的上清在150,000xg離心60分鐘獲得微粒體沉淀。標準的去飽和酶、乙炔化酶和環(huán)氧化酶分析通過來自Crepis物種的微粒體膜在25℃進行，微粒體制備或重新懸浮于新鮮的勻漿緩沖液和占總體積360μl中10nmol的[1-14C]181CoA或[1-14C]182-CoA(特異性活性85,000d.p.m./nmol)的0.2mg微粒體蛋白。當NADPH用作共還原劑時，膜重新懸浮于NADH替換為NADPH的勻漿緩沖液中。對來自Euphorbialagascae和Crepispalaestina的微粒體亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶的生化特性進行了測定并且數(shù)據(jù)通過與來自Crepisalpina的微粒體制備物的油酸鹽Δ12-去飽和酶和亞油酸鹽Δ12-乙炔化酶的生化特性相比較而獲得(表4)。如表4中所示，Crepispalaestina的亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶表現(xiàn)出與來自Crepisalpina的亞油酸鹽Δ12-乙炔化酶和油酸鹽Δ12-去飽和酶相似的生化特征，就三種酶而言它們都需要O2，無論NAOH或NAPDH作為共還原劑都同樣發(fā)揮作用，可被氰化物而不被一氧化碳抑制。并且，這些酶都不受抗細胞色素P450還原酶的單克隆抗體的抑制。表4的數(shù)據(jù)顯示Crepispalaestina的亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶與Crepisalpina的微粒體油酸鹽Δ12-去飽和酶和亞油酸鹽Δ12-乙炔化酶屬于同一組的酶。相反，Euphorbialagascae的亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶需要NADPH作為共還原劑，不受氰化物抑制，但受一氧化碳的抑制(表4)。并且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Euphorbialagascae的亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶受到抗細胞色素P450還原酶抗體的抑制。這些數(shù)據(jù)顯示出Euphorbialagascae亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶屬于細胞色素P450組的蛋白并因此與Crepispalaestina的亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶在生化上不相關。表4來自還陽參屬種類和Euphorbialagascae的環(huán)氧化酶、乙炔化酶和去飽和酶的生化特性的比較實施例3克隆Crepispalaestina環(huán)氧化酶基因的策略Crepispalaestina環(huán)氧化酶基因的克隆依賴于前面實施例中所描述的C.palaestina和C.alpina的酶的特性。具體地，多聚腺苷酸+RNA用QuickPrepMicromRNA純化試劑盒(Pharmacia生物技術公司)從Crepispalaestina正在發(fā)育的種子分離并用于合成寡脫氧胸苷酸-引發(fā)的雙鏈cDNA。將雙鏈cDNA與EcoRI/NotI多接頭(Pharmacia生物技術公司)連接并用ZAP-cDNAGipapack克隆試劑盒(Stratagene公司)構建cDNA文庫。用標準方法，從來自Crepisalpina正在發(fā)育的種子的RNA制備單鏈cDNA。使用來自植物混合功能單加氧酶的推測氨基酸序列的引物擴增單鏈cDNA，獲得稱為D12V(SEQIDNO7)的PCR片段。然后D12V片段經(jīng)隨機標記并如制造商所指定的用標準雜交條件在Amersham公司的HybondN+膜過濾器上進行CrepispalaestinacDNA文庫篩選。此方法導致稱為Cpal2的重組噬菌體的純化。Cpal2cDNA的核苷酸序列得到測定并在SEQIDNO1中列出。Cpal2cDNA看來是全長。包含Cpal2cDNA的表達載體的圖示在圖1中提供。這里所述的遺傳構建體設計用來導入植物材料中以產(chǎn)生表達試驗的環(huán)氧化酶的轉基因植物。本領域技術人員知道不需過多實驗，可產(chǎn)生相似的表達載體并通過用另一個結構基因序列代替Cpal2cDNA將其用于產(chǎn)生表達任何本發(fā)明的遺傳序列的轉基因植物。如圖2中所示，CreplcDNA的核苷酸序列編碼至少與C.alpina的乙炔化酶在氨基酸水平密切相關的多肽(Bafor等1997；國際專利申請?zhí)朠CT/SE97/00247)。對來自pCpal2的1.4Kb插入片段進行測序(SEQIDNO.1)并表明包含編碼374個氨基酸長的多肽的開放閱讀框。由Cpal2推斷的氨基酸序列顯示出與來自Crepisalpina的Δ12-乙炔化酶有81％相同性和92％相似性并與植物微粒體Δ12-去飽和酶蛋白有大約60％相同性和80％相似性(圖2)。然而，由Cpal2編碼的多肽與非-環(huán)氧化酶的酶相比在氨基酸序列上包含顯著差異。特別地，與所有微粒體Δ12去飽和酶相比Cpal2在5′末端區(qū)域缺失6個相鄰的氨基酸，并且與CreplΔ12乙炔化酶相比在3′末端區(qū)域缺失兩個相鄰的氨基酸(圖2)。盡管膜結合的脂肪酸去飽和酶基因顯示出有限的序列同源性，但它們全都含有如下所示的保守的組氨酸富集基序的三個區(qū)域(i)His-(Xaa)3-4-His；(ii)His-(Xaa)2-3-His-His；和(iii)His-(Xaa)2-3-His-His其中His代表組氨酸，Xaa代表如這里表1中所述的任何天然存在的氨基酸殘基，整個(Xaa)3-4是指包含三或四個Xaa重復的氨基酸序列，以及整個(Xaa)2-3是指包含兩或三個Xaa重復的氨基酸序列。這些組氨酸富集區(qū)域認為是酶的活性中心的一部分(Shanklin等，1994)。由Cpal2cDNA編碼的氨基酸序列包含三個與Δ12去飽和酶組氨酸富集基序相似，但不相同的組氨酸富集基序。這些數(shù)據(jù)顯示出Cpal2cDNA編碼屬于混合功能單加氧酶組的酶。上面實施例中給出的脂肪酸的分析顯示出斑鳩菊酸至少存在于Crepispalaestina的種子中。此酶事實上可能僅存在于C.palaestina的種子中。用Cpa12cDNA克隆的3′非翻譯區(qū)作為雜交探針與來自C.palaestina發(fā)育的種子和葉的mRNA進行Northern印跡，以檢測Cpal2基因的表達。如圖3中所示，Cpal2基因在發(fā)育的種子中高表達但在葉中檢測不到表達。這些數(shù)據(jù)與C.palaestina亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶在這些組織中的酶活性概況是一致的。實施例4克隆Euphorbialagascae環(huán)氧化酶基因的策略Euphorbialagascae環(huán)氧化酶基因的克隆依賴于上面實施例中所描述的E.lagascae的酶的特性。在一個用來克隆Euphorbialagascae環(huán)氧化酶基因的方法中，RNA從Euphorbialagascae未成熟的胚中在有活性的斑鳩菊酸合成的時期進行收集并用于構建cDNA文庫。cDNA文庫如前面實施例中所述構建于LambdaZapII載體(Stratagene公司)上，不同的是cDNA插入片段以直接的方式克隆到包埋于λ載體的質粒載體的EcoRI/XhoI位點。圖4中所述的(SEQIDNO18)簡并PCR引物經(jīng)合成并用于擴增來自EuphorbialagascaecDNA文庫的編碼P450酶序列的核苷酸序列。為進行PCR擴增反應，用酚∶氯仿[1∶1(v/v]提取cDNA文庫的100μl等分試樣并加工體積的乙醇沉淀DNA再將其最終重新懸浮于100μl水中。重新懸浮DNA的等分試樣(1μl)用作PCR擴增反應的模板。PCR反應在包含200μM每一種dNTP、10pmol簡并引物、1pmolT7聚合酶啟動子引物和0.4單位TaqI聚合酶的10μlTaqI聚合酶緩沖液中進行。擴增條件是94℃2分鐘；然后5個循環(huán)，每個循環(huán)包含48℃1分鐘接著72℃2分鐘然后93℃30秒；接下來進行28個循環(huán)，每個循環(huán)包含55℃30秒接著72℃90秒然后93℃30秒；以及最后一個循環(huán)包含55℃30秒接著72℃10分鐘然后于25℃反應1分鐘。PCR產(chǎn)物用EcoRI和XhoI純化和消化，然后亞克隆到用于測序特性的Bluescript載體中。發(fā)現(xiàn)PCR克隆中的一個編碼P450序列并將其用作探針來分離全長cDNA克隆。該核苷酸序列在SEQIDNO19中陳述。SEQIDNO19與P450基因2C家族的其它成員具有相似性。特別地，應用BLAST程序SEQIDNO19表現(xiàn)出與人和鼠和花生四烯環(huán)氧化酶序列具有平均40％的相同性。并且，SEQIDNO19的轉錄本顯示出在Euphorbialagascae的種子中表達而不在根和葉中表達(圖5B)。在Vernoniagalamensis發(fā)育的種子中檢測在SEQIDNO19的轉錄本但在柏大戟或亞麻，兩個不產(chǎn)生環(huán)氧脂肪酸的物種中未檢測到該轉錄本(圖5A和5B)。在另一個用于克隆Euphorbialagascae環(huán)氧化酶基因的方法中，減數(shù)雜交策略用來分離在產(chǎn)生高水平環(huán)氧脂肪酸的生物中特異性表達的基因。特別地，圖6中所描述的減數(shù)雜交方法用來分離在產(chǎn)生高水平的環(huán)氧脂肪酸，斑鳩菊酸的Euphorbialagascae中特異性表達(圖1)，而在不產(chǎn)生斑鳩菊酸的密切相關的物種柏大戟中不表達的環(huán)氧化酶基因。相應地，從Euphorbialagascae發(fā)育的胚中在mRNA活躍合成斑鳩菊酸的階段分離mRNA并將其用于產(chǎn)生所謂的“試驗者(tester)”cDNA。并且，從柏大戟發(fā)育的胚中(在與E.lagascae相似的發(fā)育階段)分離mRNA并將其用于產(chǎn)生所謂的“驅動者(driver)”cDNA。減數(shù)雜交步驟導向富含專門在Euphorbialagascae中表達的序列的文庫。來自此文庫的克隆經(jīng)測序并在數(shù)據(jù)庫中與其它P450序列的相似性的基礎上鑒定出至少兩個序列編碼P450蛋白。這兩個P450PCR克隆用作探針來分離來自前面所提及的cDNA文庫的相應全長cDNA克隆。包含SEQIDNO20所述的核苷酸序列的分離的P450cDNA之一看來似乎在Euphorbialagascae的組織中表達并且在柏大戟或亞麻，兩個不產(chǎn)生環(huán)氧脂肪酸的物種的種子組織中未檢測到同源轉錄本。由SEQIDNO20推斷的氨基酸序列顯示出cDNA克隆是全長的并編碼P450酶。這些數(shù)據(jù)顯示出SEQIDNO20所舉例的cDNA可編碼環(huán)氧化酶，如能將亞油酸轉變?yōu)榘啉F菊酸的亞油酸鹽Δ12-環(huán)氧化酶。實施例5環(huán)氧化酶活性的證明作為本發(fā)明例證的cDNA克隆編碼環(huán)氧化酶活性的確證通過用每一個單獨的候選克隆轉化不產(chǎn)生環(huán)氧脂肪酸，特別是斑鳩菊酸的擬南芥，并檢測轉化組織中原先所不能產(chǎn)生的環(huán)氧化脂肪酸的存在，或可能通過內源環(huán)氧化物水解酶由環(huán)氧化脂肪酸的代謝形成的羥基脂肪酸的存在來獲得(Blee和Schuber，1990)。將包含SEQIDNO1的環(huán)氧化酶cDNA克隆到圖8中所述的雙元載體結構中。簡單地說，cDNA通過用EcoRI消化pCpal2并用T4DNA聚合酶末端補平限制性片段從pCpal2質粒(圖1)亞克隆到雙元質粒中。雙元質粒(圖8)用BamHI進行線性化并也用T4DNA聚化酶進行末端補平。為進行末端補平反應，將1μgcDNA插入片段或線性化的雙元載體DNA重新懸浮于補充以100mM每一種dNTP和0.1mg/mlBSA以及3單位T4DNA聚合酶的50μlT4DNA聚合酶緩沖液(33mMTris-乙酸pH7.9，66mM乙酸鉀，10mM乙酸鎂和5mMDTT)中，并在37℃溫育6分鐘。反應通過在75℃加熱10分鐘而終止。用T4DNA連接酶和Promega公司推薦的常規(guī)連接條件連接平端cDNA和雙元載體DNA。選擇那些SEQIDNO1序列以正義方向插入到napin啟動子后面并因此能表達環(huán)氧化酶多肽的克隆。包含以正義方向、可操作地處于載短的napin啟動子控制之下的SEQIDNO1的雙元質粒在圖9中以圖例表示。圖9中所述的雙元質粒用電穿孔轉化到土壤桿菌菌株AGLI中并用來轉化擬南芥。轉基因的擬南芥植物按照Valvekens等(1988)和Dolferus等(1994)所述的方法獲得。使轉基因植物和未轉化的(即對照)植物生長到成熟。用常規(guī)技術分析每一植物成熟種子的脂肪酸組成。建成初級轉化體(T0)植物并從每一植物中收獲T1種子以及通過氣相層析分析脂肪酸組成。12株T0植物顯示出在其T1種子脂中含有濃度在總脂肪酸中為0.9％到15.8％的斑鳩菊酸，而未轉化的對照植物不含斑鳩菊酸(表5)。最高表達的植物株系是Cpal-17，其GLC洗脫分布圖(來自填充粒和毛細管柱分析)在圖10中表示。未轉化的對照來自填充柱的GLC洗脫分布圖也在圖10中表示。表5表達SEQIDNO1的轉基因擬南芥株系中的斑鳩菊酸水平選擇性地或者另外，此處所述的每一個推定的脂肪酸環(huán)氧化酶序列在napin種子特異性啟動子控制之下轉化進入Linumusitatissimum(亞麻)和擬南芥中。檢測轉基因的亞麻和擬南芥植物發(fā)育的種子的油中環(huán)氧脂肪酸的存在。以往的工作顯示出如果環(huán)氧脂肪酸用來供給發(fā)育的亞麻胚，它們就形成三酰甘油(實施例10)?；蛘撸湍敢部捎冒l(fā)明中的環(huán)氧化酶克隆進行轉化并分析其環(huán)氧脂肪酸的產(chǎn)生。實施例6初級T0轉基因植物上結出的T1擬南芥種子中環(huán)氧脂肪酸的質譜分析確定從Cpal2轉化的擬南芥植物(實施例5)的T1種子的種子脂類制備的甲基酯的氣相層析與未轉化的對照相比顯示出存在兩個附加的脂肪酸。這些化合物中的第一個具有與斑鳩菊酸標準相同的滯留時間。第二個化合物具有較長的滯留時間并推定為12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸，即通過內源的擬南芥的Δ15-去飽和酶在Δ15位的去飽和作用形成的斑鳩菊酸預期的衍生物。兩個峰的確切性質的確定通過從來自Cpal2-轉化的植物的環(huán)氧脂肪酸部分制備的二醇的質譜分析獲得。二醇可進一步轉變?yōu)槿谆柰橐颐巡⑼ㄟ^融合硅毛細管柱上的GC-MSDB23(Howlett-Packard5890IIGC耦聯(lián)到HewlettPackard5989MS上，在70eV15電子沖擊下工作)進行分析。總離子層析譜顯示出如下兩個峰(i)第一個洗脫峰具有突出的質量為73、172、275和299的離子，顯示出環(huán)氧基團位于C18脂肪酸的C-12位以及雙鍵位于環(huán)氧基團和羧基末端之間。該質量譜與從純的斑鳩菊酸(12，13-環(huán)氧-9-十八碳烯酸)制備的二醇的三甲基硅烷乙醚衍生物的譜相一致；以及(ii)第二個洗脫峰具有突出的質量為73、171、273和299的離子，顯示出兩個雙鍵和位于C18脂肪酸的C-12位的環(huán)氧基團的存在，與12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸的質譜相一致。實施例7Cpal2轉基因擬南芥植物的脂肪酸分析使來自轉化的擬南芥植物在napin啟動子控制下表達Cpal2cDNA克隆的T1種子發(fā)芽并從五個T0株系(表5中株系號碼為4、8、13、17和21的株系)建立T1植物。從每一株T1植物中收獲T2種子并分析脂肪酸組成。由斑鳩菊酸的存在按預期分離轉化體4、8、13和21(表5)的后代，那些植物含有的斑鳩菊酸最高達到3.1％(表6)。所有含有斑鳩菊酸(即表6中的環(huán)氧181)的T1植物也含有12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸(即表6中的環(huán)氧182；也見于圖11)，顯示出由Cpal2環(huán)氧化酶合成的一些斑鳩菊酸繼續(xù)由內源的Δ15-去飽和酶進行去飽和作用。表6來自擬南芥的五個初級cpal2轉化體的T1植物所結的自交種子的脂肪酸組成</tables>實施例8Cpal2轉基因Linela植物的脂肪酸分析上面所描述的包含Cpal2cDNA克隆(圖9)的雙元質粒結構用電穿孔轉化到根瘤土壤桿菌菌株AGL1中。轉化的根瘤土壤桿菌通過Lawrence等(1989)描述的方法用于感染亞麻Eyre變種外植體，除了將MS培養(yǎng)基用作基本培養(yǎng)基以誘導再生莖材料上根的生成。兩個命名為AP20和AP21的初級Linola轉化體(T0植物)用直接針對于Cpal2基因的引物通過PCR以及通過顯示這些植物是卡那霉素抗性的證實它們是轉基因的。用常規(guī)技術單獨分析來自每一株植物的十枚T1種子的脂肪酸組成。如表7中所示，來自AP20的種子分為三組，其中三枚種子不含斑鳩菊酸，二枚含超過0.7％的斑鳩菊酸，以及五枚含有中等水平(0.13-0.47％)的斑鳩菊酸。相類似地，來自AP21的種子也分為三組，其中五枚種子不含斑鳩菊酸，二枚含有超過0.25％的斑鳩菊酸以及三枚含有中等水平(0.09-0.14％)的斑鳩菊酸(表8)。因此，總共獲得12枚含有斑鳩菊酸的種子。十二枚AP20和AP21種子中的八枚含有斑鳩菊酸也含有12，13-環(huán)氧-9，15-十八碳二烯酸。表7來自LinolaCpal2初級轉化體AP20的10枚單獨T1種子的脂肪酸組成表8來自LinolaCpal2初級轉化體AP21的10枚單獨T1種子的脂肪酸組成</tables>四株T1植物來自卡那霉素抗性的AP20幼苗。接下來所有四株植物顯示出在其T2種子中產(chǎn)生斑鳩菊酸(表9)。這些T2種子中的182環(huán)氧脂肪酸水平未進行分析。表9來自AP20的LinolaCpal2T1后代的T2種子的脂肪酸組成</tables>na＝未分析實施例9在轉基因生物中合成環(huán)氧脂肪酸產(chǎn)生富含斑鳩菊酸的油通過將此處所述的環(huán)氧化酶基因，特別是SEQIDNO1轉化到前面實施例中所描述的擬南芥中實現(xiàn)。如表5中所示，表達SEQIDNO1的轉基因的擬南芥株系在其種子中產(chǎn)生相對于其它脂肪酸的高水平的斑鳩菊酸。特別地，在一個轉基因株系中，產(chǎn)生的斑鳩菊酸多達總的種子脂肪酸含量的15.2％(w/w)。富含斑鳩菊酸的油的產(chǎn)生還可通過將此處所述的SEQIDNO1、3、5、19或20中任一環(huán)氧化酶基因并優(yōu)選地是SEQIDNO1或3或5中任意一項轉化到任何一般有很高水平的亞油酸以及最小的能利用亞油酸作為底物的競爭性酶活性的油富集生物中而實現(xiàn)。發(fā)明中的遺傳序列可操作地置于在含油種子中產(chǎn)生高水平表達的啟動子的控制之下，例如napin種子特異性啟動子。在另一個轉化擬南芥的方法中，用發(fā)明中的環(huán)氧化酶轉化亞麻、向日葵、玉米或紅花的高亞油酸基因型。當環(huán)氧化酶基因以高水平表達時，高水平的斑鳩菊酸通過轉基因植物在種子油合成過程中產(chǎn)生?；蛘?，用發(fā)明中的環(huán)氧化酶轉化Linola(＝低亞油酸)亞麻。當環(huán)氧化酶基因以高水平表達時，高水平的斑鳩菊酸通過轉基因的Linola亞麻植物在種子油合成過程中產(chǎn)生。并且，本發(fā)明人已顯示出給予發(fā)育的亞麻種子的標記的斑鳩菊酸沒有降解但在三酰甘油分子的全部三個位置整合到貯存的脂中(見實施例10)。與這些數(shù)據(jù)相一致的是，通過導入的環(huán)氧化酶合成的高水平的斑鳩菊酸易于貯存于此物種的種子油三酰甘油中。實施例10油酸和斑鳩菊酸整合到發(fā)育的亞麻籽子葉的脂中于種子發(fā)育的中期(開花后20天)脫離的發(fā)育的亞麻籽子葉(每次培養(yǎng)中的6對，重復培養(yǎng))與10nmol[1-14C]斑鳩菊酸(特異性活性3000d.p.m./nmol)或[1-14C]油酸(特異性活性5000d.p.m./nmol)的銨鹽在0.2mlpH7.2的磷酸鹽緩沖液中于30℃溫育30分鐘。然后將子葉用1ml蒸餾水洗三次并根據(jù)Bligh和Dyer(1959)的方法在UltraTurrax中立即提取或在提取前將其在0.5mlpH7.2的磷酸鹽緩沖液中繼續(xù)溫育90或270分鐘。將氯仿相中脂的等分試樣進行甲基化并在n-己烷/二乙基乙醚/乙酸(85∶15∶1)中的硅膠TLC板中分離。每一樣品氯仿相中的剩余的脂用在兩個分離的硅膠TLC板上并且將板置于氯仿/甲醇/乙酸/水(85∶15∶10∶3.5按體積)中用于極性脂的分離以及置于n-己烷/二乙基乙醚/乙酸(60∶40∶1.5)中用于中性脂的分離。去除對應真正標準遷移的脂面積并通過液體閃爍計數(shù)測定每一個脂的放射性。氯仿相中14C-標記的回收在圖12中描述。多少超過一半的加入的來自[14C]油酸和[14C]斑鳩菊酸的放射性由子葉吸收并在脈沖標記30分鐘后作為親脂性底物回收。這個量在進一步與兩個底物溫育270分鐘的過程中實際上保持不變。脂的放射性甲基酯的分離顯示出大部分來自[14C]斑鳩菊酸施放實驗的放射性(92％)存在于與甲基-斑鳩菊酸鹽有相同遷移的化合物中并說明環(huán)氧基團在整個270分鐘的溫育過程中于亞麻籽子葉里保持完整。30分鐘后來自[14C]斑鳩菊酸施放存在于氯仿相中的約28％的活性存在于磷脂酰膽堿中并且在溫育300分鐘時放射性下降到只有5％(圖13)。30分鐘后來自[14C]油酸施放存在于氯仿相中的約22％的活性存在于磷脂酰膽堿中并且在溫育300分鐘時放射性下降到大約11％(圖13)。30分鐘后來自[14C]斑鳩菊酸施放的存在于氯仿相中的約32％的活性存在于三酰甘油中并且在溫育300分鐘時放射性上升到超過60％(圖14)。在[14C]斑鳩菊酸施放實驗中雙酰甘油含有大約24％的活性并且這個量在溫育期間保持不變。30分鐘后來自[14C]油酸施放的存在于氯仿相中的約5％的活性存在于三酰甘油中并且在溫育300分鐘時放射性上升到18％(圖18)。在[14C]油酸施放實驗的30分鐘之后雙酰甘油含有大約18％的活性并且這個量在溫育期間保持不變。上面的實驗顯示出亞麻籽子葉不在任何程度上代謝斑鳩菊酸的環(huán)氧基團。它進一步顯示出亞麻籽子葉具有能從膜脂上有效去除斑鳩菊酸并將其整合到三酰甘油中的代謝。實施例11從其它含環(huán)氧酸的物種克隆Δ12-環(huán)氧化酶基因Cpal2Δ12-環(huán)氧化酶基因的同系物通過克隆在發(fā)育種子中高表達的Δ12混合功能單加氧酶基因家族成員并將其氨基酸序列與已知的Δ12-去飽和酶和Δ12-環(huán)氧化酶序列相比較而從其它富含環(huán)氧脂肪酸的物種中獲得。這些基因或者通過用基于Cpal2基因(SEQIDNO1)或D12V片段(SEQIDNO7)的引物篩選發(fā)育種子的cDNA文庫，或者通過用針對這里所述的植物Δ12混合功能單加氧酶的保守序列設計的引物擴增PCR片段而進行克隆。推定的Δ12-環(huán)氧化酶序列與已知的Δ12-去飽和酶序列相比表現(xiàn)出針對這里所包括的Δ12-環(huán)氧化酶序列有更大的總體序列相同性。在此方法的一個實施例中，全長的Δ12-環(huán)氧化酶樣的序列從在種子油中含有高水平斑鳩菊酸的未鑒定的還陽參屬種類中獲得并已知不是Crepispalaestina。Poly(A)+RNA用QuickPrepMicromRNA純化試劑盒(Pharmacia生物技術公司)從此還陽參屬種類發(fā)育的種子中分離并用于合成Oligod(T)-引物雙鏈cDNA。然后將因此而獲得的雙鏈cDNA連接到EcoRI/NotI接頭上(Pharmacia生物技術公司)并用ZAP-cDNAGigapack克隆試劑盒(Stratagene公司)構建cDNA文庫。用來自Crepisalpina由制造商所規(guī)定的隨機標記的DRV片段(SEQIDNO7)，用常規(guī)雜交條件篩選HybondN+膜過濾器(Amersham公司)上的cDNA文庫。這導致了命名為CrepX的重組噬菌體的純化。CrepXcDNA的核苷酸序列經(jīng)測定并在SEQIDNO3中陳述。由CrepX(SEQIDNO4)推斷的氨基酸序列包含與Cpal2Δ12環(huán)氧化酶序列有97％相同性的374個氨基酸的蛋白，但與擬南芥L26296的Δ12-去飽和酶序列僅有57％的相同性。這明確證明了在另一個有高斑鳩菊酸含量的還陽參屬種類中基因的存在，該基因與Cpal2Δ12-環(huán)氧化酶基因高度同源并明確地不是去飽和酶基因。在此方法的第二個實施例中，從含有斑鳩菊酸的物種Vernoniagalamensis中獲得部分Δ12-環(huán)氧化酶樣的序列。由從V.galamensis發(fā)育的種子中分離的總RNA用常規(guī)步驟制備第一鏈cDNA模板。用來自由植物混合功能單加氧酶推斷的氨基酸序列的引物通過擴增單鏈cDNA獲得命名為Vga11的PCR片段(長度為550個核苷酸)。擴增DNA的核苷酸序列用常規(guī)步驟測定并在SEQIDNO5中陳述。由Vga11PCR片段(SEQIDNO6)推斷的氨基酸序列與Cpa12Δ12-環(huán)氧化酶和擬南芥L26296的Δ12-去飽和酶的全序列的比較證明了擴增的Vga11序列編碼與Cpa12多肽的跨越103-285氨基酸殘基的區(qū)域相一致的氨基酸序列。在此區(qū)域內，Vga11序列與Cpa12Δ12-環(huán)氧化酶序列的氨基酸相同性(67％)比與擬南芥Δ12-去飽和酶序列的相同性(60％)更大，說明擴增的DNA與環(huán)氧化酶比與去飽和酶序列更為一致。本領域技術人員知道本發(fā)明提出非這里所特定描述的變化和修飾。應當理解本發(fā)明包括所有這樣的變化和修飾。發(fā)明還包括所有單獨或聯(lián)合地在本說明書中涉及或說明的這樣的步驟、特征、組合物和化合物，以及任何和所有上述步驟或特征的任意二者或更多的結合。參考文獻1.An等(1985)EMBOJ.4277-284.2.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，RE，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.(1987).于分子生物學常用方法.WileyInterscience(ISBN047150338).3.Badami，R.C.和Patil，K.B.(1981)脂類研究進展19，119-53.4.Bafor，M.，Smith，M.A.，Jonsson，L.，Stobart，K.和Stymne，S.(1993)Arch.Biochem.Biophys.303，145-151.5.Bafor，M.，Banas，A.，Wiberg，E.，Lenman，M.，Stahl，U.和Stymne，S.(1997)InWilliams，J.P.，Mobasher，K.U.，Lem，N.W.(編輯)植物脂類的生理學、生物化學和分子生物學，kluwer學院出版社，印刷中.6.Blee和Schuber(1990)生物化學雜志265，12887-12894.7.Blee，E.，Wilcox，A.L.，Marnett，J.M.，Schuber，F(xiàn).(1993)生物化學雜志268，1798-1715.8.Blee，E.，Stahl，S.，Schuber，F(xiàn).和Stymne，S.(1994)生物化學生物物理研究交流197，778-7849.Bligh，E.G.和Dyer，W.J.(1959)加拿大生物化學生理學雜志230，379-288.10.Bozak，K.R.，Yu，H.，Sirevag，R.和Christoffersen，R.E.(1990)美國國家科學院院報87，3904-39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50GATAGGGTTATTGCTAGGCATCAAAGGCCATCTATGAAGGATAAGATG1105AspArgValIleAlaArgHisGlnArgProSerMetLysAspLysMet355360365GTTAAGAGGTATACTGCTGCTGTTGTTTGCGAGCTTGATAGGTATGCT1153ValLysArgTyrThrAlaAlaValValCysGluLeuAspArgTyrAla370375380AAGCTTCTTCCATCTTCTCTTAGGTGCGTTGCTGCTGATGAGTGGAAG1201LysLeuLeuProSerSerLeuArgCysValAlaAlaAspGluTrpLys385390395TTCAGGGAGTATCTTATTCCAGTTGGAATGACTGTTGGAAACCTTAAG1249PheArgGluTyrLeuIleProValGlyMetThrValGlyAsnLeuLys400405410ACTACTGTTATGCTTGATCAAAAGGATCCAGTTGATCCAGAGCTTTTC1297ThrThrValMetLeuAspGlnLysAspProValAspProGluLeuPhe415420425430GATGGAATGTATGGACTTGATGCTGAGGTTCATTTCGATAAGACTGAT1345AspGlyMetTyrGlyLeuAspAlaGluValHisPheAspLysThrAsp435440445AGGTTCATGCCACCATTCTCTGCTGGGAGGATTGCCTGCGCTGGACAA1393ArgPheMetProProPheSerAlaGlyArgIleAlaCysAlaGlyGln450455460CTTCTTGCTGCTTATGAGCTTTTCCTTTTCTTCTGGACTATTGCTGAT1441LeuLeuAlaAlaTyrGluLeuPheLeuPhePheTrpThrIleAlaAsp465470475GTTTTCCAAATTTTCTCTCTTGCTCAATTCAAGGAGGGACATTGCACT1489ValPheGlnIlePheSerLeuAlaGlnPheLysGluGlyHisCysThr480485490GCTGTTACTCTTATTATTGATTGCCTTGCTGTTAGGTATGATCTTTGC1537AlaValThrLeuIleIleAspCysLeuAlaValArgTyrAspLeuCys495500505510CTTGCTAGGTAGGGACCTTTACCGTTTGTGTGACCGTGTCAATGCTTGC1586LeuAlaArgAATGGGCTTTTAATAATATTATTA1610(2)關于SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長度1698個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型DNA(ix)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置8..1504(xi)序列描述SEQIDNO20GAGAACAATGGCACAATTCGGCACGAGGGAAATTCTAGTCTCACTCTTT49MetAlaGlnPheGlyThrArgGluIleLeuValSerLeuPhe1510CTCTTTCTAATACTAATAAAGTTCACATTTTTAAAACTCAAAACCCCC97LeuPheLeuIleLeuIleLysPheThrPheLeuLysLeuLysThrPro15202530CAAAACCTCCCCCCATCACCACCATCTTTTCCAATCACCGGCCATCTC145GlnAsnLeuProProSerProProSerPheProIleThrGlyHisLeu354045CATCTCCTAAAACAACCAATCCACAGAACTCTCCACCAAATCGCCACC193HisLeuLeuLysGlnProIleHisArgThrLeuHisGlnIleAlaThr505560AAGTACGGGGACATCTTATTCCTCCGATTCGGAACACGAAAAGTCCTA241LysTyrGlyAspIleLeuPheLeuArgPheGlyThrArgLysValLeu657075GTCATCTCCTCTCTCCCCGCCGTACAAGAATGTTTCACTATAAACGAC289ValIleSerSerLeuProAlaValGlnGluCysPheThrIleAsnAsp808590ATCATTTTCGCTAACCGCCCAACAATTCTCGCCGGGAAGCACCTCAAT337IleIlePheAlaAsnArgProThrIleLeuAlaGlyLysHisLeuAsn95100105110TACAATTCCACCACCATGGGATTCGCCTCCTATGGCGATCACTGGCGT385TyrAsnSerThrThrMetGlyPheAlaSerTyrGlyAspHisTrpArg115120125CATCTCCGACGACTCACAACAATTGAGCTCTTCTCTGCAAATCGTGTT433HisLeuArgArgLeuThrThrIleGluLeuPheSerAlaAsnArgVal130135140GCCATGTTTTCCGGGTTCCGGGCCGATGAAAGTACAGCTTTTTATCAA481AlaMetPheSerGlyPheArgAlaAspGluSerThrAlaPheTyrGln145150155ACAGTTGTTCCAGGAAATCGGGATTCGGGAAAGATAGTAACTTTGACA529ThrValValProGlyAsnArgAspSerGlyLysIleValThrLeuThr160165170TCGAAACTGATGGAGCTTACACTGAATAACATAATGAGAATGGCTGCC577SerLysLeuMetGluLeuThrLeuAsnAsnIleMetArgMetAlaAla175180185190GGAAAACGGTTTTACGGGAAAGAAGTGAAGGATGAAGAAGGTGAGTTG625GlyLysArgPheTyrGlyLysGluValLysAspGluGluGlyGluLeu195200205TTGCAGGATCTTATGAAGAAAATGGAGGCGCTCCGGGGGAATTCAACG673LeuGlnAspLeuMetLysLysMetGluAlaLeuArgGlyAsnSerThr210215220GTGAAACGAGATTATTTTCCAGTATTGCAGTGGATTGATTATCAGGGA721ValLysArgAspTyrPheProValLeuGlnTrpIleAspTyrGlnGly225230235GTAAAGAAGAAGATGAGGAACCTGATGAAGAAAATGGACGGGTTCTTG769ValLysLysLysMetArgAsnLeuMetLysLysMetAspGlyPheLeu240245250CAAAATCTCATTGATGAACACCGAAACACGACGTTGTGGATCAATCAA817GlnAsnLeuIleAspGluHisArgAsnThrThrLeuTrpIleAsnGln255260265270GTTCGAGCAACTCGGACAAAAAGAGGAACTTGGACACTGGTAGATGTT865ValArgAlaThrArgThrLysArgGlyThrTrpThrLeuValAspVal275280285ATGTTGAATCTTAAAAAGACACAACCTGACTTCTACACTGATCTAACT913MetLeuAsnLeuLysLysThrGlnProAspPheTyrThrAspLeuThr290295300ATCAAAGGTGTCATTCAGACAACACTGACTGCAGGATCTCAAACGTCA961IleLysGlyValIleGlnThrThrLeuThrAlaGlySerGlnThrSer305310315GCAGTTACACTAGAATGGGCGCTGTCACTTCTTCTCAACCATCCTCAA1009AlaValThrLeuGluTrpAlaLeuSerLeuLeuLeuAsnHisProGln320325330GTAATGCACAAAGCTTATGCCGAAATAGAGGCGATTGTCGGGACCAAC1057ValMetHisLysAlaTyrAlaGluIleGluAlaIleValGlyThrAsn335340345350CGCTTATTAAACGAAGCCGACTTACCACATCTAAGCTATTTACAAAAC1105ArgLeuLeuAsnGluAlaAspLeuProHisLeuSerTyrLeuGlnAsn355360365ATAATCACCGAGACATTTCGACTCTTCCCACCAGTACCACTTTTACTA1153IleIleThrGluThrPheArgLeuPheProProValProLeuLeuLeu370375380CCCCATAAATCATCAGCAGATTGCATAGTTTCCGGGTTTCACATACCA1201ProHisLysSerSerAlaAspCysIleValSerGlyPheHisIlePro385390395CGGGGCACAATGTTGCTAGTGAACACATGGAGCATGAATAGAAATCCA1249ArgGlyThrMetLeuLeuValAsnThrTrpSerMetAsnArgAsnPro400405410AGATTATGGAAGGAACCAGAGAAATTCATACCAGAAAGATTTGAAGGA1297ArgLeuTrpLysGluProGluLysPheIleProGluArgPheGluGly415420425430GGAGAAAATACTGAAGGGTGTAACTATAAATTGCTTCCTTTCGGTGCA1345GlyGluAsnThrGluGlyCysAsnTyrLysLeuLeuProPheGlyAla435440445GGAAGGCGGGCTTGTCCGGGGGCCGGTGTGGCGAAACGAATGGTAGGA1393GlyArgArgAlaCysProGlyAlaGlyValAlaLysArgMetValGly450455460CTCACTTTAGGTGCATTGATTCAGTGTTTTGAGTGGGAAAGAATTGGG1441LeuThrLeuGlyAlaLeuIleGlnCysPheGluTrpGluArgIleGly46547045GAAGAAGAAATAGATTTGAGTGAAGGAACAGGTCTTACTATGCCAAAA1489GluGluGluIleAspLeuSerGluGlyThrGlyLeuThrMetProLys480485490GATTTCCTTTGGAAGTAATATGCAAACCTCGGCAAAACATGATTAACTTTCTTTC1544AspPheLeuTrpLys495TACATTGTTATAAAAGGTGGGTTTCTTTGCAGGTGCCAACCCTAATTCAAATATCGCATT1604TTTTCCCTGCAACCCAGCTGCTAACCAAATATCACTGTTTCTCATTATTCCTTATATAAA1664ACCTTAAAGCACTATTTGCCTCCTAAAAAAAAAA1698權利要求1.編碼除了哺乳動物花生四烯酸環(huán)氧化酶以外的脂肪酸環(huán)氧化酶的分離核酸分子或與其互補的核酸分子。2.根據(jù)權利要求1所述的分離核酸分子，其中環(huán)氧化酶是能催化脂肪酸分子中碳鍵環(huán)氧化作用的混合功能單加氧酶。3.根據(jù)權利要求2所述的分離核酸分子，其中碳鍵是不飽含脂肪酸分子中的雙鍵。4.根據(jù)權利要求1或3中任意一項所述的分離核酸分子，其中環(huán)氧化酶是Δ6-環(huán)氧化酶、Δ9-環(huán)氧化酶、Δ12-環(huán)氧化酶或Δ15-環(huán)氧化酶。5.根據(jù)權利要求4所述的分離核酸分子，其中環(huán)氧化酶是Δ12-環(huán)氧化酶。6.根據(jù)權利要求1到5中任意一項所述的分離核酸分子，來自植物。7.根據(jù)權利要求6所述的分離核酸分子，其中植物選自包含還陽參屬種類、大戟屬種類、苘蒿屬種類和斑鳩菊屬種類的目錄。8.根據(jù)權利要求6所述的分離核酸分子，其中植物產(chǎn)生高水平的斑鳩菊酸。9.根據(jù)權利要求7所述的分離核酸分子，其中植物是選自包含粗糙還陽參、金黃還陽參、Crepisconyzaefolia、Crepisintermedia、Crepisoccidentalis、Crepispalaestina、膀胱還陽參和Crepisxacintha的目錄的還陽參屬種類。10.根據(jù)權利要求8或9所述的分離核酸分子，其中植物是Crepispalaestina。11.根據(jù)權利要求7所述的分離核酸分子，其中植物是Vernoniagalamensis。12.根據(jù)權利要求1到11中任意一項所述的分離核酸分子，包含與SEQIDNO1或3或5或其互補序列或其同系物、類似物或衍生物有至少約65％相同的核苷酸序列。13.根據(jù)權利要求1到12中任意一項所述的分離核酸分子，能在至少低嚴格條件下與包含在SEQIDNO1或3或5或其互補序列內的至少20個連續(xù)核苷酸雜交。14.一種分離核酸分子，包含與SEQIDNO1或3或5中的任意一個或其互補核苷酸序列至少65％相同的核苷酸序列。15.根據(jù)權利要求14所述的分離核酸分子，包含SEQIDNO1中所示的核苷酸序列或其至少約20個連續(xù)核苷酸。16.根據(jù)權利要求14所述的分離核酸分子，包含SEQIDNO3中所示的核苷酸序列或其至少約20個連續(xù)核苷酸。17.根據(jù)權利要求14所述的分離核酸分子，包含SEQIDNO5中所示的核苷酸序列或其至少約20個連續(xù)核苷酸。18.一種分離核酸分子，包含與SEQIDNO19或20中的任意一個的至少200個連續(xù)核苷酸或其互補序列至少75％相同的核苷酸序列。19.包含與啟動子序列可操作連接根據(jù)權利要求1到17中任意一項所述的分離核酸分子的遺傳構建體，其中所述核酸分子能以相對于天然存在的環(huán)氧化酶基因的體內轉錄方向正義或反義的方向得到轉錄。20.改變細胞、組織、器官或生物中環(huán)氧脂肪酸水平的方法，該方法包含將包含根據(jù)權利要求1到17中任意一項所述的分離的核酸分子的正義、反義、核酶或共抑制分子導入細胞、組織、器官或生物中并在足以使上述正義、反義、核酶或共抑制分子表達的條件下培養(yǎng)上述細胞一段時間。21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中導入正義、反義、核酶或共抑制分子的步驟包含用正義、反義、核酶或共抑制分子穩(wěn)定轉化細胞、組織、器官或生物。22.在細胞中合成重組具酶活性的環(huán)氧化酶多肽的方法，該方法包含在足以使表達發(fā)生的條件下培養(yǎng)包含根據(jù)權利要求1到17中任意一項所述的分離核酸分子的細胞一段時間。23.根據(jù)權利要求22所述的方法，包括用分離的核酸分子轉化細胞的額外的第一步。24.在細胞中合成重組具酶活性的環(huán)氧化酶多膚的方法，該方法包含以下步驟(i)制備包含可操作地置于能引起上述遺傳序列在上述細胞中表達的啟動子控制之下的根據(jù)權利要求1到17中任意一項所述的分離核酸分子和選擇性地表達增強子元件的遺傳構建體；(ii)將上述遺傳構建體轉化入上述細胞中；并且(iii)選擇以高水平表達由遺傳序列編碼的功能性環(huán)氧化酶的轉化體。25.在轉基因植物中合成重組具酶活性的環(huán)氧化酶多肽的方法，包含以下步驟(i)制備包含可操作地置于種子特異性啟動子控制之下根據(jù)權利要求1到17中任意一項所述的分離的核酸分子和選擇性地表達增強子元件的遺傳構建體，其中所述遺傳序列也置于轉錄終止子序列的上游；(ii)將上述遺傳構建體轉化入上述植物的細胞或組織中；并且(iii)選擇在種子中以高水平表達由遺傳序列編碼的功能性環(huán)氧化酶的轉化體。26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中植物是正常產(chǎn)生高水平亞油酸的含油種子物種。27.根據(jù)權利要求25或26所述的方法，其中植物從包含Linola亞麻、油籽油菜、向日葵、紅花、大豆、亞麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄欖或油棕等的目錄選出。28.按照根據(jù)權利要求22到27中任意一項所述的方法制備的重組多肽。29.包含SEQIDNO2或4或6中所示的氨基酸序列的重組多肽或與其至少50％相同的同系物、類似物或衍生物。30.一種重組多肽，是SEQIDNO2或4或6中所示的部分氨基酸序列與來自不同的混合功能單加氧酶的氨基酸序列之間融合的多肽。31.根據(jù)權利要求30所述的重組多肽，其中不同的混合功能單加氧酶是去飽和酶、乙炔化酶或羥化酶。32.根據(jù)權利要求30或31所述的重組多肽，其中所述多肽表現(xiàn)出與其從中衍生的任一多肽的催化活性不同的催化活性。33.在細胞、組織、器官或生物中合成環(huán)氧化脂肪酸的方法，該方法包含將表達根據(jù)權利要求28到32中任意一項所述的重組多肽的細胞、組織、器官或生物與脂肪酸底物一起在足以使上述底物的至少一個碳鍵轉變?yōu)榄h(huán)氧基團的條件下培養(yǎng)一段時間。34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中脂肪酸底物是不飽和脂肪酸并且上述底物中被環(huán)氧化的碳鍵是碳雙鍵。35.根據(jù)權利要求33或34所述的方法，其中脂肪酸底物從含有棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、9，15-十八碳二烯酸和花生四烯酸的目錄中選出。36.根據(jù)權利要求33到35中任意一項所述的方法，其中被環(huán)氧化的碳鍵是Δ6碳鍵或Δ9碳鍵或Δ12碳鍵或Δ15碳鍵。37.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中被環(huán)氧化的碳鍵是Δ12碳鍵。38.根據(jù)權利要求33到37中任意一項所述的方法，其中合成的環(huán)氧化脂肪酸是斑鳩菊酸。39.根據(jù)權利要求33到38中任意一項所述的方法，包含用編碼重組環(huán)氧化酶或其同系物、類似物或衍生物的核酸分子轉化或轉染細胞、組織、器官或生物的額外的第一步。40.根據(jù)權利要求33到39中任意一項所述的方法，其中表達重組環(huán)氧化酶的細胞、器官、組織或生物來自細菌、酵母、真菌、霉菌、昆蟲、植物、鳥類或哺乳動物。41.根據(jù)權利要求40所述的方法，其中細胞、器官、組織或生物來自酵母、植物、真菌或霉菌。42.根據(jù)權利要求41所述的方法，其中酵母、植物、真菌或霉菌是含油的酵母、植物、真菌或霉菌43.根據(jù)權利要求42所述的方法，其中植物是正常不以高水平表達重組環(huán)氧化酶的含油種子植物。44.根據(jù)權利要求43所述的方法，其中含油種子植物從含有Linola亞麻、油籽油菜、向日葵、紅花、大豆、亞麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄欖或油棕等的目錄選出。45.用根據(jù)權利要求1到17中任意一項所述的分離核酸分子轉化的植物，其細胞、組織或器官或也包含上述核酸分子的上述植物的后代。46.能表達根據(jù)權利要求28到32中任意一項所述的重組多肽的轉化植物，其細胞、組織或器官或也能表達上述重組多肽的上述植物的后代。47.根據(jù)權利要求45或46所述的植物或其細胞、組織或器官或其后代，包括或來自Linola亞麻、油籽油菜、向日葵、紅花、大豆、亞麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄欖或油棕。48.根據(jù)權利要求45或46所述的植物或其細胞、組織或器官或其后代，包括或來自擬南芥。49.根據(jù)權利要求45或46所述的植物或其細胞、組織或器官或其后代，包括或來自亞麻。50.能與混和功能單加氧酶多肽或其抗原決定基結合的抗體分子。全文摘要本發(fā)明總的涉及編碼脂肪酸環(huán)氧化酶的新遺傳序列。具體地,本發(fā)明涉及編碼脂肪酸△12－環(huán)氧化酶包括混合功能單加氧酶的遺傳序列。更優(yōu)選地,本發(fā)明提供編碼植物脂肪酸環(huán)氧化酶,特別是Crepispalaestina△12－環(huán)氧化酶的cDNA序列及其同系物、類似物和衍生物。本發(fā)明的遺傳序列提供可改變或控制諸如酵母、霉菌、細菌、昆蟲、鳥類、哺乳動物或植物的生物中脂肪酸代謝,特別是其中將不飽和脂肪酸轉變?yōu)榄h(huán)氧化脂肪酸的代謝的方法。本發(fā)明延伸至用本遺傳序列轉化的遺體修飾的油－富集生物和從中生成的油。由此生成的油提供了用于有效生產(chǎn)涂料、樹脂、膠、塑料、表面活性劑和潤滑劑等的成本有效性原材料。文檔編號C12N15/09GK1257541SQ98805470公開日2000年6月21日申請日期1998年4月9日優(yōu)先權日1997年4月15日發(fā)明者斯滕·斯蒂姆,阿倫·格林,蘇林德·辛格,瑪麗特·倫曼申請人:聯(lián)邦科學和工業(yè)研究組織,斯滕·斯蒂姆